Protokół tworzenia strumienia biofilmu w urządzeniu mikroprzepływowym z mikrofilarami

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie powstawania serpentyn bakteryjnych w urządzeniu mikroprzepływowym z mikrofilarami. Osiąga się to poprzez pierwsze wyprodukowanie chipa mikroprzepływowego. Drugim etapem zabiegu jest wyhodowanie badanych bakterii, w tym przypadku fluorescencja pseudomonas.

Ostatnie kroki to złożenie zestawu eksperymentalnego, wstrzyknięcie bakterii do chipa mikroprzepływowego i zebranie danych. Ostatecznie wyniki mogą pokazać ewolucję serpentyny w czasie za pomocą obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej grypy. Wizualna demonstracja tego metalu ma kluczowe znaczenie, ponieważ różne kroki są trudne do nauczenia.

Ze względu na interdyscyplinarny charakter eksperymentu, procedura ta wymaga wafli krzemowych z głębokim reaktywnym trawieniem jonowym. Fotorezystor na waflach należy zmyć. Zacznij od wyciszenia formy głównej.

Dodaj dwie lub trzy krople trichloroetylenu do fiolki i umieść ją w osuszaczu wraz z wzorem formy do góry obok niego. W ciągu dwóch lub trzech godzin forma zostanie odizolowana. Podczas siloizacji przygotuj silikonową bazę cygara PDMS mix 1 8 4 ze środkiem utwardzającym w proporcji 10 do jednego.

Następnie odgazowuje PDMS pod próżnią przez około dwie godziny. Teraz przenieś silosową płytkę do uchwytu i zalej ją PDMS, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki. Pozwól PDMS utwardzić się na płytce w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

To wytwarza stempel A-P-D-M-S z formy silikonowej o rozmiarze. Po zakończeniu utwardzania odklej stempel PDMS za pomocą noża. Następnie wytnij stempel na chip mikroprzepływowy za pomocą noża.

Teraz za pomocą rdzenia tnącego wywierć otwory na wlocie i wytrzyj pozycje na stemplu. Kolejnym krokiem jest przyklejenie stempla do szkła. Wystaw 24-milimetrowe szkiełko nakrywkowe i stempel PDMS na działanie plazmy tlenowej przez 30 sekund.

Po naświetleniu przymocuj szkiełko nakrywkowe do dolnej strony stempla PDMS, a utworzy się wiązanie. Umieść zestaw w piekarniku o temperaturze 70 stopni Celsjusza na 10 minut. Aby zakończyć proces dla tego protokołu, przygotuj płytki LB wykonane z ultraczystej wody i dozowane 50 mikrogramów na mililitr tetracykliny dodanej w temperaturze od 50 do 55 stopni Celsjusza.

Podczas nalewania talerzy bąbelki można pęknąć, paląc je. Schłodzone i zestalone płytki należy datować i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza w folii aluminiowej. Przygotowałem również bulion LB wykonany z ultra czystej wody i dozowany z 50 mikrogramami na mililitr tetracykliny.

Przechowuj bulion w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a także zawiń w folię. Teraz hodowle fluorescencji Pseudomonas przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na płytkach LB, ułóż płytki w zygzakowaty wzór i inkubuj je przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza w ciemności. Następnego dnia wybierz kolonię z talerza i zaszczep kolbę świeżo przygotowanego S one inkubowanego przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z 150 obr./min wstrząsania.

Zmierzyć gęstość optyczną kultury po inkubacji. Następnie wykonaj roztwór S dwa. Dodaj pięć mililitrów LB do plastikowej probówki, a następnie dodaj wystarczającą ilość roztworu S one do uzyskania OD przy 600 nanometrach 0,1, co jest typowe dla eksperymentu z biofilmem.

Najpierw przeprowadź eksperyment za pomocą pęsety Podłącz plastikowe rurki o średnicy wewnętrznej 0,20 cala do wlotów i wylotów przygotowanego chipa. Rurki muszą być elastyczne i wystarczająco długie. Tutaj mają około 20 cali.

Następnie napełnić strzykawki roztworem S dwa. Przymocuj igły o rozmiarze 30 i usuń bąbelki. Zapobieganie przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do kanału jest krytycznym krokiem, zwłaszcza ze względu na czas trwania eksperymentu na linii.

Bąbelki mogą uszkadzać miękkie struktury utworzone przez bakterie. Następnie podłączyć strzykawki do rurek wlotowych i podłączyć rurki wylotowe do pojemników na odpady. Teraz umieść strzykawki w pompie strzykawkowej i ustaw pompę na żądane natężenie przepływu, takie jak osiem mikrolitrów na godzinę pod mikroskopem wyposażonym w komorę komórkową ustawioną na temperaturę inkubacji.

Użyj obiektywu 40x, aby zobaczyć chip mikroprzepływowy. Teraz uruchom pompę. Po wprowadzeniu bakterii do komory inicjowane jest również tworzenie biofilmu.

Biofilm będzie się tworzył i dojrzewał przez godziny, dni, robił zdjęcia, aby śledzić jego postęp. Za pomocą SEMA wykonano obraz układu mikroprzepływowego. Wejście przypominające widelec jest tworzone w celu wyrównania ciśnienia w poprzek urządzenia.

Widać też, że ściany filarów są prawie pionowe. W celu zbadania tworzenia się biofilmu fluorescencji wstrzyknięto do urządzenia w ilości ośmiu mikrolitrów na godzinę. Tworzenie biofilmu rozpoczęło się po kilku minutach infuzji rozcieńczonej kultury bakteryjnej.

Jednak po kilku godzinach w pobliżu części środkowej zaobserwowano pojawienie się nitkowatych struktur rozciągających się między mikrofilarami. Przerywana elipsa wyznacza tworzące się serpentyny uformowane na uwięzi na jednym końcu do obszaru biegunowego jednego z mikrofilarów. Serpentyny były również widziane wzdłuż przekątnej między dwoma mikrofilarami.

Grubość serpentyn zwiększała się z czasem w wyniku podziału komórek, a także inkorporacji bakterii planktonowych. Rozprzestrzeniały się również wraz ze strumieniami czasu zajmującymi dużą objętość w urządzeniu, co prowadziło do tworzenia się dojrzałego biofilmu, który mógł zatkać urządzenie. Mechaniczna symulacja przepływu przez urządzenie pokazuje, że serpentyny początkowo orientują się wzdłuż płynnych linii strumienia.

Co więcej, w początkowej fazie wstęgi powstają w miejscach o największej prędkości przepływu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób powstają i ewoluują strumienie biofilmu w środowisku mikroprzepływowym. Nie zapominaj, że praca z bakteriami może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak protokoły bezpieczeństwa biologicznego.