Eksplantaty keratocytów danio pręgowanego w celu zbadania zbiorowej migracji komórek i reepitelializacji w gojeniu się ran skórnych

Ogólnym celem tej procedury jest ustanowienie doskonałych kultur keratocytów danio pręgowanego do wykorzystania w zbiorowej migracji komórek i badaniach gojenia się ran nabłonkowych. Osiąga się to poprzez usunięcie łusek z przyczepioną tkanką nabłonkową ze znieczulonego dorosłego danio pręgowanego. Łuski z przyczepioną tkanką umieszcza się w naczyniu hodowlanym, aby umożliwić przyleganie komórek.

Następnie dodaje się pożywkę hodowlaną wraz z wszelkimi zabiegami wskazanymi w projekcie eksperymentalnym. Na koniec komórki są inkubowane i obserwowane za pomocą mikroskopii wideo przez żądany okres czasu. Ostatecznie można zastosować różne testy, aby wykazać zmiany w migracji lub morfologii komórek, a także ekspresję białek lub innych markerów w czasie.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącą metodą, taką jak metoda transformacji hodowli komórkowej, jest to, że hodowle eksplantatów są pierwotne, które ściśle łączą się z właściwościami komórki in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie gojenia się ran nabłonkowych, takie jak rola migracji zbiorowej i przejście nabłonkowe do mezenchymalnego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, będą miały trudności, ponieważ łuski mogą nie przyczepiać się do powierzchni wzrostu lub mogą nie rosnąć w danym naczyniu hodowlanym.

Tę procedurę zademonstrują studentka medycyny Jose Rap PanIN, Chana TI i Agnes Pasquale, obie starsze współpracowniczki naukowe w moim laboratorium. Aby przygotować się do tego eksperymentu, odchloruj około 1,5 litra wody z kranu za pomocą komercyjnego środka odchlorowującego lub odstawiając wodę na 24 godziny, a następnie użyj 500 mililitrów do napełnienia każdej z trzech jednolitrowych zlewek. Oznaczyć jedną zlewkę do przechowywania ryb przed jakimkolwiek zabiegiem, a drugą do odzyskiwania do trzeciej zlewki.

Dodaj 100 mikrogramów na mililitr trica. Aby znieczulić ryby, napełnij płytką tacę lodem. Podgrzej pożywkę hodowlaną do temperatury pokojowej i zbierz czystą pęsetę jubilerską.

Wyczyść pęsetę, zanurzając końcówki w 70% etanolu i przepuszczając je przez palnik Bunsena, pozwalając etanolowi się spalić. Złap żądaną liczbę ryb i umieść w zlewce. Przenieś pojedynczą rybę do zlewki anestezjologicznej.

Po znieczuleniu ryby zgodnie z protokołem tekstowym przenieś ją do lodu i ułóż poziomo z ogonem skierowanym w stronę ręki trzymającej pęsetę. Aby usunąć łuski, ustaw pęsetę równolegle do ryby. Trzymając końcówkę na krawędzi łuski, lekko wciśnij płaską stronę pęsety w bok ryby, aby łuska uniosła się z ciała ryby.

Użyj pęsety, aby chwycić łuskę, a następnie zerwij ją i bez odwracania umieść w naczyniu do hodowli tkankowej. Powtórz procedurę, usuwając maksymalnie 12 łusek od dużego dorosłego osobnika, omijając okolice skrzeli, linię boczną i płetwy. Umieść rybę w zlewce regeneracyjnej i monitoruj, aby upewnić się, że wyzdrowieje po znieczuleniu.

Następnie przenieś rybę do indywidualnego zbiornika i pozwól rybie zregenerować się przez 21 dni, aby umożliwić pełną regenerację łusek. W zależności od eksperymentu umieść do 20 łusek na plastik. Naczynie poddane hodowli tkankowej o grubości 35 milimetrów lub od czterech do sześciu łusek na szklankę.

Dolne naczynie, pozwól, aby łuski przylegały do naczynia, a następnie delikatnie dodaj 1,2 mililitra kompletnej pożywki do każdej pożywki. Inkubować kultury X explan w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez pożądany okres czasu z leczeniem lub bez niego, aby przeprowadzić mikroskopię. Po wyjęciu z inkubatora naczynia zawierającego arkusze komórek, należy umieścić je w stoliku mikroskopowym.

Użyj obiektywu z czterema rozmiarami x, aby początkowo ustawić ostrość, aby ułatwić robienie zdjęć w miarę upływu czasu. Zaznacz położenie każdego arkusza komórek i/lub orientację naczynia na scenie. Sfotografuj arkusze komórek w różnych punktach czasowych zgodnie z protokołem eksperymentalnym, a jeśli tylko potrzebne są nieruchome obrazy do eksperymentu, umieść je z powrotem w inkubatorze.

Aby utrwalić próbki do mikroskopii immunofluorescencyjnej, przygotuj i podgrzej roztwory w temperaturze pokojowej. Aby wyświetlić miejsca OSE pod fluorescencją, użyj naczyń hodowlanych ze szklanym dnem o grubości 35 milimetrów do uprawy bakłażanów, jak opisano wcześniej w tym filmie, bez usuwania pożywki hodowlanej, dodaj 0,8 mililitra 4% paraldehydu w 1,1 XPBS do każdej potrawy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie odessać roztwór. Dodaj dodatkowe 0,8 mililitra utrwalacza do każdego naczynia, a po drugiej pięciominutowej inkubacji odessać roztwór. O ile nie używasz zewnętrznych ligandów lub epitopów, przepuszczaj komórki, dodając 0,5 mililitra 0,2% TRITTON X 100 w jednej inkubacji XPBS przez pięć minut.

Przed usunięciem roztworu dodać 0,5 mililitra 1% BSA w jednym XPBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę lub w czterech stopniach Celsjusza przez noc po inkubacji, odessać roztwór i przystąpić do barwienia przeciwciałami. Alternatywnie, dodaj jeden do dwóch mililitrów 1% BSA w jednym XPBS i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy do czterech tygodni. Przeprowadź immunofluorescencję.

Zgodnie z protokołem tekstowym, jak pokazano poniżej, arkusze keratocytów można zaobserwować migrację spod skali w ciągu kilku godzin od założenia hodowli EXPLAN. Czasami można zaobserwować indywidualnie migrujący keratynocyt, który oderwał się od zbiorczo migrującego arkusza. Początkowe tempo przesuwania arkusza jest niezwykle szybkie, ale tempo to szybko zwalnia, gdy komórki rozprzestrzeniają się w ciągu pierwszych 48 godzin hodowli.

Szybki wzrost nie jest związany z proliferacją komórek, ponieważ po znakowaniu przez 24 godziny fluorescencyjnym EDU, około 10% komórek wykazuje dowody na podział komórek w tempie znacznie niższym niż obserwowane w transformowanych liniach komórkowych. Gdy leczenie zostanie dodane w momencie ustalenia X explan, niektóre związki zmieniają zbiorową migrację komórek. Na przykład, jak pokazano tutaj, niektóre inhibitory MMP zmniejszają powierzchnię arkusza komórkowego po 24 godzinach.

W hodowli, gdy rozpuszczalny peptyd zawierający RGD jest dodawany do pożywki hodowlanej w celu zakłócenia tworzenia się adhezji, kulawe na przedniej krawędzi arkusza szybko się kurczą, a następnie krawędź przednia arkusza odrywa się i chowa i mniej niż dwie minuty, aby ocenić lokalizację białek w arkuszu lub w litrach i komórkach podążających, Cały arkusz można naprawić i poplamić, jak pokazano na tym rysunku. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 10 do 15 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby dodać wstępnie ogrzaną pożywkę hodowlaną dopiero po pozostawieniu czasu na przyleganie cytów do naczynia hodowlanego Zgodnie z tą procedurą.

Inną metodę, taką jak QPCR, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na wszelkie dodatkowe pytania, takie jak zmiany w ekspresji genów w odniesieniu do czasu i/lub warunków leczenia. Po obejrzeniu tej procedury powinieneś mieć znacznie lepsze pojęcie o tym, jak ustanowić kultury explan IDE do użycia w różnych procedurach.