Ruchliwość promieniowa i funkcja cytotoksyczna retrowirusowych limfocytów T transdukowanych wektorem replikującym, nieadherentnych alloreagujących limfocytów T

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pokazanie nieprzylegającej migracji efektorowych limfocytów T przez monowarstwę przylegających komórek nowotworowych. Osiąga się to poprzez najpierw ustanowienie monowarstwy przylegających komórek nowotworowych w studzienkach pokrytych poli D lizyną teflonowych szkiełek maskowanych jako drugi etap znakowany fluorescencyjnie efektor, limfocyty T są sedymentowane do środka monowarstwy za pomocą kolektora sedymentacyjnego komórek. Następnie mikroskopia świetlna i fluorescencyjna służą do wizualizacji migracji nieprzylegających komórek przez monowarstwę.

Wyniki pokazują, że funkcje migracji i efektorowe nieadherentnych limfocytów T w kohodowli z przylegającą monowarstwą komórek nowotworowych są zachowane po transdukcji limfocytów wektorem retrowirusowym. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że migrację promieniową nieprzylegających efektorowych limfocytów T można mierzyć w kulturze węglowej z przylegającymi komórkami nowotworowymi. Ma to daleko idące implikacje dla pacjentów z pierwotnymi lub przerzutowymi guzami mózgu, ponieważ allogeniczne cytotoksyczne limfocyty T, które są modyfikowane w celu ekspresji genu aktywatora pro-leków, takiego jak deaminaza cytozynowa, są testowane jako multimodalne podejście do eliminacji guza w mózgu.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności z ustanowieniem przylegających monowarstw komórek nowotworowych ze względu na niejednorodność wzrostu komórek nowotworowych w charakterystyce przylegania. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy generowania równej monowarstwy guza i skutecznej sedymentacji nieprzylegającego L-O-C-T-L wymagają doświadczonego zrozumienia charakterystyki obu typów komórek. Na początek umieść do czterech wysterylizowanych.

10-dołkowe szkiełka pokryte teflonem na sterylnej szalce Petriego o wymiarach 150 milimetrów na 15 milimetrów. Umieść szalkę Petriego o wymiarach 35 milimetrów na 10 milimetrów zawierającą od dwóch do trzech mililitrów sterylnej wody obok szkiełek, aby zapewnić wilgotność. Następnie wstępnie przygotuj szkiełka, pokrywając każdą studzienkę roztworem 100 mikrogramów na mililitr poli D lyciny lub poli L lizyny.

Inkubować szkiełka przez godzinę w temperaturze pokojowej, następnie odessać roztwór i dwukrotnie przepłukać powierzchnię studzienki PBS z przygotowanymi dołkami na próbki. Zbierz zlewającą się kolbę z przylegającymi komórkami nowotworowymi. Policz liczbę żywotnych komórek za pomocą mikroskopii świetlnej, a następnie zawieś komórki w stężeniu pięć razy 10 do sześciu komórek na mililitr.

W buforowanej pożywce wzrostowej dodaj od pięciu do 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki, w zależności od typu komórki nowotworowej, zwiększ objętość studzienki do 40 mikrolitrów za pomocą pożywki i powoli pipetuj w górę iw dół, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Po wysianiu dołków pozwól komórkom nowotworowym osiąść w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie przykryj szalkę Petriego pokrywką i ostrożnie przenieś ją do inkubatora z wilgotnością 37 stopni Celsjusza z 5% inkubacją dwutlenku węgla przez co najmniej 24 godziny.

Codziennie zmieniaj pożywkę hodowlaną w studzienkach, ostrożnie usuwając część pożywki z monowarstwy i zastępując ją większą objętością świeżej, kompletnej pożywki z komórek T. Komórki zazwyczaj zlewają się w ciągu jednego do trzech dni, aby przygotować komórki do sedymentacji na monowarstwie komórek nowotworowych. Pobrać nieprzylegające limfocyty T i oznaczyć je barwnikiem proliferacji komórek zgodnie z protokołem producenta co najmniej godzinę przed testem.

Następnie umieść nawilżoną komorę zawierającą szkiełka komórek nowotworowych w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przemyć studzienki PBS przez pipetowanie, a następnie dodać do studzienek 45 mikrolitrów kompletnej pożywki z 10% surowicą. Nasuń wysterylizowany kolektor sedymentacyjny komórek na studzienki, aż haczyk na końcu kolektora dotknie dna szkiełka.

Upewnij się, że medium jest widoczne w kanałach kolektora. Następnie policz nieprzylegające komórki i zawieś je od jednego do dwóch razy od 10 do piątej. Komórki na mikrolitr w pożywce.

Delikatnie zarąb komórki, aby wyeliminować wszelkie skupiska komórek, które zakłócałyby sedymentację komórek. Powoli odpipetować jeden mikrolitr zawiesiny komórek do kanału kolektora dla każdego. Następnie inkubuj aparat w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut, aby komórki w kanale mogły osiąść na monowarstwie.

Po ustabilizowaniu się komórek delikatnie podnieś kolektor prosto do góry, nie dotykając suwaka. Upewnij się, że granulki komórek zostały osadzone w obwodzie kanału kolektora. Za pomocą mikroskopu osadzone komórki powinny lekko przylegać do monowarstwy, tak aby delikatne przesuwanie szkiełka nie powodowało rozproszenia osadu.

Po potwierdzeniu, że komórki się osadziły, przenieś szkiełko do odwróconego mikroskopu wyposażonego w komorę na dwutlenek węgla i wilgotność. Użyj obiektywu four x do jasnego pola i wielokanałowego obrazowania fluorescencyjnego komórek. Uzyskaj obrazy danego obszaru w jasnym polu i kanałach fluorescencyjnych, a następnie dodaj mikronowe paski za pomocą oprogramowania do przechwytywania obrazu.

Przechowuj szkiełko w nawilżonym inkubatorze między punktami czasowymi po uzyskaniu wszystkich punktów czasowych. Przeciągnij i upuść pliki obrazów do programu do edycji obrazów i wybierz opcję dodaj warstwę, aby utworzyć plik obrazu z wieloma warstwami. Połącz światło i obrazy fluorescencyjne w jedną warstwę.

Użyj oprogramowania do akwizycji, aby zrobić zdjęcia obszaru o wymiarach osiem milimetrów na osiem milimetrów. Oprogramowanie powinno być ustawione tak, aby automatycznie łączyło ze sobą przechwycone obrazy przy użyciu kanału, który jest najlepiej reprezentowany w całej studni. Jeśli obrazowane są tylko kanały fluorescencyjne, powinien to być kanał do obrazowania przylegających komórek.

Alternatywnie obrazy można zszyć za pomocą oprogramowania do edycji obrazów. Odbywa się to poprzez wyrównanie obszarów obrazów, które są zachowane z jednego obrazu do drugiego i nakładanie obrazów na siebie, aż zostanie wygenerowany pełny obraz. Zszyj obrazy za pomocą oprogramowania do tworzenia obrazów.

Wykorzystaj połączone obrazy do tworzenia map fluorescencji o intensywności powierzchni za pomocą oprogramowania Image J, aby zobrazować agregację fluorescencyjnych komórek T lub ich rozprzestrzenianie się w czasie. Ludzkie cytotoksyczne limfocyty T o reakcji allo, znane jako transdukowane Allo CTL, z wektorem retrowirusowym kompetentnym do replikacji kodującym szmaragdowozielony gen ekspresji białka fluorescencyjnego, umieszczono w środku monowarstwy komórek glejaka. Po czterech godzinach, w ciągu 24 godzin, cały OCTL utworzył widoczne agregaty.

W przylegającej monowarstwie komórkowej pojawiły się puste plamy, co wskazuje na lizę komórek nowotworowych, a niektóre allo CTL wyemigrowały poza krawędź natarcia. Znakowane fluorescencyjnie mysie Allo CTL umieszczono w środku monowarstwy fluorescencyjnie znakowanych komórek glejaka grypy po jednej godzinie Allo CTL ściśle związane z komórkami glejaka po 48 godzinach, Allo CTL migrowało od środka intensywności powierzchni monowarstwy. Mapy fluorescencyjne zostały wygenerowane na podstawie tych obrazów za pomocą oprogramowania do obrazowania J i pokazują znaczną migrację z centrum po 48 godzinach.

Ważne jest, aby codziennie zmieniać pożywkę hodowlaną dla monowarstwy komórek nowotworowych, aby utrzymać zdrowe warunki hodowli. Ponadto, po opanowaniu, sedymentacja nieprzylegających komórek powinna zająć około 20 minut Po tej procedurze. Inne metody, takie jak śledzenie ścieżek komórek, mogą być wykorzystane do odpowiedzi na pytania dotyczące szybkości, z jaką allo CTL migrują przez monowarstwę lub czasu, w którym są w kontakcie z komórkami nowotworowymi wykonującymi swoje funkcje cytotoksyczne.

Protokół ten pomoże naukowcom zajmującym się immunoterapią genową w badaniu migracji zmodyfikowanych genowo limfocytów T w kokulturze z komórkami nowotworowymi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować nieprzylegające i przylegające komórki do hodowli co oraz jak używać kolektora sedymentacji komórek do badania poziomej migracji promieniowej komórek nieprzylegających nad monowarstwą komórek nowotworowych.