Ruchliwość promieniowa i funkcja cytotoksyczna retrowirusowych limfocytów T transdukowanych wektorem replikującym, nieadherentnych alloreagujących limfocytów T

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykazanie migracji nieprzylegających efektorowych limfocytów T po monowarstwie przylegających komórek nowotworowych. Osiąga się to poprzez utworzenie w pierwszym kroku monowarstwy przylegających komórek nowotworowych w dołkach szkiełek z maską teflonową pokrytych poli-D-lizyną, a w drugim kroku efektorowe limfocyty T znakowane fluorescencyjnie są osadzane w centrum monowarstwy przy użyciu manifoldu do sedymentacji komórek. Następnie wykorzystuje się mikroskopię świetlną i fluorescencyjną do wizualizacji migracji nieprzylegających komórek po monowarstwie.

Wyniki pokazują, że migracja i funkcje efektorowe nieprzylegających limfocytów T w ko-kulturze z przylegającą monowarstwą komórek nowotworowych są zachowane po transdukcji limfocytów wektorem retrowirusowym. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość pomiaru radialnej migracji nieprzylegających efektorowych limfocytów T w ko-kulturze z przylegającymi komórkami nowotworowymi. Ma to dalekosiężne znaczenie dla pacjentów z pierwotnymi lub przerzutowymi guzami mózgu, ponieważ allogeniczne cytotoksyczne limfocyty T zmodyfikowane w celu ekspresji genu aktywatora proleku, takiego jak cytozyna deaminaza, są testowane jako podejście multimodalne w celu eliminacji nowotworu w mózgu.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mają trudności z utworzeniem przylegających monowarstw komórek nowotworowych ze względu na heterogeniczność cech adhezyjnych wzrostu tych komórek. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ kroki prowadzące do uzyskania równomiernej monowarstwy nowotworowej oraz efektywnej sedymentacji nieprzylegających L-O-C-T-L wymagają doświadczenia w zakresie charakterystyki obu typów komórek. Aby rozpocząć, należy przygotować do czterech wysterylizowanych.

10 szkiełek z powłoką teflonową i dołkami w sterylnej szalce Petriego o wymiarach 150 mm na 15 mm. Obok szkiełek należy umieścić szalkę Petriego o wymiarach 35 mm na 10 mm zawierającą od 2 do 3 ml sterylnej wody w celu zapewnienia wilgotności. Następnie należy przeprowadzić wstępną obróbkę szkiełek, pokrywając każdy dołek roztworem poli-D-lizyny lub poli-L-lizyny w stężeniu 100 µg/ml.

Inkubować preparaty przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, następnie odessać roztwór i dwukrotnie przepłukać powierzchnię dołka roztworem PBS, przygotowując dołki na próbki. Zebrać konfluencyjną hodowlę adherentnych komórek nowotworowych z kolby. Policzyć liczbę żywych komórek za pomocą mikroskopii świetlnej, a następnie zawiesić komórki w stężeniu 5 × 10⁶ komórek/ml.

Do buforowanej pożywki wzrostowej w każdej studzience dodaje się od 5 do 10 µL zawiesiny komórek, w zależności od typu komórek nowotworowych, uzupełniając objętość studzienki pożywką do 40 µL i powoli pipetując w górę i w dół, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Po wysianiu komórek do studzienek należy pozostawić je w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby opadły na dno. Następnie należy nałożyć pokrywkę na szalkę Petriego i ostrożnie przenieść ją do inkubatora z nawilżaczem w temperaturze 37 °C i 5% CO2, gdzie inkubuje się je przez co najmniej 24 godziny.

Codziennie wymieniaj pożywkę w dołkach, ostrożnie usuwając część pożywki z monowarstwy i zastępując ją większą objętością świeżej, kompletnej pożywki dla limfocytów T. Komórki zazwyczaj osiągają pełną konfluencję w ciągu jednego do trzech dni, co przygotowuje je do sedymentacji na monowarstwę komórek nowotworowych. Zbierz nieprzylegające limfocyty T i oznakuj je barwnikiem do proliferacji komórek zgodnie z protokołem producenta co najmniej godzinę przed rozpoczęciem analizy.

Następnie umieść komorę nawilżania zawierającą szkiełka z komórkami nowotworowymi w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przemyj dołki roztworem PBS za pomocą pipety, a następnie dodaj do dołków 45 µL pożywki kompletnej z 10% serum. Nasuń sterylną listwę do sedymentacji komórek na dołki, aż haczyk na końcu listwy dotknie dna szkiełka.

Upewnij się, że pożywka jest widoczna w kanałach rozdzielacza. Następnie policz komórki nieprzylegające i zawieś je w pożywce w stężeniu od 1 do 2 × 10⁵ komórek na µL.

Delikatnie rozbij komórki, aby wyeliminować wszelkie aglomeraty, które mogłyby zakłócić sedymentację komórek. Powoli pipetuj 1 µL zawiesiny komórkowej do kanału kolektora dla każdego dołka. Następnie inkubuj aparat w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut, aby komórki w kanale osiadły na warstwie monowarstwy.

Po osiadaniu komórek ostrożnie podnieś kolektor pionowo w górę, nie dotykając szkiełka. Upewnij się, że osady komórkowe znajdują się w obrębie obwodu kanału kolektora. Pod mikroskopem osiadłe komórki powinny lekko przylegać do monowarstwy, tak aby delikatne przesunięcie szkiełka nie spowodowało rozproszenia osadu.

Po potwierdzeniu, że komórki osiadły, przenieś preparat pod mikroskop odwrócony wyposażony w komorę z dwutlenkiem węgla i kontrolą wilgotności. Do obrazowania komórek w świetle przechodzącym oraz w wielu kanałach fluorescencyjnych użyj obiektywu 4x. Pozyskaj obrazy wybranego obszaru w kanałach światła przechodzącego i fluorescencyjnych, a następnie dodaj paski skali za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazów.

Po pozyskaniu wszystkich punktów czasowych przechowuj preparas w inkubatorze z nawilżaczem pomiędzy nimi. Przeciągnij i upuść pliki obrazów do programu do edycji grafiki i wybierz opcję dodawania warstwy, aby utworzyć plik obrazu z wieloma warstwami. Połącz obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencyjne w jedną warstwę.

Użyj oprogramowania do akwizycji, aby wykonać zdjęcia obszaru o wymiarach 8 mm na 8 mm. Oprogramowanie powinno być ustawione tak, aby automatycznie scalać przechwycone obrazy, korzystając z kanału, który jest najlepiej reprezentowany w całej studzience. Jeśli obrazowane są tylko kanały fluorescencyjne, powinien to być kanał przeznaczony do obrazowania komórek adherentnych.

Alternatywnie obrazy można połączyć za pomocą oprogramowania do edycji grafiki. Odbywa się to poprzez dopasowanie obszarów obrazów, które pozostają niezmienne między poszczególnymi zdjęciami, i nakładanie obrazów na siebie, aż do uzyskania pełnego obrazu. Połącz obrazy, korzystając z oprogramowania graficznego.

Wykorzystaj połączone obrazy do stworzenia map powierzchniowej intensywności fluorescencji za pomocą oprogramowania Image J, aby zwizualizować agregację lub rozprzestrzenianie się fluorescencyjnych limfocytów T w czasie. Ludzkie alloreaktywne cytotoksyczne limfocyty T (Allo CTL), transdukowane replikacyjnie kompetentnym wektorem retrowirusowym kodującym gen ekspresji szmaragdowo-zielonego białka fluorescencyjnego, umieszczono w centrum monowarstwy komórek glejaka. Po czterech godzinach wszystkie Allo CTL utworzyły widoczne agregaty do 24 godziny.

W przylegającej monowarstwie komórek pojawiły się puste obszary, co wskazywało na lizę komórek nowotworowych, a niektóre allo CTL przemieściły się poza krawędź czołową. Fluorescencyjnie znakowane mysie Allo CTL umieszczono w centrum monowarstwy fluorescencyjnie znakowanych komórek glejaka; po jednej godzinie Allo CTL ściśle powiązały się z komórkami glejaka, a po 48 godzinach Allo CTL przemieściły się z centrum monowarstwy. Mapy fluorescencji zostały wygenerowane z tych obrazów za pomocą oprogramowania ImageJ i wykazują znaczną migrację z centrum po 48 godzinach.

Aby utrzymać optymalne warunki hodowli, ważne jest codzienne zmienianie pożywki dla monowarstwy komórek nowotworowych. Ponadto, po opanowaniu techniki, sedymentacja komórek nieprzylegających powinna trwać około 20 minut po zastosowaniu tej procedury. Do odpowiedzi na pytania dotyczące szybkości migracji allo CTL przez monowarstwę lub czasu ich kontaktu z komórkami nowotworowymi podczas pełnienia funkcji cytotoksycznych można wykorzystać inne metody, takie jak śledzenie ścieżek komórkowych.

Niniejszy protokół pomoże badaczom z dziedziny immunoterapii genowej zgłębić migrację zmodyfikowanych genetycznie limfocytów T w kokulturze z komórkami nowotworowymi. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania komórek nieadherentnych i adherentnych do kokultury oraz sposobu wykorzystania kolektora do sedymentacji komórek w celu badania poziomej migracji radialnej komórek nieadherentnych nad monowarstwą komórek nowotworowych.