Długoterminowe urządzenie do obrazowania na żywo do lepszej eksperymentalnej manipulacji larwami danio pręgowanego

Ogólnym celem produkcji tego urządzenia do obrazowania jest stworzenie modyfikowalnej platformy do mikroskopowej analizy gojenia się ran u żywych larw danio pręgowanego. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie gojenia się ran, takie jak jaki jest wkład reorganizacji włókien kolagenowych i odpowiedzi komórkowych na późniejszy odrost tkanek po urazie. Główną zaletą tej techniki jest to, że zranienie i obrazowanie odbywa się w obrębie jednego urządzenia, podczas gdy odrastanie ogona nie jest utrudniane przez urządzenie.

Dodatkowo, wiele funkcjonalnych przedziałów zWEDGI może być modyfikowanych niezależnie, aby dostosować się do różnych stadiów larwalnych i szeregu protokołów eksperymentalnych. Aby rozpocząć, należy zamodelować komponent PDMS urządzenia z żądanymi geometriami i atrybutami zgodnie z protokołem tekstowym. Po wydrukowaniu form za pomocą fotopolimerowej drukarki 3D, wyczyść formy za pomocą cienkiej szczotki, denaturatu w butelce z rozpylaczem i sprężonego powietrza.

Delikatnie wyszoruj i usuń nieutwardzoną żywicę, szczególnie wszelki materiał z obszarów mikrokanałów. Następnie utwardzaj formy w aparacie do utwardzania UV przez 60 minut z każdej strony, ponieważ nieutwardzona żywica jest toksyczna dla larw danio pręgowanego. Za pomocą papieru ściernego o ziarnistości 200 przeszlifuj wnękę formy na płaskiej powierzchni, aż wszystkie powierzchnie sufitu zetkną się z papierem ściernym.

Papierem ściernym o ziarnistości 400 i 600 należy stopniowo lekko szlifować, aby uzyskać gładkie, równe powierzchnie na wszystkich okładzinach geometrycznych formy. Następnie użyj wskaźnika zegarowego, aby zmierzyć głębokość wgłębienia po szlifowaniu, aby sprawdzić, czy jest ona zbliżona do głębokości projektowej. Wyczyść foremki i szklane krążki, umieszczając je w myjce ultradźwiękowej wypełnionej wodą na 30 minut lub spłukując je pod bieżącą wodą.

Użyj alkoholu izopropylowego i przefiltrowanego sprężonego powietrza do oczyszczenia i wysuszenia form i pokryw. Przygotuj czystą ławkę jako miejsce do produkcji urządzeń, aby zminimalizować zanieczyszczenie zanieczyszczeniami unoszącymi się w powietrzu. Przygotuj PDMS, wlewając bazę i aktywator w stosunku 5:1 do plastikowego kubka.

Drewnianym patyczkiem do majsterkowania dobrze mieszaj przez dwie minuty, mieszając żel na sobie, jak przy wyrabianiu chleba. Odgazowywać mieszaninę w eksykatorze próżniowym przez 25 do 45 minut, aż wszystkie pęcherzyki znikną. Następnie, za pomocą 10-mililitrowej strzykawki, wypełnij wnękę każdej wydrukowanej w 3D formy około 0,75 mililitra PDMS, aż forma nieznacznie przeleje się meniskusem.

Odgazowuj napełnione formy przez 45 minut, aby usunąć dodatkowe bąbelki, które mogły powstać podczas napełniania. Nałóż szklaną osłonę na wierzch formy wypełnionej PDMS, dociskając dysk pod kątem, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków. Pozwól, aby nadmiar PDMS został usunięty podczas nakładania szklanej pokrywy dysku.

Następnie użyj małego zacisku zapadkowego, aby mocno przytrzymać tarczę pokrywy do formy. Aby uzyskać wydajność, można użyć urządzenia z wieloma zaciskami. Utwardź urządzenie PDMS i zaciśnięte formy w temperaturze 100 stopni Celsjusza w piekarniku przez co najmniej 90 minut.

Następnie wyjmij foremki z piekarnika i pozwól im ostygnąć, aż będzie można z nimi łatwo się uporać. Zacisnąć formę zawierającą utwardzone urządzenie PDMS w imadle stołowym tak, aby geometrie formy były skierowane do góry, równolegle do stołu stanowiska roboczego. Rozpocznij wyjmowanie urządzenia PDMS za pomocą pęsety z płaską końcówką, aby zwolnić kran PDMS z formy.

Następnie przerób pęsetą obwód formy. PDMS musi być utwardzany przez co najmniej 90 minut w temperaturze 100 stopni Celsjusza, w przeciwnym razie pozostanie lepki i przyklei się do formy. Dobrą wskazówką, że utwardziłeś urządzenie wystarczająco długo, jest to, że w rzeczywistości zobaczysz pęcherzyk powietrza na styku między formą a urządzeniem PDMS, co wskazuje, że można go łatwo usunąć.

Użyj przefiltrowanego, sprężonego powietrza i pęsety, aby delikatnie wyjąć urządzenie z formy, przytrzymując uchwyt i wdmuchując powietrze pod urządzenie. Następnie umieść urządzenie PDMS do góry nogami na wewnętrznej stronie pokrywy naczynia ze szklanym dnem, tak aby kliny tunelu ograniczającego dotykały plastiku. Następnie umieść pokrywę naczynia z odwróconym do góry nogami naczyniem zWEDGI i odpowiednią szklaną dolną naczyniem w myjce plazmowej z wewnętrzną szklanką skierowaną do góry.

Opróżnij komorę czyszczenia plazmowego, aż ciśnienie osiągnie 500 militorów. Ustaw częstotliwość radiową lub moc RF na wysoką i wystaw urządzenie i antenę na działanie częstotliwości RF przez około dwie minuty. Następnie powoli rozhermetyzuj komorę i umieść urządzenie i naczynie z powrotem w okapie w pomieszczeniu czystym.

Wyjmij urządzenie PDMS z pokrywy naczynia. Następnie odwróć PDMS zWEDGI do właściwej orientacji na szklance, ostrożnie umieszczając go w środkowej studzience naczynia ze szklanym dnem. Aby zapewnić przyleganie PDMS do szkła, użyj tylnego końca pęsety, aby wywrzeć nacisk wokół drobnych geometrii mikrokanałów, wygładzając PDMS w kierunku krawędzi.

Lekko dociśnij urządzenie PDMS, aby upewnić się, że pęcherzyki powietrza nie są uwięzione pod urządzeniem. Dodaj 70% etanolu do naczynia i za pomocą mikropipety przepłucz kanały, w tym przez tunel ograniczający. Następnie usuń etanol i użyj podwójnie destylowanej wody, aby przepłukać urządzenie dwa lub trzy razy przed pozostawieniem go do wyschnięcia na powietrzu.

Napełnij kanały odtłuszczonym mlekiem i inkubuj urządzenie przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby zminimalizować przyleganie larw do szklanego szkiełka nakrywkowego naczynia. Następnie delikatnie zanurz urządzenie kilka razy w podwójnie destylowanej wodzie w celu spłukania i pozostaw do wyschnięcia do góry nogami. Po znieczuleniu larw zgodnie z protokołem tekstowym należy użyć kilku mikrolitrów trikainy E3 do wstępnego zwilżenia kanałów urządzenia.

Używając końcówki pipety z szerokim otworem, podnieś pojedynczą larwę i umieść ją w kanale ładującym. Następnie, za pomocą końcówki do pipety lub podobnego narzędzia, ustaw larwę w komorze załadowczej tak, aby strona grzbietowa była skierowana w stronę prostszej krawędzi komory załadowczej, a ogon był skierowany w stronę tunelu ograniczającego. Ostrożnie pobrać płyn z komory do ranienia, pozwalając larwie spłynąć do tunelu ograniczającego.

Usuń większość płynu, utrzymując wilgoć wokół larwy. Larwa musi być odpowiednio zorientowana w tunelu ograniczającym, ponieważ większość płynu jest usuwana. Ale wokół larw musi pozostać wystarczająca ilość płynu.

Orientację można dostosować po dodaniu agarozy, ale należy to zrobić przed zestaleniem się agarozy. Pipetować 1% agarozy LMP w tricainie E3 nad głową larwy, wypełniając komorę załadowczą, i pozostawić agarozę do zestalenia się z larwą we właściwej pozycji. W razie potrzeby dodać tricainę E3 do komory do ran, aby utrzymać nawodnienie.

Następnie powtórz ten proces ładowania dla pozostałych dwóch kanałów. Za pomocą igły strzykawkowej ostrożnie usuń agarozę, która przedostała się przez tunel ograniczający do komory ranienia. W przypadku zranień, krótkotrwałego obrazowania lub izolacji leczenia ran dodaj więcej trikainy E3 na agarozę.

Aby zranić larwy w komorze do ranienia, użyj sterylnego ostrza skalpela, aby przeciąć płetwę ogonową za struną grzbietową. W razie potrzeby dodaj dodatkową trikainę E3 i załóż pokrywkę naczynia hodowlanego. Zainstaluj urządzenie zWEDGI ze znieczulonymi larwami na odwróconym mikroskopie we wkładzie scenicznym, który pomieści 60-milimetrową szklaną dolną półkę.

Zlokalizuj ogon larw w najwyższym kanale, obracając naczynie w razie potrzeby, aby ustawić ogon w żądanej pozycji. Wyobraź sobie larwę zgodnie z wymaganiami konkretnego eksperymentu. Na zakończenie eksperymentu wyjmij szalkę zWEDGI z mikroskopu.

Po usunięciu larw i agaru zgodnie z protokołem tekstowym, użyj etanolu i wody destylowanej do oczyszczenia zWEDGI, jak pokazano wcześniej, i ustaw go do góry nogami do wyschnięcia na powietrzu. Przechowuj zakryte urządzenie w chłodnym, suchym miejscu. Pokazano tutaj obrazy wykorzystujące mikroskopię wielofotonową do obrazowania drugiej harmonicznej lub SHG włókien kolagenowych w płetwie ogonowej w celu zilustrowania możliwości obrazowania zWEDGI.

Przed zranieniem SHG wykrył włókna kolagenowe, które promieniują na zewnątrz od struny grzbietowej do końca płetwy. Wkrótce po zranieniu odległość między czubkiem skurczonej płetwy a środkiem płetwy zwiększa się wraz z rozluźnieniem rany. zWEDGI pozwala na gromadzenie trójwymiarowych danych w czasie, zapewniając pełniejszy obraz dynamicznych zmian zachodzących w strukturze macierzy zewnątrzkomórkowej.

Trójwymiarowy charakter zbioru danych pozwala na rekonstrukcję przestrzenną przy użyciu oprogramowania do renderowania. Te rekonstrukcje i następujące po nich opcje rotacji ilustrują, że kurczenie się i rozluźnianie płetwy zachodzi nie tylko w płaszczyźnie XY zbioru obrazów, ale także w osi Z, gdy ogon spłaszcza się od wygięcia w górę stanu skurczonego. Po wydrukowaniu form wielokrotnego użytku technikę wytwarzania można wykonać w ciągu trzech do czterech godzin.

Podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać, aby upewnić się, że żadne pęcherzyki powietrza nie zostały uwięzione w PDMS przed utwardzeniem i utwardzać urządzenia wystarczająco długo przed próbą usunięcia ich z form. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak miejscowe stosowanie leku, znakowanie przeciwciał lub oczyszczanie RNA i białek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wpływ obecności leków lub inhibitorów na gojenie się ran. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się gojeniem się ran do zbadania dynamiki kolagenu, odpowiedzi komórek odpornościowych i odrastania tkanek u larw danio pręgowanego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyprodukować zWEDGI i używać go do ranienia i obrazowania na żywo larw danio pręgowanego. Nie zapominaj, że fotopolimerowe żywice do druku 3D są niebezpieczne dla ludzi i toksyczne dla danio pręgowanego. Należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i używanie maski na twarz podczas pracy z nieutwardzonymi częściami wydrukowanymi w 3D oraz upewnienie się, że cała żywica pozostała na wydrukach jest utwardzona przed próbą wypełnienia form PDMS.