Name: Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Naucz się automatycznej kwantyfikacji interakcji komórek krwiotwórczych ze zrębem w szpiku kostnym myszy. Ta metoda wykorzystuje mikroskopię konfokalną i analizę cyfrową do badania dynamiki komórek immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Andreasowi Radbruchowi za cenne dyskusje. Jesteśmy wdzięczni Sabine Gruczek, Patrickowi Thiemannowi i Manueli Ohde za pomoc w opiece nad zwierzętami oraz Robertowi Güntherowi za doskonałą pomoc techniczną. Dziękujemy naszym przeszkolonym oceniającym: Laurze Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Florence Pache i Katharinie Horn za ocenę próbek histologicznych oraz Randy'emu Lindquistowi za korektę manuskryptu. Dziękujemy J. i N. Lee z Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, USA za przeciwciała specyficzne dla MBP.
Ta praca była wspierana przez DFG HA5354/4-1, przez JIMI-a główny grant sieci ośrodków DFG na mikroskopię przyżyciową oraz przez TRR130/TP17, a DFG FOR 2165 (HA5354/6-1) dla A.E.H. S.Z. był wspierany przez Międzynarodową Szkołę Chorób Zakaźnych i Immunologii im. Maxa Plancka (IMPRS-IDI) w Berlinie.

Doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez odpowiednie komitety państwowe ds. dobrostanu zwierząt (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) i zostały przeprowadzone zgodnie z aktualnymi wytycznymi i przepisami (licencja na eksperymenty na zwierzętach G0194/11).
1. Generacja fluorescencyjnych myszy chimerycznych w szpiku kostnym
UWAGA: Generowanie fluorescencyjnych chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu wizualizacji komórek zrębu szpiku kostnego odbywa się zgodnie z opisem poprzednio9.
<ol>
	<li>Rozpocznij leczenie myszy Del-Cre x ROSA-tdRFP (myszy eksprymujące tandemowe białko czerwonej fluorescencji (tdRFP) wszechobecnie11-13), aby przygotować je do napromieniania. Alternatywnie, użyj dowolnego innego szczepu z wszechobecną ekspresją białka fluorescencyjnego. Podać 1 mg/ml neomycyny i 1 mg/ml witamin (A, D3, E, C) z wodą do picia na dwa dni przed napromienianiem.</li>
	<li>Napromieniuj myszy dwukrotnie 3,8 Graya promiennikiem promieniowania gamma cezu-137 w odstępie 3 godzin. W tym celu umieść myszy w klatce do napromieniania odpowiedniej dla danego naświetlacza. 
	UWAGA: Do napromieniania myszy nasz Instytut nie wymaga znieczulenia. Należy postępować zgodnie z lokalnymi zasadami instytucjonalnymi dotyczącymi znieczulenia do napromieniania. Zwierzęta należy podawać podskórnie (s.c.) w dawce 5 mg/kg karprofenu dziennie po napromienianiu, jeśli występują oznaki bólu.</li>
	<li>Następnego dnia należy rozpuścić myszy przez dożylne wstrzyknięcie 3 x 106 komórek szpiku kostnego przygotowanych z kości długich myszy dawców C57BL / 6 w buforze transferowym9. Trzymaj myszy na neomycynie i witaminach przez okres do 2 tygodni i monitoruj ich samopoczucie i wagę w tym czasie. Należy odczekać co najmniej 4 tygodnie, aby umożliwić odtworzenie układu odpornościowego przed rozpoczęciem określonych eksperymentalnych metod leczenia (np. immunizacji)9.</li>
	<li>Złóż myszy w ofierze i umieść je na desce rozbiorowej, wysterylizuj nogi 70% etanolem. Poddaj myszy eutanazji zgodnie z lokalnymi zasadami instytucjonalnymi. Nasz Instytut przeprowadza zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Użyj kleszczy i nożyczek, aby usunąć skórę z ud. Usuń tkankę mięśniową, aby odsłonić kość udową. Zwichnąć kość udową od stawu biodrowego i kolanowego za pomocą kleszczy i nożyczek. Uważaj, aby nie złamać ani nie przeciąć kości.</li>
	<li>Ostrożnie usuń pozostałe duże kawałki tkanki mięśniowej i chrząstki z kości za pomocą nożyczek. Usuń pozostałą tkankę mięśniową, pocierając kość bibułą laboratoryjną. Zebrać oczyszczone kości na szalce Petriego z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
	<li>Utrwalić całe kości udowe w 4% paraformaldehydzie (PFA, klasa mikroskopii elektronowej) przez 4 - 6 godzin.</li>
	<li>Wyrzuć PFA i inkubuj kości w 10% sacharozie w PBS O/N. Następnego dnia inkubuj kości w 20% sacharozie O/N. Następnego dnia inkubuj kości w 30% sacharozie O/N.</li>
</ol>
2. Kriosekcja kości
UWAGA: Po 16 - 24 godzinach w 30% sacharozy, zamroź kości i poddaj je kriosekcji zgodnie z metodą taśmy Kawamoto14,15.
<ol>
	<li>Przygotować dużą zlewkę (o objętości 2 000 ml) z suchym lodem i acetonem (stosunek objętościowy około 2:1, np. 400 ml suchego lodu i 200 ml acetonu) pod wyciągiem. Umieścić w nim małą zlewkę (objętość 150 - 250 ml) z heksanem (około 30 - 50 ml). Poczekaj, aż mieszanina ostygnie (około 10 minut, aż na zewnętrznej stronie dużej zlewki pojawi się szron).</li>
	<li>Napełnij 3/4 oznakowanego kriomoldu pożywką do zatapiania w krioemburgu (SCEM); ostrożnie umieść kości w środku, aż zostaną całkowicie zanurzone, uważając, aby nie dotykały krawędzi formy. Za pomocą dużych kleszczy przytrzymaj kriomold w zlewce tak, aby dno formy dotykało powierzchni heksanu.
	<ol>
		<li>Poczekaj, aż zewnętrzne krawędzie SCEM zamarzną (wskazywane przez nieprzezroczystość, zajmuje to około 15 sekund). Następnie całkowicie wrzuć formę do heksanu i pozwól jej zamarznąć na 1-2 minuty. Wyjmij zamrożoną próbkę i zawiń w celofan, a następnie w folię aluminiową (w celu ochrony próbki przed wyschnięciem i uniknięcia ekspozycji na światło). Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu kriosekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do kriosekcji kości udowych należy używać standardowego mikrotomu i ostrzy mikrotomowych do tkanek twardych.</li>
	<li>Ustawić temperaturę próbki i ostrza mikrotomu na -24 °C. Pozostaw próbkę w mikrotomie na około 15 minut przed cięciem.
	<ol>
		<li>Przymocuj blok próbki do metalowego uchwytu próbki za pomocą medium SCEM lub o optymalnej temperaturze skrawania (OCT). W razie potrzeby dostosuj orientację bloku. Przycinaj próbkę, aż kość zostanie całkowicie otwarta i szpik będzie widoczny. Dostosuj grubość przekroju do 7 μm (odrzuć pierwszą sekcję).</li>
		<li>Przymocuj kawałek taśmy Kawamoto lepką stroną do górnej części bloku próbki za pomocą drewnianej szpatułki pokrytej skórą jelenia. Następnie odetnij próbkę i obróć taśmę tak, aby sekcja znalazła się na górnej stronie. Przenieś taśmę na szkiełko szkiełkowe za pomocą kleszczy. Przymocuj taśmę do szkła ślizgowego za pomocą taśmy klejącej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostaw sekcje do wyschnięcia na co najmniej 30 minut i przechowuj je w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Niepoplamione i niezamontowane szkiełka należy przechowywać w plastikowych pudełkach na prowadnice z przekładkami między pojedynczymi szkiełkami, aby uniknąć ich sklejania. Poplamione i zamontowane szkiełka można przechowywać do tygodnia w tekturowych teczkach na szkiełka w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Kolekcja obrazów
<ol>
	<li>Rozmrażanie i barwienie kriosekcji zgodnie z powszechnymi protokołami immunofluorescencji9. Dołącz barwnik jądrowy, np. dichlorowodorek 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI), aby uwidocznić integralność tkanki. 
	UWAGA: Barwienie, na przykład, dla RFP w celu wizualizacji komórek zrębu (przeciwciało anty-RFP-biotyna i streptawidyna-Alexa Fluor 555), barwienie eozynofili przeciwciałem przeciwko głównemu białku zasadowemu (MBP) szczura i przeciwciałem anty-szczurzemu Alexa Fluor 647, limfocyty B szczurzym przeciwciałem anty-B220-Alexa Fluor 594 i PC z przeciwciałami anty-κ łańcucha lekkiego-fluoresceiny-izo-tiocyjanianu (FITC) i przeciwciałami anty-λ1 łańcucha lekkiego-FITC (szczegóły procedury barwienia opisano w9).</li>
	<li>Zamontuj poplamione sekcje: nałóż jedną kroplę fluoromount na sekcję, a następnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym #1, ostrożnie unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Następnie należy wykonać laserową skaningową mikroskopię konfokalną za pomocą przyrządu wyposażonego w linie laserowe odpowiednie do barwienia.</li>
	<li>W celu zarejestrowania obrazów do automatycznej analizy kolokalizacji komórek krwiotwórczych szpiku kostnego z komórkami zrębu za pomocą narzędzia Wimasis, należy zastosować następujące ustawienia:
	<ol>
		<li>Użyj obiektywu 20X i pola widzenia 708.15 x 708.15 μm. W przypadku automatycznej analizy utrzymuj stały rozmiar wszystkich obrazów 2 048 x 2 048 pikseli (px), aby wyniki były porównywalne.</li>
		<li>Rejestruj jeden kanał dla struktur zrębowych (np. linia laserowa 561 nm), jeden kanał dla jąder (np. DAPI, 405 nm) i dodatkowe kanały dla komórek krwiotwórczych będących przedmiotem zainteresowania (np. 3 kanały, 488/594/633 nm dla eozynofili, limfocytów B i PC).</li>
		<li>Rejestruj obrazy za pomocą uśredniania linii 4 16. Najlepiej pokryć cały odcinek udowy, wykonując pojedyncze sąsiednie obrazy. Alternatywnie zrób nieprzylegające zdjęcia z różnych obszarów szpiku kostnego (trzon i nasada). 
		UWAGA: Uważaj, aby nie nakładać się na siebie sąsiednich obrazów (aby uniknąć wielokrotnej analizy komórek w nakładających się obszarach).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisz obrazy w formacie pliku obrazu mikroskopowego. Sprawdź i, jeśli to konieczne, dostosuj kontrast dla wszystkich kanałów w oprogramowaniu do przeglądania obrazów/analizy.</li>
	<li>Eksport 3 plików .jpg na plik obrazu: jeden plik .jpg dla kanału DAPI (format czerwony/zielony/niebieski (RGB), jeden plik .jpg dla kanału zrębu (skala szarości) i jeden plik .jpg zawierający kanały dla komórek krwiotwórczych (maksymalnie 3 kanały, format RGB, np. FITC (komputery PC, fałszywy kolor: zielony)/ Alexa Fluor 594 (komórki B, fałszywy kolor: niebieski) / Alexa Fluor 647 (eozynofile, fałszywy kolor: czerwony)).</li>
</ol>
4. Automatyczna analiza obrazu
<ol>
	<li>Użyj narzędzia do analizy obrazu, aby przeprowadzić segmentację obrazu, kwantyfikację kolokalizacji i analizę sąsiedztwa (patrz Dyskusja).</li>
	<li>Jeśli korzystasz z narzędzi Wimasis, postępuj w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Prześlij zestawy 3 .jpg plików na obraz o tej samej nazwie pliku, po której następuje podkreślenie i liczba wskazująca typ obrazu.</li>
		<li>Użyj _1 dla pliku .jpg z komórkami krwiotwórczymi, _2 dla pliku .jpg dla kanału DAPI, _3 dla pliku .jpg dla kanału zrębu. Na przykład: Image1_1.jpg (komórki krwiotwórcze), Image1_2.jpg (kanał DAPI) i Image1_3.jpg (kanał zrębu). Prześlij zdjęcia za pośrednictwem konta klienta.</li>
		<li>W celu ilościowego określenia kontaktu z komórką należy wybrać narzędzie do kontaktu z komórką, klikając odpowiednie pole. Aby określić ilościowo sąsiedztwo komórek, wybierz narzędzie do określania sąsiedztwa komórek i wprowadź preferowany promień sąsiedztwa w μm (mierzony od krawędzi komórek).</li>
		<li>Pobierz wyniki. 
		UWAGA: Wyniki są dostarczane jako pliki .jpg przedstawiające komórki krwiotwórcze i kanał zrębu z zaznaczonymi granicami wykrytych obiektów, a także pojedyncze pliki .csv zawierające pomiary dla każdego obrazu, a także plik .csv podsumowujący, który zawiera dane dla wszystkich przesłanych obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na podstawie pomiarów kontaktowych określ częstotliwość kontaktów komórek krwiotwórczych (krwinek czerwonych, zielonych lub niebieskich) w kontakcie z komórkami zrębu lub częstotliwości kontaktu czerwonych, zielonych lub niebieskich krwinek z innymi typami komórek krwiotwórczych (przykład pokazano w Reprezentatywne wyniki, ryc. 4). Aby określić częstości, podziel podaną liczbę kontaktów na obrazie przez całkowitą liczbę komórek na obrazie.
	<ol>
		<li>W przypadku eksperymentów z pojedynczymi myszami zsumuj całkowitą liczbę kontaktów wszystkich obrazów dla pojedynczych myszy i podziel je przez sumę całkowitej liczby komórek wszystkich obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na podstawie pomiarów w pobliżu określ częstość występowania czerwonych, zielonych lub niebieskich krwinek w wybranej odległości od komórek zrębu i/lub częstość występowania czerwonych, zielonych lub niebieskich krwinek w preferowanej odległości od innych typów komórek krwiotwórczych, jak opisano w kroku 4.3 (patrz również Reprezentatywne wyniki, Rysunek 4).</li>
</ol>
5. Symulacja losowego pozycjonowania szpiku kostnego
<ol>
	<li>Przed wykonaniem symulacji losowego rozmieszczenia komórek na analizowanych obrazach histologicznych szpiku kostnego należy wcześniej przygotować następujące pliki: pojedyncze pliki .csv dostarczone przez narzędzie do kontaktu z komórką, oryginalne pliki .jpg dla kanału DAPI oraz oryginalne pliki .jpg dla kanału zrębowego.</li>
	<li>Aby przeprowadzić symulacje wsadowe na serii obrazów (np. wszystkie obrazy z jednego odcinka kości udowej), zbierz wszystkie oryginalne pliki .jpg (_1, _2 i _3) oraz odpowiadające im pojedyncze pliki .csv w jednym folderze. 
	UWAGA: Narzędzie symulacyjne do losowego pozycjonowania komórek szpiku kostnego jest dostępne na żądanie.</li>
	<li>Uruchom narzędzie symulacyjne, zaznacz pole "Automatycznie ładuj dane obrazu". 
	UWAGA: Program automatycznie odczyta liczbę komórek i średni rozmiar komórki z pliku .csv. Wartości te są wyświetlane w polach "Numer komórki" i "Rozmiar komórki AVG" (Rysunek 5A).</li>
	<li>Wprowadź wspólny znacznik dla .csv plików, tj. wspólny czynnik w ich nazwach. Wprowadź liczbę zestawów obrazów, które mają być używane do symulacji w trybie wsadowym.</li>
	<li>Załaduj plik .jpg wygenerowany z kanału zrębu (z nazwą pliku kończącą się _3).</li>
	<li>Wprowadź ustawienia generowania maski z kanału DAPI:
	<ol>
		<li>Zaznacz pole "Zastosować maskę?" Ustaw próg konwersji obrazu DAPI na maskę binarną na 10 (zakres 0 - 255).</li>
		<li>Zaznacz pole "8-bitowy"? Zaznacz pole "Rozszerzyć?" i ustaw stopień dylatacji na 5 pikseli. Zaznacz pole "z erozją?".</li>
		<li>Wprowadź żądaną wartość promienia sąsiedztwa (promień sąsiedztwa) używaną do analizy symulowanych obrazów. Dla obrazu o wymiarach 708,15 x 708,15 μm i rozmiarze 2 048 x 2 048 px (skalowanie pikseli xy: 0,346 μm), 29 px odpowiada 10 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pole wyboru "Używać Otsu?", aby użyć algorytmu17 Ottu do automatycznego wykrywania struktur zrębowych. 
	UWAGA: Jest to ten sam algorytm, który jest używany przez narzędzie do kontaktu i sąsiedztwa. Wykorzystanie tego samego algorytmu segmentacji obrazu w zautomatyzowanej analizie zarejestrowanego obrazu i symulowanego obrazu ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia porównywalności danych.</li>
	<li>Wprowadź ustawienia komórek krwiotwórczych, które są symulowane jako okrągłe kształty. 
	UWAGA: Numery komórek czerwonych, zielonych i niebieskich są ładowane bezpośrednio z pliku .csv (patrz także krok 5.6).
	<ol>
		<li>Użyj narzędzia symulacyjnego, aby obliczyć średnią średnicę w px czerwonych, zielonych i niebieskich komórek. Określ średni obszar pojedynczej komórki jako całkowity obszar każdego typu komórki na obrazie w pikselach podzielony przez całkowitą liczbę komórek na obrazie. Użyj średniej powierzchni, aby obliczyć promień dysku za pomocą wzoru. Podwój promień, aby określić średnią średnicę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz rozkład wielkości analizowanych typów komórek za pomocą dowolnego oprogramowania do analizy obrazu, które zawiera funkcje segmentacji obiektów. Określ σ dla wszystkich typów komórek krwiotwórczych (18 i ryc. 5B). 
	UWAGA: Ponieważ rozkłady wielkości zarejestrowanych komórek nie są określane przez automatyczną analizę obrazu, należy użyć rozkładu Gaussa jako przybliżenia rozkładów rzeczywistych. Szerokość krzywej rozkładu jest opisana przez σ i może być bardzo różna dla różnych typów komórek. (Szczegółowe informacje znajdują się na rysunku 5B).
	<ol>
		<li>Na podstawie tych pomiarów określ "odcięcie rozmiaru komórki": średnicę w pikselach, która opisuje najmniejszy obiekt nadal rozpoznawany jako kompletna komórka przez narzędzie do analizy obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadź parametry w odpowiednich polach graficznego interfejsu użytkownika (Rysunek 5A).
	<ol>
		<li>Wprowadź odcięty rozmiar komórki, tj. minimalny rozmiar komórki dozwolony w symulacji, jako średnicę w px.</li>
		<li>Wprowadź σ w px, aby przeprowadzić symulację rozkładu rozmiaru komórek dla komórek czerwonych, zielonych i niebieskich (od kroku 5.9).</li>
		<li>Zaznacz pole "Usuń" w podsekcji "Komórki w masce". Przy tym ustawieniu program wybierze nową pozycję dla komórki, jeśli nakłada się ona na co najmniej jeden piksel z obszarem maski bez wyjścia. Zaznacz pole "Unikać nakładania się komórek?" w podsekcji "Wykluczanie komórek".</li>
		<li>Wprowadź dozwoloną minimalną odległość między środkami dwóch komórek w px. 
		UWAGA: Minimalną odległość należy określić na podstawie zarejestrowanych obrazów. Nieprawidłowo zmierzone odległości minimalne doprowadzą do stronniczych/sztucznych wyników porównania zarejestrowanych i symulowanych obrazów.</li>
		<li>Ustaw maksymalny obszar nakładania na 100%, jeśli nakładanie jest definiowane przez minimalną odległość od środka do środka.</li>
		<li>Ustaw narzędzie symulacyjne na 1,000 powtórzeń.</li>
		<li>Zaznacz pole "Automatycznie zapisywać komórki?", aby zapisać współrzędne symulowanych obiektów dla wszystkich powtórzeń każdego obrazu wsadu jako pliki .rect (format tekstowy). Zaznacz pole "Automatycznie zapisywać obrazy?", aby zapisać plik .tiff dla każdego symulowanego obrazu. Wprowadź wspólny znacznik dla zapisanych plików. 
		UWAGA: Opcja "Automatycznie zapisywać komórki?" skraca czas trwania symulacji i ogólny rozmiar danych w porównaniu z zapisywaniem rzeczywistych symulowanych obrazów. Pliki .rect zapisują współrzędne symulowanych komórek jako prostokąty i w ten sposób można je w razie potrzeby przekształcić w symulowane obrazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij symulację, klikając "Uruchom symulację". 
	UWAGA: Narzędzie symulacyjne automatycznie generuje plik .csv dla 1 000 symulacji każdego obrazu, w tym średniej liczby kontaktów i liczby okolic dla komórek czerwonych, zielonych i niebieskich z komórkami czerwonymi, zielonymi, niebieskimi i zrębowymi dla każdego zestawu powtarzających się symulacji. Dodatkowo dla wszystkich tych wartości podane są średnie z 1000 symulacji z odchyleniem standardowym (STD) i błędem standardowym średniej (SEM).</li>
	<li>Określ średnie częstotliwości kontaktu i częstotliwości sąsiedztwa dla jednego zestawu 1 000 symulowanych obrazów. W tym celu należy podzielić średnią liczbę kontaktów i okolic przez zarejestrowaną liczbę komórek na obrazie. Porównaj częstotliwości z wynikami automatycznej analizy kolokalizacyjnej zarejestrowanego obrazu.</li>
	<li>Zastosuj odpowiednie metody statystyczne w zależności od analizy19 (na rysunku 7 użyliśmy dwustronnego testu rang ze znakiem Wilcoxona).</li>
</ol>

<ol><li>Kunisaki, Y., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secrets+of+the+bone+marrow+niche%3A+Enigmatic+niche+brings+challenge+for+HSC+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion.</a> Nat Med. 18, 864-865 (2012).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505, 327-334 (2014).</li>
<li>Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+niches+controlling+B+lymphocyte+behavior+within+bone+marrow+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development.</a> Immunity. 20, 707-718 (2004).</li>
<li>Cariappa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perisinusoidal+B+cells+in+the+bone+marrow+participate+in+T-independent+responses+to+blood-borne+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes.</a> Immunity. 23, 397-407 (2005).</li>
<li>Sapoznikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+clusters+of+dendritic+cells+provide+critical+survival+signals+to+B+cells+in+bone+marrow+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches.</a> Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).</li>
<li>Tokoyoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Professional+memory+CD4%2B+T+lymphocytes+preferentially+reside+and+rest+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow.</a> Immunity. 30, 721-730 (2009).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+is+a+major+reservoir+and+site+of+recruitment+for+central+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells.</a> Immunity. 22, 259-270 (2005).</li>
<li>Lin, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+4-1BBL+on+radioresistant+cells+in+providing+survival+signals+through+4-1BB+expressed+on+CD8%28%2B%29+memory+T+cells+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow.</a> Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).</li>
<li>Zehentmeier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+and+dynamic+components+synergize+to+form+a+stable+survival+niche+for+bone+marrow+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells.</a> Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).</li>
<li>Nagasawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+niches+in+the+bone+marrow+required+for+B-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development.</a> Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).</li>
<li>Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faithful+activation+of+an+extra-bright+red+fluorescent+protein+in+%27knock-in%27+Cre-reporter+mice+ideally+suited+for+lineage+tracing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in 'knock-in' Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies.</a> Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).</li>
<li>Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cre-transgenic+mouse+strain+for+the+ubiquitous+deletion+of+loxP-flanked+gene+segments+including+deletion+in+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells.</a> Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).</li>
<li>Kawamoto, T., Kawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+thin+frozen+sections+from+nonfixed+and+undecalcified+hard+tissues+using+Kawamot%27s+film+method%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Cytol%22%5BJournal%5D)">Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method.</a> Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).</li>
<li>Smith, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience+%2F+editorial+board%2C+Jacqueline+N.+Crawley+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Basic confocal microscopy.</a> Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 2 (Unit 2.2), (2001).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+threshold+selection+method+from+gray-level+histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Sys.%2C+Man.%2C+Cyber%22%5BJournal%5D)">A threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).</li>
<li>Hughes, I., Hase, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHughes%2C+I+%22Measurements+and+Their+Uncertainties%3A+A+Practical+Guide+To+Modern+Error+Analysis%22">Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2010).</li>
<li>Quinn, G. P., Keough, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQuinn%2C+GP+%22Experimental+Design+and+Data+Analysis+for+Biologists%22">Experimental Design and Data Analysis for Biologists</a>. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2002).</li>
<li>Kiel, M. J., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncertainty+in+the+niches+that+maintain+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells.</a> Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).</li>
<li>MacQueen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+Methods+for+classification+and+Analysis+of+Multivariate+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+5th+Berkeley+Symposium+on+Mathematical+Statistics+and+Probability+Vol.+1%22%5BJournal%5D)">Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations.</a> Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. 1965 Jun 21-Jul 18, Statistical Laboratory of the University of California, Berkeley, , University of California Press. Berkeley, CA. 666(1967).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Jarjour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+reveals+origin+and+dynamics+of+lymph+node+follicular+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells.</a> J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).</li>
<li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histo-cytometry%3A+a+method+for+highly+multiplex+quantitative+tissue+imaging+analysis+applied+to+dendritic+cell+subset+microanatomy+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes.</a> Immunity. 37, 364-376 (2012).</li>
<li>Moreau, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37, 351-363 (2012).</li>
<li>Siffrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+partially+reversible+th17+cell-induced+neuronal+dysfunction+in+the+course+of+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis.</a> Immunity. 33, 424-436 (2010).</li>
<li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche%3A+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).</li>
<li>Danielsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euclidian+distance+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Computer+Graphics+and+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">Euclidian distance mapping.</a> Computer Graphics and Image Processing. 14, 21(1980).</li>
<li>Tellier, J., Kallies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+home+for+plasma+cells+-+a+niche+to+survive%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Finding a home for plasma cells - a niche to survive.</a> Eur J Immunol. , (2014).</li>
<li>Winter, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocytes+constitute+a+functional+component+of+a+plasma+cell+niche+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow.</a> Blood. 116, 1867-1875 (2010).</li>
<li>Rozanski, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+antibody+responses+depend+on+CD28+function+in+bone+marrow-resident+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells.</a> J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).</li>
<li>Rodriguez Gomez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basophils+support+the+survival+of+plasma+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Basophils support the survival of plasma cells in mice.</a> J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+and+adhesion+patterns+determine+the+cellular+composition+of+the+bone+marrow+plasma+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche.</a> J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).</li>
<li>Kohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-CSF-mediated+thrombopoietin+release+triggers+neutrophil+motility+and+mobilization+from+bone+marrow+via+induction+of+Cxcr2+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands.</a> Blood. 117, 4349-4357 (2011).</li>
</ol>

Juan Escribano Navarro jest powiązany z Wimasis GmbH, Monachium, Niemcy. Pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Pomimo postępów w nowoczesnych metodach obrazowania optycznego, analiza danych histologicznych jest wciąż często utrudniana przez brak odpowiednich narzędzi i metod kwantyfikacji lub przez stronnicze analizy koncentrujące się na niewielkim obszarze zainteresowania. Przedstawione tutaj podejście synergistyczne łączy analizę obrazu obejmującą cały obszar szpiku kostnego, zautomatyzowaną segmentację i rozpoznawanie obiektów różnych typów komórek krwiotwórczych i zrębowych, analizę ko-lokalizacji, a na koniec narzędzie do wa...

Ze względu na niedawny szybki rozwój technologiczny w mikroskopii, w tym obrazowanie optyczne, analiza komórek w kontekście całej tkanki staje się coraz bardziej dostępna dla immunologów. Charakterystyka pojedynczych komórek w zawiesinie stanowi cenną i niezbędną metodę zrozumienia funkcji komórkowych i molekularnych. Jednak analiza komórek w ich (mikro)anatomicznym środowisku jest niezbędna do zrozumienia interakcji między różnymi typami komórek, które współpracują w złożonych procesach, takich jak rozwój odpowiedzi immunologicznej.
Chociaż stosunkowo łatwo jest uzyskać informacje jakościowe z obrazów, ilościowe określenie tych danych pozostaje wyzwaniem, częściowo ze względu na fakt, że metody analizy w tej dziedzinie są opóźnione w porównaniu do tego, co jest możliwe w pozyskiwaniu obrazów. Wielu badaczy nadal polega na czasochłonnym ręcznym zliczaniu komórek w swoich obrazach histologicznych, wprowadzając w ten sposób stronniczość między różnymi oceniającymi i utrudniając replikację przez inne grupy. Często wybiera się jeden reprezentatywny obraz, aby podkreślić stwierdzenie dotyczące pozycji sieci komórkowej lub kolokalizacji w publikacji, co utrudnia czytelnikowi ocenę statystycznego znaczenia takiego zdarzenia.
Razem z faktem, że pełna zawartość informacji zawartych w danych obrazowych jest rzadko wykorzystywana, podkreśla to potrzebę bardziej bezstronnego, szybszego i wszechstronnego podejścia do analizy obrazów histologicznych.
Szpik kostny to złożona tkanka, która pełni ważne funkcje życiowe jako organ hematopoezy u dorosłych kręgowców. Oprócztego, że jest miejscem narodzin komórek krwiotwórczych1,2 i odgrywa ważną rolę w rozwoju limfocytów B3, działa również jako miejsce, w którym inicjowane są reakcje immunologiczne4 i wspiera dojrzałe, recyrkulacyjne limfocyty B5. Ponadto jego rola w utrzymaniu pamięci immunologicznej stała się coraz bardziej doceniana w ostatniej dekadzie, ponieważ stwierdzono, że rezyduje tam kilka typów komórek składających się na pamięć immunologiczną6-9.
Związek między złożoną architekturą tkankową szpiku kostnego a jego funkcjami nadal pozostaje nieuchwytny. W przeciwieństwie do wtórnych narządów limfatycznych, które są zorganizowane w makroprzedziały, takie jak strefy komórek T i B, szpik kostny nie ma wyraźnego podziału na makroprzedziały. Do tej pory odrębne przedziały w szpiku kostnym są definiowane przez ich bliskość do kory kostnej lub do układu naczyniowego. Znaczenie różnych rezydujących populacji komórek zrębowych w szpiku kostnym dla wielu procesów, takich jak wspieranie komórek macierzystych, rozwój komórek B lub utrzymanie populacji komórek pamięci immunologicznej (takich jak długowieczne komórki plazmatyczne (PC), limfocyty T pamięci CD4 + i CD8 +) wyraźnie wskazuje, że w szpiku kostnym istnieje pewien stopień mikrokompartmentalizacji.
Te obserwacje doprowadziły do koncepcji odrębnych nisz mikroanatomicznych, które specjalizują się w określonych funkcjach (utrzymanie komórek macierzystych, rozwój komórek B na różnych etapach i utrzymanie pamięci immunologicznej) w szpiku kostnym. Chociaż wydaje się, że istnieje pewien stopień niejednorodności wśród nisz, które pełnią różne funkcje, niektóre czynniki wytwarzane przez komórki zrębu, takie jak ligand 12 chemokiny CXC (CXCL12) lub interleukina 7 (IL-7), są kluczowymi składnikami kilku z tych nisz10. Wizualizacja i charakterystyka komórek zrębu w szpiku kostnym jest trudna ze względu na ich cechy morfologiczne z długimi, cienkimi wypustkami dendrytycznymi tworzącymi sieć w całym szpiku kostnym oraz brak odpowiednich markerów do rozróżniania subpopulacji zrębu.
Nie jest jeszcze jasne, w jakim stopniu te nisze mają wspólne cechy w odniesieniu do ich składu komórkowego i molekularnego, oraz które elementy sprawiają, że dana nisza jest wyjątkowa. Oprócz komórek zrębu wykazano, że typy komórek krwiotwórczych odgrywają kluczową rolę, dostarczając pewnych sygnałów przynajmniej dla niektórych nisz. Nie ulega wątpliwości, że złożoność składu niszy wymaga ich analizy in situ, a dla immunologów i hematologów coraz ważniejsze staje się przybliżanie mikroarchitektury szpiku kostnego, np. poprzez analizę relacji przestrzennych między jego składnikami komórkowymi.
Tutaj przedstawiono strategię ilościowego określania kolokalizacji komórkowej i relacji sąsiedztwa w szpiku kostnym w sposób zautomatyzowany i bezstronny. Zapewniony jest szczegółowy przepływ pracy, w tym generowanie chimerycznych myszy, zawierających fluorescencyjne komórki zrębu i niefluorescencyjne komórki krwiotwórcze, przygotowanie wycinków histologicznych z nieodwapnionych kości, akwizycję obrazów konfokalnych obejmujących całą kość, a także zautomatyzowaną analizę obrazu kolokalizacji komórkowej i jej walidację/dyskryminację na podstawie losowego pozycjonowania za pomocą narzędzia symulacyjnego (ryc. 8).

<table><tbody><tr><td>Neomycyna</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma</a></td><td>N6386 SIGMA</td><td>Hydrat soli trysiarczanu neomycyny, kod zagrożenia UE: GHS08</td></tr><tr><td>Ursovit AD3EC</td><td>Serumwerke Bernburg</td><td></td><td>1 ml zawiera: 50.000 I.E. palmitynianu retinylu, 5.000 I.E. cholekalcyferolu, 30 mg octanu tokoferolu, 100 mg kwasu askorbinowego, 1 mg kwasu sorbowego, 200 mg polioksylowanego oleju rycynowego 35, 0,5 mg galianu propylu</td></tr><tr><td>Bufor transferowy (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicyliny/streptomycyny)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma</a></td><td>P4333, H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hapten 4-hydroksy-3-nitrofenyloacetylokoniugowany z gamma globuliną kurcząt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gamma globulina kurcząt (CGG) 100 mg</td><td><a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Rockland</a></td><td>D602-0100</td><td></td></tr><tr><td>20% roztwór paraformaldehydu (klasa EM)</td><td>Science Services</td><td>15713</td><td>Kody zagrożenia UE: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08</td></tr><tr><td>D(+)-sacharoza</td><td><a href="http://www.carlroth.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Roth</a></td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>179124 SIGMA-ALDRICH</td><td>Kody zagrożenia UE: GHS02, GHS07</td></tr><tr><td>Heksan</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>208752 SIGMA-ALDRICH</td><td>Kody zagrożenia UE: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09</td></tr><tr><td>Formy do kriosekcji Tissue-Tek (standardowe)</td><td><a href="http://www.sakuraus.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sakura</a></td><td>4557</td><td>25 x 20 x 5 mm</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td><a href="http://www.sakuraus.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sakura</a></td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Medium do zatapiania SCEM Kawamoto</td><td><a href="http://section-lab.jp/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Section-Lab, JP</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania krioprzekrojów Kawamoto&amp;nbsp;</td><td><a href="http://section-lab.jp/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Section-Lab, JP</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kriofolia Kawamoto typ 2C(9)</td><td><a href="http://section-lab.jp/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Section-Lab, JP</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nóż do mikrotomu MX35 premier plus, niski profil</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>3052835</td><td>Dł. x szer.: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), grubość: 0.25 mm (0.01")</td></tr><tr><td>Poliklonalne królicze przeciwciało anty-RFP, biotynilowane</td><td><a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Rockland</a></td><td>600-406-379</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna Alexa Fluor 555</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>S-32355</td><td></td></tr><tr><td>Szczurze anty-MBP</td><td>J. and N. Lee</td><td></td><td>dostępne od: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., klon MT-14.7</td></tr><tr><td>Kozie anty-szczurze Alexa Fluor 647</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>Szczurze anty-B220 - Alexa Fluor 594</td><td></td><td></td><td>wyprodukowane i sprzężone wewnętrznie (DRFZ), klon RA3.6B2, Alexa Fluor 594 z Life Technologies</td></tr><tr><td>Mysie anty-łańcuch lekki l1 -FITC</td><td></td><td></td><td>wyprodukowane i sprzężone wewnętrznie (DRFZ), klon LS136</td></tr><tr><td>Szczurze anty-łańcuch lekki k - FITC</td><td></td><td></td><td>wyprodukowane i sprzężone wewnętrznie (DRFZ), klon 187.1</td></tr><tr><td>DAPI (4&amp;prime;,6-diamidyno-2-fenyloindolu dichlorowodorek)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma</a></td><td>D9542 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjne medium montażowe</td><td><a href="http://www.dako.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> DAKO</a></td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe (24 x 24 x 0.13-0.16 mm)</td><td><a href="http://www.carlroth.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Roth</a></td><td>H875.2</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka Superfrost (75 x 25 mm)</td><td><a href="http://www.vwr.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VWR</a></td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td></td><td></td><td>wyposażony w linie laserowe 405, 488, 561, 594, 633 nm oraz obiektyw powietrzny 20X/0.8 NA. Użyto mikroskopu Zeiss LSM710 oraz oprogramowania Zen 2010 w wersji 6.0.</td></tr><tr><td>Zautomatyzowane narzędzia do analizy obrazów szpiku kostnego</td><td><a href="http://www.wimasis.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Wimasis, Monachium</a></td><td></td><td>Narzędzie do kontaktu komórek oraz narzędzie do sąsiedztwa komórek zostaną udostępnione przez firmę Wimasis na życzenie.</td></tr><tr><td>Środowisko uruchomieniowe VC2012</td><td>Microsoft</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679" target="_blank"&gt;bezpłatne pobieranie&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Narzędzie symulacyjne do losowego rozmieszczania komórek</td><td></td><td></td><td>dostępne od nas na życzenie</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu z funkcjami segmentacji obrazu</td><td></td><td></td><td>Do pomiaru rozkładu wielkości komórek hematopoetycznych w szpiku kostnym użyto programu Volocity (Perkin Elmer) (&lt;strong&gt;Rycina 5&lt;/strong&gt;). Alternatywami są Definiens Image Analysis (Definiens) lub Cell Profiler (&lt;a href="http://www.cellprofiler.org" target="_blank"&gt;bezpłatne pobieranie&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu Fiji&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank"&gt;bezpłatne pobieranie&lt;/a&gt;. Program Fiji był używany przez przeszkolonych oceniających do ręcznego liczenia komórek (&lt;strong&gt;Rycina 3&lt;/strong&gt;).</td></tr></tbody></table>

zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Mikroskopia konfokalna jest metodą z wyboru do analizy lokalizacji wielu typów komórek w złożonych tkankach, takich jak szpik kostny. Jednak analiza i kwantyfikacja lokalizacji komórkowej jest trudna, ponieważ w wielu przypadkach opiera się na ręcznym liczeniu, co wiąże się z ryzykiem wprowadzenia błędu systematycznego zależnego od oceniającego i zmniejszenia wiarygodności między oceniającymi. Co więcej, często trudno jest ocenić, czy kolokalizacja między dwiema komórkami wynika z losowego pozycjonowania, zwłaszcza gdy typy komórek różnią się znacznie częstotliwością ich występowania. W tym miejscu przedstawiono metodę bezstronnej kwantyfikacji kolokalizacji komórkowej w szpiku kostnym. Protokół opisuje przygotowanie próbki stosowanej w celu uzyskania wycinków histologicznych całych mysich kości długich, w tym szpiku kostnego, a także protokół barwienia i pozyskiwanie obrazów o wysokiej rozdzielczości. Przedstawiono przebieg analizy obejmujący proces od rozpoznawania typów komórek krwiotwórczych i niekrwiotwórczych w dwuwymiarowych (2D) obrazach szpiku kostnego do kwantyfikacji bezpośrednich kontaktów między tymi komórkami. Obejmuje to również analizę sąsiedztwa w celu uzyskania informacji o mikrośrodowisku komórkowym otaczającym określony typ komórki. Aby ocenić, czy kolokalizacja dwóch typów komórek jest jedynie wynikiem losowego rozmieszczenia komórek, czy też odzwierciedla preferencyjne powiązania między komórkami, stosuje się narzędzie symulacyjne, które jest odpowiednie do testowania tej hipotezy w przypadku komórek krwiotwórczych i zrębowych. Podejście to nie ogranicza się do szpiku kostnego i może zostać rozszerzone na inne tkanki, aby umożliwić odtwarzalną, ilościową analizę danych histologicznych.

Przygotowanie kriosiekcji nieodwapnionej kości metodą taśmową Kawamoto pozwala na wycięcie całej kości jako nienaruszonego przekroju, w którym szpik kostny obszaru endostealnego pozostaje przylegający do zmineralizowanej tkanki kostnej, zarówno w trzonie, jak i w obszarach nasadowych o wysokiej gęstości kości beleczkowej (Rysunek 1). Barwienie jąder komórkowych w przekrojach wykazuje, że mimo iż nie można całkowicie uniknąć niewielkich pęknięć w preparacie, struktura zatok i tętnic, a także sieć retikula...

Przedstawiono strategię ilościowej analizy danych histologicznych w szpiku kostnym. Mikroskopia konfokalna znakowanych fluorescencyjnie komórek w skrawkach tkanek daje 2-wymiarowe obrazy, które są automatycznie analizowane. Analizy kolokalizacyjne różnych typów komórek są porównywane z danymi z symulowanych obrazów, dostarczając ilościowych informacji o interakcjach komórkowych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie powiązań między konkretnymi subpopulacjami komórek w szpiku kostnym. Jest to realizowane poprzez wstępne pobranie histologicznych krioprzekrojów z guzów kości udowych myszy. W drugim kroku przekroje są barwione do analizy immunofluorescencyjnej, a następnie wykonuje się obrazowanie konfokalne.Następnie obrazy są analizowane cyfrowo. Ostatecznie można zasymulować położenie różnych typów komórek, aby obliczyć szybkość i częstotliwość kontaktów między konkretnymi komórkami immunologicznymi, które są przedmiotem zainteresowania, a ich mikrośrodowiskiem. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas analizy nisz mikrośrodowiskowych długożyjących komórek plazmatycznych w szpiku kostnym, gdy pojawiła się potrzeba zastosowania metody pozwalającej na jednoznaczne ilościowe określenie powiązań komórkowych w obrębie tkanki szpiku kostnego.RA Maya zademonstruje procedurę kriosekcjonowania kości udowych dorosłej myszy. Najpierw ustaw temperaturę próbki i noża w standardowym mikrotomie wyposażonym w nóż do twardych tkanek na -24°C. Odczekaj 15 minut w celu aklimatyzacji.Przymocuj blok próbki do metalnego uchwytu za pomocą medium do kriowlewa

automated-quantification-hematopoietic-cell-stromal-cell-interactions

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zautomatyzowane ilometrowanie interakcji między komórkami krwiotwórczymi a komórkami stromy w obrazach histologicznych niedekalizacji kości

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Prezentujemy proces tworzenia segmentacji i kwantyfikacji kości beleczkowych dla obrazów 2D i 3D na podstawie zewnętrznej granicy kości za pomocą wtyczki ImageJ. Podejście to jest bardziej wydajne i dokładne niż obecne podejście do ręcznego ręcznego konturowania i zapewnia kwantyfikację warstwa po warstwie, która nie jest dostępna w obecnym oprogramowaniu komercyjnym.

Segmentacja i kwantyfikacja kości beleczkowych wspomagana granicami zewnętrznymi za pomocą wtyczki Imagej

Diagnoza MDS jest trudna ze względu na brak kryteriów morfologicznych lub cytogenetyki bez informacji. MFC może pomóc udoskonalić proces diagnostyczny MDS. Aby analiza MFC stała się przydatna w praktyce klinicznej, musi opierać się na parametrach o wystarczającej swoistości i czułości, a dane powinny być powtarzalne dla różnych operatorów.

Cytometria przepływowa sterowana bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego

Hodowla ex vivo eksplantatów kostnych może być cennym narzędziem do badania fizjologii kości i potencjalnej oceny leków w przebudowie kości i chorobach kości. Prezentowany protokół opisuje przygotowanie i hodowlę kalwarii wyizolowanych z czaszek nowonarodzonych myszy, a także jej zastosowania.

Pomiar przebudowy kości i odtworzenie mikrośrodowiska guz-kość przy użyciu kokultury kalwarii i histomorfometrii

Prezentujemy metodę, która wykorzystuje uogólnioną analizę obrazu opartą na obszarze do identyfikacji liczby komórek. Analiza różnych populacji komórek pozwoliła na wykorzystanie znacznych różnic w wysokości i strukturze komórek między różnymi typami komórek w ramach algorytmu adaptacyjnego.

Algorytm analizy obrazu oparty na obszarze do ilościowego oznaczania kokultur makrofagów i fibroblastów

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Tutaj opisujemy łatwy do wdrożenia, ustandaryzowany, mikrofizjologiczny system, który odzwierciedla złożoność struktury ludzkiego szpiku kostnego in vivo, dostarczając odpowiedniego modelu do precyzyjnego badania szerokiego zakresu normalnych i patologicznych zdarzeń.

Model 3D ludzkiego szpiku kostnego do badania dynamiki i interakcji między komórkami rezydentnymi w kontekście fizjologicznym lub nowotworowym

Ten protokół przedstawia ekonomiczną i efektywną metodę ilościowej oceny mikroarchitektury kości w mysim modelu osteoporozy poprzez połączenie barwienia Hematoxylin-Eosin (HE) i technik mikrotomografii komputerowej (Micro-CT).

Ocena mikroarchitektury kości beleczkowej w mysim modelu osteoporozy

Tutaj ustanowiliśmy in vivo osteo-organoidy uruchamiane przez morfogenetyczne rusztowania żelatynowe z białkiem 2 w celu pobrania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych w celu odbudowy uszkodzonego układu krwiotwórczego i odpornościowego. Ogólnie rzecz biorąc, takie podejście może stanowić obiecujące źródło komórek w terapiach komórkowych.

Podejście osteoorganoidowe in vivo do pozyskiwania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych

Tutaj prezentujemy protokoły, które umożliwiają izolację komórek zrębu z mysich kości, szpiku kostnego, grasicy i ludzkiej tkanki grasicy, kompatybilne z monokomórkową multiomiką.

Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Ten protokół przedstawia różnicowanie ludzkich osteoklastów od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i opisuje metody charakterystyki osteoklastów i prekursorów osteoklastów.

Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Naucz się automatycznej kwantyfikacji interakcji komórek krwiotwórczych ze zrębem w szpiku kostnym myszy. Ta metoda wykorzystuje mikroskopię konfokalną i analizę cyfrową do badania dynamiki komórek immunologicznych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

Przeglądaj więcej filmów