Name: Długoterminowe urządzenie do obrazowania na żywo do lepszej eksperymentalnej manipulacji larwami danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: Poznaj metodę wykorzystania urządzenia zWEDGI do długoterminowego obrazowania gojenia ran u larw Danio rerio. Technika umożliwia jednoczesne zadawanie ran i obserwację regeneracji bez utrudniania odrastania ogona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za finansowanie głównego projektu przez Morgridge Institute for Research oraz Laboratory for Optical and Computational Instrumentation. Potwierdzamy również finansowanie z NIH# R01GM102924 (AH i KWE). KH, JMS, RS, AH i KWE wymyśliły i zaprojektowały badanie. KH i JMS przeprowadziły wszystkie eksperymenty przy wsparciu DL, KP i RS. KH, JS, RS, AH i KWE przyczyniły się do powstania manuskryptu.

Uwaga: Podstawowy projekt zWEDGI został opracowany dla larw danio pręgowanego, które są 2 do 4 dni po zapłodnieniu (dpf) i są zgodne z wytycznymi University of Wisconsin-Madison Research Animals Resource Center.
1. Projektowanie i druk 3D form
<ol>
	<li>Modeluj komponent PDMS urządzenia z żądanymi geometriami i atrybutami w oprogramowaniu do modelowania 3D5. Utwórz zespół pustej formy i części PDMS i wygeneruj formę ujemną dla części PDMS, tworząc wnękę w formie odpowiadającą części PDSM. Zapisz formę jako plik .stl do druku 3D (Rysunek 2, Krok 1.1). 
	UWAGA: Plik w formacie stereolitografii (.stl) przedstawiający projekt formy przedstawiony tutaj (Rysunek 1) jest dostępny do pobrania pod adresem https://morgridge.org/designs/.</li>
	<li>Drukuj formy za pomocą fotopolimerowej drukarki 3D (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2, Krok 1.2). Jeśli to możliwe, wykonaj wiele form na jednym wydruku, aby można było uformować więcej niż jedno urządzenie za pomocą jednej partii PDMS. 
	UWAGA: Pokazany przykład został wydrukowany w trybie Hi-Res ze średnicą wiązki 0,075 mm i grubością warstwy 0,05 mm, przy użyciu żywicy fotopolimerowej5.
	<ol>
		<li>Wyczyść formy za pomocą cienkiej szczotki, denaturatu w butelce z rozpylaczem i sprężonego powietrza, aby delikatnie wyszorować i usunąć nieutwardzoną żywicę. Usuń wszelki materiał z obszarów mikrokanałów.</li>
		<li>Po utwardzeniu form w aparacie UV przez 60 minut z każdej strony, ponieważ nieutwardzona rezygnacja jest toksyczna dla larw danio pręgowanego10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeszlifuj stronę wnęki formy papierem ściernym o ziarnistości 200 na płaskiej powierzchni, aż wszystkie powierzchnie uszczelniające zetkną się z papierem ściernym (geometria kanału ładowania i obwód formy). Lekko przeszlifuj papierem ściernym o ziarnistości 400 i 600, stopniowo, aby uzyskać gładkie, płaskie powierzchnie na wszystkich okładzinach geometrycznych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2, Krok 1.3). Zmierz głębokość wnęki po szlifowaniu za pomocą wskaźnika zegarowego, aby sprawdzić, czy jest ona zbliżona do zaprojektowanej głębokości.
	<ol>
		<li>Wyczyść formy i tarcze pokrywy (1 3/4 cala średnicy x 1/4 cala grubości, szkło borokrzemianowe lub akryl; jedna szklana osłona na formę), umieszczając je w myjce ultradźwiękowej wypełnionej wodą na 30 minut lub spłukując pod bieżącą wodą.</li>
		<li>Wysuszyć sprężonym powietrzem i wyczyścić zarówno formy, jak i pokrywy alkoholem izopropylowym i przefiltrowanym sprężonym powietrzem. Użyj czystej ławki jako miejsca do produkcji urządzeń, aby zminimalizować zanieczyszczenie zanieczyszczeniami unoszącymi się w powietrzu. Pozostaw oczyszczone foremki i szklane pokrywy na czystej ławce lub przykrytej szalce Petriego, aż będą potrzebne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. PDMS Produkcja urządzenia zWEDGI
<ol>
	<li>Wykonaj PDMS, wlewając 184 elastomer silikonowy polidimetylosiloksan (PDMS) w stosunku 5:1 (baza do aktywatora) do plastikowego kubka. Dobrze mieszaj przez 2 minuty drewnianym patyczkiem rzemieślniczym, mieszając żel na sobie, jak przy wyrabianiu chleba. Na 5 foremek użyj 10 g bazy i 2 g aktywatora.
	<ol>
		<li>Mieszaninę odgazowującą w eksykatorze próżniowym przez 25 - 45 minut, aż wszystkie pęcherzyki znikną.</li>
		<li>Wypełnij wnękę każdej z wydrukowanych w 3D form około 0,75 ml PDMS za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml, aż forma nieznacznie przeleje się meniskiem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2, Krok 2.1).</li>
		<li>Odgazowuj napełnione formy przez 45 minut, aby usunąć dodatkowe pęcherzyki, które mogły powstać podczas napełniania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nałóż szklaną osłonę na formę wypełnioną PDMS, dociskając dysk pod kątem, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2, Krok 2.2). Pozwól, aby nadmiar PDMS został usunięty podczas nakładania szklanej osłony dysku.</li>
	<li>Użyj małego zacisku zapadkowego, aby mocno przytrzymać tarczę pokrywy do formy. 
	UWAGA: Tworzy to płaską powierzchnię po utwardzeniu PDMS i wytwarza otwory przelotowe, w których wydrukowane w 3D geometrie są zlicowane ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Alternatywnie, aby zwiększyć liczbę urządzeń, które można utwardzić za jednym razem, zbuduj urządzenie z wieloma zaciskami (np. <silna klasa="xfig">Rysunek 2, Krok 2.3).</li>
	<li>Utwardź urządzenie PDMS w zaciśniętych formach w temperaturze 100 oC w piekarniku przez 90 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, Krok 2.4). Wyjmij foremki z piekarnika i pozostaw do ostygnięcia, aż będzie można je łatwo obsłużyć. Jeśli urządzenie mocujące jest metalowe, wyjmij zespół tarczy formy i pokrywy z zacisku, aby zapobiec dalszemu utwardzaniu PDMS przez metal z powodu ciepła resztkowego. 
	UWAGA: Urządzenie najłatwiej wyjąć z formy, gdy jest jeszcze lekko ciepłe i nie do końca utwardzone. Jednak po wyjęciu formy z piekarnika i usunięciu pokrywy urządzenie może siedzieć przez kilka dni przed przystąpieniem do wyjmowania z formy. Jeśli urządzenie zostanie wyjęte z formy wkrótce po wyjęciu z pieca do utwardzania, umieść je na przykrytej szalce Petriego, aby zminimalizować zanieczyszczenia, a jednocześnie umożliwić mu pełne utwardzenie.</li>
</ol>
3. Plazmowe łączenie zWEDGI ze szklanym naczyniem
<ol>
	<li>Zacisnąć formę zawierającą urządzenie PDMS w imadle stołowym tak, aby geometrie formy były skierowane do góry, równolegle do stołu roboczego.
	<ol>
		<li>Rozpocznij wyjmowanie urządzenia PDMS, zwalniając zaczep PDMS z formy za pomocą pęsety z płaską końcówką. Pracuj pęsetą na obwodzie formy (jak wyjmowanie ciasta z patelni (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2, Krok 3.1)).</li>
		<li>Użyj przefiltrowanego sprężonego powietrza i pęsety, aby delikatnie wyciągnąć urządzenie z formy, przytrzymując uchwyt i wdmuchując powietrze pod urządzenie. Pracuj powoli, pozwalając, aby powietrze pomogło oddzielić PDMS od formy, zwracając szczególną uwagę na końcówki pęsety wokół cienkich odcinków tunelu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść urządzenie PDMS do góry nogami na wewnętrznej stronie pokrywy naczynia ze szklanym dnem tak, aby kliny tunelu ograniczającego dotykały plastiku (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2, Krok 3.2).</li>
	<li>Umieść pokrywę naczynia z odwróconym do góry nogami zWEDGI i odpowiednie naczynie ze szklanym dnem w myjce plazmowej z wewnętrzną szklanką skierowaną do góry (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2, Krok 3.3).
	<ol>
		<li>Opróżnij komorę czyszczenia plazmowego, aż ciśnienie osiągnie 500 mTorr.</li>
		<li>Ustaw moc o częstotliwości radiowej (RF) na wysoką. Wystaw urządzenie i antenę na działanie częstotliwości radiowej przez około 2 minuty. Powoli rozhermetyzuj komorę i umieść urządzenie wraz z naczyniem w okapie w pomieszczeniu czystym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij urządzenie PDMS z pokrywy naczynia. Odwróć PDMS zWEDGI do właściwej orientacji na szkle, umieszczając go ostrożnie na środkowej studzience szklanego dna naczynia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2, Krok 3.4)
	<ol>
		<li>Używając tylnej części pęsety, lekko dociśnij urządzenie PDMS, aby upewnić się, że pęcherzyki powietrza nie zostały uwięzione pod spodem. Zastosuj nacisk wokół drobnych geometrii mikrokanałów i wygładź PDMS aż do krawędzi (<silna klasa="xfig">Rysunek 5C). 
		UWAGA: Pełny kontakt między PDMS a szkłem zapewnia lepszą przyczepność dzięki wiązaniu plazmowemu. Urządzenie zWEDGI może być łączone plazmowo z innymi formatami naczyń ze szklanym dnem, takimi jak 6-dołkowa płytka ze szklanym dnem (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
		<li>Umieść pokrywę na misce urządzenia przed wyjęciem z okapu w pomieszczeniu czystym. 
		UWAGA: Po przymocowaniu urządzeń do szkła protokół można wstrzymać do czasu, aż będą gotowe do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie kanału i ładowanie larw
Uwaga: Ogólna hodowla danio pręgowanego była prowadzona według Księgi Danio pręgowanej, dostępnej online na stronie http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Dorosłe osobniki i zarodki danio pręgowanego utrzymywano zgodnie z wcześniejszym opisem1. Użyto dzikiego szczepu typu AB. Postępuj zgodnie z Protokołem Opieki nad Zwierzętami instytucji, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wymagań dotyczących obrazowania żywych larw.
<ol>
	<li>Przepłukać kanały co najmniej 100 μl 70% etanolu na kanał, używając mikropipety do przepłukania przez tunel ograniczający. Usuń etanol i spłucz 2 lub 3 razy wodą podwójnie destylowaną. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Napełnij kanały odtłuszczonym mlekiem (o stężeniu 1% rozcieńczonym w wodzie) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby zminimalizować przywieranie larw do szklanego szkiełka nakrywkowego naczynia. Następnie delikatnie zanurz urządzenie kilka razy w podwójnie destylowanej wodzie w celu spłukania. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu do góry nogami. 
	UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać protokół. To przygotowanie urządzenia zWEDGI można wykonać na kilka dni przed użyciem. Przechowywać pod przykryciem w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj 1% agarozę o niskiej temperaturze topnienia (LMP), łącząc 100 μl 2% stopionej agarozy LMP ze 100 μl 2x trikainy (0,4 mg/ml trikainy - 3-aminobenzoesanu etylu) w buforze E311 wstępnie podgrzanym do 38 oC. Utrzymuj 1% roztwór agarozy/trikainy w temperaturze 38 oC w gorącym bloku, aby zapobiec żelowaniu. 
	UWAGA: Do mikroskopii wielofotonowej 11 należy użyć niepigmentowanych wariantów danio pręgowanego (takich jak casper12) lub utrzymywać larwy w E3 zawierające 0,2 mM N-fenylotiomocznik, aby zapobiec tworzeniu się pigmentu11, aby zminimalizować absorpcję długości fal bliskiej podczerwieni przez pigment. 
	Uwaga: N-fenylotiomocznik jest toksyczny. Postępuj zgodnie z zasadami instytucji dotyczącymi utylizacji.</li>
	<li>Znieczulić larwy w buforze E3 zawierającym 0,2 mg/ml trikainy (Trikaina/E3)11. Poczekaj, aż larwy będą nieruchome i nie będą reagować na bodziec dotykowy.</li>
	<li>Wstępnie zwilż kanały kilkoma mikrolitrami Tricainy/E3.
	<ol>
		<li>Złap pojedynczą larwę za pomocą końcówki pipety z szerokim otworem. Umieść larwy w kanale załadowczym (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). Za pomocą końcówki do pipet lub podobnego narzędzia ustaw larwę w komorze załadowczej w taki sposób, aby strona grzbietowa była skierowana w stronę prostszej krawędzi komory ładowania, a ogon był skierowany w stronę tunelu ograniczającego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
		<li>Ostrożnie pobrać płyn z komory do ranienia, pozwalając larwie spłynąć do tunelu ograniczającego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). Usuń większość płynu, utrzymując wilgoć wokół larwy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D). Proces ten można wspomóc poprzez lekkie przechylenie naczynia w kierunku komory do nawijania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść 1% agarozy LMP w Tricaine/E3 (~38 oC) nad głową larwy, wypełniając komorę załadowczą (<silna klasa="xfig">Rysunek 3E). Pozwól agarozie zestalić się, a larwa znajduje się we właściwej pozycji. Dodaj Trikainę/E3 do komory do ranienia w razie potrzeby, aby utrzymać nawodnienie. Powtórz ten proces ładowania dla pozostałych 2 kanałów.</li>
	<li>Za pomocą igły strzykawkowej ostrożnie usuń agarozę, która przedostała się przez tunel ograniczający do komory ranienia (<silna klasa="xfig">Rysunek 3F). Dodać dodatkową trikainę/E3 tuż nad agarozą (do zranienia, krótkotrwałego obrazowania lub izolacji leczenia rany) lub w celu napełnienia szalki hodowlanej (do obrazowania długoterminowego). Załóż pokrywkę naczynia hodowlanego, aby zapobiec parowaniu. Larwy mogą być w tym momencie obrazowane (niezranione) lub zranione.</li>
</ol>
5. Ranienie i obrazowanie larw
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnego ostrza skalpela przeciąć płetwę ogonową tylnie do struny grzbietowej11 w komorze do nawijania (<silna klasa="xfig">Rysunek 3G, H). W razie potrzeby dodać więcej tricainy/E3 i założyć pokrywkę naczynia hodowlanego. 
	UWAGA: Alternatywnie, w zależności od interesującego nas okna rozwojowego, larwy mogą zostać zranione, pozostawione do regeneracji w E3 i utrzymywane w inkubatorze (28,5 oC) do pożądanego czasu obrazowania, w którym to momencie można je umieścić w kanałach, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Zamontuj urządzenie zWEDGI ze znieczulonymi larwami na odwróconym mikroskopie we wkładzie scenicznym, który pomieści szklane dno naczynia o średnicy 60 mm. Zlokalizuj ogon larwy w najwyższym kanale, obracając naczynie w razie potrzeby, aby ogon znalazł się w żądanej pozycji. Obraz zgodnie z wymaganiami dla konkretnego eksperymentu. 
	Uwaga: zWEDGI ma szerokie zastosowanie w mikroskopii świetlnej o wysokiej rozdzielczości, w tym we fluorescencji szerokokątnej i laserowej mikroskopii skaningowej. Podczas obrazowania larw danio pręgowanego należy wziąć pod uwagę szereg parametrów, ale konkretne parametry obrazowania zależą od instrumentu, próbki i eksperymentu. W tym przypadku ogon larwy został zobrazowany na specjalnie zbudowanym mikroskopie wielofotonowym5,11 z wykorzystaniem następujących parametrów: 40-krotny obiektyw do zanurzenia w wodzie na dużą odległość roboczą, wzbudzenie laserowe 890 nm, filtr emisyjny 445/20 nm i rozdzielczość 512 x 512.</li>
</ol>
6. Koniec eksperymentu
<ol>
	<li>Wyjmij szalkę zWEDGI z mikroskopu. Poddać larwy eutanazji, umieszczając zWEDGI w lodowatej kąpieli wodnej lub w temperaturze 4 oC na co najmniej 20 minut i ocenić brak bicia serca i krążenia. 
	UWAGA: Ponieważ larwy są przechowywane w oddzielnych komorach, larwy można odzyskać pojedynczo, delikatnie pociągając za agar za pomocą kleszczy lub pipety. Agar można usunąć z okolicy głowy, a larwę wykorzystać do dodatkowych procedur, takich jak utrwalenie w celu barwienia przeciwciał lub przetworzyć w celu ekstrakcji RNA lub białka.</li>
	<li>Po usunięciu larw i agaru należy oczyścić zWEDGI etanolem i wodą destylowaną, jak opisano w kroku 4.1 i ustawić do góry nogami do wyschnięcia na powietrzu. Przechowywać pod przykryciem w chłodnym, suchym miejscu. W razie potrzeby ponownie pokryć odtłuszczonym mlekiem (krok 4.2) przed następnym użyciem. 
	UWAGA: zWEDGI mogą być wielokrotnie używane, aż PDMS zacznie odchodzić od szkła.</li>
</ol>

<ol><li>Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+redox%2C+Src+family+kinase%2C+and+calcium+signaling+integrate+wound+responses+and+tissue+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish.</a> J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).</li>
<li>Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+fin+primordia+of+zebrafish+larvae+regenerate+by+a+similar+growth+control+mechanism+with+adult+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dynam%22%5BJournal%5D)">Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration.</a> Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).</li>
<li>Konantz, J., Antos, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetic+morpholino+approach+using+cardiac+ventricular+injection+to+transfect+multiple+difficult-to-target+tissues+in+the+zebrafish+larva%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva.</a> JoVE. (88), (2014).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHall%2C+C+%22Live+Imaging+in+Zebrafish%3A+Insights+into+Development+and+Disease%22">Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease</a>. Sampath, K., Roy, S. , World Scientific Pubs. Singapore. (2010).</li>
<li>Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((zWEDGI%3A+Wounding+and+Entrapment+Device+for+Imaging+Live+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. , (2016).</li>
<li>Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+tissue+repair+in+zebrafish+larvae+with+time-lapse+brightfield+stereomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy.</a> JoVE. (95), (2015).</li>
<li>Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+blood+vessels+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging blood vessels in the zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 100, 27-54 (2010).</li>
<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> JoVE. (26), (2009).</li>
<li>Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCORE+imaging%3A+specimen+in+a+corrected+optical+rotational+enclosure%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure.</a> Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).</li>
<li>Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+biocompatibility+of+3D+printed+photopolymers+using+zebrafish+embryo+toxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays.</a> Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).</li>
<li>LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+generation+microscopy+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Second harmonic generation microscopy in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).</li>
<li>White, R. M., Sessa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+Adult+Zebrafish+as+a+Tool+for+In+Vivo+Transplantation+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+9+modulates+collagen+matrices+and+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair.</a> Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).</li>
<li>Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zadaniem urządzenia zWEDGI jest uchwycenie obrazowania poklatkowego 3D poprzez stabilizację i orientację ryb w niewielkiej odległości roboczej obiektywu mikroskopu o wysokiej rozdzielczości. Spełniając te specyfikacje projektowe, jest to również ulepszenie w stosunku do tradycyjnego preparatu na bazie agaru do obrazowania na żywo. Istnieją trzy krytyczne etapy (poniżej) produkcji zWEDGI, które, jeśli nie zostaną wykonane prawidłowo, mogą skutkować wadliwymi urządzeniami:
Przygotowanie PDMS (<s...

Zdolność regeneracyjna larw danio pręgowanego Danio rerio sprawia, że są one idealnym organizmem modelowym do badania reakcji rany, jak również gojenia i odrastania1,2,3,4. Dostęp do szeregu transgenicznych linii do danio pręgowanego i anatomiczna przezroczystość danio pręgowanego dodatkowo zwiększają ich użyteczność w badaniach in vivo zdarzeń reakcji na rany, a także długoterminowych procesów regeneracyjnych4. Badanie tych procesów biologicznych przy użyciu poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości wymaga zatem urządzenia do obrazowania na żywo, które pozwala na wysoką stabilność i minimalny ruch larwy danio pręgowanego przy jednoczesnym zachowaniu żywotności. Kluczowe jest, aby urządzenie pozwalało na skuteczne zranienie, podczas gdy gojenie i regeneracja przebiegały bez wpływu urządzenia.
Standardowa metoda stabilizacji obrazowania na żywo, polegająca na osadzaniu larwy w agarozie podczas obrazowania na żywo, ogranicza wzrost i regenerację ran5 i może zwiększyć śmiertelność, ponieważ larwy zaczynają wykazywać oznaki stresu sercowego i martwicy tkanek po czterech godzinach4. Dlatego usunięcie agarozy z obszarów zainteresowania jest często konieczne, aby umożliwić normalny rozwój i regenerację6, narażając larwy na potencjalne uszkodzenia podczas odcinania agarozy. Ponadto, w przypadku techniki osadzania agarozy, użytkownik musi zorientować larwy w krótkim czasie, zanim agaroza zastygnie5,6,7. Szybkie manipulowanie larwą wymaga nie tylko umiejętności użytkownika, ale także grozi uszkodzeniem larwy. Chociaż opisano metody stabilizacji larwy do obrazowania na żywo, aby obejść te wady, takie jak prążkowane studzienki agarowe3 lub divets8, użycie silikonowego smaru próżniowego do stworzenia komory obrazowania z rurami PVC lub innymi materiałami6 oraz rurki rotacyjne9, wiele z tych metod jest pracochłonnych, niechlujnych, często nie nadaje się do ponownego użycia i nie pozwala na manipulację środowiskiem (leczenie farmakologiczne, zranienia itp.) po zamontowaniu ryby.
Dlatego też urządzenie zWEDGI (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) zostało zaprojektowane tak, aby przezwyciężyć niektóre z wad montażu agaru do długoterminowego obrazowania larw danio pręgowanego na żywo, jednocześnie umożliwiając manipulację próbką. zWEDGI składa się z trzech półotwartych, podzielonych komór (<klasa silna="xfig">Rysunek 1A), aby umożliwić ładowanie, unieruchamianie, ranienie i obrazowanie larw danio pręgowanego w ciągu 2 do 4 dni po zapłodnieniu. Urządzenie jest wykonane z polidimetylosiloksanu (PDMS) i umieszczone na szkiełku nakrywkowym naczynia do obrazowania o średnicy 60 mm ze szklanym dnem. Prezentowany tutaj projekt był przeznaczony do badań nad gojeniem się ran, jednak zastosowanie modułowej konstrukcji i standardowych technologii wytwarzania sprawia, że projekt zWEDGI można modyfikować i poddawać różnorodnym procedurom eksperymentalnym, zwłaszcza w przypadku procedur, które wymagają minimalnych ograniczeń związanych z eksperymentalną manipulacją i długotrwałym obrazowaniem.

<table><tbody><tr><td>Fabricate molds</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solidworks Professional Accedemic Research Oprogramowanie do modelowania 3D</td><td>Dassault Systemes</td><td>SPX0117-01</td><td>Fisher Unitech</td></tr><tr><td>Viper Si2 SLA</td><td>3D Systems Inc.</td><td>23200-902</td><td>3D Systems Inc.</td></tr><tr><td>Żywica fotopolimerowa Accura 60</td><td>3D Systems Inc.</td><td>24075-902</td><td>3D Systems Inc.</td></tr><tr><td>alkohol denaturowany</td><td>Sunnyside</td><td>5613735</td><td></td></tr><tr><td>Aparatura do utwardzania UV</td> Menards <td>3D Systems Inc.</td><td>23363-101-00</td><td>3D Systems Inc.</td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe TouchNTuff</td><td>Ansell</td><td>92-600</td><td>McMaster Carr</td></tr><tr><td>220B, 400B, ziarnistość 600 T414 niebieski papier ścierny&nbsp;</td><td>Dysk ze</td> szkła borokrzemianowego Norton <td>66261139359, 54, 52</td><td>MSC</td></tr><tr><td>, średnica 2"</td><td>McMaster-Carr</td><td>MIL-G-47033</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>środek do czyszczenia ultradźwięków</td><td>Branson</td><td>1510R-MTH</td><td></td></tr><tr><td>alkohol izopropylowy 70%</td><td>Hydrox</td><td>54845T43</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>10 uncji przezroczystego plastikowego kubka</td><td>WNA Masterpiece</td><td>557405</td><td>Amazonka</td></tr><tr><td>6-calowy kij rzemieślniczy</td><td>Perfect Stix</td><td>Craft WTD-500</td><td>Amazon</td></tr><tr><td>Nazwa</strong</td><td>>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Wyprodukuj urządzenie zWEDGI PDMS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 zestaw z elastomeru silikonowego&nbsp;</td><td>Kleje Dow-Corning</td><td>4019862</td><td>Ellworth&nbsp;</td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>305219</td><td>Vitality Medical Inc</td></tr><tr><td>eksykator</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>F42027-0000</td><td>Amazon</td></tr><tr><td>4 w zacisku zapadkowym</td><td>Pittsburgh</td><td>68974</td><td>Piec</td></tr><tr><td>laboratoryjny</td> Harbor Freight <td>Quincy Lab Inc.</td>Zestaw pęsety <td>przemysłowej 20GC</td><td>Global Dysza</td></tr> z <tr><td>filtrem sprężonego powietrza</td><td></td>Aven 549825 McMaster-Carr <td>Innotech</td><td>TA-N2-2000FT</td></tr><tr><td>Imadło próżniowe</td> do pomieszczeń czystych <td>Wilton Tool Group</td><td>63500</td><td>MSC Przemysłowe</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>naczynie ze szklanym dnem 55 mm; Szkło pokrywowe Micro-well 30 mm #1,5</td><td>Cellvis</td><td>D60-30-1,5-N</td><td>Cellvis</td></tr><tr><td>czyścik plazmowy</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td>Harrick Plasma</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Ładowanie Larwy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetteman, P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol (przed użyciem rozcieńczony do 70% wodą)</td><td>Pharmco-aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-5A</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>mleko</td><td></td> w proszku <td>2902887</td><td>MP Biomedicals</td></tr><tr><td>podwójnie destylowana woda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-fenylotiormocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Trikaina (3-aminobenzoesan etylu)</td><td></td><td>C-FINQ-UE</td><td>Western Chemical</td></tr><tr><td>agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td> Blok cieplny <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>(inkubator do suchej kąpieli)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-2</td> Bufor <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>E3&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>końcówka do pipet z dużym otworem, 200 uL</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-134</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Końcówka do pipet ogólnego przeznaczenia, 200 uL</td><td>Fisherbrand</td><td>21-197-8E</td><td></td></tr> <tr><td>Ostrze skalpela Fisher Scientific#15&nbsp;</td><td>Feather</td><td>2976</td><td></td></tr><tr><td>Igła strzykawkowa Amazon 25G</td><td>BD&nbsp;</td><td>BD305122</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Obrazowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>odwrócony mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris oprogramowanie do obrazowania Bitplane</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

długoterminowe urządzenie do obrazowania na żywo do lepszej eksperymentalnej manipulacji larwami danio pręgowanego

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

Larwa danio pręgowanego jest ważnym organizmem modelowym zarówno dla biologii rozwojowej, jak i gojenia ran. Co więcej, larwy danio pręgowanego są cennym systemem do obrazowania mikroskopowego dynamicznych zjawisk biologicznych w przestrzeni i czasie w wysokiej rozdzielczości z rozdzielczością komórkową. Jednak tradycyjna metoda enkapsulacji agarozy do obrazowania na żywo może utrudniać rozwój larw i odrastanie tkanek. Dlatego ten manuskrypt opisuje zWEDGI (Zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), które zostało zaprojektowane i wyprodukowane jako funkcjonalnie podzielone urządzenie do orientacji larw do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, umożliwiając jednocześnie przecięcie płetwy ogonowej w urządzeniu, a następnie nieograniczony rozwój i ponowny wzrost ogona. Urządzenie to pozwala na zranienie i długotrwałe obrazowanie przy zachowaniu żywotności. Biorąc pod uwagę, że forma zWEDGI jest drukowana w 3D, możliwość dostosowania jej geometrii sprawia, że można ją łatwo modyfikować do różnych zastosowań obrazowania danio pręgowanego. Co więcej, zWEDGI oferuje liczne korzyści, takie jak dostęp do larwy podczas eksperymentów w celu zranienia lub zastosowania odczynników, równoległa orientacja wielu larw w celu usprawnienia obrazowania oraz możliwość wielokrotnego użycia urządzenia.

Mikrofluidyczne urządzenie zWEDGI z PDMS jest urządzeniem funkcjonalnie podzielonym na komory, zaprojektowanym tak, aby realizować cztery główne funkcje (wymienione poniżej) związane z obrazowaniem na żywo gojenia ran i odrostu płetwy ogonowej u larw zebrafish. PDMS wybrano do produkcji zWEDGI, ponieważ jest on nie tylko łatwo dostępny i stanowi standard przemysłowy pod względem biokompatybilności, ale także dobrze sprawdza się w formach. Ponadto PDMS sprawia, że urządzenie jest wielorazo...

Ten manuskrypt opisuje zWEDGI (Urządzenie do Zranienia i Uwięzienia Danio Zebra dla Wzrostu i Obrazowania), które jest urządzeniem przeznaczonym do orientacji i krępowania larw danio pręgowanego. Konstrukcja pozwala na przecięcie ogona i długoterminowe zbieranie obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości, przedstawiających gojenie się i regenerację ran.

Długoterminowe urządzenie do obrazowania na żywo do lepszej eksperymentalnej manipulacji larwami danio pręgowanego

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Ogólnym celem produkcji tego urządzenia do obrazowania jest stworzenie modyfikowalnej platformy do mikroskopowej analizy gojenia się ran u żywych larw danio pręgowanego. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie gojenia się ran, takie jak jaki jest wkład reorganizacji włókien kolagenowych i odpowiedzi komórkowych na późniejszy odrost tkanek po urazie. Główną zaletą tej techniki jest to, że zranienie i obrazowanie odbywa się w obrębie jednego urządzenia, podczas gdy odrastanie ogona nie jest utrudniane przez urządzenie.Dodatkowo, wiele funkcjonalnych przedziałów zWEDGI może być modyfikowanych niezależnie, aby dostosować się do różnych stadiów larwalnych i szeregu protokołów eksperymentalnych. Aby rozpocząć, należy zamodelować komponent PDMS urządzenia z żądanymi geometriami i atrybutami zgodnie z protokołem tekstowym. Po wydrukowaniu form za pomocą fotopolimerowej drukarki 3D, wyczyść formy za pomocą cienkiej szczotki, denaturatu w butelce z rozpylaczem i sprężonego powietrza.Delikatnie wyszoruj i usuń nieutwardzoną żywicę, szczególnie wszelki materiał z obszarów mikrokanałów. Następnie utwardzaj formy w aparacie do utwardzania UV przez 60 minut z każdej str

long-term-live-imaging-device-for-improved-experimental-manipulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszej pracy opisujemy metodę montowania embrionów zebrafish do długotrwałego obrazowania, obrazowania dwufotonowego, technik uszkadzania tkanek oraz konfokalnego obrazowania time-lapse.

Dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem jest doskonałym narzędziem do obrazowania rozwoju embrionalnego. Pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Demonstrujemy jego zastosowanie do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego w szerokich skalach czasoprzestrzennych i przedstawiamy potok do fuzji i dekonwolucji zestawów danych multiview.

Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.

Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego

Mikroiniekcja zarodków i larw danio pręgowanego jest kluczową, ale wymagającą techniką stosowaną w wielu modelach danio pręgowanego. W tym miejscu przedstawiamy szereg narzędzi w mikroskali, które pomagają w stabilizacji i orientacji danio pręgowanego zarówno do mikroiniekcji, jak i obrazowania.

Urządzenia mikrostrukturalne do zoptymalizowanej mikroiniekcji i obrazowania larw danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje metodę montowania delikatnych zarodków danio pręgowanego do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Ta tania metoda jest łatwa do wykonania przy użyciu zwykłych naczyń mikroskopowych ze szklanym dnem do obrazowania pod dowolnym mikroskopem odwróconym. Montaż odbywa się w warstwach agarozy w różnych stężeniach.

Warstwowa metoda mocowania do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Przejrzystość optyczna jest główną zaletą dla biologicznej i fizjologicznej pracy komórek u danio pręgowanego. Opisano solidne metody pomiaru wzrostu komórek u poszczególnych zwierząt, które pozwalają na nowy wgląd w to, w jaki sposób wzrost mięśni szkieletowych i sąsiednich tkanek jest zintegrowany ze wzrostem całego ciała.

Wielokrotne pomiary wzrostu mięśni szkieletowych w czasie rzeczywistym u poszczególnych żywych ryb danio pręgowanych poddanych zmienionej aktywności elektrycznej

Ten protokół wykorzystuje obrazowanie za pomocą arkusza świetlnego do badania funkcji skurczu serca u larw danio pręgowanego i uzyskania wglądu w mechanikę serca poprzez śledzenie komórek i interaktywną analizę.

Obrazowanie 4D Light-sheet skurczu serca danio pręgowanego

Poznaj metodę wykorzystania urządzenia zWEDGI do długoterminowego obrazowania gojenia ran u larw Danio rerio. Technika umożliwia jednoczesne zadawanie ran i obserwację regeneracji bez utrudniania odrastania ogona.

Długoterminowe urządzenie do obrazowania na żywo do lepszej eksperymentalnej manipulacji larwami danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów