Algorytm analizy obrazu oparty na obszarze do ilościowego oznaczania kokultur makrofagów i fibroblastów

Metoda ta może być wykorzystana do pomocy naukowcom w analizowaniu i liczeniu kokultur komórek przy użyciu prostej i skutecznej analizy obszarowej. Technika ta jest stosunkowo łatwa do wdrożenia przy użyciu powszechnie dostępnego oprogramowania i oferuje niezawodny i dokładny sposób identyfikacji różnych typów komórek w środowisku wspólnej hodowli. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat synergii określonych kokultur komórek, aby wspomóc regenerację tkanek.

Metoda ta może być również stosowana do walidacji badań biomarkerów monokulturowych. Na początek hoduj surowe 264,7 makrofagów w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla do obrazowania monokultury w jednym mililitrze DMEM uzupełnionym FBS, penicyliną-streptomycyną, wodorowęglanem sodu i beta-merkaptoetanolem w pięciomililitrowej kolbie do hodowli komórkowej o gęstości 25 000 komórek na centymetr kwadratowy. Hodowla komórek NIH/3T3 w DMEM uzupełniona 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną.

Do obrazowania kokulturowego należy hodować surowe makrofagi 264.7 i fibroblasty NIH/3T3 przy użyciu pożywki do kohodowli zawierającej jedną część surowej pożywki 264.7 i jedną część pożywki NIH/3T3 razem w różnych proporcjach i całkowitej gęstości 25 000 komórek na centymetr kwadratowy. Po wysianiu inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby osiągnąć żywotną gęstość komórek wynoszącą 80% zbiegu komórek. Aby uzyskać obrazy komórek za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektyw 40X, określ zdolność algorytmu do dokładnej oceny obrazów o różnych właściwościach obrazu.

Uzyskuj obrazy w skali szarości z różnymi ogniskami, tworząc obrazy bez bulbusa i bulbus, a następnie eksportuj je do surowego pliku czi. Aby uzyskać obrazy komórek przy użyciu metody obszarowej, skopiuj i wklej plik obrazu do analizy do kosza, a następnie wprowadź nazwę pliku, wykonując polecenie. Naciśnij Uruchom, aby uruchomić program.

Analizuj obrazy, otwierając je przez rekonstrukcję, a następnie zamykając przez rekonstrukcję, używając funkcji źródłowych, aby powiększyć pierwszy plan od tła, wykonując odpowiednie polecenie. Aby binaryzować zrekonstruowane obrazy przy użyciu systemu identyfikacji opartego na percentylu, należy odróżnić komórki od tła, używając różnicy percentyla od maksymalnego odpowiedniego piksela, przy czym największa wartość piksela stanowi co najmniej 0,5% danego obrazu. Analizuj i oceniaj wartości pikseli dla surowych makrofagów 264,7, upewniając się, że wartości mieszczą się w granicach 4,5% maksymalnego odpowiedniego piksela.

Następnie oznacz piksel jako komórkowy. W przypadku obrazów zawierających profile komórek bulbusa należy zaimplementować procedurę iteracyjną, aby skorygować błędną binaryzację w środkach komórek. Określ początkowe przypuszczenie dotyczące całkowitego pokrycia komórek.

Uruchom algorytm i przeanalizuj obrazy, korzystając ze wstępnych szacunków alfa i kappa, aby wypełnić część wysp. Następnie użyj liczby komórek i pokrycia po analizie, aby ponownie obliczyć kappa. Aby określić średnią powierzchnię komórki po binaryzacji obrazu, uzyskaj wektor wszystkich środkowych lokalizacji i promieni okręgów znajdujących się na obrazie, wykonując polecenie.

Użyj promieni wyjściowych, aby obliczyć średnią powierzchnię komórki poprzez uśrednienie i przeanalizowanie co najmniej 10 komórek, aby zapewnić dokładną identyfikację obszaru. Wykonaj analizę obrazu za pomocą poleceń zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie przeprowadź analizę kokultur zawierających surowe komórki 264.7 i NIH/3T3, eksperymentalnie określając parametr phi przy użyciu obrazów surowych komórek 264.7 i NIH/3T3.

Zgadnij początkową wartość phi i iteruj, aż liczba komórek i pokrycie będą ściśle zgodne z ręcznymi zliczeniami specyficznymi dla surowej kokultury 264.7 i NIH/3T3. Określ surową liczbę 264,7 komórek w całkowitym pokryciu komórek, jak opisano wcześniej dla obrazów monokulturowych. Ponownie przeanalizuj przekształcony obraz zlewni bez parametru phi, wykrywając zarówno makrofagi, jak i fibroblasty.

Uzyskaj dane dotyczące fibroblastów NIH / 3T3 poprzez selektywne odejmowanie surowych 264,7 pikseli komórek uzyskanych przy użyciu standardowych metod progowania i kwantyfikacji opartej na obszarze opisanych wcześniej. Przeprowadzono analizę surowych makrofagów 264,7 innych niż bulbus i zarejestrowano wyniki algorytmu. Obliczenia średniej powierzchni obrazu za pomocą algorytmu naliczyły 226 komórek, podczas gdy ręczne liczenie zidentyfikowało 241 komórek z przybliżoną wartością błędu 6%Przeprowadzono również analizę surowych makrofagów bulbusa 264,7.

Obliczenia średniej powierzchni obrazu za pomocą algorytmu zliczyły 221 komórek, zweryfikowane przez ręczne zliczenie 252 komórek z przybliżoną wartością błędu 12%Przeprowadzono analizę kokultur zawierających zarówno surowe makrofagi 264,7, jak i fibroblasty NIH/3T3. Dane wyjściowe algorytmu dla surowej liczby makrofagów 264,7 wynosiły 137, podczas gdy ręczne liczenie zidentyfikowało 155 komórek z przybliżoną wartością błędu 11%Aby określić solidność algorytmu zliczania komórek, pięć surowych obrazów makrofagów 264,7 zliczono za pomocą automatycznej identyfikacji komórek i ręcznego liczenia użytkowników. Współczynnik kości został uzyskany ze średnim parametrem 0,85 na pięciu obrazach.

Kluczowym krokiem w ramach tego protokołu jest użycie parametrów opartych na percentylu, co pozwala na niezawodne wykrywanie komórek zarówno w obrazach monokulturowych, jak i kokulturowych. Protokół ten może być wykorzystany do identyfikacji komórek będących przedmiotem zainteresowania do dalszej analizy przy użyciu technik biologii molekularnej do oceny biomarkerów, które definiują określone populacje komórek i rozwój biomarkerów w systemach kohodowlanych.