Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Opisany protokół pozwala na analizę fenotypową krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek zrębu szpiku kostnego. Może być używany do badania zaburzeń w tych populacjach w różnych warunkach. W porównaniu z innymi wcześniej opisanymi metodami, technika ta pozwala na analizę fenotypową komórek krwiotwórczych, w szczególności w dwóch funkcjonalnych obszarach szpiku, śródkostnym i centralnym szpiku kostnym, a także w komórkach zrębu szpiku kostnego.

Na początek umieść uśpione zwierzę brzuchem do góry na szalce Petriego i spryskaj 70% etanolem. Wykonaj nacięcie nad brzuchem za pomocą nożyczek i odciągnij skórę aż do kostek. Chwyć jedną z nóg i odetnij jej dolną część, aby oddzielić ją od zwierzęcia za pomocą nożyczek.

Następnie zdejmij stopę z nogi, przecinając kostkę i umieść nogę w lodowatym PBS 2%FBS. Następnie chwyć kość biodrową za pomocą pęsety i przetnij za nią, aby oddzielić ją od zwierzęcia za pomocą nożyczek. Umieść kość biodrową w lodowatym PBS 2%FBS.

Po umieszczeniu nogi i kości biodrowej na szalce Petriego, oczyść kości za pomocą sterylnego skalpela. Następnie oddziel kość piszczelową i udową, przecinając kolano skalpelem i umieść czyste kości w lodowatym PBS 2%FBS. Umieść kość udową lub piszczelową w moździerzu z lodowatym PBS 2%FBS i zmiażdż kość, delikatnie dociskając ją do ścianki moździerza za pomocą tłuczka.

Następnie pipetuj powstałą zawiesinę komórek w górę iw dół za pomocą 10-mililitrowej pipety do homogenizacji i przenieś ją do 50-mililitrowej probówki przez sitko o średnicy 40 mikrometrów umieszczone na górze probówki. Przepłucz zaprawę większą ilością PBS 2%FBS i przenieś roztwór do tej samej 50-mililitrowej probówki przez to samo sitko o średnicy 40 mikrometrów. Odwirować 50-mililitrową probówkę o stężeniu 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach buforu do lizy RBC w temperaturze pokojowej, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół. Po dwuminutowej inkubacji w temperaturze pokojowej dodać 15 mililitrów PBS 2%FBS i odwirować 50-mililitrową probówkę. Jeśli osad komórkowy nie wygląda na czerwonawy, wyrzuć supernatant, ponownie zawieś osad w 200 mikrolitrach PBS 2% FBS i przenieś zawiesinę komórek do dołka z 96-dołkową płytką dolną V w celu barwienia.

Po zmiażdżeniu kości, jak pokazano wcześniej, odetnij końcówkę pipety P1000 za pomocą nożyczek i użyj jej do przeniesienia całej zawartości zaprawy do 50-mililitrowej tuby. Następnie odwirować 50-mililitrową probówkę o stężeniu 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach kolagenazy IV i roztworze dypazy II.

Inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut. Uzupełnij rurkę do 25 mililitrów PBS 2%FBS i wiruj do wymieszania. Następnie przenieś zawartość do nowej 50-mililitrowej probówki przez sitko o średnicy 100 mikrometrów.

Następnie dodaj 15 mililitrów PBS 2%FBS do starej 50-mililitrowej probówki i przenieś roztwór do nowej 50-mililitrowej probówki przez sitko o średnicy 100 mikrometrów. Po odwirowaniu i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawieś osad komórek w pięciu mililitrach buforu do lizy RBC, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół za pomocą pipety. Po dwuminutowej inkubacji w temperaturze pokojowej dodaj 15 mililitrów PBS 2%FBS.

Ponownie odwirować probówkę i jeśli osad komórkowy nie wygląda na czerwonawy po odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach PBS 2% FBS i przenieść zawiesinę komórek do studzienki z 96-dołkową płytką dolną V w celu barwienia. Następnie odwirować płytkę w stężeniu 500 G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieść kość udową na szalce Petriego i odetnij końce kości za pomocą sterylnego skalpela.

Następnie przepłukać środkową część kości, przepuszczając 100 mikrolitrów PBS 2%FBS przez wnętrze kości raz z każdej strony, używając strzykawki insulinowej bez martwej objętości 0,5 mililitra i zbierając roztwór do probówki mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr PBS 2%FBS. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do 50-mililitrowej probówki oznaczonej jako przepłukany szpik kostny, zawierającej cztery mililitry PBS 2% FBS. Zmiażdż końce kości w moździerzu z lodowatym PBS 2%FBS, delikatnie dociskając je do ścianki moździerza za pomocą tłuczka.

Po homogenizacji zawiesiny komórek przenieś ją do 50-mililitrowej probówki oznaczonej jako zmiażdżony szpik kostny przez sitko o średnicy 40 mikrometrów. Na koniec spłucz moździerz większą ilością PBS 2%FBS i przenieś roztwór do tej samej probówki. Analizę cytometrii przepływowej krwiotwórczych komórek macierzystych i multipotencjalnych komórek progenitorowych przeprowadzono w całkowitym szpiku kostnym u zdrowej młodej osoby dorosłej C57BL6J myszy.

W analizie komórek zrębu, komórek śródbłonka i mezenchymalnych komórek macierzystych w całkowitym szpiku kostnym, mezenchymalne komórki macierzyste można łatwo zidentyfikować na podstawie ekspresji receptora leptyny, a komórki śródbłonka można zidentyfikować na podstawie ekspresji CD31 i SCA-1. Analiza metodą cytometrii przepływowej komórek śródbłonka w całkowitym szpiku kostnym wykazująca rozróżnienie między komórkami śródbłonka tętniczek i sinusoidalnych w oparciu o ICAM1. Kwantyfikacja komórek śródbłonka tętniczego i sinusoidalnego szpiku kostnego w centralnej i śródkostnej tkance szpiku kostnego pokazuje, że komórki śródbłonka szpiku kostnego tętniczego są liczniejsze w obszarach śródkostnych, podczas gdy sinusoidy występują częściej w centralnych obszarach szpiku kostnego.

W przypadku uzyskania zaczerwienionego szpiku kostnego nie należy przekraczać wskazanej objętości lub liczby przypadków, w których PBS 2%FBS przechodzi przez wnętrze środkowej części kości. Połączenie opisanej metody z testami funkcjonalnymi analizowanych fenotypowo populacji komórek dostarczyłoby dalszych cennych informacji na temat potencjalnych zaburzeń tych populacji występujących w badanych warunkach. Opisany protokół pozwala na analizę fenotypową komórek krwiotwórczych w sposób zróżnicowany w śródkostniu i centralnym szpiku kostnym, umożliwiając naukowcom zbadanie zaburzeń hematopiezy potencjalnie występujących specyficznie w tych lokalizacjach szpiku kostnego.