Name: Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj analizę cytometrii przepływowej komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego myszy oraz komórek niszowych zrębu. Ta metoda umożliwia szczegółowe badanie fenotypowe w obszarach endostalnym i centralnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LM było wspierane przez grant z Lady Tata Memorial Trust. JR był wspierany przez stypendium doktoranckie z Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; Stypendium FCT UI/BD/150833/2021). ML było wspierane przez stypendium doktoranckie FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD było wspierane przez granty Amerykańskiego Towarzystwa Hematologicznego, Fundacji Pablove, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) oraz Portugalskiego Towarzystwa Hematologicznego. Dziękujemy za wsparcie ze strony dr Catariny Meireles i Emilii Cardoso z placówki TRACY w i3s.

<ol><li>Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niches+that+regulate+stem+cells+and+hematopoiesis+in+adult+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow.</a> Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).</li>
<li>Purton, L. E., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Asada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cytokine+contributions+of+perivascular+haematopoietic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches.</a> Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).</li>
<li>Mosteo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+interface+between+the+bone+marrow+vascular+niche+and+hematopoietic+stem+cells+in+myeloid+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189(2021).</li>
<li>Christodoulou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+imaging+of+native+haematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).</li>
<li>Itkin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+bone+marrow+blood+vessels+differentially+regulate+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis.</a> Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).</li>
<li>Kusumbe, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+modulation+of+vascular+niches+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).</li>
<li>Duarte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endosteal+vascular+niche+remodeling+rescues+hematopoietic+stem+cell+loss+in+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).</li>
<li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li>
<li>Laurenti, E., Gottgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+distinct+subsets+of+lineage-biased+multipotent+progenitors+control+blood+production+in+normal+and+regenerative+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).</li>
<li>Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+murine+multipotent+progenitor+isolation+scheme%3A+Establishing+a+consensus+approach+for+multipotent+progenitor+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification.</a> Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).</li>
<li>Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).</li>
<li>Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+angiogenesis+and+osteogenesis+by+a+specific+vessel+subtype+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone.</a> Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).</li>
<li>Hawkins, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+lymphocyte+proliferation%2C+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).</li>
<li>Akinduro, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+dynamics+of+acute+myeloid+leukaemia+and+haematopoietic+progenitors+competing+for+bone+marrow+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space.</a> Nature Communications. 9 (1), 519(2018).</li>
<li>Beerman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+distinct+hematopoietic+stem+cells+modulate+hematopoietic+lineage+potential+during+aging+by+a+mechanism+of+clonal+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).</li>
<li>Gomariz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+spatial+analysis+of+haematopoiesis-regulating+stromal+cells+in+the+bone+marrow+microenvironment+by+3D+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy.</a> Nature Communications. 9 (1), 2532(2018).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+factor+is+selectively+secreted+by+arterial+endothelial+cells+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow.</a> Nature Communications. 9 (1), 2449(2018).</li>
<li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e53936(2016).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li>
<li>DeFalco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-assisted+mapping+of+neural+inputs+to+a+feeding+center+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus.</a> Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).</li>
<li>Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+hematopoietic+cells+develop+from+hematopoietic+stem+cells+through+Flk2%2FFlt3-positive+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).</li>
<li>Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hCD2-iCre+and+Vav-iCre+mediated+gene+recombination+patterns+in+murine+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells.</a> PLoS One. 10 (4), 0124661(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Chociaż opisany protokół jest prosty i łatwy do wykonania, należy zwrócić szczególną uwagę na konkretne kroki. Na przykład, podczas uzyskiwania przepłukanego BM (krok 5.2), nie należy przekraczać objętości lub liczby wskazanych przypadków, w których PBS 2% FBS przechodzi przez wnętrze środkowej części kości, ponieważ może to spowodować znaczne zanieczyszczenie wypłukanej próbki populacjami komórek śródkostnych.
Zmiany w protokole mogą być wprowadzane w celu ułatwienia jego wykonania przez bada...

Cytometria przepływowa jest nieocenioną metodą do charakteryzowania i prospektywnego izolowania komórek immunologicznych i krwiotwórczych. Jest również coraz częściej stosowany do analizy populacji zrębu i nabłonka różnych tkanek. Krwiotwórcze komórki macierzyste (HSC) mają unikalne właściwości samoodnawiania i multipotencji. U dorosłych ssaków HSC znajdują się głównie w szpiku kostnym (BM), gdzie odbierają sygnały o spoczynku i przeżyciu z otaczającego mikrośrodowiska lub niszy1. HSC są formalnie definiowane zgodnie z testami funkcjonalnymi2. Niemniej jednak kilka przełomowych prac wykazało przydatność cytometrii przepływowej do identyfikacji HSC. Dzięki zastosowaniu markerów o ograniczonej powierzchni komórek możliwe jest rozróżnienie populacji krwiotwórczych, które są wysoce wzbogacone w HSCs3. Cytometria przepływowa jest zatem centralną metodą w dziedzinie komórek macierzystych. Jest on szeroko stosowany do oceny wpływu przypuszczalnych typów komórek niszowych i czynników niszowych na HSC. Łącząc cytometrię przepływową z obrazowaniem i testami funkcjonalnymi, wykazano, że HSC są krytycznie wspierane przez okołonaczyniowe mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) i komórki śródbłonka (EC). MSCs BM są grupą heterogenną i mają różny udział cytokin4, ale dobrze wiadomo, że receptor leptyny (LepR)+ MSCs są kluczowymi komórkami niszowymi1. BM EC są również wysoce heterogeniczne i mogą być częścią sinusoid, tętniczek i naczyń typu H/przejściowych5. Różne badania wykazały zniuansowany wkład tych różnych EC. Na przykład wewnątrzkostne sinusoidalne EC są przestrzennie bliższe spoczynkowi HSCs6, podczas gdy niemigrujące HSC z niższymi poziomami reaktywnych form tlenu znajdują się w pobliżu tętniczych ECs7. Bardzo ważna jest również śródkostna a centralna lokalizacja nisz. Naczynia wewnątrzkostne typu H są związane z komórkami zrębu okołonaczyniowego, które są tracone wraz ze starzeniem się, co prowadzi do utraty HSCs8. W ostrej białaczce szpikowej centralne EC są rozszerzone, podczas gdy naczynia śródkostne i śródkostne HSC są tracone9.
Większość badań w tej dziedzinie skupiała się na samej hematopoezie i na zewnętrznej regulacji HSC przez komórkę. Coraz częściej uznaje się jednak, że istnieje potrzeba lepszego scharakteryzowania nisz, które regulują inne czynniki progenitorowe, a mianowicie multipotencjalnych progenitorów (MPP), szczególnie biorąc pod uwagę, że są one głównymi czynnikami napędzającymi hematopoezę w stanie stacjonarnym10. W przeciwieństwie do ustalonej struktury hierarchicznej, ostatnie badania wykazały, że hematopoeza jest kontinuum, w którym HSC różnicują się w stronnicze MPP na wczesnym etapie11. MPP zostały nazwane według różnych schematów klasyfikacji12, ale niedawny konsensus Międzynarodowego Towarzystwa Hematologii Eksperymentalnej (ISEH) zaproponował, aby MPP były rozróżniane jako wczesne MPP i zgodnie z ich odchyleniem limfatycznym (MPP-Ly), megakariocytarnym i erytroidalnym (MPP-Mk/E) oraz szpikowym (MPP-G/M) class13. Zastosowanie cytometrii przepływowej będzie miało kluczowe znaczenie dla dalszych badań nad znaczeniem nisz BM w regulacji tych populacji. Obecne metody cytometrii przepływowej wykorzystują zmienne strategie bramkowania do różnicowania HSPC i identyfikacji komórek zrębu, a mianowicie EC, przy użyciu niespójnych markerów. Celem obecnej metody jest przedstawienie prostego i powtarzalnego procesu barwienia BM w celu identyfikacji subpopulacji HSPC, heterogenicznych grup EC i MSCs LepR+. Uważamy, że ta technika, choć porównywalna z wcześniej opisanymi metodami (patrz na przykład reference14), zapewnia zaktualizowany i łatwy do wdrożenia protokół analizy fenotypowej komórek krwiotwórczych w dwóch funkcjonalnych obszarach szpiku, endosteal i centralnym BM8,15, a także komórek niszowych zrębu BM.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 mysie przeciwciało CD54/ICAM-1</td><td>BioLegend</td><td>116114</td><td></td></tr><tr><td>APC Streptawidyna</td><td>BioLegend</td><td>405207</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszym CD117 (c-kit) APC/Cyjanina7</td><td>BioLegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszemu CD45 APC/Cyjanina7</td><td>Przeciwciało</td><td></td> przeciw mysim komórkom TER-119 103116 <td></td></tr><tr><td>APC/cyjanina7</td><td>BioLegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna anty-mysie przeciwciało CD3 i epsilonu</td><td>BioLegend</td><td>100304</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna anty-mysie przeciwciało CD4</td><td>BioLegend</td><td>100404</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna przeciwciało anty-mysie CD8a</td><td>BioLegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna anty-mysie Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)</td><td>BioLegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna przeciwciało przeciw mysim TER-119/komórkom erytroidalnym</td><td>BioLegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna przeciwciało anty-mysie/ludzkie CD11b</td><td>BioLegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna anty-mysie/ludzkie przeciwciało CD45R/B220</td><td>BioLegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 anty-mysie CD150 (SLAM)</td><td>BioLegend</td><td>115929</td><td></td></tr><tr><td>Kalibrit 2 kolorowe koraliki</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>349502</tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Merck Life Science</td><td>C1889</td><td></td></tr><tr><td>Dyspaza II</td><td>Merck Life Science</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie, zatwierdzona przez UE, pochodzenie z Ameryki Południowej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało biotynylowane Leptyna R</td><td>R& Systemy D</td><td>BAF497</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Odczynnik do stałych komórek (DAPI)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37606</td><td>Odczynnik DAPI</td></tr><tr><td>PE przeciwciało przeciw mysiej endomucynie</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-5851-82</td><td></td></tr><tr><td>PE anty-mysie Flk2 (CD135)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-1351-82</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyjanina7 przeciwciało anty-mysie CD31</td><td>BioLegend</td><td>102524</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw mysim CD48 PE/Cyjaniny7</td><td>BioLegend</td><td>103424</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>PerCP BioLegend</td><td>108122</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td><td>Merck Life Science</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone przeciwciało anty-mysie CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC 10x</td><td>BioLegend</td><td>420302</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Violet Fixable Viability Dye</td><td>BioLegend</td><td>423114</td><td>barwnik fluorescencyjny</td></tr></tbody></table>

analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells

Szpik kostny (BM) to miękka tkanka znajdująca się w kościach, gdzie głównie zachodzi hematopoeza, proces, w którym generowane są nowe krwinki. W związku z tym zawiera hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC), a także wspierające komórki zrębu, które przyczyniają się do utrzymania i regulacji HSPC. Zaburzenia hematologiczne i inne zaburzenia BM zaburzają hematopoezę, wpływając bezpośrednio na komórki krwiotwórcze i/lub poprzez zmianę niszy BM. W tym miejscu opisujemy metodę badania hematopoezy w zdrowiu i nowotworach złośliwych poprzez analizę fenotypową mysich BM HSPC i niszowych populacji zrębu za pomocą cytometrii przepływowej. Nasza metoda szczegółowo opisuje wymagane kroki w celu wzbogacenia komórek BM we frakcje śródkostne i centralne BM, a także odpowiednie strategie bramkowania w celu zidentyfikowania dwóch kluczowych typów komórek niszowych zaangażowanych w regulację HSPC, komórek śródbłonka i mezenchymalnych komórek macierzystych. Proponowana tutaj analiza fenotypowa może być połączona z mutantami myszy, modelami chorób i testami funkcjonalnymi w celu scharakteryzowania przedziału HSPC i jego niszy.

Reprezentatywne wykresy analizy cytometrii przepływowej HSC i MPP u zdrowej, młodej dorosłej myszy C57Bl/6 przedstawiono na Ryc. 1. Strategia bramkowania opiera się na najnowszej zharmonizowanej nomenklaturze zaproponowanej przez ISEH13. Podczas analizy wpływu zaburzenia, takiego jak infekcja lub nowotwór, ważne jest użycie myszy kontrolnej jako punktu odniesienia dla normalnych bramek. Kontrole Fluorescence-minus-one (FMO) mogą być szczególnie przydatne do wyznaczeni...

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

The bone marrow (BM) is the soft tissue found within bones where hematopoiesis, the process by which new blood cells are generated, primarily occurs. As ...

Opisany protokół pozwala na analizę fenotypową krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek zrębu szpiku kostnego. Może być używany do badania zaburzeń w tych populacjach w różnych warunkach. W porównaniu z innymi wcześniej opisanymi metodami, technika ta pozwala na analizę fenotypową komórek krwiotwórczych, w szczególności w dwóch funkcjonalnych obszarach szpiku, śródkostnym i centralnym szpiku kostnym, a także w komórkach zrębu szpiku kostnego.Na początek umieść uśpione zwierzę brzuchem do góry na szalce Petriego i spryskaj 70% etanolem. Wykonaj nacięcie nad brzuchem za pomocą nożyczek i odciągnij skórę aż do kostek. Chwyć jedną z nóg i odetnij jej dolną część, aby oddzielić ją od zwierzęcia za pomocą nożyczek.Następnie zdejmij stopę z nogi, przecinając kostkę i umieść nogę w lodowatym PBS 2%FBS. Następnie chwyć kość biodrową za pomocą pęsety i przetnij za nią, aby oddzielić ją od zwierzęcia za pomocą nożyczek. Umieść kość biodrową w lodowatym PBS 2%FBS.Po umieszczeniu nogi i kości biodrowej na szalce Petriego, oczyść kości za pomocą sterylnego skalpela. Następnie oddziel kość piszczelową i udową, przecinając kolano skalpelem i umieść czyste kości w lodowatym PBS 2%FBS. Umieść kość udową lub piszczelową w moździerzu z lodowatym PBS 2%FBS i zmiażdż kość, delikatnie dociskając ją do ścianki moździerza za pomocą tłuczka.Następnie pipetuj powstałą zawiesinę komórek w górę iw dół za pomocą 10-mililitrowej pipety do homogenizacji i przenieś ją do 50-mililitrowej probówki przez sitko o średnicy 40 mikrometrów umieszczone na górze probówki. Przepłucz zaprawę większą ilością PBS 2%FBS i przenieś roztwór do tej samej 50-mililitrowej probówki przez to samo sitko o średnicy 40 mikrometrów. Odwirować 50-mililitrową probówkę o stężeniu 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach buforu do lizy RBC w temperaturze pokojowej, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół. Po dwuminutowej inkubacji w temperaturze pokojowej dodać 15 mililitrów PBS 2%FBS i odwirować 50-mililitrową probówkę. Jeśli osad komórkowy nie wygląda na czerwonawy, wyrzuć supernatant, ponownie zawieś osad w 200 mikrolitrach PBS 2% FBS i przenieś zawiesinę komórek do dołka z 96-dołkową płytką dolną V w celu barwienia.Po zmiażdżeniu kości, jak pokazano wcześniej, odetnij końcówkę pipety P1000 za pomocą nożyczek i użyj jej do przeniesienia całej zawartości zaprawy do 50-mililitrowej tuby. Następnie odwirować 50-mililitrową probówkę o stężeniu 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach kolagenazy IV i roztworze dypazy II.Inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut. Uzupełnij rurkę do 25 mililitrów PBS 2%FBS i wiruj do wymieszania. Następnie przenieś zawartość do nowej 50-mililitrowej probówki przez sitko o średnicy 100 mikrometrów.Następnie dodaj 15 mililitrów PBS 2%FBS do starej 50-mililitrowej probówki i przenieś roztwór do nowej 50-mililitrowej probówki przez sitko o średnicy 100 mikrometrów. Po odwirowaniu i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawieś osad komórek w pięciu mililitrach buforu do lizy RBC, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół za pomocą pipety. Po dwuminutowej inkubacji w temperaturze pokojowej dodaj 15 mililitrów PBS 2%FBS.Ponownie odwirować probówkę i jeśli osad komórkowy nie wygląda na czerwonawy po odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach PBS 2% FBS i przenieść zawiesinę komórek do studzienki z 96-dołkową płytką dolną V w celu barwienia. Następnie odwirować płytkę w stężeniu 500 G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieść kość udową na szalce Petriego i odetnij końce kości za pomocą sterylnego skalpela.Następnie przepłukać środkową część kości, przepuszczając 100 mikrolitrów PBS 2%FBS przez wnętrze kości raz z każdej strony, używając strzykawki insulinowej bez martwej objętości 0,5 mililitra i zbierając roztwór do probówki mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr PBS 2%FBS. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do 50-mililitrowej probówki oznaczonej jako przepłukany szpik kostny, zawierającej cztery mililitry PBS 2% FBS. Zmiażdż końce kości w moździerzu z lodowatym PBS 2%FBS, delikatnie dociskając je do ścianki moździerza za pomocą tłuczka.Po homogenizacji zawiesiny komórek przenieś ją do 50-mililitrowej probówki oznaczonej jako zmiażdżony szpik kostny przez sitko o średnicy 40 mikrometrów. Na koniec spłucz moździerz większą ilością PBS 2%FBS i przenieś roztwór do tej samej probówki. Analizę cytometrii przepływowej krwiotwórczych komórek macierzystych i multipotencjalnych komórek progenitorowych przeprowadzono w całkowitym szpiku kostnym u zdrowej młodej osoby dorosłej C57BL6J myszy.W analizie komórek zrębu, komórek śródbłonka i mezenchymalnych komórek macierzystych w całkowitym szpiku kostnym, mezenchymalne komórki macierzyste można łatwo zidentyfikować na podstawie ekspresji receptora leptyny, a komórki śródbłonka można zidentyfikować na podstawie ekspresji CD31 i SCA-1. Analiza metodą cytometrii przepływowej komórek śródbłonka w całkowitym szpiku kostnym wykazująca rozróżnienie między komórkami śródbłonka tętniczek i sinusoidalnych w oparciu o ICAM1. Kwantyfikacja komórek śródbłonka tętniczego i sinusoidalnego szpiku kostnego w centralnej i śródkostnej tkance szpiku kostnego pokazuje, że komórki śródbłonka szpiku kostnego tętniczego są liczniejsze w obszarach śródkostnych, podczas gdy sinusoidy występują częściej w centralnych obszarach szpiku kostnego.W przypadku uzyskania zaczerwienionego szpiku kostnego nie należy przekraczać wskazanej objętości lub liczby przypadków, w których PBS 2%FBS przechodzi przez wnętrze środkowej części kości. Połączenie opisanej metody z testami funkcjonalnymi analizowanych fenotypowo populacji komórek dostarczyłoby dalszych cennych informacji na temat potencjalnych zaburzeń tych populacji występujących w badanych warunkach. Opisany protokół pozwala na analizę fenotypową komórek krwiotwórczych w sposób zróżnicowany w śródkostniu i centralnym szpiku kostnym, umożliwiając naukowcom zbadanie zaburzeń hematopiezy potencjalnie występujących specyficznie w tych lokalizacjach szpiku kostnego.

flow-cytometry-analysis-murine-bone-marrow-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Przedstawiono strategię ilościowej analizy danych histologicznych w szpiku kostnym. Mikroskopia konfokalna znakowanych fluorescencyjnie komórek w skrawkach tkanek daje 2-wymiarowe obrazy, które są automatycznie analizowane. Analizy kolokalizacyjne różnych typów komórek są porównywane z danymi z symulowanych obrazów, dostarczając ilościowych informacji o interakcjach komórkowych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Opisujemy metodę użycia wieloparametrowej cytometrii przepływowej do wykrywania mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w mysich zdrowych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) oraz komórkach białaczkowych z mysiego modelu ostrej białaczki szpikowej (AML) sterowanej przez MLL-AF9.

Analiza cytometryczna przepływowa mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych oraz białaczka napędzana przez MLL-AF9

Tutaj prezentujemy protokół przetwarzania świeżego szpiku kostnego (BM) wyizolowanego od myszy lub człowieka do wysokowymiarowej cytometrii masowej (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analizy komórek linii neutrofili.

Przygotowanie całego szpiku kostnego do analizy cytometrii masowej komórek z linii neutrofili

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Tutaj opisujemy nowatorską metodę cytometrii przepływowej do prospektywnej izolacji wczesnych prekursorów erytroidalnych (BFU-e) i erytroidalnych tworzących kolonie (CFU-e) bezpośrednio ze świeżego szpiku kostnego i śledziony myszy. Protokół ten, opracowany na podstawie danych transkryptomicznych pojedynczych komórek, jest pierwszym, który izoluje wszystkie erytroidalne komórki progenitorowe tkanki o wysokiej czystości.

Identyfikacja i izolacja progenitorów erytroidalnych jednostek tworzących pęknięcia i kolonii z tkanki myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

Tutaj prezentujemy protokoły, które umożliwiają izolację komórek zrębu z mysich kości, szpiku kostnego, grasicy i ludzkiej tkanki grasicy, kompatybilne z monokomórkową multiomiką.

Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Niniejszy protokół opisuje opłacalną metodę oczyszczania, namnażania i charakteryzowania wysoce jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC) od myszy. Takie podejście ułatwia pozyskiwanie dużych ilości BMSC o wysokim potencjale proliferacji i różnicowania, wspierając modele mysie i posuwając naprzód badania przedkliniczne.

Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego

Poznaj analizę cytometrii przepływowej komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego myszy oraz komórek niszowych zrębu. Ta metoda umożliwia szczegółowe badanie fenotypowe w obszarach endostalnym i centralnym.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Przeglądaj więcej filmów