Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie powiązań między konkretnymi subpopulacjami komórek w szpiku kostnym. Jest to realizowane poprzez wstępne pobranie histologicznych krioprzekrojów z guzów kości udowych myszy. W drugim kroku przekroje są barwione do analizy immunofluorescencyjnej, a następnie wykonuje się obrazowanie konfokalne.

Następnie obrazy są analizowane cyfrowo. Ostatecznie można zasymulować położenie różnych typów komórek, aby obliczyć szybkość i częstotliwość kontaktów między konkretnymi komórkami immunologicznymi, które są przedmiotem zainteresowania, a ich mikrośrodowiskiem. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas analizy nisz mikrośrodowiskowych długożyjących komórek plazmatycznych w szpiku kostnym, gdy pojawiła się potrzeba zastosowania metody pozwalającej na jednoznaczne ilościowe określenie powiązań komórkowych w obrębie tkanki szpiku kostnego.

RA Maya zademonstruje procedurę kriosekcjonowania kości udowych dorosłej myszy. Najpierw ustaw temperaturę próbki i noża w standardowym mikrotomie wyposażonym w nóż do twardych tkanek na -24°C. Odczekaj 15 minut w celu aklimatyzacji.

Przymocuj blok próbki do metalnego uchwytu za pomocą medium do kriowlewania i w razie potrzeby dostosuj orientację bloku. Przycinaj próbkę, aż kość zostanie całkowicie otwarta, a szpik stanie się widoczny. Następnie ustaw grubość przekroju na siedem mikronów.

Następnie przyklej kawałek taśmy klejowej Kawamoto stroną klejącą do góry na blok próbki, używając drewnianej szpachelki obciągniętej skórą. Wyodrębnij przekrój próbki i za pomocą pincety obróć taśmę tak, aby przekrój znajdował się po stronie górnej. Następnie przenieś taśmę na szklane podstawkę do mikroskopu.

Po pobraniu ostatniego przekroju przytwierdź taśmę do szkiełka przedmiotowego za pomocą taśmy klejącej. Pozostaw próbki do wyschnięcia na co najmniej 30 minut, a następnie przechowuj szkiełka w temperaturze -80°C. Próbki obrazuj, a rozmrożone skrawki mrożone barw zgodnie ze standardowymi protokołami immunofluorescencji.

Należy pamiętać o zastosowaniu barwienia jąder komórkowych w celu wizualizacji integralności tkanki. Po zabarwieniu preparatów do każdej próbki należy dodać jedną kroplę medium montażowego, a następnie nałożyć szklaną lamellkę nr 1 i umieścić preparat w konfokalnym mikroskopie skaningowym. Wybrać obiektyw 20x i ustawić pole widzenia o wymiarach 708,15 na 708,15 µm.

Następnie należy obrazować próbki pojedynczo w rozdzielczości 2048 na 2048 pikseli na obraz, aby zachować porównywalność wyników. Obrazy należy rejestrować w jednym kanale w celu wizualizacji struktur zrębu, w jednym kanale dla jąder komórkowych oraz w dodatkowych kanałach dla interesujących nas komórek krwiotwórczych, zgodnie z potrzebą. Obrazy należy rejestrować z zastosowaniem uśredniania linii.

W idealnym przypadku należy wykonać pojedyncze, sąsiadujące zdjęcia tak, aby pokryły one cały przekrój udowy. Następnie obrazy należy zapisać w formacie plików obrazów mikroskopowych. Potem dla każdego obrazowanego obszaru należy wyeksportować jeden plik JPEG na kanał i użyć narzędzia do analizy obrazu w celu przeprowadzenia ilościowej segmentacji obrazu, kolokalizacji oraz analizy sąsiedztwa przed wykonaniem symulacji losowej komórki.

Pozycjonowanie na analizowanych obrazach szpiku kostnego dla każdego obrazu przeznaczonego do symulacji. Umieść w jednym folderze następujące pliki: pojedyncze pliki CSV dostarczone przez narzędzie do kontaktu komórek, oryginalne pliki JPEG z kanału DPI oraz oryginalne pliki JPEG z kanału stromy, aby przeprowadzić symulacje seryjne na serii obrazów z jednej próbki udowej; w tym samym czasie przenieś wszystkie oryginalne pliki JPEG i odpowiadające im pojedyncze pliki CSV do innego folderu.

Po zgromadzeniu wszystkich plików uruchom narzędzie do symulacji. Następnie zaznacz pole automatycznego ładowania danych obrazu. Po wybraniu tej opcji pliki CSV odpowiadające analizowanym obrazom zostaną otwarte automatycznie.

Następnie wprowadź wspólny tag dla plików CSV oraz liczbę zestawów obrazów, które mają zostać użyte w symulacji w trybie wsadowym. Następnie wczytaj plik JPEG wygenerowany z kanału stromy S o nazwie kończącej się cyfrą trzy, aby utworzyć maskę dla kanału DPI. Zaznacz pole „apply mask” i ustaw próg konwersji obrazu DPI na maskę binarną na 10.

Zaznacz pola eight bit oraz dilate i ustaw stopień rozszerzenia (grade of dilation) na pięć pikseli. Następnie zaznacz pole width erosion. Wpisz pożąną wartość promienia sąsiedztwa (vicinity radius) wykorzystywanego do analizy symulowanych obrazów, a następnie zaznacz pole use OSU, aby zastosować algorytm OSU do automatycznego wykrywania struktur zrębowych dla komórek krwiotwórczych.

Symulowane jako kształty koliste. Należy zmierzyć rozkład wielkości komórek analizowanych typów komórek za pomocą dowolnego oprogramowania do analizy obrazu posiadającego odpowiednie funkcje segmentacji obiektów, a następnie wyznaczyć wartość sigma dla wszystkich typów krwinek na podstawie tych pomiarów. Można określić graniczną wielkość komórki, czyli średnicę w pikselach opisującą najmniejszy obiekt, który jest nadal rozpoznawany przez narzędzie do analizy obrazu jako pełna komórka.

Następnie wprowadź wartość odcięcia rozmiaru komórki oraz wartość sigma w pikselach dla symulacji rozkładu rozmiarów komórek czerwonych, zielonych i niebieskich. Następnie w zakładce „cells and mask” zaznacz pole „delete”, aby umożliwić programowi wybór nowej pozycji dla komórki, jeśli nakłada się ona na co najmniej jeden piksel w obszarze wykluczonym (no-go area) maski. W zakładce „cell exclusion” zaznacz również pole „avoid cell overlap”.

Następnie wprowadź dozwoloną minimalną odległość między środkami dwóch komórek w pikselach. Jeśli nakładanie się jest definiowane przez minimalną odległość od środka jednej komórki do środka drugiej, ustaw maksymalny obszar nakładania się na 100%. Następnie ustaw narzędzie symulacji na 1000 powtórzeń. Po tym zaznacz pole auto save sales, aby zapisać współrzędne symulowanych obiektów dla wszystkich powtórzeń każdego obrazu z partii jako pliki w formacie tekstowym.

Wprowadź również wspólny tag dla zapisanych plików. Na koniec kliknij „run simulation” i wyznacz średnie częstotliwości kontaktu oraz sąsiedztwa dla zestawów 1000 symulowanych obrazów odpowiadających każdemu zarejestrowanemu obrazowi. W tym celu podziel średnią liczbę kontaktów i sąsiedztw przez liczbę komórek zarejestrowanych na obrazie, a następnie porównaj uzyskane częstotliwości z wynikami zautomatyzowanej analizy kolokalizacji obrazu zarejestrowanego.

Na tej rysunku przedstawiono analizę lokalizacji eozynofili, komórek plazmatycznych i limfocytów B w mikrośrodowisku komórek zrębowych z wykorzystaniem fluorescencyjnej chimery szpiku kostnego. Pliki CSV wygenerowane przez narzędzia do analizy kontaktu i sąsiedztwa komórek zawierają liczbę komórek oraz całkowitą powierzchnię dla każdej populacji komórek w pikselach, a także liczbę kontaktów lub sąsiedztw. Przed przeprowadzeniem symulacji losowego rozmieszczenia komórek należy określić w tej symulacji parametry opisujące rozkład wielkości komórek jako rozkład Gaussa; zachowano relatywne wartości sigma zmierzone dla trzech populacji komórek.

Podczas gdy wartości Sigma zdefiniowane w pikselach zostały ustawione tak, aby odpowiadały wyglądowi wizualnemu zarejestrowanych komórek w celu wyznaczenia obszarów, w których mogą one znajdować się, maska została wygenerowana z kanału DAPI. Następnie ustalono, że wartość 10 jest optymalnym progiem gęstości dla generowania obrazów binarnych. Następnie, zgodnie z oczekiwaniami, przetestowano istotność kontaktów komórek plazmatycznych, eozynofilów lub limfocytów B z komórkami zrębu.

Analizy te ujawniły znacznie wyższe częstotliwości kontaktów w zarejestrowanych obrazach w porównaniu z symulacją dla komórek plazmatycznych i limfocytów B. W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano wyraźnej różnicy w przypadku kontaktu eozynofili z komórkami zrębu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w każdej dziedzinie wymagającej analizy złożonej struktury tkankowej szpiku kostnego, takiej jak immunologia, hematologia, patologia czy biologia komórek macierzystych.