Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja aktywności cyklu komórkowego w postnatalnych kardiomiocytach oraz określenie ich nuklearności. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji serca, takie jak: czy kardiomiocyt naprawdę się dzieli, czy jedynie zwiększa swoją ploidię lub staje się wielojądrowy? Głównymi zaletami tej techniki są możliwość wizualizacji fazy M cyklu komórkowego z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną oraz możliwość identyfikacji jąder kardiomiocytów za pomocą fluorescencji.

Procedurę zaprezentuje Patricia Freitag, technik z naszego laboratorium. W przypadku użycia par hodowlanych niehomozygotycznych, najpierw należy zidentyfikować serca transgeniczne za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby sprawdzić ekspresję EGFP analin oraz H2B-mCherry. Sygnały nuklearne EGFP analyin można najłatwiej wykryć na krawędziach przedsionków, ustawiając ostrość przez warstwy tkanki.

Aby wyizolować kardiomiocyty, należy umieścić odpowiednią liczbę serc w probówkach reakcyjnych o pojemności 1,5 ml zawierających 1 ml mieszaniny enzymów z zestawu do dysocjacji serc noworodkowych i pociąć serca nożyczkami na małe kawałki. Następnie należy przenieść roztwór do probówek reakcyjnych o pojemności 15 ml. Probówkę należy umieścić w pozycji prawie poziomej w temperaturze 37 °C na 15 minut, mieszając tkankę od 5 do 10 razy pipetą 5 ml po zakończeniu inkubacji.

Po zakończeniu trzeciej digestii zatrzymać reakcję, dodając 7,5 ml medium dwa, a następnie przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm. Przepłukać sitko komórkowe trzema ml medium dwa, łącząc płukaninę z zebranymi komórkami, a następnie odwirować komórki. Osad zawiesić ponownie w 500 µl medium jeden w celu dokonania odliczania.

Następnie wysiej 1×10⁴ komórek na dołek w 120 µL medium one w 96-dołkowej płytce z płaskim dnem i odwiruj komórki przed ich nocną inkubacją w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego dnia większość kardiomiocytów powinna pulsować. Przed rozpoczęciem transfekcji przemyj blat oraz wszystkie materiały do transfekcji roztworem do dekontaminacji RNazy, aby usunąć wszelkie RNazy.

Po przygotowaniu wszystkich materiałów, do każdego dołka należy dodać 20 µL świeżo przygotowanej mieszaniny siRNA, a następnie przenieść komórki do inkubatora na 48 godzin. Po dwóch dniach supernatant w każdym dołku należy zastąpić 120 µL medium one i ponownie inkubować komórki przez co najmniej kolejne 24 godziny. Po zakończeniu inkubacji komórki należy przemyć raz PBS, a następnie utrwalić w 4% roztworze formaldehydu przez 20 minut.

Aby przeanalizować komórki za pomocą konfokalnej wideomikroskopii, przenieś płytkę na stolik mikroskopu konfokalnego i uruchom oprogramowanie do obrazowania. Otwórz ustawienia A1plus i zaznacz pola dla kanałów jeden, dwa, trzy i cztery. W menu rozwijanym ustaw kanał pierwszy na DAPI, kanał drugi na eGFP, kanał trzeci na RFP oraz kanał czwarty na Cy5.

Kliknij napięcie kanału i użyj suwaków, aby ustawić napięcie na 80 dla każdego kanału. Użyj suwaków, aby ustawić przesunięcie (offset) na zero, a następnie kliknij przycisk Home, aby ustawić otwór w przysłonie (pinhole) w pozycji domyślnej. W menu rozwijanym ustaw rozmiar skanowania na 1024 na 1024 piksele.

Kliknij optimize, aby otworzyć okno konfiguracji rozmiaru XYZ i zaznacz pole perfect voxel pod sugerowanym krokiem Z. Wybierz obiektyw 20x i dostosuj intensywność laserów tak, aby obraz nie był niedoświetlony ani prześwietlony. Po ustawieniu wszystkich parametrów otwórz menu acquire. Wybierz scan large image, a następnie w sekcji area wybierz current position is at top left corner.

Następnie ustaw liczbę pól w osi X i Y na trzy na trzy i kliknij skanuj. Aby określić liczbę jąder kardiomiocytów, kliknij pomiar, pomiar ręczny, a następnie zliczanie. Wybierz jądra z sygnałem H2B-mCherry, znakując je i zliczając.

Następnie należy wybrać komórki pozytywne pod kątem alfa-aktyniny, aby określić liczbę kardiomiocytów. Aby policzyć kardiomiocyty w fazach G1, S i G2 z jądrowymi sygnałami EGFP analiny, należy wybrać opcję pomiar (measure), pomiar ręczny (manual measurement) i liczby (counts). Zaznaczyć jądra wykazujące ekspresję EGFP analiny i H2B-mCherry poprzez kliknięcie, a następnie ręcznie policzyć kardiomiocyty z sygnałami EGFP analiny specyficznymi dla mitozy, takimi jak pierścienie kurczliwe i ciała środkowe (mid-bodies).

Następnie należy kliknąć pomiar (measure), pomiar ręczny (manual measurement), a następnie liczniki (counts) i zaznaczyć kardiomiocyty z sygnałami EGFP analin specyficznymi dla mitozy, sygnałami cytoplazmatycznymi, pierścieniamiu kurczliwymi oraz ciałami środkowymi. W porównaniu z kontrolami negatywnymi, kardiomiocyty przetransfekowane miRNA i siRNA wykazują indukcję aktywności cyklu komórkowego. Kardiomiocyty przeprowadzające endoreduplikację wykazują wyłącznie jądrową ekspresję EGFP analin, podczas gdy kardiomiocyty przechodzące podział komórkowy wykazują ekspresję EGFP analin w lokalizacjach typowych dla fazy M.

Po trawieniu enzymatycznym tkanki serca w aparacie Langendorffa przedsionki i komory można oddzielić mechanicznie i analizować niezależnie, co pozwala na wizualizację transgenicznych kardiomiocytów komorowych H2B-mCherry z wysoką liczbą dwojądrzastych kardiomiocytów pozytywnych pod kątem H2B-mCherry. W przeciwieństwie do nich, większość kardiomiocytów przedsionkowych jest jednojądrzasta. Trawienie enzymatyczne nie prowadzi do uzyskania w 100% populacji pojedynczych komórek, co ujawnia wzór poprzecznych prążków w barwieniu na alfa-aktyninę, co dodatkowo ułatwia rozróżnienie dwojądrzastych kardiomiocytów, wykazujących ciągły wzór prążkowania, od dubletów komórkowych.

Aby przeanalizować indeks bi-jądrowości kardiomiocytów w grubych skrawkach, konieczne jest ręczne przewijanie stosu obrazów, ponieważ jądra niekoniecznie znajdują się w jednej płaszczyźnie Z, przy czym barwienie aglutyniną z zarodków pszenicy umożliwia detekcję granic komórkowych. Rekonstrukcje 3D utrwalonych skrawków serc dorosłych myszy transgenicznych pozwalają na detekcję i zautomatyzowane liczenie haczyków oraz jąder zbarwionych i pozytywnych pod kątem H2B-mCherry w celu określenia proporcji jąder kardiomiocytów w tkance w warunkach fizjologicznych. Po opanowaniu techniki, dysocjacja serca może zostać ukończona w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ciągłości pracy, aby utrzymać żywotność komórek przez cały czas trwania eksperymentu. Po zastosowaniu tej procedury możliwe jest przesiewanie mikroRNA lub innych małych cząsteczek pod kątem ich efektów indukujących proliferację w ponatalnych kardiomiocytach.