Wykorzystanie wstępnie zmontowanych plastikowych chipów mikroprzepływowych do podziału pierwotnych neuronów mysich

Urządzenia mikroprzepływowe używane do podziału neuronów stały się standardowym narzędziem w neurobiologii, umożliwiając naukowcom fizyczne i chemiczne manipulowanie subkomórkowymi regionami neuronów, w tym somatami, aksonami, dendrytami i synapsami. Te urządzenia do hodowli z przedziałami mogą pomóc odpowiedzieć na wiele pytań w dziedzinie neurobiologii, takich jak, w jaki sposób aksony rozciągają się podczas rozwoju, tworząc synapsy, jak synapsy przebudowują się i reformują po uszkodzeniu aksonów oraz jak stany patologiczne mogą transsynaptycznie rozprzestrzeniać się w chorobach takich jak choroba Alzheimera. Protokół ten opisuje użycie wstępnie zmontowanego plastikowego wielokomorowego chipa do podziału kultur pierwotnych neuronów szczura.

Główną zaletą korzystania z tych chipów jest to, że zapewniają one łatwą w użyciu i wysoce powtarzalną metodę podziału neuronów. Kolejną zaletą jest to, że chipy te zapewniają zdrowszy, długoterminowy wzrost neuronów i izolowanych aksonów niż poprzednie urządzenia z przedziałami na bazie krzemu i są równie kompatybilne z mikroskopią o wysokiej rozdzielczości. Inne systemy modelowe, w tym ludzkie komórki macierzyste, mogą być również hodowane we wstępnie zmontowanym chipie przedziałowym.

Na początek umieść sterylny, wielokomorowy chip na szalce Petriego. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu do wstępnego kodowania do lewego górnego dołka chipa i pozwól mu przepłynąć przez główny kanał do sąsiedniej studzienki. Następnie napełnij lewą dolną studzienkę chipa 100 mikrolitrami roztworu do wstępnego kodowania.

Tym razem odczekaj pięć minut, aby roztwór przepłynął przez mikrorowki. Teraz dodaj 100 mikrolitrów roztworu do wstępnego kodowania do prawej górnej studzienki i pozwól mu przepłynąć przez główny kanał do sąsiedniej studzienki. Po 90 sekundach napełnij dolną prawą studzienkę 100 mikrolitrami roztworu do wstępnego kodowania i inkubuj chip przez 10 minut.

Ostrożnie odchylić końcówkę pipety od głównego kanału i zassać roztwór z każdej studzienki. Następnie natychmiast dodaj 150 mikrolitrów PBS do lewego górnego dołka i odczekaj półtorej minuty. Następnie dodaj 150 mikrolitrów PBS do lewego dolnego dołka i odczekaj pięć minut, aby płyn mógł przepłynąć przez mikrorowki.

Następnie dodaj 150 mikrolitrów PBS do prawego górnego i prawego dolnego dołka, w tej kolejności. Po 10 minutach ponownie zassać PBS i powtórzyć kroki mycia po raz drugi. Po drugim płukaniu odessać PBS ze studzienek, tak jak poprzednio, odchylając końcówkę pipety, z dala od otworu kanału.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów 0,5 mieszanki na promil roztworu poli-D-lizyny do lewego górnego dołka chipa. Odczekaj półtorej minuty, a następnie napełnij lewą dolną studzienkę 100 mikrolitrami roztworu poli-D-lizyny. Powtórz ten proces na prawej połowie chipa.

Zamknij szalkę Petriego. Następnie umieść chip w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Po inkubacji dwukrotnie przepłukać chip PBS, jak opisano wcześniej.

Następnie odessaj PBS z urządzenia. Natychmiast dodaj 100 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych do lewego górnego dołka chipa. Po półtorej minuty dodaj multimedia do lewego dolnego dołka.

Odczekaj pięć minut, aby media przepłynęły przez mikrorowki, a następnie powtórz proces napełniania po prawej stronie chipa. Przygotuj zawiesinę komórkową zdysocjowanych neuronów hipokampa szczura zgodnie z ustalonymi protokołami. Usuń większość nośnika z każdej studzienki chipa, ale pozostaw kanały wypełnione.

Następnie natychmiast załaduj pięć mikrolitrów zawiesiny komórek do prawego górnego dołka i kolejne pięć mikrolitrów zawiesiny komórek do prawego dolnego dołka. Podczas ładowania kuwet skieruj końcówkę pipety w stronę głównego kanału. Po załadowaniu komórek przenieś chip do stolika mikroskopowego i upewnij się, że neurony znajdują się w głównym kanale.

Po odczekaniu pięciu minut, aż komórki się przyczepią, dodaj około 150 mikrolitrów pożywki do hodowli neuronów do każdej z górnych i prawych dolnych studzienek. Następnie dodaj 150 mikrolitrów pożywki do każdej z górnych i lewych dolnych studzienek. Przykryj szalkę Petriego i umieść chip na nawilżonej tacy w inkubatorze o temperaturze 5% dwutlenku węgla i temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Najpierw wyjmij 20 mikrolitrów z lewego dolnego dołka komory aksonalnej i umieść ją w prawym górnym dołku komory somatycznej. Odczekaj dwie minuty, aż przepływ w każdym kanale się zrównoważy. Następnie usuń 50 mikrolitrów pożywki z komory aksonalnej i dodaj 0,3 mikrolitra jednego milimolowego hydrazydu Alexa Fluor 488 do tego podłoża.

Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać roztwór, a następnie zawrócić pożywkę zawierającą barwnik fluorescencyjny z powrotem do komory aksonalnej. W tym momencie umieść chip na mikroskopie i zobrazuj zgodnie z potrzebami. Aby wykonać aksotomię w chipie, najpierw wyjmij pożywkę z komory aksonalnej, trzymając końcówkę pipety z dala od wejścia do głównego kanału.

Na razie przechowuj usunięte media w probówce wirówkowej. Następnie umieść pipetę aspiracyjną w pobliżu wejścia do głównego kanału komory aksonalnej i całkowicie zasysaj komorę aksonalną. Kontynuuj zasysanie obszaru przez jedną do dwóch minut.

Wymień komorę aksonalną na przechowywaną pożywkę. Upewnij się, że roztwór został całkowicie usunięty z komory, a aksony zostały odcięte, patrząc na próbkę pod mikroskopem. Następnie przykryj chip i włóż go z powrotem do inkubatora.

Aby rozpocząć barwienie immunologiczne fluorescencyjne, usuń większość pożywki z chipa, utrzymując nawilżenie wewnętrznych komór. Natychmiast dodaj 100 mikrolitrów roztworu utrwalającego do górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych. Po jednej minucie dodaj 100 mikrolitrów roztworu utrwalającego do studzienek dennych i utrwalaj komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Usuń większość roztworu ze studzienek i natychmiast dodaj 150 mikrolitrów PBS do każdego z górnych dołków przedziałów aksonalnych i somatycznych. Odczekaj dwie minuty, aż PBS spłynie do studzienek dennych, a następnie wyjmij PBS i przepłucz studzienki jeszcze dwukrotnie, stosując ten sam proces. Po ostatnim płukaniu usuń większość PBS z dołków chipa i natychmiast dodaj 150 mikrolitrów PBS z 0,25% trytonem x-100 do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych.

Odczekaj 15 minut, a następnie usuń większość płynu z dołków. Natychmiast dodaj 150 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych. Po 15 minutach usuń większość płynu z dołków i natychmiast dodaj 100 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwotnego do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych.

Przykryj chip, aby zminimalizować parowanie i inkubuj komórki w pierwotnym przeciwciałie przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przepłucz chip, usuwając większość roztworu i natychmiast dodając 150 mikrolitrów PBS do każdego z górnych dołków przedziałów aksonalnych i sematycznych. Po pięciu minutach wyjmij PBS z obu studzienek i powtórz płukanie jeszcze dwa razy.

Teraz usuń większość płynu z dołków i natychmiast dodaj 100 mikrolitrów przeciwciał wtórnych w PBS do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych. Przykryj chip, aby zminimalizować parowanie i inkubuj chip przez godzinę w temperaturze pokojowej. Jak pokazano wcześniej, przepłucz chip trzy razy za pomocą PBS, a następnie zamontuj i zobrazuj chipy zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.

Pokazane tutaj jest porównanie neuronów hodowanych na plastikowych chipach i urządzeniach PDMS. Wzrost neuronów jest porównywalny w obrębie obu platform do 15 dni w hodowli, ale przy dłuższym wieku hodowli izolowane aksony w plastikowym chipie wydają się zdrowsze przy mniejszym biciu. Aby dokładniej uwidocznić aksony w przedziałach aksonalnych, próbki te zostały również wybarwione immunologicznie pod kątem beta tubuliny III, która pokazuje zdrowy wzrost aksonów w plastikowych chipach po 22 dniach hodowli.

Dalsze barwienie próbkami 24-dniowymi pokazuje, że neurony wyhodowane w plastikowych chipach wyrażają zarówno pobudzające, jak i hamujące markery synaptyczne, vGlut1 i vGat. Oto dwa markery synaptyczne w połączeniu z neuronami mCherry znakowanymi wstecznie. Aby wykazać przydatność tego chipa do badań nad uszkodzeniem aksonów i regeneracją, neurony znakowane wstecznie zostały zobrazowane przed aksotomią i 24 godziny po niej.

Zarówno bańka retrakcyjna, jak i regenerujący akson są widoczne po aksotomii. Wyniki te są równoważne z danymi opublikowanymi przy użyciu urządzeń opartych na PDMS. Klasyczne chipy wielokompartmentowe zapewniają łatwą w użyciu opcję dzielenia neuronów na przedziały, zapewniając długotrwałe hodowle neuronów, które zachowują żywotność przez okres dłuższy niż trzy tygodnie.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wysiewie odpowiedniej liczby neuronów i upewnić się, że inkubator jest dobrze nawilżony podczas hodowli.