Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja aktywności cyklu komórkowego w kardiomiocytach postnatalnych i określenie ich jądrowości. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji serca, takie jak to, czy kardiomiocyt naprawdę się dzieli, czy tylko zwiększa swoją ploidalność lub staje się wielojądrowy? Głównymi zaletami tej techniki jest to, że fazę M cyklu komórkowego można uwidocznić w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej oraz że jądra kardiomiocytów można zidentyfikować za pomocą fluorescencji.

Procedurę zademonstruje Patricia Freitag, technik z naszego laboratorium. Jeśli używasz niehomozygotycznych par hodowlanych, najpierw zidentyfikuj transgeniczne serca za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby sprawdzić ich ekspresję EGFP, analiny i H2B-mCherry. Sygnały jądrowe analizy EGFP można najłatwiej wykryć na krawędziach przedsionków, skupiając się przez ich warstwy tkankowe.

Aby wyizolować kardiomiocyty, umieść odpowiednią liczbę serc w 1,5-mililitrowych probówkach reakcyjnych zawierających jeden mililitr mieszanki enzymów z zestawu do dysocjacji serca noworodków i pokrój serca na małe kawałki nożyczkami. Następnie przenieś roztwór do 15-mililitrowych probówek reakcyjnych. Umieść probówkę w pozycji prawie poziomej w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 minut, mieszając tkankę od pięciu do 10 razy za pomocą pięciomililitrowej pipety pod koniec inkubacji.

Pod koniec trzeciego trawienia zatrzymaj reakcję za pomocą 7,5 mililitra pożywki drugiej i przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o średnicy 70 mikronów. Przepłukać sitko komórkowe trzema mililitrami pożywki dwa, łącząc popłuczynę z zebranymi komórkami i zebrać komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić granulat w 500 mikrolitrach pożywki do liczenia.

Następnie wysiewaj jedną komórkę razy dziesięć do czwartej na studzienkę w 120 mikrolitrach pożywki na 96-dołkowej płaskiej płytce i odwiruj komórki przed ich nocną hodowlą w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego dnia większość kardiomiocytów powinna bić. Przed rozpoczęciem transfekcji przetrzyj ławkę i wszystkie materiały do transfekcji roztworem do odkażania RNAzy, aby usunąć wszelkie RNAzy.

Gdy wszystkie materiały będą gotowe, dodaj 20 mikrolitrów świeżo przygotowanej mieszanki siRNA do każdej studzienki i włóż komórki z powrotem do inkubatora na 48 godzin. Po dwóch dniach zastąp supernatant w każdym dołku 120 mikrolitrami pożywki i włóż komórki z powrotem do inkubatora na co najmniej kolejne 24 godziny. Pod koniec inkubacji przemyć komórki jeden raz PBS, a następnie utrwalić w 4% roztworze formaldehydu przez 20 minut.

Aby przeanalizować komórki za pomocą konfokalnej mikroskopii wideo, przenieś płytkę do stolika mikroskopu konfokalnego i uruchom oprogramowanie do obrazowania. Otwórz ustawienia A1plus i zaznacz pola kanału pierwszego, drugiego, trzeciego i czwartego. W menu rozwijanym ustaw kanał pierwszy na DAPI, kanał drugi na eGFP, kanał trzeci na RFP, a kanał czwarty na Cy5.

Kliknij napięcie kanału i użyj suwaków, aby ustawić napięcie na 80 dla każdego kanału. Użyj suwaków, aby ustawić przesunięcie na zero i kliknij przycisk home, aby ustawić otwór w pozycji wyjściowej. Ustaw rozmiar skanowania na 1024 na 1024 piksele w menu rozwijanym.

Kliknij optymalizuj, aby otworzyć okno ustawień rozmiaru XYZ i zaznacz pole idealnego woksela pod sugerowanym krokiem Z. Wybierz obiektyw 20x i dostosuj intensywność lasera, aż obraz nie będzie ani niedoświetlony, ani prześwietlony. Po ustawieniu wszystkich parametrów otwórz menu pobierania. Wybierz opcję Skanuj duży obraz, a następnie wybierz bieżącą pozycję w lewym górnym rogu pod obszarem.

Następnie ustaw liczbę pól w X i Y na trzy na trzy i kliknij skanuj. Aby zdefiniować liczbę jąder kardiomiocytów, kliknij przycisk Pomiar, Pomiar ręczny i Zliczenia. Zaznacz jądra z sygnałami H2B-mCherry, oznaczając je i zliczając.

Następnie wybierz komórki dodatnie alfa-aktyniny, aby określić liczbę kardiomiocytów. Aby policzyć kardiomiocyty fazy G1, S, G2 z jądrowymi sygnałami analiny EGFP, wybierz pomiar, pomiar ręczny i zliczanie. Oznacz jądra ekspresji EGFP analiny i H2B-mCherry za pomocą kliknięcia i ręcznie policz kardiomiocyty za pomocą specyficznych dla mitozy sygnałów analiny EGFP, takich jak pierścienie kurczliwe i środkowe części ciała.

Następnie kliknij pomiar, pomiar ręczny i liczenie, a następnie kliknij kardiomiocyty z specyficznymi dla mitozy sygnałami analiny EGFP, sygnałami cytoplazmatycznymi, pierścieniami kurczliwymi i środkowymi ciałami. W porównaniu z kontrolami ujemnymi, kardiomiocyty transfekowane miRNA i siRNA wykazują indukcję aktywności cyklu komórkowego. Kardiomiocyty, które przeprowadzają endoreduplikację, wykazują wyłącznie jądrową ekspresję analiny EGFP, podczas gdy kardiomiocyty poddawane podziałowi komórkowemu wykazują ekspresję analiny EGFP w typowych lokalizacjach fazy M.

Po enzymatycznym trawieniu tkanki serca w aparacie Langendorffa, przedsionki i komory mogą być mechanicznie oddzielone i analizowane niezależnie, co pozwala na wizualizację transgenicznych kardiomiocytów komorowych H2B-mCherry z dużą liczbą dwujądrowych kardiomiocytów H2B-mCherry dodatnich. Natomiast większość kardiomiocytów przedsionkowych jest jednojądrowata. Trawienie enzymatyczne nie prowadzi do powstania 100% populacji pojedynczej komórki, która ujawnia wzór prążkowania krzyżowego przez barwienie alfa-aktyniną, co dodatkowo ułatwia dyskryminację między dwujądrowymi kardiomiocytami jako ciągłym wzorcem prążków krzyżowych i dubletów komórkowych.

Aby przeanalizować wskaźnik dwuzarodkowości kardiomiocytów w grubych plasterkach, konieczne jest ręczne przewijanie stosu, ponieważ jądra niekoniecznie leżą w jednej płaszczyźnie Z, a barwienie aglutyniną z kiełków pszenicy pozwala na wykrycie komórki borders. 3D rekonstrukcje ustalonych wycinków dorosłych serc myszy transgenicznych umożliwiają wykrycie i automatyczne liczenie haczyków, barwione i H2B-mWiśnia dodatnie jądra w celu określenia proporcji jąder kardiomiocytów w warunkach fizjologicznych w tkance. Po opanowaniu dysocjacja serca może zostać zakończona w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać o ciągłej pracy, aby utrzymać żywotność komórek przez cały czas trwania eksperymentu. Po tej procedurze możliwe jest badanie przesiewowe mikroRNA lub innych małych substancji pod kątem ich działania indukującego proliferację w kardiomiocytach postnatalnych.