Name: Protokół tworzenia strumienia biofilmu w urządzeniu mikroprzepływowym z mikrofilarami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj tworzenie strumieni biofilmu w mikroprzepływowym urządzeniu z mikrofilarami przy użyciu Pseudomonas fluorescens. Ta metoda umożliwia obserwację dynamiki rozwoju biofilmu w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować profesorowi Howardowi Ceri z Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu w Calgary za dostarczenie szczepów bakteryjnych. A. Kumar dziękuje za wsparcie ze strony NSERC. T. Thundat dziękuje za wsparcie finansowe z programu Canada Excellence Research Chair (CERC). Autorzy dziękują również za pomoc Pani Zahrze Nikakhtari za pomoc w filmowaniu.

Wykonaj tutaj eksperymentalne protokoły w kolejności opisanej poniżej. Protokoły mikrowytwarzania do tworzenia platformy mikroprzepływowej omówiono w kroku 1. Krok 2 opisuje protokół hodowli bakteryjnej (Rysunek 2), a Krok 3 odnosi się do montażu zestawu eksperymentalnego (Rysunek 3). Wreszcie, rzeczywisty etap eksperymentalny jest opisany w kroku 4.
1. Procedura produkcji chipów
UWAGA: Odpowiednie procedury bezpieczeństwa muszą być przestrzegane dla procesów opisanych poniżej. Aby uzyskać szczegółowe informacje, skonsultuj się z instytucjonalnym inspektorem bezpieczeństwa.
<ol>
	<li>Zaprojektuj maskę za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. L-Edit). Konstrukcja kanału składa się z głównego mikrokanału o szerokości 625 μm. W centralnej części kanału znajduje się szereg mikrosłupków o średnicy 50 μm, oddalonych od siebie o 25 μm (patrz pliki uzupełniające).</li>
	<li>Wydrukuj ten wzór na szkle (szkło sodowo-wapniowe o wymiarach 5 x 5 cali), które ma grubość 0,09 cala i jest pokryte warstwą chromu (Cr) o grubości około 70 nm, przy użyciu maskowania w celu przygotowania maski fotograficznej. Użyj programisty AZ400K przez 1 minutę. Następnie wytrawiaj warstwę Cr za pomocą wytrawiacza Cr przez około 1 minutę. Za pomocą acetonu usuń rezystant i wyczyść go zimnym roztworem piranii (H2SO4 iH2O2w stosunku 3:1).</li>
	<li>Fotolitografia
	<ol>
		<li>Wyczyść standardową 4-calową płytkę krzemową chemicznie roztworem piranii przez 20 minut.</li>
		<li>Opłucz wafel wodą DI i wysusz go.</li>
		<li>Podgrzej wafel na gorącej płycie (200 °C przez 15 min).</li>
		<li>Pokryj wafel krzemowy fotorezystem. W tym przypadku dodatni fotorezystor AZ4620 został pokryty wirowo na płytce krzemowej z prędkością 2000 obr./min przez 25 sekund, aby uzyskać warstwę o grubości 12,5 μm.</li>
		<li>Usuń cały rozpuszczalnik przez delikatne pieczenie wafla na gorącej płycie, unosząc wafel przez 90 sekund na przepływie azotu w temperaturze 100 °C. Następnie trzymaj go w próżni w tej samej temperaturze przez 60 sekund.</li>
		<li>Umieść wafel w ciemnym pudełku na 24 godziny w celu odwodnienia.</li>
		<li>Wystaw wafel na działanie światła UV w celu przeniesienia zaprojektowanego wzoru na fotorezystor.</li>
		<li>Zanurz płytkę w roztworze do wywoływania fotorezystu (AZ400K) na 240 sekund. Następnie opłucz wafel alkoholem izopropylowym i wysusz go, umieszczając w strumieniu gazowego azotu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Proces ICP-DRIE (Inductively Coupled Plasma - Deep Reactive Ion Etching) Proces ICP-DRIE (Inductively Coupled Plasma - Deep Reactive Ion Etching)
	<ol>
		<li>Zastosuj wytrawianie DRIE. Wybierz odpowiednią głębokość wytrawiania zgodnie z ostateczną głębokością wymaganą dla urządzenia (50 μm w tym badaniu). Fotorezystor działa podczas tego procesu jako warstwa maskująca.</li>
		<li>Usuń pozostały fotorezystor acetonem i wyczyść wafel.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odlew PDMS (polidimetylosiloksan)
	<ol>
		<li>Użyj trichlorometylosilanu (TCMS) do silanizacji silikonowej formy głównej. Wlać 2 lub 3 krople trichlorometylosilanu do fiolki i umieścić ją w eksykatorze obok silikonowej formy głównej. Odczekaj 2-3 godziny, aby proces silanizacji się zakończył.</li>
		<li>W osobnym pojemniku wymieszaj bazę silikonową Sylgard 184 z utwardzaczem w stosunku wagowym 10:1, aby przygotować PDMS. Odgazowuje PDMS, poddając go warunkom próżni (około 2 godzin).</li>
		<li>Umieść silikonową formę główną w uchwycie. Następnie wlej PDMS na silikonową formę główną, aby utworzyć pieczęć PDMS. Upewnij się, że podczas tego procesu w PDMS nie tworzą się pęcherzyki.</li>
		<li>Utwardzać PDMS przez 2 godziny w temperaturze 80 °C.</li>
		<li>Odklej stempel PDMS od formy głównej. Następnie pokrój stempel PDMS na osobne mikrochipy. Na koniec użyj rdzenia tnącego, aby wywiercić otwory na wlot (wloty) i wylot (wyloty).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Klejenie PDMS do szkła
	<ol>
		<li>Wystaw szkiełko nakrywkowe i stempel PDMS na działanie plazmy tlenowej przez 30 sekund. Stempel PDMS należy przymocować do szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Aby uzyskać prawidłowe uszczelnienie między stemplem PDMS a szkiełkiem nakrywkowym, należy wyżarzyć urządzenie, wkładając je do pieca w temperaturze 70 °C na 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kultura bakteryjna
UWAGA: Odpowiednie protokoły bezpieczeństwa biologicznego muszą być przestrzegane dla Kroków 2-4. Aby uzyskać szczegółowe informacje, skonsultuj się z instytucjonalnym inspektorem bezpieczeństwa.
<ol>
	<li>Przygotuj płytki agarowe LB
	<ol>
		<li>Dodać 20 g proszku agarowego Luria-Bertani (LB) (Miller) i 500 ml ultraczystej wody do kolby o pojemności 1 l. Wymieszaj, aby rozpuścić proszek.</li>
		<li>Sterylizować w autoklawie przy ciśnieniu 15 psi, 121 °C przez 15 min.</li>
		<li>Pozostawić kolbę do ostygnięcia do temperatury 50-55 °C na ławce lub w łaźni wodnej w okapie bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Dodać antybiotyk tetracyklinę, aby osiągnąć końcowe stężenie 50 μg/ml. Dobrze wymieszać, mieszając.</li>
		<li>Wlej mieszaninę do talerzy. Napełnij każdy talerz do 1/2 - 2/3 wysokości.</li>
		<li>Podpal na krótko pęcherzyki powietrza, aby je przebić, jeśli się uformują. Zestalone pęcherzyki powietrza są trudne do rozprzestrzeniania się kultury bakteryjnej.</li>
		<li>Pozostaw talerze do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
		<li>Gdy ostygną, włóż talerze z powrotem do rękawa, zamknij torebkę, oznacz (antybiotyk i datę) i przechowuj w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Przykryj zapas talerzy folią aluminiową, ponieważ światło dezaktywuje wiele antybiotyków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie bulionu LB
	<ol>
		<li>Do kolby dodać 20 g bulionu Luria-Bertani (LB) w proszku (Miller) i 1 l ultraczystej wody. Wymieszaj, aby rozpuścić proszek.</li>
		<li>Sterylizować w autoklawie przy ciśnieniu 15 psi, 121 °C przez 15 min.</li>
		<li>Pozostawić kolbę do ostygnięcia do temperatury 50-55 °C na ławce lub w łaźni wodnej w okapie systemu bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Dodać antybiotyk tetracyklinę, aby osiągnąć końcowe stężenie 50 μg/ml. Dobrze wymieszać przez mieszanie.</li>
		<li>Po ostygnięciu umieść oznaczoną butelkę w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Przykryj butelkę folią aluminiową, ponieważ światło dezaktywuje wiele antybiotyków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla bakterii na płytce agarowej LB (w tym protokole wykorzystuje się Pseudomonas fluorescens)
	<ol>
		<li>Wyjąć bulion bakteryjny z zamrażarki (-80 °C) i umieścić go na lodzie.</li>
		<li>Umieść bulion bakteryjny o temperaturze -80 °C i płytkę agarową LB w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Nałóż szczep bakteryjny na płytkę agarową LB w zygzakowaty wzór. Przykryć płytkę agarową i inkubować ją w temperaturze 30 °C przez noc. Na koniec przechowuj talerz w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór bakteryjny (S1)
	<ol>
		<li>Wlać 50 ml pożywki bulionowej LB do kolby sterylizowanej w autoklawie. Wykonaj tę operację wewnątrz kaptura bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Przenieść pojedynczą kolonię bakteryjną z płytki agarowej LB do kolby. Czynność tę należy również wykonywać wewnątrz kaptura bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Umieścić kolbę w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 30 °C i prędkości 150 obr./min na odpowiedni czas (4 godziny).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować rozcieńczony roztwór bakteryjny (S2)
	<ol>
		<li>Wlej 5 ml bulionu LB do wysterylizowanej plastikowej tuby.</li>
		<li>Rozcieńczyć S1 mieszając z podłożem bulionowym LB. Następnie zwiruj roztwór. Rozcieńczyć roztwór, aby osiągnąć pożądaną gęstość optyczną (OD mierzona przy 600 nm = 0,1). 
		UWAGA: Eksperymenty z biofilmem zazwyczaj wykorzystują wartości OD w tym sąsiedztwie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotuj konfigurację eksperymentalną
<ol>
	<li>Za pomocą pęsety połącz elastyczne plastikowe rurki (0,20 cala średnicy) z wlotem (wlotami) i wylotem (wylotami) mikroczipa. Wloty i wyloty zostały wcześniej wywiercone w części PDMS mikrochipa (krok 1.5.5). W tym badaniu mikroczip składa się z dwóch wlotów i jednego wylotu.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę (strzykawki) roztworem bakteryjnym (roztworem S2) i usunąć wszystkie pęcherzyki ze strzykawki.</li>
	<li>Podłączyć końcówkę (końcówki) strzykawki (igłę 30 G 0,5 cala) do rurki wlotowej. Następnie podłącz rurkę wylotową (rury) wylotową do pojemnika na odpady.</li>
</ol>
4. Uruchom eksperyment
<ol>
	<li>Podłączyć strzykawkę (strzykawki) do końcówki (końcówek) strzykawki.</li>
	<li>Umieścić i zamocować strzykawkę (strzykawki) na pompie strzykawkowej. Następnie umieść mikroczip pod mikroskopem optycznym z soczewkami obiektywowymi o pożądanym powiększeniu (np. 40X). Przykryj mikroczip urządzeniem z komorą na żywe komórki, aby utrzymać stałą temperaturę środowiska do rozwoju bakterii (30 °C dla P. fluorescens).</li>
	<li>Ustaw pompę na żądany poziom natężenia przepływu (powiedzmy 10 μl/h) i rozpocznij pompowanie płynu.</li>
	<li>Po wprowadzeniu bakterii do komory inicjowane jest również tworzenie biofilmu. Tworzenie i dojrzewanie biofilmu zwykle trwa kilka godzin, a nawet dni. Obserwuj i rób zdjęcia wzrostu biofilmu przez mikroskop.</li>
</ol>

<ol><li>Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+web+of+streamers%3A+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).</li>
<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms%3A+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+together+now%3A+Integrating+biofilm+research+across+disciplines%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">All together now: Integrating biofilm research across disciplines.</a> MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).</li>
<li>Yazdi, S., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+aggregation+and+biofilm+formation+in+a+vortical+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow.</a> Biomicrofluidics. 6, 044114(2012).</li>
<li>Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+around+corners+triggers+the+formation+of+biofilm+streamers%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers.</a> J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).</li>
<li>Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+streamers+cause+catastrophic+disruption+of+flow+with+consequences+for+environmental+and+medical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).</li>
<li>Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bacterial+streamers+during+filtration+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems.</a> Biofouling. 28, 551-562 (2012).</li>
<li>Taherzadeh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Study+of+the+Drag+and+Oscillatory+Movement+of+Biofilm+Streamers+in+Fast+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows.</a> Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).</li>
<li>Vrouwenvelder, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+flow+regime+on+pressure+drop+increase+and+biomass+accumulation+and+morphology+in+membrane+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems.</a> Water Res. 44, 689-702 (2010).</li>
<li>Mitchell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+enhanced+geologic+sequestration+of+supercritical+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Greenhouse+Gas+Control%22%5BJournal%5D)">Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2.</a> International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).</li>
<li>Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+biological+clogging+in+unsaturated+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Contam+Hydrol%22%5BJournal%5D)">Modeling of biological clogging in unsaturated porous media.</a> J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+confinement+features+can+affect+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Microscale confinement features can affect biofilm formation.</a> Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).</li>
<li>Neethirajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeethirajan%2C+S+%22Encylopedia+of+Nanotechnology%22">Encylopedia of Nanotechnology</a>. Bhushan, B., et al. , Springer. (2012).</li>
<li>Barathi, S., Vasudevan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+petroleum+hydrocarbons+by+Pseudomonas+fluorescens+isolated+from+a+petroleum-contaminated+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Int%22%5BJournal%5D)">Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil.</a> Environ Int. 26, 413-416 (2001).</li>
<li>Das, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+post-formation+dynamics+of+bacterial+biofilm+streamers+as+highly+viscous+liquid+jets%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv+preprint+arXiv%3A1312.6056%22%5BJournal%5D)">Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets.</a> arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).</li>
<li>Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commonality+of+elastic+relaxation+times+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Commonality of elastic relaxation times in biofilms.</a> Phys Rev Lett. 93, (2004).</li>
<li>Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-chip+methodologies+for+the+study+of+transport+in+porous+media%3A+energy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications.</a> Lab Chip. 8, 689-693 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pokazaliśmy proste urządzenie mikroprzepływowe, które naśladuje porowate media do badania rozwoju biofilmu w złożonych siedliskach. Istnieje kilka krytycznych kroków, które decydują o wyniku eksperymentów. Obejmują one geometrię urządzenia. Chociaż geometria słupka może się różnić, konieczna jest odpowiednia przestrzeń porowa, aby mogły się formować serpentyny. Co więcej, Valiei i wsp. 1 wykazały, że powstawanie wstrześni zachodzi tylko w pewnym zakresie natężenia przepływu. Przy natężeniach przepływu...

Ostatnio zademonstrowaliśmy dynamikę tworzenia biofilmu bakteryjnego w urządzeniu mikroprzepływowym, które naśladuje porowate media1. Biofilmy bakteryjne są zasadniczo koloniami bakterii zagregowanych powierzchniowo, które są otoczone zewnątrzkomórkowymi substancjami polimerowymi (EPS)2-4. Te cienkie warstwy bakterii mogą tworzyć się w prawie każdej możliwej niszy, od gładkich powierzchni po znacznie bardziej złożone siedlisko porowatych mediów. Valiei i wsp. W ramach projektu 1 wykorzystano urządzenie mikroprzepływowe z układem mikrofilarów do symulacji struktury mediów porowatych i zbadano tworzenie biofilmu w tym urządzeniu w funkcji natężenia przepływu płynu. Odkryli, że w pewnym reżimie przepływu między różnymi filarami zaczęły pojawiać się nitkowate biofilmy zwane serpentynami. Serpentyny mogą być przywiązane na jednym lub obu końcach do twardych powierzchni, ale reszta konstrukcji jest zawieszona w cieczy. Tworzenie się serpentyny zwykle rozpoczyna się po utworzeniu początkowej warstwy biofilmu, a jej tworzenie może dyktować długoterminową ewolucję biofilmu w tak złożonych siedliskach. Ostatnio kilku badaczy badało dynamikę powstawania streamerów. Yazdi i wsp. 5 pokazało, że serpentyny mogą tworzyć się w przepływach wirowych pochodzących z oscylującego bąbla. W innym eksperymencie Rusconi i wsp. 6 badano wpływ krzywizny kanału i geometrii kanału na powstawanie serpentyny. Odkryli, że wstęgi mogą tworzyć się w zakrzywionych odcinkach mikrokanałów, a morfologia streamerów jest związana z ruchliwością. Ostatnie badania wykazały, że streamery mogą mieć szerokie reperkusje w różnych naturalnych i sztucznych scenariuszach, ponieważ mogą działać jako prekursory do tworzenia dojrzałych struktur w porowatych granicach, prowadzić do szybkiej i katastrofalnej proliferacji biofilmu w systemach biomedycznych, a także powodować znaczne interakcje przepływ-struktura itp.
Serpentyny biofilmu często tworzą się w skomplikowanych siedliskach, takich jak porowate media. Zrozumienie wzrostu biofilmu w środowisku porowatym jest istotne dla kilku procesów środowiskowych i przemysłowych, takich jak biologiczne oczyszczanie ścieków10, utrzymanie integralności odwiertu w sytuacjach takich jak wychwytywanie CO2 11 i zatykanie porów w glebie12. Obserwacja tworzenia się biofilmu w tak złożonych siedliskach może często być trudna ze względu na nieprzezroczystość porowatych mediów. W takich sytuacjach porowate platformy mediów oparte na mikroprzepływach mogą okazać się niezwykle korzystne, ponieważ umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym i in situ. Kolejną zaletą mikrofluidyki jest możliwość zbudowania wielu bioreaktorów na jednej platformie biomikroprzepływowej i jednoczesnego umożliwienia monitorowania online i/lub włączenia czujników. Elastyczność w realizacji wielu eksperymentów laboratoryjnych w jednym urządzeniu oraz możliwość gromadzenia istotnych istotnych danych do dokładnej analizy statystycznej jest ważną zaletą systemów mikroprzepływowych13,14.
W kontekście powyższej dyskusji, zrozumienie dynamiki powstawania streamerów w środowisku porowatych mediów byłoby korzystne dla kilku zastosowań. W tym badaniu opracowujemy protokół badania powstawania streamerów w urządzeniu, które naśladuje porowate media. Opisano wytwarzanie platformy mikroprzepływowej, niezbędne etapy hodowli komórkowej i eksperymenty. W naszych doświadczeniach wykorzystano dziki szczep bakterii Pseudomonas fluorescens. P. fluorescens, występujący naturalnie w glebie, odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu ekologii gleby15. Zastosowany szczep bakteryjny został genetycznie zmodyfikowany w celu konstytutywnej ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP).

<table><tbody><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher</td><td>BP1425-500</td><td>zawiesić 40 g w 1 l oczyszczonej wody</td></tr><tr><td>bulion LB</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td>zawiesić 20 g w 1 l oczyszczonej wody</td></tr><tr><td>Kaptur bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Microzone corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td>sterylna 100 mm x 15 mm polistyrenowa szalka Petriego</td></tr><tr><td>Wytrząsarka do inkubatora</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Excella E24 seria wytrząsarek</td></tr><tr><td>50 ml sterylizowana probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>Polipropylenowa baza wolna od RNaz / DNaz</td></tr><tr><td></td><td>MP Biomedicals</td><td>103012</td><td>50 &#956; g/ml</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 silikon</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>68037-59-2</td><td>Elastomer Baza i utwardzacz</td></tr><tr><td>Dodatni fotorezystuł (AZ4620)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa rurka</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protokół tworzenia strumienia biofilmu w urządzeniu mikroprzepływowym z mikrofilarami

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Kilka gatunków bakterii posiada zdolność przyczepiania się do powierzchni i kolonizowania ich w postaci cienkich warstw zwanych biofilmami. Biofilmy, które rosną w porowatych podłożach, są istotne dla wielu procesów przemysłowych i środowiskowych, takich jak oczyszczanie ścieków i sekwestracja CO2 . Użyliśmy Pseudomonas fluorescens, Gram-ujemnej bakterii tlenowej, do zbadania tworzenia biofilmu w urządzeniu mikroprzepływowym, które naśladuje porowate media. Urządzenie mikroprzepływowe składa się z szeregu mikrosłupków, które zostały wykonane przy użyciu miękkiej litografii. Następnie zbadano tworzenie się biofilmu w tych urządzeniach z przepływem i wykazaliśmy tworzenie się nitkowatych biofilmów zwanych serpentynami w naszym urządzeniu. Szczegółowe protokoły wytwarzania i montażu urządzenia mikroprzepływowego znajdują się tutaj wraz z protokołami hodowli bakteryjnych. Przedstawiono również szczegółowe procedury eksperymentowania z urządzeniem mikroprzepływowym wraz z reprezentatywnymi wynikami.

Z wykorzystaniem wspomnianego powyżej protokołu mikrowytwarzania skonstruowano mikrofluidyczne urządzenie oparte na PDMS. Rysunek 1 przedstawia obrazy z rozpylnego mikroskopu elektronowego (SEM) urządzenia PDMS. Rysunek 1a pokazuje sekcję wlotową urządzenia. Utworzono wlot w kształcie widelca, aby wyrównać ciśnienie w całym urządzeniu. Dalsze obrazowanie SEM wykazało również, że ścianki filarów są niemal pionowe (Rysunek 1b). Hodowlę bakterii (Rysunek 2)...

Omawiane są protokoły badania tworzenia się biofilmu w urządzeniu mikroprzepływowym, które naśladuje porowate media. Urządzenie mikroprzepływowe składa się z szeregu mikrofilarów i badane jest tworzenie biofilmu przez Pseudomonas fluorescens w tym urządzeniu.

Protokół tworzenia strumienia biofilmu w urządzeniu mikroprzepływowym z mikrofilarami

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykazanie powstawania bakteryjnych pasm (streamers) w urządzeniu mikroprzepływowym z mikrosłupkami. Cel ten osiąga się poprzez najpierw wykonanie chipa mikroprzepływowego. Drugim krokiem procedury jest hodowla badanych bakterii, w tym przypadku Pseudomonas fluorescence.Ostatnie etapy polegają na złożeniu zestawu doświadczalnego, wstrzyknięciu bakterii do chipa mikroprzepływowego i zebraniu danych. W rezultacie można uzyskać obraz ewolucji czasowej streamerów za pomocą obrazowania z mikroskopii fluorescencyjnej. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ poszczególne kroki są trudne do opanowania.Ze względu na interdyscyplinarny charakter eksperymentu, procedura ta wymaga zastosowania wafli krzemowych poddanych głębokiemu trawieniu jonowym. Fotorezyst z wafli powinien zostać zmyty. Należy rozpocząć od przygotowania formy matki.Do fiolki należy dodać dwie lub trzy krople trichloroetylenu, a następnie umieścić ją w eksykatorku obok formy, ustawionej stroną projektową do góry. Po dwóch lub trzech godzinach forma zostanie zasilikonowana. W czasie silikonizacji należy przygotować mieszaninę PDMS, łącząc bazę silikonową 1 8 4 z utwardzaczem w stosunku 10:1.Następnie odgazuj PDMS w próżni przez około dwie godziny. Teraz przenieś zylikonyzowany wafel do uchwytu i wlej na niego PDMS, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza. Pozostaw PDMS do utwardzenia na waflu w temperaturze 80 °C przez dwie godziny.W ten sposób wytwarza się stempel z A-P-D-M-S z przygotowanej formy krzemowej. Po zakończeniu procesu utwardzania odklejamy stempel PDMS przy pomocy nożyka. Następnie za pomocą nożyka wycinamy ze stempla chip mikroprzepływowy.Następnie, używając wiertła koronnego, wywierć otwory w miejscach wlotu i wylotu na stemplu. Kolejnym krokiem jest połączenie stempla ze szkłem. Poddaj 24 milimetrową lamellkę oraz stempel PDMS działaniu plazmy tlenowej przez 30 sekund.Po ekspozycji przymocuj szkiełko nakrywkę do dolnej strony stempla PDMS, aby utworzyła się wiązana. Umieść cały zestaw w piekarniku w temperaturze 70 °C na 10 minut. Aby zakończyć proces zgodnie z tym protokołem, przygotuj płytki LB sporządzone z wody ultrapurej z dodatkiem tetracykliny w stężeniu 50 µg/mL, dodanej w temperaturze od 50 do 55 °C.Podczas wlewania szalek pęcherzyki powietrza można usunąć, przejeżdżając nad nimi płomieniem. Schłodzone i zastygnięte szalki należy opatrzyć datą i przechowywać w temperaturze 4°C, owijając je folią aluminiową. Należy również przygotować bulion LB przy użyciu wody ultrapurej, z dodatkiem tetracykliny w stężeniu 50 µg/mL.Przechowywać bulion w temperaturze 4 °C, owinięty folią. Następnie, z zapasów kultur Pseudomonas fluorescence przechowywanych w temperaturze -80 °C, wykonać posiew na płytki LB, prowadząc smugowanie w kształcie zygzaka, a następnie inkubować płytki przez noc w temperaturze 30 °C w ciemności. Następnego dnia wyciąć pojedynczą kolonię z płytki i zaszczepić ją do kolby ze świeżo przygotowanym podłożem S1, inkubując przez noc w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 150 RPM.Zmierz gęstość optyczną hodowli po inkubacji. Następnie przygotuj roztwór S dwa. Do plastikowej probówki dodaj pięć mililitrów LB, a następnie dodaj odpowiednią ilość roztworu S jeden, aby uzyskać OD przy 600 nanometrach równą 0,1, co jest wartością typową dla eksperymentu z biofilmem.W pierwszej kolejności należy przygotować układ eksperymentalny za pomocą pęsety. Do wlotów i wylotów przygotowanego chipa podłączyć plastikowe rurki o średnicy wewnętrznej 0,20 cala. Rurki muszą być elastyczne i wystarczająco długie; w tym przypadku mają one około 20 cali.Następnie napełnij strzykawki roztworem S two. Przymocuj tępokonieczne igły o rozmiarze 30 G i usuń pęcherzyki powietrza. Zapobieganie przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do kanału jest krytycznym etapem, zwłaszcza ze względu na czas trwania eksperymentu.Pęcherzyki powietrza mogą uszkodzić delikatne struktury tworzone przez bakterie. Następnie należy podłączyć strzykawki do rurek wlotowych, a rurki wylotowe do pojemników na odpady. Teraz należy umieścić strzykawki w pompie strzykawkowej i ustawić pompkę na pożądaną prędkość przepływu, na przykład 8 µL/h, korzystając z mikroskopu wyposażonego w komorę do hodowli komórkowej ustawioną na temperaturę inkubacji.Do obserwacji chipa mikroprzepływowego można użyć obiektywu 40x. Następnie uruchom pompę. W momencie wprowadzenia bakterii do komory rozpoczyna się również proces tworzenia biofilmu.Biofilm będzie się formować i dojrzewać przez godziny lub dni; należy wykonywać zdjęcia, aby monitorować postępy tego procesu. Do obrazowania wykorzystano chip mikroprzepływowy wykonany metodą SEMA. Wlot w kształcie widełek został zaprojektowany w celu wyrównania ciśnienia hydraulicznego w obrębie urządzenia.Można również zauważyć, że ściany filarów są niemal pionowe. Aby zbadać tworzenie się biofilmu, do urządzenia wstrzyknięto barwnik fluorescencyjny z prędkością 8 µL/h. Tworzenie biofilmu rozpoczęło się po kilku minutach infuzji rozcieńczonej kultury bakterii.Jednak po kilku godzinach w pobliżu części środkowej zaobserwowano pojawienie się struktur nitkowatych rozciągających się między mikropilarami. Przerywana elipsa wyznacza formujący się streamer; streamery tworzyły się, będąc przymocowane jednym końcem do obszaru bieguna jednego z mikropilarów. Streamery były widoczne również wzdłuż przekątnej między dwoma mikropilarami.Grubość strumieni zwiększała się w czasie w wyniku podziałów komórkowych oraz wbudowywania bakterii planktonicznych. Namnażały się one również z czasem, a zajmowana przez strumienie duża objętość w urządzeniu doprowadziła do powstania dojrzałego biofilmu, który mógł spowodować zatkanie urządzenia. Mechaniczna symulacja przepływu przez urządzenie wykazuje, że strumienie początkowo orientują się wzdłuż linii prądu cieczy.Ponadto, w początkowej fazie strumienie biofilmowe powstają w miejscach o najwyższej prędkości przepływu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak tworzą się i ewoluują strumienie biofilmowe w środowisku mikroprzepływowym. Pamiętaj, że praca z bakteriami może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak protokoły bezpieczeństwa biologicznego.

protocol-for-biofilm-streamer-formation-microfluidic-device-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Protokół tworzenia streamera biofilmowego na urządzeniu mikrofluidycznym z mikrofilarami

Opisujemy protokół wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych, które umożliwiają wychwytywanie i hodowlę komórek. W tym podejściu wykorzystuje się ustrukturyzowane mikrostruktury, takie jak rowki wewnątrz kanałów mikrofluidycznych, aby stworzyć obszary o niskim naprężeniu ścinającym, w których komórki mogą zostać unieruchomione.

Urządzenie mikrofluidyczne z wzorami rowków do badania zachowania komórek

Niniejszy protokół opisuje mikrofluidyczny model kokultury do jednoczesnej i zlokalizowanej hodowli komórek nabłonkowych oraz bakterii. Model ten może być wykorzystany do badania roli różnych rozpuszczalnych sygnałów molekularnych w patogenezie, a także do oceny skuteczności potencjalnych probiotycznych szczepów bakteryjnych.

Mikrofluidyczna kokultura komórek nabłonkowych i bakterii do badania oddziaływań zapśredniczonych przez sygnały rozpuszczalne

Źródło: Kurz, D. L. i in. Platforma mikrofluidyczna do badania biozatkania w porowatych ośrodkach. J. Vis. Exp. (2022)Film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do badania powstawania biofilmu. Do mikrokanału wprowadzana jest zawiesina bakteryjna, po której następuje inkubacja, umożliwiająca rozwój biofilmu. Następnie wznawia się przepływ, a monitorowanie ciśnienia wraz z obrazowaniem wykorzystuje się do wykrywania powstawania biofilmu i zatkania porów w czasie.

Urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania w czasie rzeczywistym i śledzenia ciśnienia podczas tworzenia biofilmu

Przedstawiono procedurę tworzenia i obrazowania mostków kapilarnych w geometrii szczelinowo-porowej. Tworzenie mostków kapilarnych polega na tworzeniu filarów w celu zapewnienia kierunkowej niejednorodności fizycznej i chemicznej w celu przypięcia płynu.  Mostki kapilarne są formowane i manipulowane za pomocą mikroetapów i wizualizowane za pomocą kamery CCD.

Wykonanie i wizualizacja mostków kapilarnych w geometrii porów szczelinowych

Celem tego artykułu jest opisanie użycia systemu mikroprzepływowego do tworzenia wielogatunkowych biofilmów, które zawierają gatunki typowo identyfikowane w ludzkiej naddziąsłowej płytce nazębnej. Podkreślono metody opisu architektury biofilmu, żywotności biofilmu oraz podejścia do zbierania biofilmu do analiz zależnych od kultury lub niezależnych od kultury.

Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

Biofilmy mają złożone interakcje z otaczającym je środowiskiem. Aby kompleksowo zbadać interakcje biofilm - środowisko, przedstawiamy tutaj szereg metod tworzenia heterogenicznego środowiska chemicznego do rozwoju biofilmu, ilościowego określania lokalnej prędkości przepływu oraz analizy transportu masowego w koloniach biofilmu i wokół nich.

Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk

Ten protokół opisuje użycie konfigurowalnego zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego do wizualizacji tworzenia biofilmu u Candida albicans w warunkach fizjologicznych gospodarza.

Wizualizacja tworzenia się biofilmu u Candida albicans za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego

Krzywe przełomu (BTC) są skutecznymi narzędziami do badania transportu bakterii w porowatych mediach. Tutaj przedstawiamy narzędzia oparte na urządzeniach fluidycznych w połączeniu z mikroskopią i zliczaniem metodą cytometrii przepływowej w celu uzyskania BTC.

Połączenie urządzeń fluidycznych z mikroskopią i cytometrią przepływową w celu badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych w skalach przestrzennych

Prezentujemy technologię, która wykorzystuje wspomagany kapilarność montaż w platformie mikroprzepływowej do modelowania mikroobiektów zawieszonych w cieczy, takich jak bakterie i koloidy, w określone tablice na podłożu z polidimetylosiloksanu.

Modelowanie mikroorganizmów i mikrocząstek poprzez sekwencyjny montaż wspomagany kapilarnością

Obecny protokół opisuje platformę mikroprzepływową do badania rozwoju biofilmu w porowatych ośrodkach quasi-2D poprzez połączenie obrazowania mikroskopowego o wysokiej rozdzielczości z jednoczesnymi pomiarami różnicy ciśnień. Platforma określa ilościowo wpływ wielkości porów i natężenia przepływu płynu w porowatych ośrodkach na biozatkanie.

Platforma mikroprzepływowa do badania biozatykania w pożywkach porowatych

Poznaj tworzenie strumieni biofilmu w mikroprzepływowym urządzeniu z mikrofilarami przy użyciu Pseudomonas fluorescens. Ta metoda umożliwia obserwację dynamiki rozwoju biofilmu w czasie rzeczywistym.

Protokół tworzenia strumienia biofilmu w urządzeniu mikroprzepływowym z mikrofilarami

Przeglądaj więcej filmów