Algorytm analizy obrazu oparty na obszarze do ilościowego oznaczania kokultur makrofagów i fibroblastów
15 lutego 2022
Prezentujemy metodę, która wykorzystuje uogólnioną analizę obrazu opartą na obszarze do identyfikacji liczby komórek. Analiza różnych populacji komórek pozwoliła na wykorzystanie znacznych różnic w wysokości i strukturze komórek między różnymi typami komórek w ramach algorytmu adaptacyjnego.
Metoda ta może być wykorzystana do pomocy naukowcom w analizowaniu i liczeniu kokultur komórek przy użyciu prostej i skutecznej analizy obszarowej. Technika ta jest stosunkowo łatwa do wdrożenia przy użyciu powszechnie dostępnego oprogramowania i oferuje niezawodny i dokładny sposób identyfikacji różnych typów komórek w środowisku wspólnej hodowli. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat synergii określonych kokultur komórek, aby wspomóc regenerację tkanek.
Metoda ta może być również stosowana do walidacji badań biomarkerów monokulturowych. Na początek hoduj surowe 264,7 makrofagów w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla do obrazowania monokultury w jednym mililitrze DMEM uzupełnionym FBS, penicyliną-streptomycyną, wodorowęglanem sodu i beta-merkaptoetanolem w pięciomililitrowej kolbie do hodowli komórkowej o gęstości 25 000 komórek na centymetr kwadratowy. Hodowla komórek NIH/3T3 w DMEM uzupełniona 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną.
Do obrazowania kokulturowego należy hodować surowe makrofagi 264.7 i fibroblasty NIH/3T3 przy użyciu pożywki do kohodowli zawierającej jedną część surowej pożywki 264.7 i jedną część pożywki NIH/3T3 razem w różnych proporcjach i całkowitej gęstości 25 000 komórek na centymetr kwadratowy. Po wysianiu inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby osiągnąć żywotną gęstość komórek wynoszącą 80% zbiegu komórek. Aby uzyskać obrazy komórek za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektyw 40X, określ zdolność algorytmu do dokładnej oceny obrazów o różnych właściwościach obrazu.
Uzyskuj obrazy w skali szarości z różnymi ogniskami, tworząc obrazy bez bulbusa i bulbus, a następnie eksportuj je do surowego pliku czi. Aby uzyskać obrazy komórek przy użyciu metody obszarowej, skopiuj i wklej plik obrazu do analizy do kosza, a następnie wprowadź nazwę pliku, wykonując polecenie. Naciśnij Uruchom, aby uruchomić program.
Analizuj obrazy, otwierając je przez rekonstrukcję, a następnie zamykając przez rekonstrukcję, używając funkcji źródłowych, aby powiększyć pierwszy plan od tła, wykonując odpowiednie polecenie. Aby binaryzować zrekonstruowane obrazy przy użyciu systemu identyfikacji opartego na percentylu, należy odróżnić komórki od tła, używając różnicy percentyla od maksymalnego odpowiedniego piksela, przy czym największa wartość piksela stanowi co najmniej 0,5% danego obrazu. Analizuj i oceniaj wartości pikseli dla surowych makrofagów 264,7, upewniając się, że wartości mieszczą się w granicach 4,5% maksymalnego odpowiedniego piksela.
Następnie oznacz piksel jako komórkowy. W przypadku obrazów zawierających profile komórek bulbusa należy zaimplementować procedurę iteracyjną, aby skorygować błędną binaryzację w środkach komórek. Określ początkowe przypuszczenie dotyczące całkowitego pokrycia komórek.
Uruchom algorytm i przeanalizuj obrazy, korzystając ze wstępnych szacunków alfa i kappa, aby wypełnić część wysp. Następnie użyj liczby komórek i pokrycia po analizie, aby ponownie obliczyć kappa. Aby określić średnią powierzchnię komórki po binaryzacji obrazu, uzyskaj wektor wszystkich środkowych lokalizacji i promieni okręgów znajdujących się na obrazie, wykonując polecenie.
Użyj promieni wyjściowych, aby obliczyć średnią powierzchnię komórki poprzez uśrednienie i przeanalizowanie co najmniej 10 komórek, aby zapewnić dokładną identyfikację obszaru. Wykonaj analizę obrazu za pomocą poleceń zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie przeprowadź analizę kokultur zawierających surowe komórki 264.7 i NIH/3T3, eksperymentalnie określając parametr phi przy użyciu obrazów surowych komórek 264.7 i NIH/3T3.
Zgadnij początkową wartość phi i iteruj, aż liczba komórek i pokrycie będą ściśle zgodne z ręcznymi zliczeniami specyficznymi dla surowej kokultury 264.7 i NIH/3T3. Określ surową liczbę 264,7 komórek w całkowitym pokryciu komórek, jak opisano wcześniej dla obrazów monokulturowych. Ponownie przeanalizuj przekształcony obraz zlewni bez parametru phi, wykrywając zarówno makrofagi, jak i fibroblasty.
Uzyskaj dane dotyczące fibroblastów NIH / 3T3 poprzez selektywne odejmowanie surowych 264,7 pikseli komórek uzyskanych przy użyciu standardowych metod progowania i kwantyfikacji opartej na obszarze opisanych wcześniej. Przeprowadzono analizę surowych makrofagów 264,7 innych niż bulbus i zarejestrowano wyniki algorytmu. Obliczenia średniej powierzchni obrazu za pomocą algorytmu naliczyły 226 komórek, podczas gdy ręczne liczenie zidentyfikowało 241 komórek z przybliżoną wartością błędu 6%Przeprowadzono również analizę surowych makrofagów bulbusa 264,7.
Obliczenia średniej powierzchni obrazu za pomocą algorytmu zliczyły 221 komórek, zweryfikowane przez ręczne zliczenie 252 komórek z przybliżoną wartością błędu 12%Przeprowadzono analizę kokultur zawierających zarówno surowe makrofagi 264,7, jak i fibroblasty NIH/3T3. Dane wyjściowe algorytmu dla surowej liczby makrofagów 264,7 wynosiły 137, podczas gdy ręczne liczenie zidentyfikowało 155 komórek z przybliżoną wartością błędu 11%Aby określić solidność algorytmu zliczania komórek, pięć surowych obrazów makrofagów 264,7 zliczono za pomocą automatycznej identyfikacji komórek i ręcznego liczenia użytkowników. Współczynnik kości został uzyskany ze średnim parametrem 0,85 na pięciu obrazach.
Kluczowym krokiem w ramach tego protokołu jest użycie parametrów opartych na percentylu, co pozwala na niezawodne wykrywanie komórek zarówno w obrazach monokulturowych, jak i kokulturowych. Protokół ten może być wykorzystany do identyfikacji komórek będących przedmiotem zainteresowania do dalszej analizy przy użyciu technik biologii molekularnej do oceny biomarkerów, które definiują określone populacje komórek i rozwój biomarkerów w systemach kohodowlanych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę analizy i liczenia ko-kultur komórek za pomocą podejścia opartego na analizie obrazu. Technika ta została zaprojektowana, aby być prostą i efektywną, zapewniając niezawodną identyfikację różnych typów komórek w otoczeniu ko-kultury.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Analiza obrazów
- Regeneracja tkanek
Tło
- Ko-kultury komórek mogą dostarczyć wglądu w interakcje komórkowe.
- Różne typy komórek wykazują znaczne różnice strukturalne.
- Dokładne liczenie komórek jest kluczowe dla zrozumienia dynamiki ko-kultur.
- Istniejące metody mogą brakować niezawodności lub łatwości implementacji.
Cel badania
- Opracowanie metody efektywnego liczenia komórek w ko-kulturach.
- Poprawa zrozumienia, jak określone typy komórek synergizują.
- Walidacja badań biomarkerów monokultur.
Stosowane metody
- Wykorzystanie analizy obrazu opartej na obszarze do identyfikacji komórek.
- Hodowla makrofagów 264.7 raw i komórek NIH/3T3.
- Implementacja adaptacyjnego algorytmu do analizy.
- Zastosowanie powszechnie dostępnego oprogramowania dla łatwości zastosowania.
Główne wyniki
- Metoda zapewnia niezawodne i dokładne liczenie komórek.
- Skuteczna odróżnia różne typy komórek.
- Uzyskano wgląd w mechanizmy regeneracji tkanek.
- Osiągnięto walidację badań monokultur.
Wnioski
- Metoda analizy opartej na obszarze jest cennym narzędziem dla badaczy.
- Upraszcza proces analizy ko-kultur.
- Technika ta może poprawić badania w dziedzinie biologii komórki i inżynierii tkankowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of heterogeneous cell populations is critical for de-risking target validation in tissue regeneration and fibrosis research. This area-based image analysis algorithm enables reliable distinction and counting of macrophage-fibroblast cocultures, supporting mechanistic de-risking by reducing ambiguity in cellular interaction studies. The method provides predictive confidence in early discovery by delivering quantitative, reproducible readouts essential for go/no-go decisions in preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying macrophage and fibroblast contributions in coculture systems.
- Operational Value: Supports biological de-risking through reproducible, error-bounded cell counting (<10% error margin) in complex co-culture environments.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative data on cell-type-specific responses to modulators or genetic perturbations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, quantitative outputs for assay readiness in high-density seeding conditions.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility via percentile-based thresholding and iterative correction for non-ideal cell morphologies.
- Scalability: Enables platform reuse across varying coculture ratios and image qualities using widely available MATLAB-based tools.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant system modeling by enabling analysis of cocultures central to tissue regeneration pathways.
- Mechanistic De-risking: Isolates fibroblast and macrophage contributions via selective exclusion algorithms, clarifying pathway-specific effects.
- Preclinical Readiness: Provides validated cell counts that inform biomarker assessment and molecular analysis of specific populations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, offering a reusable capability for quantifying stromal-immune interactions in fibrosis and wound healing models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling accurate phenotyping of macrophage-fibroblast cocultures.
- Screening: Delivers assay standardization and quantitative outputs essential for reliable compound screening in coculture systems.
- Analytics: Generates measurements (cell counts, coverage, area) that allow teams to compare conditions and assess biological responses.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation by enabling analysis of cocultures in tissue regeneration contexts.
- Enterprise Reuse: Frameworks the method as a scalable, standardized tool applicable across multiple cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in coculture systems.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across varying image qualities and cell densities.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in fibrosis and regeneration programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative, reproducible coculture phenotyping data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in image analysis and MATLAB programming for algorithm implementation and parameter tuning.
- Dependent on inverted microscopy with 40X objective and grayscale image acquisition capabilities.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition protocols (focus, lighting, file format) for consistent algorithm performance.
- Requires adaptation of parameters (phi, alpha, kappa) when applied to different cell types or coculture ratios.
- Practical limitation: Algorithm accuracy depends on sufficient height differences between cell types for effective segmentation.
