Obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego

Utrzymanie tkanek nabłonkowych wymaga ciągłego usuwania uszkodzonych i obumierających komórek bez naruszania funkcji bariery. Aby to osiągnąć, nabłonek wytłacza umierające komórki, tworząc i kurcząc pierścień aktyny i miozyny w komórce otaczającej umierającą komórkę, aby ją wyrzucić, jednocześnie zamykając wszelkie luki, które mogły powstać w wyniku jej wyjścia. W tym artykule wideo Metoda indukowania i obrazowania ekstruzji komórek apoptotycznych z naskórka larw danio pręgowanego w czasie rzeczywistym.

W pokazanym przykładzie osiąga się to poprzez wstrzyknięcie czerwonego białka fluorescencyjnego znakowanej sondą aktyny F do transgenicznych zarodków danio pręgowanego w jednym stadium komórkowym eksprymujących zielone białko fluorescencyjne w naskórku w celu uwidocznienia działających włókien w tkankach nabłonkowych. Dzień czwarty, po personalizacji, larwy, które wyrażają zarówno GFP, jak i RFP, są następnie traktowane G four 18 w celu wywołania apoptozy w naskórku. Dynamika aktyny i zmiany kształtu komórek nabłonka, które zachodzą podczas ekstruzji, są wizualizowane za pomocą obrazowania poklatkowego na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak siła immunologiczna i analizy, jest to, że możemy zaobserwować szybkie zmiany i dynamikę aktyny, które zachodzą podczas procesu ekstruzji w żywej tkance nabłonkowej. W tym filmie pokażemy Ci procedurę obrazowania ekstruzji komórek apoptotycznych z naskórka rozwijającej się danio pręgowanej w czasie rzeczywistym. Używamy tej procedury w naszym laboratorium, aby zrozumieć, w jaki sposób komórki koordynacyjnie przestawiają swój cytoszkielet aktonowy, aby usunąć komórki apoptotyczne przy jednoczesnym zachowaniu funkcji bariery i jak zakłócenie procesu ekstruzji może prowadzić do pewnych stanów chorobowych.

Więc zacznijmy: Aby zobrazować dynamikę działania podczas ekstruzji komórek w naskórku rozwijającego się danio pręgowanego, zacznijmy od rozmrożenia wcześniej transkrybowanego RNA na lodzie. Transkrybujemy Mr.mRNA kodujące czerwone białko fluorescencyjne połączone z cielęciem w domenie homologii utrofiny i działamy w wiązaniu białka. Dodaj czerwień fenolową do RNA w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać końcowe stężenie RNA około 30 nanogramów na mikrolitr i załaduj jeden mikrolitr roztworu do wyciągniętej igły kapilarnej przez ponowne napełnianie.

Zebrać około 75 zarodków C-K-G-F-P w stadium 1 komórki w buforze E trzy. Pobrać pipetowane zarodki do formy do mikroiniekcji za pomocą pipety do makaronu w pięciu i trzech czwartych i delikatnie ustawić zarodki w korycie za pomocą FST Dumont. Po piąte, kleszcze działają szybko, aby uniknąć konieczności wstrzykiwania RNA do wieloetapowych zarodków pod standardowym laboratoryjnym mikroskopem stereoskopowym.

Użyj mikrowstrzykiwacza z kontrolowanym ciśnieniem, aby wstrzyknąć RNA do jarzma zarodków jako skamieniałość fenolu. Kolor czerwony powinien być widoczny w zarodku po wstrzyknięciu. Pamiętaj, aby wstrzyknąć co najmniej 50 zarodków do każdego eksperymentu.

Posortuj zarodki, aby usunąć wszelkie niezapłodnione lub uszkodzone jaja i wysiaduj wszystkie pozostałe zarodki w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach użyj fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, aby wybrać zarodki danio pręgowanego, które mają wysoki poziom fluorescencji GFP w naskórku i fluorescencję działającą znakowaną RFP. Inkubuj wybrane zarodki w temperaturze 28 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do rozpoczęcia leczenia farmakologicznego w celu wywołania ekspozycji na apoptozę na aminoglikozyd.

Antybiotyk G 4 18 lub lek powoduje wytłaczanie komórek apoptotycznych z naskórka rozwijających się larw danio pręgowanego. Co ważne, zabieg ten działa tylko na larwy, które są cztery dni po zapłodnieniu i starsze, aby wywołać ekstruzję komórek. Zbierz do 25 larw danio pręgowanego wyrażających zarówno GFP, jak i RFP w 4 dni po zapłodnieniu w naczyniu hodowlanym o wymiarach 35 na 10 milimetrów zawierającym trzy mililitry pożywki E trzy.

Ostrożnie zastąp pożywkę trzema mililitrami E trzy zawierającymi jeden miligram na mililitr G four 18 i inkubuj larwy w leku przez cztery godziny w ciemności w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Następnie usuń pożywkę i zastąp ją podgrzanym E trzema pożywkami zawierającymi 0,02% trików i przystąp do montowania larw w celu zobrazowania. Przenieś do trzech larw do 1,5-mililitrowej rurki fendora i usuń większość pożywki E three.

Za pomocą wyciętej końcówki pipety odpipetuj 120 mikrolitrów 1% niskotopliwego aros do mieszanki probówki. A następnie delikatnie odpipetuj mieszaninę larw i aro na szkło nakrywkowe na dnie naczynia do hodowli matech. Za pomocą uchwytu na szpilkę FST z dołączonym kołkiem lub igłą wolframową, szybko ustaw larwy tak, aby były prosto i płasko przylegające do szkła nakrywkowego.

Pozwól aose zastygnąć. Następnie delikatnie napełnij naczynie E trzema pożywkami zawierającymi 0,02% trica. Odkryliśmy, że cały proces ekstruzji komórek apoptotycznych z naskórka rozwijających się larw danio pręgowanego trwa około 20 minut.

Tutaj pokazujemy, jak skonfigurować eksperyment z obrazowaniem poklatkowym przy użyciu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem i oprogramowania i/lub IQ w celu zebrania płaszczyzn serii Z przez pojedynczą warstwę naskórka danio pręgowanego. Najpierw włącz kamerę mikroskopową z laserami argonowymi i helowo-neonowymi oraz świetlówkę epi w oprogramowaniu i/lub IQ. Utwórz protokół szeregów czasowych zawierający długości fal, które mają być zobrazowane.

Częstotliwość interwałów między przechwytywaniem obrazu i liczba powtórzeń przechwytywania Delikatnie umieść matową szalkę zawierającą preparat na stoliku mikroskopu, a następnie użyj 20-krotnego obiektywu ze światłem przechodzącym, aby ustawić ostrość na larwach. Przesuń obiektyw 40-krotnego zanurzenia w wodzie do właściwej pozycji. Korzystając z tego celu, możemy sfilmować około 20 do 25 komórek na pole, co pozwala nam śledzić zachowania komórek podczas wytłaczania, jednocześnie rozwiązując dynamikę działania subkomórkowego.

Ostrożnie umieść kroplę wody na wierzchu obiektywu 40 razy i szybko umieść na nim naczynie matowe. Zidentyfikuj próbkę za pomocą oświetlenia w jasnym polu, a następnie użyj fluorescencji epi o długości 488 nanometrów, aby skupić się konkretnie na naskórku dodatnim GFP. Przełącz na tryb skanowania konfokalnego.

Dostosuj odpowiednio intensywność lasera i czas ekspozycji dla każdego z kanałów. Zadbaj o zrównoważenie mocy lasera i czasu naświetlania, aby zapewnić optymalne wykrywanie sygnału i zapobiec fototoksyczności. Aby zidentyfikować wytłaczane komórki, użyj fluorescencji epi do wizualizacji naskórka znakowanego GFP i zidentyfikuj grupę komórek w klasycznym wzorze rozety składającym się ze zbioru komórek otaczających małą okrągłą komórkę pośrodku.

Dodatkowo powinna istnieć akumulacja aktyny oznaczonej znakiem RFP widoczna jako pierścień wokół małej okrągłej komórki pośrodku, co jest cechą charakterystyczną wytłaczania komórek. Po zidentyfikowaniu komórki wytłaczającej szybko ustaw górny i dolny limit dla serii Z oraz rozmiar kroku. Następnie zacznij zbierać cztery zestawy danych konfokalnych D, aby wyświetlić dane i zobrazować skurcz pierścienia aktynowego i zachowania nabłonkowe, które zachodzą wokół umierającej komórki.

Z biegiem czasu twórz projekcje 3D serii Z i zapisuj dane jako plik filmowy. Ten krok można wykonać za pomocą różnych pakietów oprogramowania. Rysunek ten przedstawia ekspresję RFP UTR CH w naskórku larw zebry CK GFP po czterech dniach od zapłodnienia.

Tutaj nadal kadrują się projekcje Z z filmu poklatkowego, które podążają za dynamiką gry na żywo. Podczas procesu ekstruzji komórek nabłonka pokazane są strzałki oznaczające pierścień aktyny utworzony przez sąsiednie komórki, który kurczy się i zamyka w ciągu dwóch minut. Postępując zgodnie z tą procedurą, możemy zastosować inne metody w połączeniu z tą techniką, takie jak stosowanie inhibitorów chemicznych lub mutacji genetycznych, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób zmiana ekstruzji może prowadzić do określonych stanów chorobowych.

Ze względu na niepowodzenie w usuwaniu komórek apoptotycznych, właśnie pokazaliśmy, jak skonfigurować eksperyment z obrazowaniem poklatkowym, aby zobrazować proces wytłaczania z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ograniczeniu ilości światła wystawionego na próbkę, aby zapobiec wybielaniu lub toksyczności fotograficznej. Więc to wszystko.

Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.