Name: Algorytm analizy obrazu oparty na obszarze do ilościowego oznaczania kokultur makrofagów i fibroblastów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Poznaj algorytm analizy obrazu oparty na obszarze do ilościowego oznaczania kokultur makrofagów RAW 264.7 i fibroblastów NIH/3T3. Ta metoda umożliwia niezawodne rozróżnianie typów komórek i badanie mechanizmów regeneracji tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana przez National Institutes of Health (R01 AR067247), a częściowo przez program Delaware INBRE, wspierany przez grant z National Institute of General Medical Sciences-NIGMS (P20 GM103446) z National Institutes of Health i Stanu Delaware. Treść manuskryptu niekoniecznie odzwierciedla poglądy agencji finansujących.

1. Hodowla komórkowa i akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Hodowla makrofagów RAW264.7 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% penicyliną-streptomycyną, 1,5 g / l wodorowęglanem sodu i 5 μM β-merkaptoetanolem.
	<ol>
		<li>W przypadku obrazowania monokulturowego należy hodować komórki RAW264.7 o gęstości 25 000 komórek/cm2 w kolbie do hodowli komórkowej o pojemności 5 ml z 1 ml pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla komórek NIH/3T3 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w DMEM uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną11.</li>
	<li>W przypadku obrazowania kokulturowego należy wyhodować makrofagi RAW264.7 i fibroblasty NIH/3T3 razem w różnych proporcjach, przy całkowitej gęstości 25 000 komórek/cm2. Użyj pożywki do kokultury, która jest 1 częścią pożywki RAW264.7 (DMEM uzupełnioną 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny, 1,5 g/l wodorowęglanu sodu i 5 μM β-merkaptoetanolu) i 1 częścią pożywki NIH/3T3 (DMEM uzupełnioną 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny).</li>
	<li>Po wysiewie inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aby osiągnąć gęstość żywotnych komórek wynoszącą 80% zbiegu komórek.</li>
	<li>Komórki obrazowe z odwróconym mikroskopem wyposażonym w obiektyw 40x. Uzyskaj wszystkie obrazy w skali szarości i wyeksportuj je do surowego pliku ".czi".
	<ol>
		<li>Określ zdolność algorytmu do dokładnej oceny obrazów o różnych cechach obrazu. Uzyskuj obrazy o różnych ogniskach, tworząc zarówno obrazy "niebulwiaste" (<silna klasa="xfig">Rysunek 2), jak i "bulwiaste" obrazy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
		<li>Eksportuj i konwertuj obrazy komórek do 8-bitowego formatu obrazu tiff (.tiff) za pomocą ImageJ za pomocą funkcji "Konwersja wsadowa" na surowych plikach ".czi" przed analizą MATLAB. Przechowuj przekonwertowane obrazy w folderze lokalnym i ręcznie przesyłaj te pliki obrazów do odpowiedniego kosza MATLAB.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza obrazu-monokultura z wykorzystaniem przede wszystkim pliku "monoculture.m"
UWAGA: Następujące kroki zostały wykonane przy użyciu MATLAB. W protokole MATLAB użyto trzech plików: "process.m" (Supplemental coding file 1), plik zawierający algorytm, "monoculture.m" (Supplemental coding file 2), plik do uruchomienia do analizy obrazów monokulturowych oraz "coculture_modified.m" (Supplemental coding file 3), plik do uruchomienia do analizy obrazów kokultury.
<ol>
	<li>Użyj metody opartej na obszarze, aby uzyskać obrazy komórek pokazujące względne zmiany wysokości. Obraz jest wyprowadzany dla każdego podkroku, wykorzystując funkcję 'imshow()' dla każdego podobrazu. Skopiuj i wklej plik obrazu do analizy do kosza, a następnie wprowadź nazwę pliku w następującym poleceniu. Naciśnij uruchom, aby uruchomić program. 
	imread('filename.tiff')
	<ol>
		<li>Analizuj obrazy, "otwierając przez rekonstrukcję", a następnie "zamykając przez rekonstrukcję" za pomocą funkcji źródłowych8, aby powiększyć pierwszy plan od tła. Użyj pierwszego polecenia, aby otworzyć przez rekonstrukcję, a drugiej i trzeciej sekwencji, aby zakończyć przez rekonstrukcję 
		'imopen()' 
		'imerode()' 
		'imreconstruct()'</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Binaryzuj zrekonstruowane obrazy na czyste czarne i czysto białe piksele, korzystając z systemu identyfikacji opartego na percentylu. Należy pamiętać, że w tym systemie komórki są konwertowane na wartość czystego białego piksela "255", podczas gdy obiekty tła i obce (niekomórkowe) są konwertowane na wartość czystego czarnego piksela "0".
	<ol>
		<li>Odróżnij komórki od tła, używając różnicy percentyla w stosunku do "maksymalnej odpowiedniej wartości piksela", która stanowi największą wartość piksela stanowiącą co najmniej 0,5% danego obrazu.</li>
		<li>Analizuj i oceń wartości pikseli dla makrofagów RAW264.7. Jeśli te wartości mieszczą się w granicach 4,5% od maksymalnej odpowiedniej liczby pikseli, oznacz piksel jako komórkowy. 
		UWAGA: To polecenie można wydać za pomocą prostej instrukcji if.</li>
		<li>W przypadku obrazów zawierających bulwiaste profile komórek, takie jak te widoczne na Rysunek 2, zaimplementuj procedurę iteracyjną, aby skorygować błędną binaryzację w środkach komórek (określanych jako 'wyspy; " patrz poniżej), w następujący sposób.</li>
		<li>Określ wstępne przypuszczenie dotyczące całkowitego pokrycia komórek; 60% wykorzystano w tym badaniu. Należy zauważyć, że liczba komórek obecnych na obrazie powinna być zależna od pokrycia komórek - związek między liczbą komórek a pokryciem komórek można zatem określić eksperymentalnie. Korzystając z tej zależności, określ zmienne 'Alpha' i 'kappa' 
		UWAGA: "Alfa" reprezentuje wektor 3 x 1 zawierający następujące względne percentyle wysokości: percentyl wysokości, w którym zidentyfikowano komórki, percentyl wysokości, w którym zidentyfikowano tło, oraz percentyl wysokości, na którym zwykle znajdowały się wyspy – regiony, w których wartości intensywności były znacznie niższe niż wartości komórek. "Kappa" oznacza całkowity obszar pokryty przez komórki na obrazie.</li>
		<li>Uruchom algorytm, który (i) przeanalizuje obrazy przy użyciu początkowych oszacowań wartości alfa i kappa w celu wypełnienia części wysp oraz (ii) użyje liczby komórek i pokrycia po analizie do ponownego obliczenia kappa. Jeśli wartość kappa mieści się w granicach 10% początkowego przypuszczenia, przejdź do następnego kroku. 
		UWAGA: W przypadku obrazów zawierających komórki RAW264.7 i NIH/3T3 stwierdzono, że alfa wynosi [4.3, 5.5, 10]. Innymi słowy, różnica 4,3% w stosunku do maksymalnego odpowiedniego piksela określała percentyl wysokości, w którym identyfikowano komórki, różnica 5,5% w stosunku do maksymalnego odpowiedniego piksela określała percentyl wysokości, w którym identyfikowano tło. Różnica 10% w stosunku do maksymalnej odpowiedniej liczby pikseli określała percentyl wysokości, na którym zwykle znajdowały się wyspy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po binaryzacji obrazu automatycznie określ średnią powierzchnię komórki za pomocą algorytmu wyszukiwania okręgów typu open source, który wykonuje transformację Hougha na zbinaryzowanym obrazie12,13,14. Użyj następującego polecenia, aby uzyskać wektor wszystkich położeń środkowych i promieni okręgów znajdujących się na obrazie. 
	'[środki, promienie] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])' 
	"A" w tym poleceniu to wybrany obraz, a [minradius, maxradius] to zakres promieni, który algorytm będzie próbował wykryć. 
	UWAGA: Ta procedura określania średniej powierzchni komórki zakłada, że morfologia komórek makrofagów była zarówno okrągła, jak i spójna między komórkami10. Z danych eksperymentalnych wynika, że promienie makrofagów wynoszą najczęściej od 30 do 50 pikseli przy 40-krotnym powiększeniu. Ten zakres pikseli jest zdefiniowany jako dopuszczalny zakres dla algorytmu znajdowania okręgu. Promienie mogą się znacznie różnić w przypadku innych typów komórek i wymagałyby określenia za pomocą analizy eksperymentalnej.
	<ol>
		<li>Użyj promieni wyjściowych, aby obliczyć średnią powierzchnię komórki przez uśrednienie. Przeanalizuj co najmniej 10 komórek, aby zapewnić dokładną identyfikację obszaru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ całkowitą liczbę komórek na obrazie, korzystając ze średniej powierzchni komórki.
	<ol>
		<li>Przejrzyj matrycę obrazu w pętli i policz całkowitą liczbę pikseli komórek. Określ całkowite pokrycie komórek, dzieląc liczbę pikseli komórki przez całkowitą liczbę pikseli na obrazie. Określ całkowitą liczbę komórek na obrazie, dzieląc liczbę pikseli komórki przez średnią powierzchnię komórki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza obrazu-kokultura wykorzystująca przede wszystkim plik "coculture_modified.m"
UWAGA: Następujące kroki zostały wykonane przy użyciu MATLAB.
<ol>
	<li>Użyj metody opartej na obszarze, aby uzyskać obrazy komórek pokazujące względne zmiany wysokości. Obraz jest wyprowadzany dla każdego podkroku, wykorzystując funkcję 'imshow()' dla każdego podobrazu. Skopiuj i wklej plik obrazu do analizy do kosza, a następnie wprowadź nazwę pliku w następującym poleceniu. Naciśnij uruchom, aby uruchomić program. 
	'imread('filename.tiff')"
	<ol>
		<li>Analizuj obrazy, "otwierając przez rekonstrukcję", a następnie "zamykając przez rekonstrukcję" za pomocą funkcji źródłowych10, aby powiększyć pierwszy plan od tła. Użyj pierwszego polecenia, aby otworzyć przez rekonstrukcję, a drugiej i trzeciej sekwencji, aby zakończyć przez rekonstrukcję. 
		'imopen ()' 
		'imerode()' 
		'imreconstruct()'</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź analizę kokultur zawierających komórki RAW264.7 i NIH/3T3 przy użyciu dwóch selektywnych binaryzacji, uzyskanych przez wykorzystanie różnic wysokości między dwoma typami komórek.
	<ol>
		<li>Eksperymentalnie określ parametr "phi" za pomocą obrazów komórek RAW264.7 i NIH/3T3, gdzie phi reprezentuje proporcjonalną różnicę wysokości między dwoma typami komórek. Zgadnij początkową wartość phi i iteruj, aż liczba komórek i pokrycie będą ściśle zgodne z ręcznymi zliczeniami, specyficznymi dla kokultury RAW264.7 i NIH/3T3. 
		UWAGA: Stwierdzono, że wartość phi użyta w tych badaniach wynosi 3,2. Phi służy do selektywnego filtrowania obrazu, aby wyglądał tak, jakby zawierał tylko komórki RAW264.7, jak widać na Rysunek 4C.</li>
		<li>Określ liczbę komórek RAW264.7 i całkowite pokrycie komórek w podobny sposób, jak w przypadku obrazów monokulturowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie przeanalizuj obraz przekształcony w zlewnię bez parametru phi, wykrywając zarówno makrofagi, jak i fibroblasty. Uzyskaj dane fibroblastów NIH/3T3 poprzez selektywne odejmowanie pikseli komórek RAW264.7, uzyskanych przy użyciu standardowych metod progowania i kwantyfikacji opartej na obszarze opisanych w kroku 2.
	<ol>
		<li>Po przeanalizowaniu całego obrazu określ całkowitą liczbę pikseli NIH/3T3, odejmując całkowitą liczbę pikseli komórek od liczby pikseli RAW264.7. Oblicz pokrycie komórek NIH/3T3 i RAW264.7, dzieląc przez liczbę pikseli komórek dla każdej linii komórkowej przez całkowitą liczbę pikseli obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+sizing+of+cells+in+microscope+images+by+template+matching+and+edge+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Fifth+International+Conference+on+Image+Processing+and+its+Applications%2C+1995%22%5BJournal%5D)">Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection.</a> Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).</li>
<li>Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+type+cell+detection+and+counting+method+based+on+FCN%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+-+2017+IEEE+17th+International+Conference+on+Bioinformatics+and+Bioengineering+%28BIBE%29%22%5BJournal%5D)">An extended type cell detection and counting method based on FCN.</a> Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).</li>
<li>Choudhry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+automated+colony+and+cell+counting+by+digital+image+analysis+based+on+edge+detection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection.</a> PLoS One. 11 (2), 0148469(2016).</li>
<li>Torre, V., Poggio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+edge+detection%5BTitle%5D)+AND+%22MIT+Artificial+Intelligence+Lab+Memo+768%22%5BJournal%5D)">On edge detection.</a> MIT Artificial Intelligence Lab Memo 768. , 1-9 (1984).</li>
<li>Fuller, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+vital+fluorescent+staining+method+for+monitoring+bacterial+transport+in+subsurface+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).</li>
<li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+distance+and+watershed+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Processing%22%5BJournal%5D)">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).</li>
<li>Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html">https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html</a> (2022).</li>
<li>Bala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+watershed+image+segmentation+technique+using+MATLAB%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Scientific+and+Engineering+Research%22%5BJournal%5D)">An improved watershed image segmentation technique using MATLAB.</a> International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).</li>
<li>Glaros, T., Larsen, M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+fibroblasts+during+inflammation%2C+tissue+damage+and+organ+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%28Landmark+Edition%29%22%5BJournal%5D)">Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).</li>
<li>Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+and+fibroblast+interactions+in+biomaterial-mediated+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451(2019).</li>
<li>Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+growth+factor+gene+delivery+with+collagen-triggered+wound+repair+cascades+using+collagen-mimetic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%26+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides.</a> Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).</li>
<li>Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html">https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html</a> (2022).</li>
<li>Atherton, T., Kerbyson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+invariant+circle+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Image+and+Vision+Computing%22%5BJournal%5D)">Size invariant circle detection.</a> Image and Vision Computing. 17, 795-803 (1999).</li>
<li>Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+counting+of+red+blood+cells+in+blood+cell+images+using+Hough+transform%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Computer+Applications%22%5BJournal%5D)">Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform.</a> International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).</li>
<li>Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-analysis+based+readout+method+for+biochip%3A+Automated+quantification+of+immunomagnetic+beads%2C+micropads+and+patient+leukemia+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell.</a> Micron. 133, 102863(2020).</li>
<li>Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantification+of+immunomagnetic+beads+and+leukemia+cells+from+optical+microscope+images%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Signal+Processing+and+Control%22%5BJournal%5D)">Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images.</a> Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).</li>
<li>Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+and+astrocyte+co-culture+assay+for+high+content+analysis+of+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173(2009).</li>
<li>Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+signaling+in+co-cultures+of+macrophages+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts.</a> Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).</li>
<li>Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+implant+acceptance+and+wound+healing%3A+material+selection+and+implant+location+modulate+macrophage+and+fibroblast+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).</li>
<li>Wang, Z., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalizing+cell+segmentation+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Generalizing cell segmentation and quantification.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 189(2017).</li>
<li>Zou, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+validation+of+image+segmentation+quality+based+on+a+spatial+overlap+index%5BTitle%5D)+AND+%22Academic+Radiology%22%5BJournal%5D)">Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index.</a> Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Zaprojektowaliśmy ogólną procedurę opartą na obszarze, która dokładnie i wydajnie zliczała komórki na podstawie ich wysokości, co pozwoliło na ilościowe określenie komórek bez barwienia nawet w systemach kokultury. Kluczowe kroki tej procedury obejmowały wdrożenie systemu względnej intensywności, za pomocą którego można różnicować komórki. Zastosowanie analizy wysokości względnej służyło dwóm celom: nie było potrzeby podawania parametrów zewnętrznych, ponieważ parametry względne były stałe dla danego typu komórki i param...

Oprogramowanie jest rutynowo wdrażane podczas technik analizy obrazu, aby zapewnić, że wyniki są dokładne, wydajne i bezstronne. W przypadku testów komórkowych częstym problemem jest błędna identyfikacja komórek. Obrazy z nieprawidłowymi ustawieniami ogniskowej i kontrastu mogą prowadzić do rozmycia komórek, w którym granice poszczególnych komórek stają się trudne do zidentyfikowania1. Obecność obcych cech obrazu, takich jak pory, pęcherzyki lub inne niepożądane obiekty, może utrudniać procedury liczenia, spowalniając proces liczenia i prowadząc do błędnej identyfikacji. Co więcej, liczenie komórek może być uciążliwe, a liczenie setek powtórzeń może być niezwykle czasochłonne. Co więcej, podczas ręcznego liczenia istnieje wrodzona subiektywna stronniczość, a zatem podejmowanie decyzji dotyczących identyfikacji komórek jest często niedokładne2. Zautomatyzowane oprogramowanie oferuje ekscytujący potencjał w zakresie ominięcia wszystkich tych problemów poprzez szybkie i precyzyjne odróżnianie komórek od ciał obcych, w tym obiektów znacznie przekraczających ludzkie możliwości precyzyjnego wykrywania, w oparciu o dobrze zdefiniowane kryteria identyfikacji, które zmniejszają wpływ stronniczości badacza. Typowe techniki identyfikacji komórek za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania obejmują dwie główne metody: segmentację i progowanie3. W tym miejscu demonstrujemy uogólniony protokół oparty na obszarze, który umożliwia szybkie, dokładne i niedrogie zliczanie komórek w szeroko dostępnej strukturze oprogramowania.
Techniki segmentacji, takie jak wykrywanie krawędzi, starają się izolować pojedyncze komórki, wykorzystując różnice intensywności w obrazie. Zmiany intensywności, które odróżniają komórkę od reszty obrazu, najczęściej polegają na gwałtownych zmianach jasności4. Wykrywanie krawędzi obejmuje etap filtrowania regularyzacyjnego, po którym następuje etap różnicowania, w którym wykrywane są zmiany intensywności. Proces różnicowania identyfikuje krawędzie i kontury w obrazie zmian o dużej intensywności, a te krawędzie i kontury są skorelowane z obecnością komórki. Chociaż obrazy z szumem mogą być przetwarzane przez algorytmy odszumiania4, techniki wykrywania krawędzi są idealnie stosowane do analizy obrazów o niskim poziomie szumu tła. Proces działa optymalnie, gdy granice komórek są wyraźnie i łatwo rozróżnialne i nie są ograniczane przez kontury jasności niezwiązane z obecnością komórki, rozmyciem komórek, obcymi obiektami lub zdefiniowanymi wewnętrznymi strukturami komórkowymi1,2. Jeśli obraz jest szczególnie zaszumiony, komórki można dodatkowo rozróżnić poprzez barwienie fluorescencyjne lub transfekcję białkami fluorescencyjnymi2,5. Chociaż znacznie poprawia to dokładność technik segmentacji, wymaga dodatkowych kosztów i dodatkowych inwestycji czasowych w przygotowanie kultur komórkowych do obrazowania.
Techniki progowania polegają na podziale obrazu na dwie kategorie: pierwszy plan i tło, z komórkami przypisanymi do pierwszego planu3. Techniki te wykorzystują zmiany koloru/kontrastu do zdefiniowania pozornej wysokości obiektu; Obiekty, które są rutynowo "wyższe" niż tło, można łatwo zidentyfikować jako komórki. Transformacja zlewni działa w ten sposób, kojarząc powierzchnie z jasnymi pikselami jako pierwszym planem i tymi z ciemnymi pikselami jako tłem6,7. Dzięki identyfikacji opartej na wysokości, techniki progowe mogą rutynowo odróżniać hałas od pożądanych obiektów, pod warunkiem, że znajdują się one w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. W połączeniu z kwantyfikacją obszarową, transformacja zlewiska może dokładnie identyfikować grupy obiektów w środowiskach, w których typowe techniki segmentacji, takie jak wykrywanie krawędzi, byłyby niedokładne.
Transformacje zlewni są często łączone z technikami segmentacji w celu przygotowania obrazów do dokładniejszej analizy, co skutkuje większą dokładnością zliczania komórek. W tym procesie transformacja zlewni służy do wyróżnienia potencjalnych obszarów zainteresowania przed segmentacją. Transformacja zlewni zapewnia wyjątkowe korzyści poprzez identyfikację komórek na pierwszym planie obrazów, co może poprawić dokładność analizy segmentacji poprzez usunięcie potencjalnych wyników fałszywie dodatnich dla komórek, takich jak nierówne plamy tła. Mogą jednak pojawić się trudności przy próbie dostosowania obrazów opartych na komórkach do transformacji przełomowej. Obrazy o dużej gęstości komórek mogą być nękane niedostateczną segmentacją, w której agregaty komórek są identyfikowane jako pojedyncza grupa, a nie jako pojedyncze składniki. Obecność szumu lub gwałtownych zmian intensywności może również powodować nadmierną segmentację, w której algorytm nadmiernie izoluje komórki, co skutkuje nadmierną i niedokładną liczbą komórek8.
Tutaj szczegółowo opisujemy metodę minimalizacji podstawowych wad transformacji zlewni poprzez włączenie komponentów analizy progowej do algorytmu kwantyfikacji opartej na obszarze, jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Warto zauważyć, że algorytm ten został zaimplementowany za pomocą oprogramowania typu open source i/lub powszechnie dostępnego, a zastosowanie tej struktury liczenia komórek było możliwe bez drogich odczynników lub skomplikowanych technik przygotowania komórek. Makrofagi RAW264.7 zostały wykorzystane do zademonstrowania metody ze względu na ich kluczową rolę w regulacji utrzymania tkanki łącznej i procesów gojenia się ran9. Dodatkowo przeanalizowano fibroblasty NIH/3T3 ze względu na ich kluczową rolę w utrzymaniu i naprawie tkanek. Komórki fibroblastów często współistnieją i wspierają makrofagi, co generuje potrzebę rozróżnienia tych fenotypowo odrębnych typów komórek w badaniach kokulturowych.
Liczby komórek na obrazach o wysokiej gęstości żywotnych komórek (VCD) można niezawodnie i efektywnie określić ilościowo, obliczając obszar pokryty przez komórki oraz średni obszar zajmowany przez pojedynczą komórkę. Zastosowanie progowania w przeciwieństwie do segmentacji do identyfikacji komórek umożliwiło również bardziej złożone analizy, takie jak eksperymenty, w których różne typy komórek w kokulturach były analizowane jednocześnie. Stwierdzono, że fibroblasty NIH/3T3, które często kolokalizują się z makrofagami RAW264.7 w miejscu gojenia się ran, rosną w płaszczyźnie ogniskowej, która różniła się od płaszczyzny ogniskowej makrofagów10. W związku z tym uruchomiono wiele algorytmów progowych w celu zdefiniowania tła i pierwszego planu w zależności od analizowanego typu komórki, umożliwiając dokładne zliczenie dwóch różnych typów komórek na tym samym obrazie.

<table><tbody><tr><td>Axio Observer 7 Mikroskop odwrócony</td><td>Zeiss</td><td>1028290770</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Skrobaki komórkowe</td><td>CellTreat</td><td>229310</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dublecco</td><td>Fisher Scientific</td><td>12430047</td> PBS Fisher Scientific 14190144 <td></td></tr><tr><td>Dublecco</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB Software</td><td>MathWorks</td><td>2021A</td><td></td></tr><tr><td>NIH/3T3 Komórki</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL - 1658</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina&ndash; Streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333-20ML</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 Komórki</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB - 71</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014-25G</td><td></td></tr><tr><td>T75 Kolba do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>CLS3814-24EA</td><td></td></tr></tbody></table>

algorytm analizy obrazu oparty na obszarze do ilościowego oznaczania kokultur makrofagów i fibroblastów

Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures

Kwantyfikacja komórek jest niezbędna dla szerokiego zakresu badań biologicznych i biochemicznych. Konwencjonalna analiza obrazu komórek zazwyczaj wykorzystuje metody wykrywania fluorescencji, takie jak barwienie immunofluorescencyjne lub transfekcja białkami fluorescencyjnymi, lub techniki wykrywania krawędzi, które często są podatne na błędy ze względu na szum i inne nieidealne cechy tła obrazu. 
Zaprojektowaliśmy nowy algorytm, który mógł dokładnie zliczać i rozróżniać makrofagi i fibroblasty, komórki o różnych fenotypach, które często kolokalizują się podczas regeneracji tkanek. Do implementacji algorytmu wykorzystano MATLAB, który różnicował różne typy komórek na podstawie różnic we wzroście od tła. Podstawowy algorytm został opracowany przy użyciu metody obszarowej, aby uwzględnić różnice w rozmiarze/strukturze komórek i warunkach wysiewu o dużej gęstości. 
Nieidealności w strukturach komórkowych zostały uwzględnione za pomocą dodatkowego, iteracyjnego algorytmu wykorzystującego wewnętrzne parametry, takie jak pokrycie komórek, obliczone na podstawie danych eksperymentalnych dla danego typu komórki. Na koniec przeprowadzono analizę środowisk kokulturowych przy użyciu algorytmu izolacji, w którym różne typy komórek zostały selektywnie wykluczone na podstawie oceny względnych różnic wysokości w obrębie obrazu. Stwierdzono, że podejście to pozwala na dokładne zliczanie komórek w granicach 5% marginesu błędu dla komórek monokulturowych i w granicach 10% marginesu błędu dla komórek hodowanych w kokulturze.

Analiza niepęcherzykowatych makrofagów RAW264.7 została przeprowadzona w monokulturze przy zagęszczeniu 25,0 komórek/cm2. Wykonano reprezentatywne obrazy hodowli komórkowej, które przetworzono w programie MATLAB po konwersji do formatu tiff 8-bitowego w programie ImageJ. Wyniki algorytmu z całego procesu zapisano i udokumentowano na Rysunku 2 dla obrazu reprezentatywnego. Na tym obrazie algorytm policzył 26 komórek, a liczbę tę zweryfikowano poprzez porównanie z liczeniem ręcznym,...

Prezentujemy metodę, która wykorzystuje uogólnioną analizę obrazu opartą na obszarze do identyfikacji liczby komórek. Analiza różnych populacji komórek pozwoliła na wykorzystanie znacznych różnic w wysokości i strukturze komórek między różnymi typami komórek w ramach algorytmu adaptacyjnego.

Algorytm analizy obrazu oparty na obszarze do ilościowego oznaczania kokultur makrofagów i fibroblastów

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either ...

Metoda ta może być wykorzystana do pomocy naukowcom w analizowaniu i liczeniu kokultur komórek przy użyciu prostej i skutecznej analizy obszarowej. Technika ta jest stosunkowo łatwa do wdrożenia przy użyciu powszechnie dostępnego oprogramowania i oferuje niezawodny i dokładny sposób identyfikacji różnych typów komórek w środowisku wspólnej hodowli. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat synergii określonych kokultur komórek, aby wspomóc regenerację tkanek.Metoda ta może być również stosowana do walidacji badań biomarkerów monokulturowych. Na początek hoduj surowe 264,7 makrofagów w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla do obrazowania monokultury w jednym mililitrze DMEM uzupełnionym FBS, penicyliną-streptomycyną, wodorowęglanem sodu i beta-merkaptoetanolem w pięciomililitrowej kolbie do hodowli komórkowej o gęstości 25 000 komórek na centymetr kwadratowy. Hodowla komórek NIH/3T3 w DMEM uzupełniona 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną.Do obrazowania kokulturowego należy hodować surowe makrofagi 264.7 i fibroblasty NIH/3T3 przy użyciu pożywki do kohodowli zawierającej jedną część surowej pożywki 264.7 i jedną część pożywki NIH/3T3 razem w różnych proporcjach i całkowitej gęstości 25 000 komórek na centymetr kwadratowy. Po wysianiu inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby osiągnąć żywotną gęstość komórek wynoszącą 80% zbiegu komórek. Aby uzyskać obrazy komórek za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektyw 40X, określ zdolność algorytmu do dokładnej oceny obrazów o różnych właściwościach obrazu.Uzyskuj obrazy w skali szarości z różnymi ogniskami, tworząc obrazy bez bulbusa i bulbus, a następnie eksportuj je do surowego pliku czi. Aby uzyskać obrazy komórek przy użyciu metody obszarowej, skopiuj i wklej plik obrazu do analizy do kosza, a następnie wprowadź nazwę pliku, wykonując polecenie. Naciśnij Uruchom, aby uruchomić program.Analizuj obrazy, otwierając je przez rekonstrukcję, a następnie zamykając przez rekonstrukcję, używając funkcji źródłowych, aby powiększyć pierwszy plan od tła, wykonując odpowiednie polecenie. Aby binaryzować zrekonstruowane obrazy przy użyciu systemu identyfikacji opartego na percentylu, należy odróżnić komórki od tła, używając różnicy percentyla od maksymalnego odpowiedniego piksela, przy czym największa wartość piksela stanowi co najmniej 0,5% danego obrazu. Analizuj i oceniaj wartości pikseli dla surowych makrofagów 264,7, upewniając się, że wartości mieszczą się w granicach 4,5% maksymalnego odpowiedniego piksela.Następnie oznacz piksel jako komórkowy. W przypadku obrazów zawierających profile komórek bulbusa należy zaimplementować procedurę iteracyjną, aby skorygować błędną binaryzację w środkach komórek. Określ początkowe przypuszczenie dotyczące całkowitego pokrycia komórek.Uruchom algorytm i przeanalizuj obrazy, korzystając ze wstępnych szacunków alfa i kappa, aby wypełnić część wysp. Następnie użyj liczby komórek i pokrycia po analizie, aby ponownie obliczyć kappa. Aby określić średnią powierzchnię komórki po binaryzacji obrazu, uzyskaj wektor wszystkich środkowych lokalizacji i promieni okręgów znajdujących się na obrazie, wykonując polecenie.Użyj promieni wyjściowych, aby obliczyć średnią powierzchnię komórki poprzez uśrednienie i przeanalizowanie co najmniej 10 komórek, aby zapewnić dokładną identyfikację obszaru. Wykonaj analizę obrazu za pomocą poleceń zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie przeprowadź analizę kokultur zawierających surowe komórki 264.7 i NIH/3T3, eksperymentalnie określając parametr phi przy użyciu obrazów surowych komórek 264.7 i NIH/3T3.Zgadnij początkową wartość phi i iteruj, aż liczba komórek i pokrycie będą ściśle zgodne z ręcznymi zliczeniami specyficznymi dla surowej kokultury 264.7 i NIH/3T3. Określ surową liczbę 264,7 komórek w całkowitym pokryciu komórek, jak opisano wcześniej dla obrazów monokulturowych. Ponownie przeanalizuj przekształcony obraz zlewni bez parametru phi, wykrywając zarówno makrofagi, jak i fibroblasty.Uzyskaj dane dotyczące fibroblastów NIH / 3T3 poprzez selektywne odejmowanie surowych 264,7 pikseli komórek uzyskanych przy użyciu standardowych metod progowania i kwantyfikacji opartej na obszarze opisanych wcześniej. Przeprowadzono analizę surowych makrofagów 264,7 innych niż bulbus i zarejestrowano wyniki algorytmu. Obliczenia średniej powierzchni obrazu za pomocą algorytmu naliczyły 226 komórek, podczas gdy ręczne liczenie zidentyfikowało 241 komórek z przybliżoną wartością błędu 6%Przeprowadzono również analizę surowych makrofagów bulbusa 264,7.Obliczenia średniej powierzchni obrazu za pomocą algorytmu zliczyły 221 komórek, zweryfikowane przez ręczne zliczenie 252 komórek z przybliżoną wartością błędu 12%Przeprowadzono analizę kokultur zawierających zarówno surowe makrofagi 264,7, jak i fibroblasty NIH/3T3. Dane wyjściowe algorytmu dla surowej liczby makrofagów 264,7 wynosiły 137, podczas gdy ręczne liczenie zidentyfikowało 155 komórek z przybliżoną wartością błędu 11%Aby określić solidność algorytmu zliczania komórek, pięć surowych obrazów makrofagów 264,7 zliczono za pomocą automatycznej identyfikacji komórek i ręcznego liczenia użytkowników. Współczynnik kości został uzyskany ze średnim parametrem 0,85 na pięciu obrazach.Kluczowym krokiem w ramach tego protokołu jest użycie parametrów opartych na percentylu, co pozwala na niezawodne wykrywanie komórek zarówno w obrazach monokulturowych, jak i kokulturowych. Protokół ten może być wykorzystany do identyfikacji komórek będących przedmiotem zainteresowania do dalszej analizy przy użyciu technik biologii molekularnej do oceny biomarkerów, które definiują określone populacje komórek i rozwój biomarkerów w systemach kohodowlanych.

area-based-image-analysis-algorithm-for-quantification-macrophage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Adhezyjne mikrowzory normalizujące architekturę komórkową mogą być wykorzystane do zwiększenia czułości w wykrywaniu efektów działania leków, poprawy powtarzalności oraz uproszczenia zautomatyzowanego pozyskiwania i analizy obrazów. Taka technologia przyniesie korzyści w testach przesiewowych leków/siRNA, które są przeprowadzane na konwencjonalnych podłożach do hodowli komórkowej i w konsekwencji obarczone są nadmierną zmiennością międzykomórkową.

Udoskonalona wizualizacja i analiza ilościowa efektów działania leków z wykorzystaniem komórek rozmieszczonych w mikrowzorach

Opisano nową metodę pozyskiwania makrofagów z hodowli pierwotnej komórek wątroby szczura. Metoda ta wykorzystuje proliferację makrofagów w hodowli, a następnie wstrząsanie kolb z kulturą i oczyszczanie poprzez selektywną adhezję do plastikowych naczyń. Technika ta pozwala na wydajne pozyskanie makrofagów wątrobowych bez konieczności stosowania złożonego sprzętu i specjalistycznych umiejętności.

Prosta i wydajna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłych osobników

Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.

Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

Sondy specyficzne dla celu stanowią innowacyjne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych, takich jak ekspresja białek w różnych typach chorób (np. zapaleniu, infekcji i nowotworzenia). W tym badaniu opisano ilościową trójwymiarową ocenę tomograficzną infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego przy użyciu tomografii fluorescencyjnej specyficznej dla F4 / 80.

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Mikroglej to komórki odpornościowe mózgu, które badają i reagują na zmienione fizjologie mózgu poprzez zmiany morfologiczne, które mogą być oceniane ilościowo. Protokół ten przedstawia protokół analizy oparty na ImageJ, aby przedstawić morfologię mikrogleju jako ciągłe dane zgodnie z takimi wskaźnikami, jak rozgałęzienie komórki, złożoność i kształt.

Kwantyfikacja morfologii mikrogleju na podstawie mikrofotografii immunohistochemicznej tkanki przygotowanej za pomocą ImageJ

Tutaj opisujemy prostą i przystępną strategię wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w utrwalonych w formalinie odcinkach tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie. Metodologia ta łączy istniejące techniki obrazowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i analizy wieloparametrowej testów obrazowania.

Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Artykuł opisuje ilościowe określenie 1) wielkości i liczby zrostów ogniskowych oraz 2) wskaźnika kształtu komórki i jego rozkładu na podstawie obrazów konfokalnych zlewających się monowarstw komórek MCF7.

Kwantyfikacja obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach komórek MCF7

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki, biologia nowotworów wymaga nowatorskich narzędzi in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym. Opisujemy protokoły wykorzystania kokultur mikroprzepływowych immunologicznych z nowotworami w warunkach 2D i 3D, kompatybilnych z dynamicznym, wieloparametrycznym monitorowaniem funkcji komórkowych.

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

Choroby neurodegeneracyjne są związane z rozregulowanymi funkcjami mikrogleju. W artykule przedstawiono test in vitro fagocytozy komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC. Odczyty z mikroskopii ilościowej opisano zarówno dla obrazowania poklatkowego żywych komórek, jak i obrazowania o wysokiej zawartości komórek stałych.

Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów z sferoidą guza w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenu I, z możliwością porównania wpływu rozpuszczalnych i fizycznych właściwości mikrośrodowiska na inwazję komórek.

Test koinwazji sferoidów makrofagów i guzów

Poznaj algorytm analizy obrazu oparty na obszarze do ilościowego oznaczania kokultur makrofagów RAW 264.7 i fibroblastów NIH/3T3. Ta metoda umożliwia niezawodne rozróżnianie typów komórek i badanie mechanizmów regeneracji tkanek.

Algorytm analizy obrazu oparty na obszarze do ilościowego oznaczania kokultur makrofagów i fibroblastów

Przeglądaj więcej filmów