Name: Eksplantaty keratocytów danio pręgowanego w celu zbadania zbiorowej migracji komórek i reepitelializacji w gojeniu się ran skórnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj metodę eksplantatów keratocytów Danio rerio do badania zbiorowej migracji komórek i gojenia ran naskórkowych. Ta technika pozwala obserwować dynamikę migracji oraz zmiany morfologii komórkowej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze z Midwestern University College of Health Sciences Research Facilitation Grant przyznany EEH oraz Midwestern University Office of Research and Sponsored Programs Intramural Grant przyznany KJL.

Ten protokół jest zgodny z Zasadami Dobrostanu Zwierząt AVMA dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Środkowo-Zachodnim.
1. Przygotowanie znieczulenia, sprzętu i mediów
<ol>
	<li>Odchloruj około 1,5 l wody z kranu za pomocą dostępnego w handlu środka odchlorowującego (dostępnego w sklepach zoologicznych) lub odstawiając wodę na 24 godziny. Zaopatrz się w trzy zlewki o pojemności 1 l i napełnij każdą z nich 500 ml odchlorowanej wody. Oznacz jedną do trzymania ryb przed jakimkolwiek zabiegiem, a drugą do rekonwalescencji. Do trzeciej zlewki dodać 100 μg/ml metanosulfonianu trikainy; Staje się to zlewką, w której ryby zostaną znieczulone.</li>
	<li>Napełnij płytką tacę lodem, podgrzej pożywkę hodowlaną (RPMI 1640, 10% FBS (płodowa surowica bydlęca), 50 μg/ml gentamycyny, 100 μg/ml kanamycyny, 25 mM HEPES) do RT i zbierz czystą pęsetę jubilerską. Wyczyść pęsetę, zanurzając końcówki w 70% etanolu i przepuść przez palnik Bunsena, pozwalając etanolowi się spalić.</li>
	<li>Zdecyduj, czy zabieg zostanie wykonany bez powiększenia, przy użyciu komercyjnego, stołowego podświetlanego szkła powiększającego o powiększeniu 2 - 10x, czy mikroskopu preparacyjnego (całkowicie w zależności od osobistych preferencji).</li>
</ol>
2. Zakładanie kultur eksplantatów
<ol>
	<li>Złap żądaną liczbę ryb i umieść w zlewce do przechowywania. Przenieś pojedynczą rybę do zlewki anestezjologicznej; Najlepiej jest znieczulać ryby indywidualnie.</li>
	<li>Monitoruj efekty znieczulenia, obserwując pływanie i ruch skrzeli ryb. W miarę postępu znieczulenia ruch skrzeli zwalnia, a ryby będą pływać nieregularnie i często do góry nogami; Rozważ znieczulenie ryb, gdy tylko ustanie ruch skrzeli. Nie pozostawiaj ryb na dłuższy czas w kąpieli anestezjologicznej, ponieważ może to spowodować śmierć ryby.</li>
	<li>Wyjmij rybę ze zlewki znieczulającej i przenieś do lodu, układając rybę poziomo z ogonem skierowanym w stronę ręki trzymającej pęsetę. Jeśli masz doświadczenie w tej technice i jeśli do przygotowania eksplantatów ma być użytych wiele ryb, rozważ umieszczenie następnej ryby w zlewce anestezjologicznej w tym czasie.</li>
	<li>Aby usunąć łuski, ustaw pęsetę równolegle do ryby, z końcówką na krawędzi łuski. Lekko wciśnij płaską stronę pęsety w bok ryby, aby łuska uniosła się z ciała ryby. Chwyć łuskę pęsetą, zerwij i umieść (bez odwrócenia) w naczyniu do hodowli tkankowej. Powtórz procedurę, usuwając maksymalnie 12 łusek od dużego dorosłego osobnika (po 6 z każdej strony), unikając okolicy skrzeli, linii bocznej i płetw.</li>
	<li>Umieść rybę w zlewce regeneracyjnej i monitoruj, aby upewnić się, że dochodzi do siebie po znieczuleniu. W tym czasie ryby można przenieść z powrotem do indywidualnego zbiornika. Pozwól rybie dojść do siebie przez co najmniej 21 dni, aby umożliwić pełną regenerację łusek.</li>
	<li>W zależności od projektu eksperymentalnego, umieścić do 20 łusek na plastikowym naczyniu poddanym kulturze tkankowej o średnicy 35 mm lub 4 - 6 łusek na naczynie ze szklanym dnem. Pozwól, aby łuski przylegały do naczynia przed delikatnym dodaniem podłoża, aby nie odrywały się od naczynia. 
	UWAGA: Wraz z doświadczeniem wiele ryb można przetworzyć przed dodaniem pożywki do pierwszego dania.</li>
	<li>Dodać 1,2 ml kompletnej pożywki (patrz ppkt 1.2 powyżej) do każdej płytki o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Zaleca się inkubację kultur eksplantatów w temperaturze 28 °C w 5% CO2 przez pożądany okres czasu, z dodatkowym traktowaniem lub bez. Alternatywnie, inkubować kultury na podgrzewanym stoliku mikroskopowym lub w komorze do hodowli żywych komórek w celu mikroskopii wideo.</li>
</ol>
3. Mikroskopia Brightfield i Wideo
<ol>
	<li>Umieść naczynia zawierające arkusze komórek na stoliku mikroskopu i początkowo ustaw ostrość za pomocą soczewki obiektywowej 4X. 
	UWAGA: W zależności od eksperymentu można zastosować większe powiększenia. Oznaczenie położenia każdego arkusza komórek i/lub orientacji naczynia na stole ułatwi robienie zdjęć w czasie z arkuszami w mniej więcej tej samej orientacji.</li>
	<li>Wyjmij szalki z inkubatora i sfotografuj w różnych punktach czasowych, zgodnie z każdym protokołem eksperymentalnym, i umieść z powrotem w inkubatorze, jeśli potrzebne są tylko nieruchome obrazy w czasie eksperymentu.</li>
	<li>Podczas wykonywania wideomikroskopii należy zwrócić uwagę na następujące kwestie:
	<ol>
		<li>Umieść arkusz skali/wyłaniającej się komórki w polu view w taki sposób, aby migrujący arkusz komórek pozostał w polu widzenia przez cały czas trwania filmu. 
		UWAGA: Może to wymagać pewnego doświadczenia w obserwowaniu, jak komórki migrują spod spodu wagi. W przypadku krótkich filmów jest to mniejszy problem niż w przypadku dłuższych filmów.</li>
		<li>W przypadku krótszych ram czasowych inkubuj w RT. W przypadku dłuższych ram czasowych (18+ godzin) należy użyć podgrzewanego etapu lub komory inkubacyjnej, aby utrzymać temperaturę, równowagę pH i zminimalizować parowanie pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Utrwalenie do mikroskopii immunofluorescencyjnej
<ol>
	<li>Przygotować i wstępnie ogrzać wszystkie roztwory do temperatury 28 °C. Aby wyświetlić keratocyty pod wpływem fluorescencji, hoduj kultury eksplantatów, jak opisano powyżej, używając naczyń do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm ze szklanym dnem. Alternatywnie można zastosować szkiełka ze szklaną komorą.</li>
	<li>Dodaj 0,8 ml 4% paraformaldehydu w 1,1x PBS do każdego naczynia. Nie usuwaj najpierw pożywki hodowlanej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie odsysać w celu usunięcia roztworu.</li>
	<li>Dodaj 0,8 ml 4% paraformaldehydu w 1,1x PBS do każdego naczynia. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie odsysać w celu usunięcia roztworu.</li>
	<li>O ile nie używasz zewnętrznych ligandów lub zewnętrznych epitopów, przepuszczalność komórek przez dodanie 0,5 ml 0,2% Triton X-100 w 1X PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie odsysać w celu usunięcia roztworu.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml 1% BSA do 1x PBS i inkubować przez 1 godzinę (w temperaturze pokojowej) lub O/N (w temperaturze 4 °C). 
	UWAGA: W zależności od warunków eksperymentalnych, na tym etapie można dodać falloidynę.</li>
	<li>Po inkubacji zaaspirować, aby usunąć roztwór i przystąpić do barwienia przeciwciałami. Alternatywnie, należy przechowywać szalki hodowlane, dodając co najmniej 1 - 2 ml 1% BSA w 1x PBS przez 3 - 4 tygodnie w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
5. Protokół immunofluorescencji
<ol>
	<li>Przygotować roztwory przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych zgodnie z zaleceniami producenta. 
	UWAGA: Jeśli zalecenia producenta nie są dostępne, dobre początkowe rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych (w 1% BSA w 1x PBS) wynosi 1:500 dla przeciwciał poliklonalnych i 1:1,000 dla przeciwciał monoklonalnych; Dobrym początkowym rozcieńczeniem dla przeciwciał drugorzędowych jest 1:1,000. Dostosuj te rozcieńczenia oryginalnego materiału uzyskanego od producenta wyżej, jeśli sygnał jest słaby, niższe, jeśli sygnał jest silny, a tło stanowi problem.</li>
	<li>Odessać 1% BSA w roztworze 1x PBS. Dodać 0,5 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować przez 1 godzinę (w temperaturze pokojowej) lub O/N (w temperaturze 4 °C).</li>
	<li>Usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała, umieścić w czystej i oznakowanej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i zamrozić w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Pozwala to na ponowne użycie przeciwciała pierwszorzędowego, jeśli zajdzie taka potrzeba.</li>
	<li>Umyj naczynie 3 - 5 razy za pomocą 1x PBS, wyjmując i wyrzucając PBS po każdym myciu.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych. W razie potrzeby dodaj znakowaną fluorescencyjnie falloidynę (zgodnie ze stężeniem zalecanym przez producenta) na tym etapie. Inkubować przez 1 godzinę (w temperaturze pokojowej) lub O/N (w temperaturze 4 °C). 
	UWAGA: Zastosowanie znakowanej fluorescencyjnie falloidyny pozwala na wizualizację filamentów aktynowych; Odkryliśmy, że falloidyna znakowana 488 działa najlepiej w naszych keratocytach danio pręgowanego, ale można użyć innych fluoroforów.</li>
	<li>Usunąć i wyrzucić roztwór przeciwciał drugorzędowych.</li>
	<li>Umyj naczynie 3 - 5 razy za pomocą 1x PBS, wyjmując i wyrzucając PBS po każdym myciu. 
	UWAGA: Naczynie można przechowywać pod przykryciem przed światłem w temperaturze 4 °C, jeśli nie można go natychmiast view; upewnij się, że 1x PBS został dodany do naczynia przed przechowywaniem, aby upewnić się, że komórki nie wyschną, ale ogrzeją się do RT (20 - 30 min), a następnie usuń PBS tuż przed przejściem do następnego kroku.</li>
	<li>Gdy będziesz gotowy do obserwacji, dodaj 2-3 krople podłoża montażowego, z DAPI lub bez, w zależności od potrzeb eksperymentalnych, do naczynia i pozostaw na 10 minut w temperaturze RT. 
	UWAGA: Używamy dostępnego na rynku podłoża montażowego na bazie glicerolu z DAPI, ale można użyć innych mediów montażowych. Pozostawienie 10 minut, aby podłoże montażowe znalazło się w naczyniu, ułatwia łatwe wyjęcie szklanego szkiełka nakrywkowego z dna naczynia.</li>
	<li>Po inkubacji delikatnie ściśnij boki naczynia, aby je poluzować i usuń szkiełko nakrywkowe. Dodaj dodatkową kroplę nośnika montażowego na szklane szkiełko podstawowe i umieść szkiełko nakrywkowe komórkami w dół na szkiełku. 
	UWAGA: Rozważ uszczelnienie szkiełka nakrywkowego do szkiełka za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci, jeśli szkiełko musi być przechowywane dłużej niż 1-2 dni.</li>
	<li>Obserwuj szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym. 
	UWAGA: Większość naszych zdjęć została wykonana przy użyciu obiektywu 40X lub 63X w zanurzeniu w oleju, ale konkretna użyta soczewka obiektywowa będzie zależeć od protokołu eksperymentalnego.</li>
</ol>

<ol><li>Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratocytes+generate+traction+forces+in+two+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Keratocytes generate traction forces in two phases.</a> Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).</li>
<li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453, 475-480 (2008).</li>
<li>Lacayo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+large-scale+cell+morphology+and+movement+from+local+actin+filament+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics.</a> PLOS Biology. 5, 233(2007).</li>
<li>Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+locomotion+for+simple-shaped+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Principles of locomotion for simple-shaped cells.</a> Nature. 362, 167-171 (1993).</li>
<li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Movement+of+Cell+Clusters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The Movement of Cell Clusters.</a> J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).</li>
<li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mechanical+tension+on+protrusive+activity+and+microfilament+and+intermediate+filament+organization+in+an+epidermal+epithelium+moving+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture.</a> The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).</li>
<li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+of+primary+zebrafish+keratocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes.</a> Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).</li>
<li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Zebrafish+as+a+Model+System+for+Cutaneous+Wound-Healing+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).</li>
<li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+pro-inflammatory+cytokines+and+metalloproteinase-1+by+TGF-b1+in+synovial+fibroblasts+from+rheumatoid+arthritis+and+normal+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica.%2C+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals.</a> Clinica., & Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).</li>
<li>Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+MMP-2+expression+and+secretion+change+with+increasing+serial+passage+of+keratocytes+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).</li>
<li>Schnaper, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+extracellular+matrix+proteins+and+decreased+expression+of+matrix+proteases+after+serial+passage+of+glomerular+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells.</a> Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).</li>
<li>Tondreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+matrix+metalloproteinase%2Ftissue+inhibitor+of+metalloproteinase+production+by+mesenchymal+stromal+cells+in+response+to+inflammatory+cytokines%3A+the+role+of+their+migration+in+injured+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues.</a> Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).</li>
<li>Zimmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts+from+primary+culture+-+primary+culture+cells+markedly+differ+from+fourth-passage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells.</a> Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).</li>
<li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+keratocyte+explant+cultures+as+a+wound+healing+model+system%3A+differential+gene+expressio.%2C+%26+morphological+changes+support+epithelial%E2%80%93mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., & morphological changes support epithelial–mesenchymal transition.</a> Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).</li>
<li>Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFb+%28transforming+growth+factor+b%29+and+keratocyte+motility+in+24-hour+zebrafish+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures.</a> Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).</li>
<li>Barut, B. A., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Realizing+the+potential+of+zebrafish+as+a+model+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease.</a> Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEtchin%2C+J+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 309-337 (2011).</li>
<li>Li, P., White, R. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+P+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 403-417 (2011).</li>
<li>Yen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+heterogeneity+and+mutational+burden+of+engineered+melanomas+in+zebrafish+models%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models.</a> Genome Biology. 14, R113(2013).</li>
<li>Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+and+Sdf-1+Pathways+Interact+during+Zebrafish+Fin+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration.</a> PLoS One. 4, e5824(2009).</li>
<li>Dufourcq, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+SDF-1+regulates+blastema+formation+during+zebrafish+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration.</a> Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).</li>
<li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li>
<li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Electroporation+of+Morpholinos+into+the+Regenerating+Adult+Zebrafish+Tail+Fin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin.</a> Journal of Visualized Experiments. 61, e3632(2012).</li>
<li>Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+Gene+Expression+in+the+Adult+Zebrafish+Brain+Using+Cerebroventricular+Microinjection+of+Morpholino+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides.</a> Journal of Visualized Experiments. 75, e50415(2013).</li>
<li>Konantz, J., Antos, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+Genetic+Morpholino+Approach+Using+Cardiac+Ventricular+Injection+to+Transfect+Multiple+Difficult-to-target+Tissues+in+the+Zebrafish+Larva%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva.</a> Journal of Visualized Experiments. 88, e51595(2014).</li>
<li>Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+expression+of+transgenes+in+adult+zebrafish+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation.</a> BMC Biotechnology. 5, 29(2005).</li>
<li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((During+collective+migration%2C+leader+keratocytes+generate+tension+in+sheet+and+may+become+follower+or+individually+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells.</a> Experimental Cell Research. In press, (2014).</li>
<li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+revised%3A+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models).</a> The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).</li>
<li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+and+collective+cell+migration+in+24+primary+zebrafish+explant+cultures%3A+MMP13+plays+an+inhibitory+role+and+MMP14+may+respond+to+stretch+during+reepithelialisation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International+Reports%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation.</a> Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).</li>
<li>Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-14+is+a+mechanically+regulated+activator+of+secreted+MMPs+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).</li>
<li>Sire, J. -Y., Girondot, M., Babiar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marking+zebrafish%2C+Danio+rerio+%28cyprinidae%29%2C+using+scale+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration.</a> The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teleost+skin%2C+an+ancient+mucosal+surface+that+elicits+gut-like+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).</li>
<li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).</li>
<li>Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotion+of+Xenopus+epidermis+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture.</a> Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).</li>
<li>Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+in+vitro+culture+of+larval+and+adult+epidermal+cells+of+the+frog+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellula.%2C+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis.</a> In Vitro Cellula., & Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).</li>
<li>Schober, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+kinase+modulates+tension+signaling+to+control+actin+and+focal+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics.</a> The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najważniejszym krokiem dla powodzenia hodowli eksplantatów keratocytów jest pozostawienie wagi na przyleganiu do naczynia hodowlanego przez około 2 - 3 minuty przed dodaniem pożywki. Około 75% łusek będzie przylegać i wyrastać z arkuszy (liczba kultur ustalonych dla każdego eksperymentu będzie musiała zostać odpowiednio dostosowana). Arkusze keratocytów nie tworzą się wokół każdej łuski usuniętej z ryby i umieszczonej w kulturze z kilku powodów. Po pierwsze, barwienie eksplantatów DAPI ujawnia, że niektóre łuski mają prz...

Badania nad ruchliwością komórek tradycyjnie koncentrowały się na pojedynczych migrujących komórkach. Keratocyty hodowane z eksplantatów ryb i okazały się potężnym systemem modelowym do badania mechanizmów ruchliwości komórek przy użyciu zarówno eksperymentalnych, jak i matematycznych podejść modelowania1-6. Prace eksperymentalne na indywidualnie migrujących komórkach są wspomagane przez szybki, płynny ruch ślizgowy komórek, przy zachowaniu jednolitego kształtu, prędkości i kierunku. Jednak in vivo komórki często poruszają się zbiorowo, zachowując połączenia komórka-komórka, szczególnie podczas embriogenezy, gojenia się ran i przerzutów. W związku z tym zbiorowa migracja komórek jest rosnącym i coraz bardziej znaczącym obszarem badań w dziedzinie migracji komórek. Kolektywna migracja tych komórek została niedawno opisana7 i ma wiele unikalnych cech, które sprawiają, że jest to potężny system do badania zbiorowej migracji komórek w modelu gojenia się ran.
Gdy łuski są zrywane ze znieczulonego dorosłego danio pręgowanego, część tkanki nabłonkowej pozostaje przyczepiona do spodniej strony łuski. Po dodaniu pożywki do hodowli komórkowej te komórki nabłonkowe lub keratocyty szybko migrują jako jednostka zbiorowa z wagi. Hodowla eksplantatów może być postrzegana jako nabłonkowy model gojenia się ran, w którym komórki migrują z eksplantatu, tak jak w przypadku prowizorycznej macierzy łożyska rany, aby przywrócić nienaruszony nabłonek. Najnowsze dane sugerują, że ta hodowla ex vivo naśladuje wiele cech gojenia się ran in vivo u dorosłych danio pręgowanych. Wskaźniki zamykania się ran8 przekładają się na szybkość migracji podobną do obserwowanej w systemie ex vivo 7. Ponadto, w modelu gojenia się ran in vivo, leczenie warfaryną sugeruje, że hemostaza nie ma wpływu na szybkość gojenia, podczas gdy leczenie hydrokortyzonem w celu zmniejszenia odpowiedzi immunologicznej nie opóźnia reepitelializacji8. Ponieważ danio pręgowany nie krwawi po usunięciu łuski ze zwierzęcia, hemostaza nie jest głównym graczem. Chociaż znaleźliśmy komórki odpornościowe w eksplantatach, nie badaliśmy wpływu, jaki mogą one mieć na zbiorową migrację komórek.
Przedstawiony tutaj protokół opisuje, jak stworzyć hodowle eksplantatów keratocytów danio pręgowanego, które zapewniają spójność i powtarzalność do wykorzystania w wielu testach biologicznych. Te hodowle eksplantatów są szczególnie przekonującym modelem in vitro dla zbiorowej migracji komórek z kilku powodów. Po pierwsze, keratocyty danio pręgowanego są komórkami pierwotnymi wykorzystywanymi w ciągu kilku godzin od założenia kultur eksplantatów. W związku z tym komórki te nie uległy zmianom morfologicznym i ekspresji genów związanym z pasażem komórek pierwotnych9-13. Po drugie, system ten stanowi model do badania reepitelializacji w odpowiedzi na zranienie14 i, w ramach odpowiedzi na zranienie, inicjowany jest proces przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego (EMT), o czym świadczą zmiany w ekspresji genów i rearanżacje cytoszkieletu14,15. W ten sposób scharakteryzowano zmiany tła w ekspresji i ruchliwości genów, które zachodzą w komórkach nieleczonych i zapewniają kontekst do interpretacji zmian związanych z leczeniem. Ponadto keratocyt rybi i keratynocyt ludzki są funkcjonalnie równoważne; Obie są pierwotnymi komórkami nabłonkowymi swojego gatunku i odgrywają kluczową rolę w gojeniu się ran nabłonkowych. Po trzecie, dorosłe rybo pręgowane zyskują uznanie jako system modelowy dla różnych chorób człowieka16-18, w tym czerniaka i innych nowotworów19-21, gojenia się ran skórnych8,14 i regeneracji tkanek22-24.
Zalety techniczne tego systemu są równie przekonujące. Rosnąca liczba zmutowanych i transgenicznych linii jest dostępna w scentralizowanych placówkach non-profit. W szczególności projekt Zebrafish Mutation Project (ZMP) w Wellcome Trust Sanger Institute ma na celu stworzenie allelu nokautującego w każdym genie kodującym białko w genomie danio pręgowanego. Obecnie zmutowali 11 892 geny, czyli około 45% genomu, w których scharakteryzowano 24 088 alleli. Ponadto ZMP przyjmuje propozycje i bezpłatnie generuje nokauty. Najnowsze metody knockdownu genów u larw i dorosłych ryb danio pręgowanego25-28 zapewniają elastyczność w badaniu funkcji genów ważnych dla rozwoju, dla których podejścia transgeniczne są problematyczne lub niepraktyczne.
Ze względu na ich niezwykle szybkie tempo ruchliwości wynoszące ~145 μm/h krótko po założeniu kultur29, testy mogą być zakończone szybko (zwykle w ciągu 24 godzin lub mniej). Ponieważ eksperymenty można szybko przeprowadzić, a kultury dobrze rosną w RT, unika się kilku przeszkód technicznych związanych z testami migracji komórek ssaków z wykorzystaniem mikroskopii wideo. Ponadto w dobie napiętych budżetów badawczych danio pręgowany jest łatwy i niedrogi w utrzymaniu.
Struktura i zachowanie eksplantu jest złożone. Ponieważ ryby nie krwawią po usunięciu łuski, jest mało prawdopodobne, aby łuska usunęła znacznie więcej niż powierzchowne warstwy naskórka. Keratocyty wydają się być dominującym typem komórek w eksplantacie, gdy łuski są początkowo usuwane z ryby, ponieważ zdecydowana większość komórek wydaje się barwić przeciwciałem anty-E-kadheryny14. Co więcej, nie ma dowodów na obecność fibroblastów w początkowej hodowli, co ocenia się na podstawie braku barwienia wimentyną przez immunofluorescencję14. Jednak przy wielokrotnym usuwaniu łuski wydaje się, że w eksplantacie znajdują się liczne neutrofile (patrz wideo 1). Zidentyfikowaliśmy te komórki jako neutrofile na podstawie obserwacji morfologicznych ich wielkości, szybkiej ruchliwości i migracji z arkusza komórkowego po wystawieniu na LPS (dane nie pokazane). Ponadto komórki te barwią się jasno przeciwciałem przeciwko cytozolowi neutrofilowemu, a także różnymi drugorzędowymi przeciwciałami IgG, co wskazuje, że mają obfite FcR na swojej powierzchni (dane nie pokazane). W eksplantacie znajduje się wiele warstw komórek. Mikroskopia konfokalna ujawnia obecność pojedynczej warstwy w pobliżu krawędzi natarcia do więcej niż dwóch warstw keratocytów w pobliżu skali z neutrofilami widocznymi powyżej, poniżej i między arkuszami keratocytów komórkowych.
We wczesnych punktach czasowych komórki na skraju wielowarstwowego eksplantatu polaryzują się, inicjując zbiorową migrację keratocytów z eksplantatu z początkową szybkością ~145 μm/h. Powierzchnia pokryta eksplantatem gwałtownie się zwiększa, co prowadzi do rozprzestrzeniania się komórek, naprężenia w arkuszu i zmniejszenia szybkości posuwania się krawędzi natarcia. Szybkie wzajemne konwersje między komórkami prowadzącymi i naśladującymi obserwuje się na krawędzi natarcia podczas tworzenia i zamykania spontanicznie powstałych otworów w arkuszu7. W miarę kontynuowania procesu EMT zainicjowanego eksplantatem fragmenty arkusza i keratocyty tracą swoją wyspecjalizowaną, szybką ruchliwość. Ekspresja genów i zmiany morfologiczne zgodne z EMT, gojeniem się ran i reakcjami zapalnymi zachodzą w ciągu 7 dni od hodowli, przy czym eksplantaty uważa się za żywotne przez około 10 dni14.

<table><tbody><tr><td>Naczynia hodowlane ze szklanym dnem o średnicy 35 mm (pokryte lizyną Poly-D)</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td>Grubość 1.5 mm jest najlepsza do usuwania szkiełka nakrywkowego. Średnica 14 mm zapewnia większą powierzchnię hodowli.</td></tr><tr><td>Kleszcze Swiss Jewelers Style, Integra, Miltex 17-303</td><td>VWR</td><td>21909-460</td><td>Uważamy, że wąskie, cienkie kleszcze najlepiej sprawdzają się w usuwaniu kamienia.</td></tr></tbody></table>

eksplantaty keratocytów danio pręgowanego w celu zbadania zbiorowej migracji komórek i reepitelializacji w gojeniu się ran skórnych

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Ze względu na swoje unikalne właściwości ruchliwe, keratocyty ryb oddzielone od kultur eksplantatów od dawna są wykorzystywane do badania mechanizmów migracji pojedynczych komórek. Jednakże, gdy eksplantaty są już ustabilizowane, komórki te również poruszają się kolektywnie, zachowując wiele cech, które sprawiają, że poszczególne keratocyty są atrakcyjnym modelem do badania migracji: szybkie tempo ruchliwości, rozległe blaszki bogate w aktynę z prostopadłym aktynowym oraz stosunkowo stała prędkość i kierunek migracji. We wczesnych eksplantatach szybka interkonwersja komórek migrujących indywidualnie z tymi migrującymi zbiorowo pozwala na badanie roli adhezji komórka-komórka w określaniu trybu migracji i podkreśla powiązania molekularne między tymi dwoma sposobami migracji. Komórki w późniejszych eksplantatach tracą zdolność do szybkiej i zbiorowej migracji, gdy zachodzi przejście nabłonkowe do mezenchymalnego, a geny związane z gojeniem się ran i stanem zapalnym ulegają zróżnicowanej ekspresji. W ten sposób eksplantaty keratocytów mogą służyć jako model in vitro dla reepitelializacji, która zachodzi podczas gojenia się ran skórnych i mogą stanowić unikalny system do badania mechanizmów zbiorowej migracji komórek w kontekście zdefiniowanego programu zmian ekspresji genów. Dostępnych jest wiele zmutowanych i transgenicznych linii danio pręgowanego, co pozwala na tworzenie eksplantatów z ryb o różnym pochodzeniu genetycznym. Pozwala to na jednoznaczne określenie roli różnych białek w tych procesach. Przedstawione tutaj protokoły opisują łatwą i skuteczną metodę ustanawiania tych kultur eksplantatów do wykorzystania w różnych testach związanych ze zbiorową migracją komórek.

Jak pokazano na Rysunku 1, arkusze keratocytów można zaobserwować migrujące spod łuski w ciągu kilku godzin od ustanowienia kultury eksplantu. Sporadycznie można dostrzec pojedynczo migrujące keratocyty, które oderwały się od zbiorowo migrującego arkusza. Ponadto, ponieważ eksplant pochodził z ryby, która została wcześniej oskrobana, przez arkusz migruje liczne neutrofile. W dłuższych okresach hodowli arkusz keratocytów ulega fragmentacji w miarę jak komórki przechodzą proces EMT14.
<p cla...

Keratocyty danio pręgowanego migrują w arkuszach komórkowych z eksplantatów i dostarczają modelu in vitro do badania mechanizmów zbiorowej migracji komórek w kontekście gojenia się ran nabłonkowych. Protokoły te szczegółowo opisują skuteczny sposób ustanawiania pierwotnych kultur eksplantatów do wykorzystania w zbiorczych testach migracji komórek.

Eksplantaty keratocytów danio pręgowanego w celu zbadania zbiorowej migracji komórek i reepitelializacji w gojeniu się ran skórnych

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie hodowli eksplantów keratocytów ryby danio w celu wykorzystania ich w badaniach nad zbiorową migracją komórek oraz gojeniem ran nabłonkowych. Osiąga się to poprzez uprzednie usunięcie łusek z przytwierdzonym nabłonkiem z znieczulonej dorosłej ryby danio. Łuski z przytwierdzonym nabłonkiem umieszcza się w naczyniu hodowlanym, aby umożliwić adhezję komórek.Następnie dodaje się pożywkę hodowlaną wraz z ewentualnymi substancjami traktującymi wskazanymi w planie doświadczenia. Na koniec komórki inkubuje się i obserwuje za pomocą wideomikroskopii przez określony czas. Ostatecznie można zastosować szereg analiz w celu wykazania zmian w migracji lub morfologii komórkowej, a także w ekspresji białek lub innych markerów w czasie.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metoda hodowli przekształconych komórek, jest fakt, że hodowle eksplantów są pierwotne, co w dużym stopniu odzwierciedla właściwości komórek in vivo. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie gojenia ran nabłonkowych, takie jak rola migracji zbiorowej oraz przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ łuski mogą nie przytwierdzać się do powierzchni wzrostu lub nie rozwijać w danej naczyniu hodowlanym.Procedurę tę zaprezentują Jose Rap PanIN, student medycyny, oraz Chana TI i Agnes Pasquale, obie starsze badaczki w moim laboratorium. Aby przygotować się do tego eksperymentu, należy odchlorować około 1,5 litra wody z kranu, używając komercyjnego środka odchlorującego lub pozostawiając wodę na 24 godziny, a następnie użyć 500 mililitrów do napełnienia każdego z trzech zlewków o pojemności jednego litra. Jeden zlewkę należy oznaczyć jako przeznaczoną do trzymania ryb przed rozpoczęciem procedury, a drugi jako przeznaczony do rekonwalescencji w trzecim zlewku.Dodaj 100 µg/mL trica. Aby znieczulić ryby, napełnij płytką tacę lodem. Podgrzej pożywkę do temperatury pokojowej i przygotuj czyste pęsety jubilerskie.Oczyść pęsetę, zanurzając jej końcówki w 70% etanolu, a następnie przełóż je przez płomień palnika Bunsena, pozwalając etanolowi odparować. Odłów odpowiednią liczbę ryb i umieść je w zlewce z roztworem przechowującym. Przenieś pojedynczą rybę do zlewki z anestetykiem.Po znieczuleniu ryby zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś ją na lód i ułóż poziomo, tak aby ogon był skierowany w stronę ręki trzymającej pęsetę. Aby usunąć łuski, ustaw pęsetę równolegle do ryby. Umieść końcówkę pęsety na krawędzi łuski, a następnie lekko dociśnij płaską stronę pęsety do boku ryby, aby łuska uniosła się z ciała zwierzęcia.Za pomocą pęsety uchwyć łuskę, a następnie wyjmij ją i, nie odwracając, umieść w naczyniu do hodowli tkankowej. Powtórz procedurę, usuwając maksymalnie 12 łusek z dużego dorosłego osobnika, unikając obszaru skrzeli, linii bocznej i płetw. Umieść rybę w zlewce do rekonwalescencji i monitoruj ją, aby upewnić się, że doszło do wybudzenia z narkozy.Następnie przenieś rybę do osobnego zbiornika i pozwól jej na regenerację przez 21 dni, aby umożliwić całkowite odtworzenie łusek. W zależności od eksperymentu, umieść do 20 łusek na plastikowej, 35 milimetrowej płytce do hodowli tkankowej lub od czterech do sześciu łusek na szkiełku.Odwróć naczynie dnem do góry, aby umożliwić przyleganie łusek do dna, a następnie delikatnie dodaj 1,2 mililitra pożywki kompletnej do każdego naczynia hodowlanego. Inkubuj kultury eksplantów X w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez żądany czas, z zastosowaniem lub bez zastosowania odpowiedniej obróbki, w celu przeprowadzenia mikroskopii. Po wyjęciu z inkubatora naczynia zawierającego arkusze komórkowe, umieść je na stoliku mikroskopu.Użyj obiektywu 4x do wstępnego ustawienia ostrości, aby ułatwić wykonywanie zdjęć w czasie. Oznacz położenie każdego arkusza komórkowego lub orientację szalki na stoliku. Fotografuj arkusze komórkowe w różnych punktach czasowych zgodnie z protokołem eksperymentalnym, a jeśli do eksperymentu wymagane są jedynie obrazy statyczne, umieść szalkę z powrotem w inkubatorze.Aby utrwalić próbki do mikroskopii immunofluorescencyjnej, należy przygotować i ogrzać roztwory do temperatury pokojowej. W celu obrazowania miejsc OSE w świetle fluorescencyjnym, należy użyć szalkek hodowlanych o średnicy 35 milimetrów z szklanym dnem do hodowli bakłażanów, zgodnie z opisem wcześniejszym w tym filmie; bez usuwania medium hodowlanego, do każdej szalki należy dodać 0.8 mililitrów 4% paraldehydu w 1.1 XPBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie odessaj roztwór. Dodaj kolejne 0,8 mililitrów utrwalacza do każdej płytki, a po drugiej pięciominutowej inkubacji odessaj roztwór. O ile nie stosowane są zewnętrzne ligandy lub epitopy, przepuszczalnij komórki, dodając 0,5 mililitrów 0,2% TRITTON X 100 w XPBS i inkubując przez pięć minut.Przed usunięciem roztworu należy dodać 0,5 ml 1% BSA w 1x PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę lub w temperaturze 4°C przez noc; po inkubacji należy odessać roztwór i przystąpić do barwienia przeciwciałami. Alternatywnie można dodać od jednego do dwóch mililitrów 1% BSA w 1x PBS i przechowywać w temperaturze 4°C przez trzy do czterech tygodni. Następnie należy przeprowadzić immunofluorescencję.Zgodnie z protokołem tekstowym przedstawionym tutaj, arkusze keratocytów migrujące spod łuski można zaobserwować w ciągu kilku godzin od ustanowienia kultury eksplantu. Sporadycznie można dostrzec pojedynczo migrujący keratynocyt, który oddzielił się od zbiorowo migrującego arkusza. Początkowe tempo przemieszczania się arkusza jest niezwykle szybkie, lecz tempo to gwałtownie spada w miarę rozprzestrzeniania się komórek podczas pierwszych 48 godzin hodowli.Szybki wzrost nie jest związany z proliferacją komórek, ponieważ po 24-godzinnym znakowaniu fluorescencyjnym EDU jedynie około 10% komórek wykazuje oznaki podziału, co jest wskaźnikiem znacznie niższym niż obserwowanym w transformowanych liniach komórkowych. Gdy preparaty są dodawane w momencie ustalenia się eksplanów, niektóre związki zmieniają zbiorową migrację komórek. Na przykład, jak tutaj pokazano, niektóre inhibitory MMP zmniejszają powierzchnię płata komórkowego po 24 godzinach.W hodowli, gdy do pożywki dodaje się rozpuszczalny peptyd zawierający sekwencję RGD w celu zakłócenia tworzenia adhezji, lamele na przednim brzegu arkusza gwałtownie się kurczą, a następnie przedni brzeg arkusza odrywa się i cofają; w czasie krótszym niż dwie minuty, aby ocenić lokalizację białek wewnątrz arkusza lub w komórkach prowadzących i podążających, cały arkusz może zostać utrwalony i zabarwiony, jak pokazano na tej figurze. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w 10 do 15 minut, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać o dodaniu podgrzanej wcześniej pożywki hodowlanej dopiero po odczekaniu czasu niezbędnego do przyprzylgnięcia cytów do naczynia hodowlanego zgodnie z tą procedurą.W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak zmiany w ekspresji genów w zależności od czasu i/lub warunków traktowania, można przeprowadzić inne metody, np. qPCR. Po zapoznaniu się z tą procedurą powinni Państwo mieć znacznie lepsze wyobrażenie o tym, jak zakładać hodowle IDE explan do wykorzystania w różnych procedurach.

zebrafish-keratocyte-explants-to-study-collective-cell-migration

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przeszczepy keratocytów rybki labiryntowej do badań nad zbiorową migracją komórek i reepithelializacją w gojeniu się ran skóry

Obumierające komórki są usuwane z tkanek nabłonkowych poprzez skoordynowany skurcz komórek sąsiednich, bez naruszania funkcji barierowej. Przejrzystość optyczna rozwijających się rybek danio przymrużonych stanowi doskonały system do wizualizacji procesu ekstruzji w żywych nabłonkach. W niniejszej pracy opisujemy metody indukcji i obrazowania ekstruzji w naskórku larw rybek danio przymrużonych z rozdzielczością komórkową.

Obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego

Badanie najwcześniejszych zdarzeń progresji komórek przednowotworowych i interakcji wrodzonych komórek odpornościowych jest kluczowe dla zrozumienia i leczenia raka. W tym miejscu opisujemy metodę warunkowego wywoływania przemian komórek nabłonkowych i późniejszego obrazowania na żywo interakcji wrodzonych komórek odpornościowych z komórkami skóry wyrażającymi HRASG12V u larw danio pręgowanego.

Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami immunologicznymi i przednowotworowymi przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Gal4/UAS w skórze larw danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje metodę mechanicznego uszkodzenia naczynia krwionośnego u zarodków danio pręgowanego. Ten model urazów stanowi platformę do badania hemostazy, stanów zapalnych związanych z urazami i gojenia się ran w organizmie idealnie nadającym się do mikroskopii w czasie rzeczywistym.

Mechaniczne uszkodzenie naczynia w zarodkach danio pręgowanego

Prezentujemy protokół do uchwycenia dynamiki regeneracji płetw ogonowych larw danio pręgowanego w skali całej tkanki za pomocą stereomikroskopii opartej na jasnym polu. Technika ta umożliwia uchwycenie dynamiki regeneracji z rozdzielczością pojedynczej komórki. Metodologię tę można dostosować do każdego mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w kamerę CCD i oprogramowanie do filmów poklatkowych.

Uchwycenie naprawy tkanek u larw danio pręgowanego za pomocą stereomikroskopii poklatkowej w jasnym polu

Opisane tutaj jest ustanowienie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów reakcji na uszkodzenia tkanek nabłonkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku.

Opracowanie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo do badania naprawy ran nabłonkowych w rodzimym mikrośrodowisku

Ten manuskrypt opisuje zWEDGI (Urządzenie do Zranienia i Uwięzienia Danio Zebra dla Wzrostu i Obrazowania), które jest urządzeniem przeznaczonym do orientacji i krępowania larw danio pręgowanego. Konstrukcja pozwala na przecięcie ogona i długoterminowe zbieranie obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości, przedstawiających gojenie się i regenerację ran.

Długoterminowe urządzenie do obrazowania na żywo do lepszej eksperymentalnej manipulacji larwami danio pręgowanego

Tutaj opisujemy protokoły do wykonywania obrazowania na żywo i analizy ilościowej dynamiki receptorów chemoatraktantu u neutrofili danio...

Obrazowanie na żywo receptorów chemokiny w neutrofilach danio pręgowanego podczas reakcji na ranę

Eksplantaty blastodermy danio pręgowanego są generowane przez izolowanie komórek embrionalnych od endogennych centrów sygnalizacyjnych we wczesnym zarodku, tworząc stosunkowo naiwne klastry komórek, które łatwo manipulować i hodować ex vivo. Ten artykuł zawiera instrukcje dotyczące tworzenia takich eksplantatów i demonstruje ich użyteczność, pytając o role sygnalizacji węzłowej podczas gastrulacji.

Wytwarzanie naiwnych eksplantatów blastodermy z zarodków danio pręgowanego

Ten protokół skupia się na uszkadzaniu powierzchni oka danio pręgowanego poprzez ścieranie, aby ocenić późniejsze zamknięcie rany na poziomie komórkowym. Podejście to wykorzystuje zadzior oczny do częściowego usunięcia nabłonka rogówki i wykorzystuje skaningową mikroskopię elektronową do śledzenia zmian w morfologii komórek podczas zamykania rany.

Gojenie się ran rogówki danio pręgowanego: od ścierania do analizy obrazowej zamknięcia rany

Ten artykuł opisuje metodę tworzenia ran w nabłonku żywej Clytia hemisphaerica medusa i obrazowania gojenia ran w wysokiej rozdzielczości in vivo. Dodatkowo przedstawiono technikę wprowadzania barwników i leków w celu zakłócenia procesów sygnalizacyjnych w komórkach nabłonka i macierzy zewnątrzkomórkowej podczas gojenia się ran.

Charakterystyka gojenia się ran nabłonkowych in vivo przy użyciu parzydełkowego organizmu modelowego Clytia hemisphaerica

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepiania komórek o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w zarodkach i larwach danio pręgowanego na każdym etapie, między co najmniej 1 a 7 dniem po zapłodnieniu.

Przeszczep komórek w wysokiej rozdzielczości u embrionów i larw danio pręgowanego

Poznaj metodę eksplantatów keratocytów Danio rerio do badania zbiorowej migracji komórek i gojenia ran naskórkowych. Ta technika pozwala obserwować dynamikę migracji oraz zmiany morfologii komórkowej w czasie rzeczywistym.

Eksplantaty keratocytów danio pręgowanego w celu zbadania zbiorowej migracji komórek i reepitelializacji w gojeniu się ran skórnych (Wideo) | JoVE Journal

Eksplantaty keratocytów danio pręgowanego w celu zbadania zbiorowej migracji komórek i reepitelializacji w gojeniu się ran skórnych

Przeglądaj więcej filmów