Name: Obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo ekstruzji komórek z naskórka Danio rerio. Technika fluorescencyjna pozwala obserwować dynamikę aktyny podczas usuwania apoptotycznych komórek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Rosenblatta za dyskusje naukowe, sugestie i uwagi. Chcielibyśmy również podziękować Mary Halloran za uprzejme udostępnienie plazmidu kodującego RFP-UtrCH oraz Davidowi Grunwaldowi za dostarczenie transgenicznych danio pręgowanych CK:GFP. Dziękujemy również Gretchen King oraz personelowi Centralized Zebrafish Resource na University of Utah za doskonałą opiekę i utrzymanie danio pręgowanych. Praca ta była finansowana z grantu NIH-NIGMS NIH Director’s New Innovator Award 1 DP2 OD002056-01 przyznanego JR. GTE otrzymała wsparcie z grantu NIH Multidisciplinary Cancer Training Program Grant 5T32 CA03247-8.

Podstawowy schemat postępowania w wizualizacji dynamiki aktyny podczas ekstruzji komórek w naskórku rozwijającego się danio pręgowanego
Epidermis rozwijającego się danio pręgowanego składa się z dwóch odrębnych warstw: warstwy powierzchniowej (perydermy) oraz warstwy podstawnej komórek, które kontaktują się z błoną podstawną2. Komórki zewnętrznej warstwy powierzchniowej ulegają apoptozie i są usuwane z tkanki poprzez ekstruzję3 (Ryc. 1). Aby zwizualizować ten proces w czasie rzeczywistym, wstrzykujemy do zarodków transgenicznych danio pręgowanego na etapie jednej komórki, wykazujących ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod promotorem cytokeratyny 8 dla nabłonka wielowarstwowego6, RNA kodujące czerwone białko fluorescencyjne połączone z domeną homologii kalponiny utrofiny, białka wiążącego aktynę (RFP-UtrCH) 4,5 (Ryc. 2A). Chociaż po wstrzyknięciu RNA białko RFP-UtrCH jest wyrażane powszechnie w całym organizmie, skupiamy się na powierzchniowych komórkach epidermy wykazujących ekspresję zarówno RFP, jak i GFP, aby śledzić dynamikę aktyny specyficznie w naskórku (Ryc. 2B). Następnie traktujemy larwy G418, aby wywołać apoptotyczną ekstruzję komórek, a następnie obrazujemy epidermis i filamenty aktynowe przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym i pozyskujemy zbiory danych 4D.
Przed rozpoczęciem eksperymentu
<ol>
	<li>Przeprowadź transkrypcję RNA in vitro z linearyzowanego matrycowego DNA przy użyciu zestawu mMessage mMachine SP6 (Ambion), a następnie oczyść RNA z czapeczką za pomocą zestawu RNeasy Mini (Qiagen). Rozcieńcz RNA do stężenia ˜60ng/ul w sterylnej wodzie, przygotuj aliquoty po 3-5μl i przechowuj w temperaturze -80°C do momentu wstrzyknięcia. Uwaga: Unikaj wielokrotnego zamrażania i odmrażania, aby zapobiec degradacji RNA.</li>
 <li>Przygotuj formę do unieruchamiania embrionów podczas wstrzykiwania, wlewając 40mL 2% agarozy w podłożu E3 dla embrionów (E3) do płytki hodowlanej 10 x 15mm i umieszczając w niej formę do mikroiniekcji (Adaptive Science Tools, # I-34). Po zestaleniu się agarozy wyjmij formę, aby odsłonić wgłębienia w agarozie. Przechowuj płytkę w temperaturze 4°C do momentu użycia.</li>
 <li>Wytraw igły kapilarne do wstrzykiwania z borokrztalowego szkła z włóknami (OD 1.0mm, ID 0.78, długość 10cm) za pomocą wyciągacza pipet Sutter P-97 przy następujących ustawieniach (Heat 485, Pull 50, Velocity 60, Delay/Time 90, Pressure 20). Uwaga: Różne rodzaje szkła będą wymagały optymalizacji wymienionych parametrów.</li>
 <li>Przygotuj 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (Low Melt, LM) w podłożu E3 i przechowuj aliquoty po 1mL w temperaturze 42°C. Należy zachować ostrożność, ponieważ odparowanie E3 z zapasów może zwiększyć stężenie agarozy.</li>
 <li>Utrzymuj dorosłe rybki danio w standardowych warunkach laboratoryjnych, z regularnym cyklem światła i ciemności: 14 godzin światła i 10 godzin ciemności7. Wieczorem, dzień przed eksperymentem, przygotuj ryby do rozrodu, umieszczając 3 samice i 2 samce w zbiorniku przedzielonym przegrodą. Następnego ranka wymień wodę w zbiorniku i usuń przegrodę w momencie zapalenia świateł.</li>
</ol>
1. Iniekcja RNA kodującego białko wiążące aktynę z fluorescencyjnym znacznikiem
<ol>
	<li>Rozmrozić RNA na lodzie. Dodać czerwień fenolową 0,5% do RNA w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowe stężenie RNA ok. 30ng/μl, a następnie napełnić 1μl roztworu do wyciągniętej igły kapilarnej metodą wstecznego napełniania. </li>
 <li>Zebrać ok. 75 embrionów CK:GFP w stadium jednego komórki8 w medium E3. Przenieść zebrane embriony do formy do mikrowstrzykiwania za pomocą pipety Pasteura 5 ¾ i delikatnie ustawić embriony w rynience pęsetą FST Dumont #5. Uwaga: Należy pracować szybko, aby uniknąć wstrzyknięcia w embrion w stadium wielokomórkowym, co może prowadzić do mozaikowej ekspresji wstrzykniętego RNA.</li>
 <li>Pod standardowym laboratoryjnym stereomikroskopem sekcyjnym wstrzyknąć RNA do żółtka embrionów, używając mikrowstrzykiwacza z kontrolą ciśnienia (Harvard Apparatus PLI-10 Pico-Injector). Po wstrzyknięciu w embrionie powinna być widoczna czerwona kropka (czerwień fenolowa). Wstrzyknąć RNA do co najmniej 50 embrionów dla każdego eksperymentu. (Szczegółowy protokół wstrzykiwania RNA do embrionów danio przełamanego znajduje się w poprzednim protokole JoVE9). 
	Uwaga: 
 <ol type="A">
 	<li>Do wstrzykiwania RNA do embrionów w stadium jednej komórki należy użyć objętości ok. 2nl. Aby określić ilość wstrzykniętego RNA, należy wydać bolus RNA do kropli oleju mineralnego na skalibrowanym szkiełku z mikrometrem lub pod mikroskopem z wbudowaną skalą w okularach. Kropla RNA powinna mieć kształt idealnej sfery. Ilość dostarczonego materiału obliczyć za pomocą wzoru: Objętość (w nl) = 4/3πr3. Dostarczoną objętość można regulować, zmieniając ciśnienie wstrzykiwania lub czas trwania procesu w urządzeniu. </li>
 <li>Należy również dbać o to, aby wstrzyknąć najmniejszą ilość RNA umożliwiającą wizualizację fluoroforu, ponieważ wysokie stężenia RNA mogą być toksyczne dla rozwijającego się embrionu. W celu ustalenia odpowiedniego poziomu ekspresji przed rozpoczęciem właściwego eksperymentu należy przeprowadzić badanie krzywej dawka-odpowiedź.</li>
 
 </ol>
</li>
<li>Posegregować embriony, usuwając niezapłodnione lub uszkodzone jaja, a pozostałe embriony umieścić w temperaturze 28,5°C. </li>
<li>Po 24 godzinach, za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu sekcyjnego, wybrać embriony danio przełamanego wykazujące wysoki poziom fluorescencji GFP (naskórek) i RFP (aktyna). Wybrane embriony przechowywać w temperaturze 28,5°C aż do rozpoczęcia podawania leku indukującego apoptozę.</li>
</ol>

2. Indukcja ekstruzji komórek w larwach danio pręgowanego przy użyciu G418
Stwierdziliśmy, że ekspozycja na antybiotyk aminoglikozydowy G418, znany również jako Geneticin, wywołuje apoptozę i ekstruzję komórek epidermalnych w rozwijających się larwach zebrafish3 poprzez nieznany mechanizm. Co istotne, zabieg ten działa jedynie w przypadku larw w 4. dniu po zapłodnieniu i starszych. Zaobserwowaliśmy, że w dowolnym momencie w nabłonku płetwy larw zebrafish traktowanych G418 można znaleźć ˜ 5-25 ekstrudujących komórek. Ponieważ liczba apoptotycznych komórek ulegających ekstruzji może się różnić między osobnikami, zalecamy montowanie kilku ryb do obrazowania.
<ol>
	<li>Zebraikowe larwy w 4. dniu po zapłodnieniu (dpf), wykazujące fluorescencję GFP i RFP, zebrać i umieścić w naczyniu hodowlanym o wymiarach 35 x 10mm zawierającym 3 mililitry (mLs) medium E3. W naczyniu tej wielkości można poddać procesowi do 25 larw.</li>
 <li>Ostrożnie wymienić medium na 3mLs medium E3 zawierającego 1mg/mL G418 i inkubować larwy w obecności leku przez 4 godziny w temperaturze 28.5°C. Należy pamiętać, że G418 jest światłoczuły, dlatego należy zadbać o to, aby naczynie hodowlane było przykryte lub znajdowało się w ciemności.</li>
 <li>Usunąć medium i zastąpić je podgrzanym do 28.5°C medium E3 zawierającym 0.02% Tricaine, a następnie przystąpić do montowania larw.</li>
</ol>

3. Montowanie larw zebrafish do obrazowania

<ol>
	<li>Przenieś 3 larwy do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml i usuń większość medium E3 po opadnięciu ryb na dno probówki. Ustalono, że przed zestaleniem się agarozy można poprawnie zamontować do 3 osobników. </li>
 <li>Używając przyciętego końcówki pipety, nanieś 120 µl 1% LM-agarozy (42°C) do probówki, wymieszaj, a następnie delikatnie nanieś mieszaninę larw i agarozy na szkiełko nakrywkowe znajdujące się na dnie naczynia hodowlanego MatTek.</li>
 <li>Używając uchwytu do szpilek FST z włożoną szpilką lub przymocowaną igłą wolframową, szybko ustaw larwy tak, aby leżały prosto i płasko przy szkiełku nakrywkowym naczynia MatTek. 
	Uwaga: Zazwyczaj najpierw używamy prostej szpilki do orientacji larw, a następnie szpilki w kształcie litery L, aby upewnić się, że przylegają one płasko do szkiełka nakrywkowego, zapobiegając jednocześnie uszkodzeniu preparatów. 
</li>
 <li>Po zestaleniu się agarozy delikatnie wypełnij naczynie medium E3 zawierającym 0,02% Tricaine.
	Uwaga: Alternatywnie do medium E3 w naczyniu do obrazowania można dodać G418, aby kontynuować indukcję ekstruzji, choć długotrwała ekspozycja na 1 mg/mL G418 spowoduje śmierć larw. 
</li>
</ol>
4. Obrazowanie na żywo dynamiki aktyny i zachowań poszczególnych komórek nabłonkowych podczas ekstruzji komórkowej przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym

Stwierdziliśmy, że cały proces ekstruzji komórek apoptotycznych z naskórka rozwijających się larw rybek zebrafish trwa około 20 minut3. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przygotować eksperyment obrazowania poklatkowego w celu zebrania serii płaszczyzn z w pojedynczej warstwie naskórka rybek zebrafish, aby zwizualizować proces ekstruzji. Zaobserwowaliśmy, że typowe fluorescencyjne mikroskopy szerokopolowe powodują znaczny fotobleaching filamentów aktynowych i nie pozwalają na obrazowanie poklatkowe. Dlatego, aby zmaksymalizować rozdzielczość i zapobiec fotobleachingowi, stosujemy konfokalny mikroskop z wirującym dyskiem. Poniżej opisujemy, jak przygotować eksperyment przy użyciu oprogramowania Andor IQ z mikroskopem Nikon, choć omówione zasady można zastosować w podobnych konfiguracjach mikroskopowych.
<ol>
	<li>W pierwszej kolejności włącz lasery argonowy (do wzbudzenia GFP przy 488nm) i HeNe (do wzbudzenia RFP przy 561nm), mikroskop, kamerę oraz lampę epifluorescencyjną.</li>
 <li>W oprogramowaniu Andor IQ (wersja 1.10.1) utwórz protokół serii czasowej zawierający wybrane długości fal do obrazowania, częstotliwość odstępów między kolejnymi ujęciami oraz liczbę powtórzeń procesu akwizycji.</li>
 <li>Delikatnie umieść naczynie MatTek z preparatem na stole mikroskopu i używając obiektywu 20x z oświetleniem przeświecającym, ustaw ostrość na larwy.</li>
 <li>Przesuń obiektyw immersyjny 40X w wodzie (N.A. 0,8) do odpowiedniej pozycji. Używając tego obiektywu, możemy filmować około 20-25 komórek w jednym polu widzenia, co pozwala na śledzenie zachowań komórkowych podczas ekstruzji przy jednoczesnej rozdzielczości dynamiki aktyny wewnątrzkomórkowej. Uwaga: Te same strategie montażu i obrazowania można zastosować w mikroskopach odwróconych, przy czym należy użyć obiektywu immersyjnego 40X w wodzie z długą odległością roboczą.</li>
 <li>Ostrożnie nałóż kroplę wody na górną część obiektywu 40x i szybko umieść na niej naczynie MatTek. Uwaga: Jeśli problemem jest odparowywanie wody, można zastosować roztwór immersyjny Zeiss Immersol.</li>
 <li>Zidentyfikuj preparat, korzystając z oświetlenia fazowego lub DIC, a następnie użyj epifluorescencji 48nm, aby precyzyjnie ustawić ostrość na skórę (epidermis) wykazującą pozytywną fluorescencję GFP.</li>
 <li>Przełącz urządzenie w tryb skanowania konfokalnego. Odpowiednio dostosuj intensywność lasera i czas ekspozycji dla każdego z kanałów (48nm i 561nm). Należy zachować równowagę między mocą lasera a czasem ekspozycji, aby uzyskać optymalną detekcję sygnału i zapobiec fotobleachingowi lub toksyczności.</li>
 <li>Aby zidentyfikować komórki podlegające ekstruzji, użyj epifluorescencji do wizualizacji skóry znakowanej GFP i znajdź grupę komórek ułożonych w klasyczny wzór rozety, składający się z zespołu komórek otaczających małą, okrągłą komórkę w centrum. W trybie skanowania konfokalnego widoczne powinno być również nagromadzenie aktyny znakowanej RFP w formie pierścienia wokół małej, okrągłej komórki w środku, co jest cechą charakterystyczną ekstruzji komórkowej. Po zidentyfikowaniu komórki podlegającej ekstruzji, szybko skonfiguruj mikroskop do akwizycji konfokalnych zbiorów danych 4D (X-Y-Z-Czas).</li>
 <li>Wyznacz górny i dolny punkt w płaszczyźnie z, aby zwizualizować pojedynczą warstwę skóry, w tym komórkę podlegającą ekstruzji, i wybierz wielkość kroku. Dla obrazowania time-lapse ustaw odstępy czasowe między ujęciami oraz liczbę powtórzeń. Przykładowo, zazwyczaj wykonujemy serię z w zakresie 5-10μm, z krokiem 1 μm, co 1-2 minuty przez okres 30 minut.</li>
 <li>Aby przejrzeć dane, zazwyczaj tworzymy projekcje 3D serii z i zapisujemy zbiór danych jako plik wideo zgodny z Quick Time (Apple). W ten sposób możemy wizualizować skurcz pierścienia aktynowego oraz zachowania nabłonka występujące wokół obumierającej komórki w czasie.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig1.jpg" alt="Schemat ekstruzji komórkowej; montaż pierścienia filamentów aktynowych, kontrakcja i proces apoptozy komórki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat ekstruzji apoptotycznej komórki. Filamenty aktynowe zaznaczono kolorem czerwonym, komórki naskórka GFP-dodatnie kolorem zielonym.
<img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig2.jpg" alt="Zbiór danych 4D nabłonka płetw; komórki larw RFP-UtrCH, CK:GFP w procesie ekstruzji, schemat mikroskopowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Schemat eksperymentalny. A. Schemat przebiegu eksperymentu. BEkspresja RFP-UtrCH w naskórku 4-dniowych zarodków ryb zebrafish CK:GFP. 
<img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig3.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna wykazująca lokalizację białek CK:GFP i RFP-UtrCH; obraz scalony (merge) uwidacznia kolokalizację." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3. Klatki (projekcje osi z) z filmu time-lapse przedstawiającego dynamikę aktyny na żywo podczas procesu ekstruzji komórek nabłonkowych. Strzałki wskazują pierścień aktyny utworzony przez sąsiednie komórki, który kurczy się i zamyka w ciągu 2 minut.

<ol><li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li>
<li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li>
<li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li>
<li>Burkel, B. M., Dassow, G. von, Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li>
<li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li>
<li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%2C+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroreductase-mediated+cell%2Ftissue+ablation+in+zebrafish%3A+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li>
</ol>

Zapewnienie dobrostanu zwierząt
Wszystkie procedury przeprowadzone w ramach niniejszego protokołu z użyciem danio pręgowanego, Danio rerio, zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Utah (Zapewnienie Dobrostanu Zwierząt nr 10-07017).

Opisany tutaj protokół demonstruje prostą i przejrzystą metodę wizualizacji procesu ekstruzji w żywej tkance nabłonkowej. Ten rodzaj eksperymentu pozwala na zbadanie subtelności dynamiki aktyny, których nie doceniano wcześniej w analizach tkanek utrwalonych, i w związku z tym uzupełnia powszechne metody immunofluorescencyjne. Protokół ten możemy zastosować w połączeniu z inhibitorami chemicznymi lub mutantami genetycznymi, aby lepiej przeanalizować proces ekstruzji oraz badać stany chorobowe związane z niezdolnością do u...

<table><tbody><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Odczynnik</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 Kit</td><td>Odczynnik</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Zbiorniki do przenoszenia</td><td>Narzędzie</td><td>Thoren Aquatic Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa do pipet</td><td>Narzędzie</td><td>Bel Art Products</td><td>F3789</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura 5&lt;sup&gt; &amp;#190;&lt;/sup&gt; </td><td>Narzędzie</td><td>VWR international</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Forma do mikroiniekcji</td><td>Narzędzie</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>I-34</td><td></td></tr><tr><td>Płytka hodowlana 100x15mm</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Wytoparka mikropipet Flamming/Brown</td><td>Narzędzie</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P97</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary borokrzemowe z włóknem</td><td>Narzędzie</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B1400-78-10</td><td>OD 1.0mm, ID 0.78mm, długość 10cm</td></tr><tr><td>Słoik do przechowywania elektrod</td><td>Narzędzie</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>0.5% w DPBS</td></tr><tr><td>Mikroinjektor i mikromanipulator z kontrolą ciśnienia</td><td>Narzędzie</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>Szalka hodowlana 35x10mm</td><td>Narzędzie</td><td>Cellstar</td><td>627-160</td><td></td></tr><tr><td>G418 (Geneticyna)</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10131-035</td><td>50 mg/mL w dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #5</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do pinów 12cm</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Piny wkładkowe</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>26007-02 i -03</td><td></td></tr><tr><td>Szalka hodowlana z dnem szklanym i szkiełkiem nakrywkowym 1.5</td><td>Narzędzie</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1360-100</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy</td><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>S2X12</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop z wirującym dyskiem</td><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse Ti</td><td>Wyposażony w głowicę z wirującym dyskiem Yokagawa</td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Kamera</td><td>Andor</td><td>DV-885-VP</td><td>Kwadratowe piksele 1002x1004x8 mikronów</td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatyczne utrzymanie tkanek nabłonkowych wymaga ciągłego usuwania uszkodzonych komórek bez zaburzania funkcji bariery. Nasze badania wykazały, że obumierające komórki wysyłają sygnały do żyjących sąsiadów, aby utworzyli i skurczyli pierścień z aktyny i miozyny, który wyrzuca komórkę z płata nabłonka, jednocześnie zamykając wszelkie luki, które mogły powstać w wyniku jej usunięcia; proces ten nazywa się ekstruzją komórkową1. Przezroczystość optyczna rozwijających się danio pręgowanych stanowi doskonały system do wizualizacji ekstruzji w żywych nabłonkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę indukowania i obrazowania ekstruzji w naskórku larw danio pręgowanych. Aby zwizualizować ekstruzję, wstrzykujemy sondę znakowaną czerwonym białkiem fluorescencyjnym przeciwko F-aktynie do transgenicznych embrionów danio pręgowanych w stadium jednej komórki, które wykazują ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego w naskórku, a następnie indukujemy apoptozę poprzez dodanie G418 do larw. Następnie wykorzystujemy obrazowanie poklatkowe (time-lapse) na konfokalnym mikroskopie z dyskiem obrotowym, aby obserwować dynamikę aktyny i zachowanie komórek nabłonkowych podczas procesu ekstruzji komórek apoptotycznych. Podejście to pozwala nam badać proces ekstruzji w żywych nabłonkach i otworzy drogę do badania stanów chorobowych spowodowanych niezdolnością do eliminacji komórek apoptotycznych.

Obumierające komórki są usuwane z tkanek nabłonkowych poprzez skoordynowany skurcz komórek sąsiednich, bez naruszania funkcji barierowej. Przejrzystość optyczna rozwijających się rybek danio przymrużonych stanowi doskonały system do wizualizacji procesu ekstruzji w żywych nabłonkach. W niniejszej pracy opisujemy metody indukcji i obrazowania ekstruzji w naskórku larw rybek danio przymrużonych z rozdzielczością komórkową.

Obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego

Utrzymanie homeostazy tkanek nabłonkowych wymaga ciągłego usuwania uszkodzonych komórek bez naruszania funkcji barierowej. Nasze badania wykazały...

Utrzymanie tkanek nabłonkowych wymaga ciągłego usuwania uszkodzonych i obumierających komórek bez naruszania funkcji bariery. Aby to osiągnąć, nabłonek usuwa obumierające komórki poprzez tworzenie i kurczenie pierścienia aktyny i miozyny w komórkach otaczających komórkę obumierającą, co pozwala na jej wyrzucenie przy jednoczesnym zamykaniu wszelkich luk, które mogły powstać w wyniku jej usunięcia. W tym artykule wideo przedstawiono metodę indukcji i obrazowania ekstruzji komórek apoptotycznych z naskórka larw ryby danio pręgowanego w czasie rzeczywistym.W pokazany sposób osiąga się to poprzez wstrzyknięcie sondy F-aktyny znakowanej czerwonym białkiem fluorescencyjnym do zarodków transgenicznych danio pręgowanego na jednym z etapów rozwoju, które wykazują ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego w naskórku, aby zwizualizować filamenty aktynowe w tkankach nabłonkowych. Larwy w czwartym dniu po zapłodnieniu, wykazujące ekspresję zarówno GFP, jak i RFP, są następnie traktowane G418 w celu indukowania apoptozy w naskórku. Dynamika aktyny oraz zmiany kształtu komórek nabłonkowych zachodzące podczas ekstruzji są wizualizowane za pomocą obrazowania time-lapse na konfokalnym mikroskopie z dyskiem wirującym.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analizy sił immunologicznych, jest możliwość obserwacji gwałtownych zmian i dynamiki aktyny zachodzących podczas procesu ekstruzji w żywej tkance nabłonkowej. W tym filmie przedstawimy procedurę obrazowania ekstruzji komórek apoptotycznych z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego w czasie rzeczywistym. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby zrozumieć, w jaki sposób komórki koordynowanie reorganizują swój cytoszkielet aktynowy w celu usunięcia komórek apoptotycznych przy jednoczesnym zachowaniu funkcji barierowej oraz w jaki sposób zaburzenia procesu ekstruzji mogą prowadzić do określonych stanów chorobowych.Zacznijmy zatem. Aby zwizualizować dynamikę aktyny podczas ekstruzji komórek w naskórku rozwijającego się danio pręgowanego, należy rozpocząć od rozmrożenia wcześniej przetranskrybowanego RNA na lodzie. Transkrybujemy mRNA kodujące czerwone białko fluorescencyjne połączone z domeną homologii kalpainy utrofiny oraz białkiem wiążącym aktynę. Dodaj czerwień fenolową do RNA w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać końcowe stężenie RNA wynoszące około 30 ng/µL, a następnie załaduj 1 µL roztworu do wyciągniętej igły kapilarnej poprzez napełnianie wsteczne.Zebrać około 75 embrionów C-K-G-F-P w stadium 1 komórki do buforu E trzy. Za pomocą pipety Pastera o średnicy 5 ¾ przenieść zebrane embriony do formy do mikroiniekcji i delikatnie ułożyć je w rowku za pomocą pęsety Dumont nr 5. Pracować szybko, aby uniknąć konieczności iniekcji RNA do embrionów w różnych stadiach rozwoju, korzystając ze standardowego laboratoryjnego stereomikroskopu sekcyjnego.Użyj mikroinjektora sterowanego ciśnieniem, aby wstrzyknąć RNA do żółtka embrionów jako kontrolę fenolową. Po iniekcji w embrionie powinien być widoczny kolor czerwony. Należy upewnić się, że w każdym eksperymencie poddano iniekcji co najmniej 50 embrionów.Posegreguj embriony, aby usunąć wszystkie niezapłodnione lub uszkodzone jaja, a następnie inkubuj pozostałe embriony w temperaturze 28°C. Po 24 godzinach, używając fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, wybierz embriony danio pręgowanego, które wykazują wysoki poziom fluorescencji GFP w naskórku oraz fluorescencję znakowaną RFP. Inkubuj wybrane embriony w temperaturze 28°C do momentu rozpoczęcia leczenia farmakologicznego w celu indukcji apoptozy poprzez ekspozycję na aminoglikozyd.Antybiotyk G 418 lub lek wywołuje ekstruzję komórek apoptotycznych z naskórka rozwijających się larw zebrafish. Co istotne, aby wywołać ekstruzję komórek, zabieg ten działa wyłącznie na larwy w 4. dniu po zapłodnieniu i starsze. Przenieś do szalki hodowlanej o wymiarach 35 × 10 mm zawierającej 3 mL pożywki E3 do 25 larw zebrafish w 4. dniu po zapłodnieniu, wykazujących ekspresję zarówno GFP, jak i RFP.Ostrożnie zastąp medium trzema mililitrami E three zawierającego 1 mg/mL G four 18 i inkubuj larwy w leku przez cztery godziny w ciemności w temperaturze 28 °C. Następnie usuń medium i zastąp je podgrzanym wcześniej medium E three zawierającym 0,02% trica, a następnie przystąp do montowania larw do obrazowania. Przenieś do trzech larw do probówki typu fendor o pojemności 1,5 mL i usuń większość medium E three.Za pomocą przyciętej końcówki pipety pipetować 120 µL 1% low melt agarose do probówki i wymieszać. Następnie delikatnie przenieść larwy wraz z mieszaniną agarose na szkiełko nakrywkowe znajdujące się na dnie naczynia hodowlanego Matech. Używając uchwytu do pinów FST z włożonym pinem lub przymocowaną igłą wolframową, szybko zorientować larwy tak, aby leżały prosto i płasko na szkiełku nakrywowym.Pozostaw agarozy do stężenia. Następnie delikatnie wypełnij szalkę pożywką E3 zawierającą 0,02% trica. Stwierdziliśmy, że cały proces ekstruzji komórek apoptotycznych z naskórka rozwijających się larw zebrafish trwa około 20 minut.W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przygotować eksperyment obrazowania time-lapse z wykorzystaniem konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym oraz oprogramowania and or IQ w celu zebrania serii płaszczyzn Z przez pojedynczą warstwę naskórka danio pręgowanego. Najpierw, za pomocą oprogramowania and or IQ, włącz lasery argonowe i helowo-neonowe, kamerę mikroskopową oraz lampę epifluorescencyjną. Następnie utwórz protokół serii czasowej zawierający długości fal, które mają zostać zobrazowane.Częstotliwość odstępów między przejęciami obrazów oraz liczba powtórzeń każdego przejęcia. Ostrożnie umieść szalkę mattec zawierającą preparat na stoliku mikroskopu, a następnie użyj obiektywu 20x i światła przechodzącego, aby ustawić ostrość na larwy. Przesuń obiektyw imersyjny w wodzie 40x do właściwej pozycji. Korzystając z tego obiektywu, możemy filmować około 20 do 25 komórek w jednym polu widzenia, co pozwala nam śledzić zachowania komórkowe podczas ekstruzji, przy jednoczesnej rozdzielczości dynamiki aktyny na poziomie subkomórkowym.Ostrożnie nanieś kroplę wody na górną część obiektywu 40x, a następnie szybko umieść na niej szalkę Mattec. Zidentyfikuj preparat, korzystając z oświetlenia w polu jasnym, a następnie użyj epi-fluorescencji o długości fali 488 nm, aby ustawić ostrość konkretnie na skórę wykazującą ekspresję GFP. Przełącz urządzenie w tryb skanowania konfokalnego.Odpowiednio dostosuj intensywność lasera i czas ekspozycji dla każdego z kanałów. Należy zadbać o zrównoważenie mocy lasera i czasu ekspozycji w celu optymalnej detekcji sygnału oraz zapobiegania fototoksyczności. Aby zidentyfikować ekstrudujące komórki, wykorzystaj fluorescencję epi do wizualizacji epidermy znakowanej GFP i zidentyfikuj grupę komórek w klasycznym wzorze rozety, składającą się ze zbioru komórek otaczających małą, okrągłą komórkę w centrum.Dodatkowo, wokół małej, okrągłej komórki w centrum powinno być widoczne nagromadzenie aktyny znakowanej RFP w formie pierścienia, co jest charakterystyczną cechą ekstruzji komórki. Po zidentyfikowaniu ekstrudującej komórki należy szybko ustawić górną i dolną granicę serii Z oraz wielkość kroku. Następnie należy rozpocząć akwizycję czterech konfokalnych zestawów danych 4D, aby przeanalizować dane oraz zwizualizować skurcz pierścienia aktynowego i zachowania nabłonkowe występujące wokół obumierającej komórki.W czasie wykonaj projekcje 3D serii Z i zapisz dane w formie pliku wideo. Krok ten można zrealizować przy użyciu różnych pakietów oprogramowania. Rysunek ten przedstawia ekspresję RFP UTR CH w naskórku larwy zebrafish CK GFP w czwartym dniu po zapłodnieniu.Poniżej przedstawiono projekcje Z pojedynczych klatek z filmu time-lapse, które obrazują dynamikę procesów zachodzących na żywo. Podczas procesu ekstruzji komórek nabłonkowych strzałki wskazują pierścień aktyny utworzony przez sąsiednie komórki, który kurczy się i zamyka w ciągu dwóch minut. Po przeprowadzeniu tej procedury możemy zastosować inne metody w połączeniu z tą techniką, takie jak wykorzystanie inhibitorów chemicznych lub mutacji genetycznych, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób zaburzenia ekstruzji mogą prowadzić do określonych stanów chorobowych.W związku z niepowodzeniem w usuwaniu komórek apoptotycznych, zaprezentowaliśmy właśnie sposób przygotowania eksperymentu obrazowania time-lapse w celu wizualizacji procesu ekstruzji z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby ograniczyć ilość światła padającego na preparat, aby zapobiec fotoblaknięciu lub toksyczności. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

live-imaging-cell-extrusion-from-epidermis-developing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie na żywo wydalania komórek z naskórka rozwijających się danio pręcikowatych

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Źródło: Williams, A. L., et al. Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia protokół obrazowania poklatkowego wielofotonowego w celu wizualizacji migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodku danio pręgowanego w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością.

Wizualizacja migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodku danio pręgowanego za pomocą wielofotonowego obrazowania poklatkowego

Badanie najwcześniejszych zdarzeń progresji komórek przednowotworowych i interakcji wrodzonych komórek odpornościowych jest kluczowe dla zrozumienia i leczenia raka. W tym miejscu opisujemy metodę warunkowego wywoływania przemian komórek nabłonkowych i późniejszego obrazowania na żywo interakcji wrodzonych komórek odpornościowych z komórkami skóry wyrażającymi HRASG12V u larw danio pręgowanego.

Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami immunologicznymi i przednowotworowymi przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Gal4/UAS w skórze larw danio pręgowanego

Keratocyty danio pręgowanego migrują w arkuszach komórkowych z eksplantatów i dostarczają modelu in vitro do badania mechanizmów zbiorowej migracji komórek w kontekście gojenia się ran nabłonkowych. Protokoły te szczegółowo opisują skuteczny sposób ustanawiania pierwotnych kultur eksplantatów do wykorzystania w zbiorczych testach migracji komórek.

Eksplantaty keratocytów danio pręgowanego w celu zbadania zbiorowej migracji komórek i reepitelializacji w gojeniu się ran skórnych

Łącząc transplantację komórek, znakowanie cytoszkieletu i podejście do utraty/wzmocnienia funkcji, ten protokół opisuje, w jaki sposób migrująca prospektywna płytka przedstrunowa danio pręgowanego może być wykorzystana do analizy funkcji genu kandydującego w migracji komórek in vivo.

Analiza migracji komórek in vivo przy użyciu przeszczepów komórek i obrazowania poklatkowego w zarodkach danio pręgowanego

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem jest doskonałym narzędziem do obrazowania rozwoju embrionalnego. Pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Demonstrujemy jego zastosowanie do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego w szerokich skalach czasoprzestrzennych i przedstawiamy potok do fuzji i dekonwolucji zestawów danych multiview.

Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.

Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Poznaj metodę obrazowania na żywo ekstruzji komórek z naskórka Danio rerio. Technika fluorescencyjna pozwala obserwować dynamikę aktyny podczas usuwania apoptotycznych komórek w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów