Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie powiązań między określonymi podzbiorami komórek w szpiku kostnym. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie histologicznych skrawków kriogenicznych z guzów kości udowych myszy. W drugim etapie skrawki są barwione do analizy immunofluorescencyjnej i pozyskiwane są obrazy konfokalne.

Obrazy są następnie analizowane cyfrowo. Ostatecznie pozycje różnych typów komórek można symulować w celu obliczenia szybkości i częstotliwości kontaktu między określonymi komórkami immunologicznymi będącymi przedmiotem zainteresowania a ich mikrośrodowiskiem. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy analizowaliśmy nisze mikrośrodowiskowe dla długowiecznych komórek plazmatycznych w szpiku kostnym i potrzebowaliśmy metody jednoznacznego ilościowego określenia powiązań komórkowych w tkance szpiku kostnego.

RA Maya zademonstruje Ci procedurę kriogenicznego odsysania kości udowych od dorosłej myszy. Najpierw ustaw temperaturę próbki i ostrza standardowego mikrotomu wyposażonego w ostrze z twardą tkanką na minus 24 stopnie Celsjusza. Po 15 minutowej aklimatyzacji.

Przymocuj blok próbki do metalowego uchwytu próbki za pomocą medium do zatapiania kriogenicznego i w razie potrzeby dostosuj orientację bloku. Przycinaj próbkę, aż kość zostanie całkowicie otwarta i szpik będzie widoczny. Następnie dostosuj grubość przekroju do siedmiu mikronów.

Następnie przymocuj kawałek taśmy klejącej kawamoto lepką stroną do górnej części bloku próbki za pomocą drogiej drewnianej szpatułki pokrytej skórą, przekrój próbkę i użyj kleszczy. Obróć taśmę tak, aby sekcja znajdowała się na górze. Następnie przenieś taśmę na szklane szkiełko mikroskopowe.

Przymocuj taśmę do szkiełka za pomocą taśmy klejącej po zebraniu ostatniego odcinka. Pozostawić próbki na dysku przez co najmniej 30 minut i przechowywać szkiełka w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Dwie kobiety obrazują próbki barwiące rozmrożone skrawki kriogeniczne zgodnie z powszechnymi protokołami immunofluorescencji.

Upewnij się, że dołączyłeś plamę jądrową w celu wizualizacji integralności tkanki. Po wybarwieniu skrawków dodaj jedną kroplę uchwytu podłogowego do każdej próbki, a następnie szklane szkiełko nakrywkowe numer jeden na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym. Wybierz soczewkę obiektywu 20x i ustaw pole view 708 punktów 15 na 708 punktów 15 mikronów.

Następnie zobrazuj próbki pojedynczo w rozdzielczości 2048 na 2048 pikseli na obraz, aby wyniki były porównywalne. Rejestrowanie obrazów w jednym kanale w celu wizualizacji struktur zrębowych, jednym kanale dla jąder i dodatkowych kanałów dla komórek krwiotwórczych będących przedmiotem zainteresowania, w razie potrzeby. Nagrywaj obrazy za pomocą uśredniania linii.

Idealnie jest rejestrować pojedyncze sąsiednie obrazy, aby pokryć cały odcinek kości udowej. Następnie zapisz obrazy w formacie pliku obrazu mikroskopowego. Następnie wyeksportuj po jednym pliku JPEG na kanał dla każdego zobrazowanego obszaru i użyj narzędzia do analizy obrazu, aby przeprowadzić segmentację obrazu, kwantyfikację kolokalizacji i analizę sąsiedztwa przed wykonaniem symulacji komórki losowej.

Pozycjonowanie na analizowanych obrazach szpiku kostnego dla każdego obrazu, który ma być symulowany. Umieść następujące pliki w jednym folderze, pojedynczych plikach CSV dostarczonych przez narzędzie do kontaktu z komórką. Oryginalne pliki JPEG kanału DPI i oryginalne pliki JPEG kanału zrębowego do wykonywania symulacji wsadowych na serii obrazów z pojedynczej próbki kości udowej w celu przeniesienia wszystkich oryginalnych plików JPEG i odpowiadających im pojedynczych plików CSV do innego folderu w tym czasie.

Po złożeniu wszystkich plików uruchom narzędzie symulacyjne. Następnie zaznacz pole automatycznego ładowania danych obrazu. Po zaznaczeniu tej opcji pliki CSV odpowiadające analizowanym obrazom są otwierane automatycznie.

Następnie wprowadź wspólny tag dla plików CSV oraz liczbę zestawów obrazów, które powinny być używane do symulacji w trybie wsadowym. Następnie załaduj plik J peg wygenerowany z kanału S stroma o nazwie pliku kończącej się na trzy, aby wygenerować maskę dla kanału DPI. Zaznacz pole Zastosuj maskę i ustaw próg konwersji obrazu DPI na maskę binarną na 10.

Zaznacz pola osiem bitów i rozszerz i ustaw stopień dylatacji na pięć pikseli. Następnie zaznacz pole erozji szerokości. Następnie wprowadź żądaną wartość promienia sąsiedztwa używanego do analizy symulowanych obrazów i zaznacz pole Użyj OSU, aby użyć algorytmu OSU do automatycznego wykrywania struktur zrębu komórek krwiotwórczych.

Symulowane jako okrągłe kształty. Zmierz rozkład wielkości komórek analizowanych typów komórek za pomocą dowolnego oprogramowania do analizy obrazu, które zawiera odpowiednie funkcje segmentacji obiektów, i określ sigma dla wszystkich typów komórek krwiotwórczych na podstawie tych pomiarów. Można określić granicę rozmiaru komórki, czyli średnicę w pikselach, która opisuje najmniejszy obiekt nadal rozpoznawany jako kompletna komórka przez narzędzie do analizy obrazu.

Następnie wprowadź odcięcie rozmiaru komórki i sigmę w pikselach, aby przeprowadzić symulację rozkładu rozmiaru komórki dla komórek czerwonych, zielonych i niebieskich. Następnie na karcie komórki i maska zaznacz pole usuwania, aby umożliwić programowi wybranie nowej pozycji komórki, jeśli nakłada się ona na co najmniej jeden piksel w obszarze zakazanym maski. Na karcie wykluczania komórek zaznacz również pole unikaj nakładania się komórek.

Następnie wprowadź dozwoloną minimalną odległość między środkami dwóch komórek w pikselach. Jeśli nakładanie się jest definiowane przez minimalną odległość od środka jednej komórki do środka innej, ustaw maksymalny obszar nakładania na 100%Następnie ustaw narzędzie symulacyjne na 1000 powtórzeń. Następnie zaznacz pole automatycznego zapisywania sprzedaży, aby zapisać współrzędne symulowanych obiektów dla wszystkich powtórzeń każdego obrazu partii jako zniszczone pliki w formacie tekstowym.

Wprowadź również wspólny znacznik dla zapisanych plików. Na koniec kliknij uruchom symulację i określ średnie częstotliwości kontaktu i sąsiedztwa zestawów 1000 symulowanych obrazów odpowiadających każdemu zarejestrowanemu obrazowi. W tym przypadku średni kontakt i sąsiedztwo są zliczane przez zarejestrowaną liczbę komórek na obrazie i porównuje częstości z wynikami automatycznej analizy kolokalizacji zarejestrowanego obrazu.

Na rysunku przedstawiono analizę lokalizacji eozynofili, komórek plazmatycznych i limfocytów B z mikrośrodowiskiem komórek zrębu z fluorescencyjnym chimerycznym szpikiem kostnym. Pliki CSV wygenerowane przez narzędzia do kontaktu i sąsiedztwa zawierają liczbę komórek i łączną powierzchnię dla każdej populacji komórek w pikselach, a także liczbę kontaktów lub sąsiedztwa. Przed wykonaniem symulacji losowego rozmieszczenia komórek należy określić parametry opisujące rozkład wielkości komórki jako rozkład Gaussa w tej symulacji, zachowano względne wartości sigma zmierzone dla trzech populacji komórek.

Podczas gdy wartości Sigma zdefiniowane w pikselach zostały ustawione tak, aby pasowały do wyglądu zarejestrowanych komórek, aby zdefiniować obszary, w których można umieścić komórki, maska została wygenerowana z kanału DAPI. Następnie wyznaczono wartość 10 jako optymalny próg gęstości do generowania obrazów binarnych. Znaczenie kontaktów komórek plazmatycznych, eozynofili lub limfocytów B z komórkami zrębu zostało następnie przetestowane zgodnie z oczekiwaniami.

Analiza ta wykazała znacznie wyższe wskaźniki kontaktu w zarejestrowanych obrazach w porównaniu z symulacją dla komórek plazmatycznych i limfocytów B. W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano wyraźnej różnicy w kontakcie z komórkami zrębu eozynofili. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w każdej dziedzinie wymagającej analizy złożonej struktury tkankowej szpiku kostnego, takiej jak immunologia, hematologia, patologia czy biologia komórek macierzystych.