Name: Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji cyklu komórkowego w kardiomiocytach postnatalnych myszy transgenicznej. Technika fluorescencyjna umożliwia rozróżnienie podziału komórkowego od zmian ploidalności w badaniach regeneracji serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy S. Grünbergowi (Bonn, Niemcy) i P. Freitagowi (Bonn, Niemcy) za ich pomoc techniczną.

<ol><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Raulf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+systems+for+unequivocal+identification+of+cardiac+myocyte+nuclei+and+analysis+of+cardiomyocyte+cell+cycle+status%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res.Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status.</a> Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).</li>
<li>Field, C. M., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin%2C+a+contractile+ring+protein+that+cycles+from+the+nucleus+to+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex.</a> J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).</li>
<li>Hesse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+cell+division+using+high-resolution+imaging+of+M-phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Commun%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle.</a> Nat.Commun. 3, 1076(2012).</li>
<li>Eulalio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+identifies+miRNAs+inducing+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration.</a> Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).</li>
<li>Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors+induces+cardiomyocyte+re-entry+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle.</a> J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).</li>
<li>Hosoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonality+of+mouse+and+human+cardiomyogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).</li>
<li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).</li>
<li>Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16889791">Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation.</a> J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Cell+Generation+and+Turnover+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart.</a> Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Istnieje kontrowersja co do tego, czy kardiomiocyty są w stanie ponownie wejść w cykl komórkowy i dzielić się po urazie i podczas homeostazy tkanek. Wartości obrotu podstawowego kardiomiocytów podano w zakresie od 1%1 do 80%7. Również po uszkodzeniu serca w strefie granicznej odnotowano indukcję aktywności cyklu komórkowego i wytwarzanie nowych kardiomiocytów, z wartościami od 0,0083%8 do 25 - 40%7. Rozbieżności te można częśc...

Prawidłowa identyfikacja jąder kardiomiocytów i stanu cyklu komórkowego ma kluczowe znaczenie dla określenia obrotu i regeneracji mięśnia sercowego. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku stosowania markerów jądrowych, takich jak pHH3, Ki-67 lub analogi tymidyny, do identyfikacji aktywności cyklu komórkowego. Ponieważ zdolność proliferacyjna kardiomiocytów dorosłych ssaków jest bardzo mała1, fałszywa identyfikacja jądra dodatniego dla markera proliferacji jądra kardiomiocytów może mieć decydujące znaczenie dla wyniku testu proliferacji. Co więcej, kardiomiocyty są podatne na zmiany w cyklu komórkowym, takie jak endoreduplikacja i mitoza acytokinetyczna, które skutkują powstawaniem komórek poliploidalnych i wielojądrowych, a nie podziałem komórkowym. W tym celu interpretacja barwienia przeciwciałami przeciwko powszechnym markerom cyklu komórkowego nie jest rozstrzygająca we wszystkich przypadkach.
Tutaj prezentujemy metody prostego rozpoznawania mysich kardiomiocytów i ich nujawności w natywnych izolowanych komórkach i grubych skrawkach tkanek w stadium postnatalnym i dorosłym poprzez jednoznaczną identyfikację ich jąder. W tym celu wykorzystano transgeniczną linię myszy z ekspresją białka fuzyjnego składającego się z ludzkiego histonu H2B i mCherry specyficznej dla kardiomiocytów pod kontrolą promotora Myh6 (Myh6-H2B-mCh)2. Krzyżowanie tej linii myszy z linią myszy o wskaźniku proliferacji transgenicznej, w której ekspresja białka fuzyjnego eGFP-aniliny jest pod kontrolą wszechobecnego promotora aktyny kurczaka ze wzmacniaczem CMV (anilina CAG-eGFP), pozwala na określenie stanu cyklu komórkowego. Białko rusztowania anilina ulega specyficznej ekspresji w aktywnych komórkach cyklu komórkowego3, a jego różnicowa lokalizacja subkomórkowa podczas cyklu komórkowego pozwala na śledzenie na żywo postępu cyklu komórkowego z wysoką rozdzielczością M-Phase4. Dlatego podwójnie transgeniczne myszy mogą być używane do rozróżniania proliferujących kardiomiocytów od tych, które ulegają zmianom cyklu komórkowego. Okazuje się to szczególnie przydatne w badaniach przesiewowych in vitro pod kątem substancji indukujących proliferację.

<table><tbody><tr><td>10 cm szalka Petriego</td><td>Sarstedt</td><td>821472</td><td></td></tr><tr><td>100 &mikro; m sitko komórkowe</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>2,3-butanodion, monoksym, (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>G20x1 &frac12; kaniula iniekcyjna, Sterican</td><td>Braun, Melsungen 4657519</td><td></td><td></td></tr><tr><td>igła o rozmiarze 20</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>2-metylo-butan</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>37% roztwór formaldehydu</td><td>AppliChem GmbH&nbsp;</td><td>A0936,1000</td><td></td></tr><tr><td>3-drogowy kran</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>16494C</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 50 ml</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Otto Fischar GmbH</td><td>27669</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z Alexa-Fluorem</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-605-205</td><td></td></tr><tr><td>Alfa-aktinina EA-53, mysia IgG</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka do hodowli komórkowych, 96 Well, Pół obszaru</td><td>Greiner bio-one</td><td>675986</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza B</td><td>Roche</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop konfokalny Eclipse Ti-E</td><td>Kriostat Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM 3050S</td> Serum osła <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Jackson Immuno Research, Suffolk, GB</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica cielęca</td><td>PromoCell, Heidelberg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu (4%)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3697</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry świni, typ A</td><td>Sigma-Aldrich, szkiełka nakrywkowe Steinheim</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Rurka przedłużająca Heidelberger</td><td>IMPROMEDIFORM GmbH</td><td>MF 1833</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna-Natrium</td><td>Ratiopharm</td><td>5394.02.00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe HistoBond</td><td>Marienfeld</td><td>0810000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (1&nbsp; mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>300334</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Zmodyfikowany Dulbecco' s Medium (IMDM)</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Corning</td><td>354221</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; sseldorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>Mysia IgG Cy5 (osioł)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>probówka do mikrowirówek</td><td>Sarstedt</td><td>72690</td><td></td></tr><tr><td>Mini wytrząsarka</td><td>VWR</td><td>12620-940</td><td></td></tr><tr><td>mimik miRNA mirVana, has-miR199a-3p</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4464066</td><td></td></tr><tr><td>Biopsja Mold</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>M-slide 8-dołkowy ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck Millipore</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>ujemny kontrola (zakodowane RNA)</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji serca noworodków</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach</td><td>130-098-373</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; sseldorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne, NEAA</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstad</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, Zredukowana pożywka w surowicy</td><td>Gibco</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>P21-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>P27-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe z polialkoholu winylowego z DABCO&reg;, zapobiegające blaknięciu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Qiagen</td><td>1007885</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>pojemniki na próbki</td><td>Vitlab</td><td>80731</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie NIS Elements Nikon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Compound</td><td>Sakura Finetek / VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Jodek ToPro3 (642/661)</td><td>Molekularny sondy/ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Aglutynina z kiełków pszenicy (WGA) Fluoresceina oznaczona</td><td>Vector Laboratories</td><td>VEC-FL-1021-5</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-aktynina</td><td>przeciwciało Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Kardiomiocyty są podatne na zmiany cyklu komórkowego, takie jak endoreduplikacja (ciągłe rundy syntezy DNA bez kariokinezy i cytokinezy) i mitoza acytokinetyczna (kariokineza, ale bez cytokinezy). Takie nietypowe zmiany cyklu komórkowego skutkują powstawaniem komórek poliploidalnych i wielojądrowych, a nie podziałem komórkowym. Dlatego, aby określić obrót i regenerację serca, kluczowe znaczenie ma prawidłowa identyfikacja jąder kardiomiocytów, liczby jąder w komórce i stanu ich cyklu komórkowego. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku stosowania markerów jądrowych do identyfikacji aktywności cyklu komórkowego, takich jak analogi tymidyny Ki-67, PCNA lub pHH3. W tym miejscu przedstawiamy metody rozpoznawania kardiomiocytów i ich jądrowości oraz określania ich aktywności cyklu komórkowego. Używamy dwóch opublikowanych systemów transgenicznych: transgenicznej linii myszy Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz linii myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego. Połączone razem, te dwa systemy ułatwiają badanie regeneracji i plastyczności serca.

W celu analizy wpływu siRNA/miRNA na aktywność cyklu komórkowego postnatalnych kardiomiocytów in vitro, kardiomiocyty myszy podwójnie transgenicznych Myh6-H2B-mCh/CAG-eGFP-anillin izolowano w 3. dniu postnatalnym (P3) i transfekowano indukującym aktywność cyklu komórkowego miR1995, siRNA p27 oraz siRNA Fzr1. W porównaniu z kontrolą negatywną (Rycina 1A), zdjęcia kardiomiocytów transfekowanych miR199- (Rycina 1B) oraz siRNA...

Aby odróżnić podział komórek od zmian cyklu komórkowego w kardiomiocytach, prezentujemy protokoły wykorzystujące dwie transgeniczne linie myszy: myszy transgeniczne Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego.

Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja aktywności cyklu komórkowego w postnatalnych kardiomiocytach oraz określenie ich nuklearności. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji serca, takie jak: czy kardiomiocyt naprawdę się dzieli, czy jedynie zwiększa swoją ploidię lub staje się wielojądrowy? Głównymi zaletami tej techniki są możliwość wizualizacji fazy M cyklu komórkowego z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną oraz możliwość identyfikacji jąder kardiomiocytów za pomocą fluorescencji.Procedurę zaprezentuje Patricia Freitag, technik z naszego laboratorium. W przypadku użycia par hodowlanych niehomozygotycznych, najpierw należy zidentyfikować serca transgeniczne za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby sprawdzić ekspresję EGFP analin oraz H2B-mCherry. Sygnały nuklearne EGFP analyin można najłatwiej wykryć na krawędziach przedsionków, ustawiając ostrość przez warstwy tkanki.Aby wyizolować kardiomiocyty, należy umieścić odpowiednią liczbę serc w probówkach reakcyjnych o pojemności 1,5 ml zawierających 1 ml mieszaniny enzymów z zestawu do dysocjacji serc noworodkowych i pociąć serca nożyczkami na małe kawałki. Następnie należy przenieść roztwór do probówek reakcyjnych o pojemności 15 ml. Probówkę należy umieścić w pozycji prawie poziomej w temperaturze 37 °C na 15 minut, mieszając tkankę od 5 do 10 razy pipetą 5 ml po zakończeniu inkubacji.Po zakończeniu trzeciej digestii zatrzymać reakcję, dodając 7,5 ml medium dwa, a następnie przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm. Przepłukać sitko komórkowe trzema ml medium dwa, łącząc płukaninę z zebranymi komórkami, a następnie odwirować komórki. Osad zawiesić ponownie w 500 µl medium jeden w celu dokonania odliczania.Następnie wysiej 1×10⁴ komórek na dołek w 120 µL medium one w 96-dołkowej płytce z płaskim dnem i odwiruj komórki przed ich nocną inkubacją w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego dnia większość kardiomiocytów powinna pulsować. Przed rozpoczęciem transfekcji przemyj blat oraz wszystkie materiały do transfekcji roztworem do dekontaminacji RNazy, aby usunąć wszelkie RNazy.Po przygotowaniu wszystkich materiałów, do każdego dołka należy dodać 20 µL świeżo przygotowanej mieszaniny siRNA, a następnie przenieść komórki do inkubatora na 48 godzin. Po dwóch dniach supernatant w każdym dołku należy zastąpić 120 µL medium one i ponownie inkubować komórki przez co najmniej kolejne 24 godziny. Po zakończeniu inkubacji komórki należy przemyć raz PBS, a następnie utrwalić w 4% roztworze formaldehydu przez 20 minut.Aby przeanalizować komórki za pomocą konfokalnej wideomikroskopii, przenieś płytkę na stolik mikroskopu konfokalnego i uruchom oprogramowanie do obrazowania. Otwórz ustawienia A1plus i zaznacz pola dla kanałów jeden, dwa, trzy i cztery. W menu rozwijanym ustaw kanał pierwszy na DAPI, kanał drugi na eGFP, kanał trzeci na RFP oraz kanał czwarty na Cy5.Kliknij napięcie kanału i użyj suwaków, aby ustawić napięcie na 80 dla każdego kanału. Użyj suwaków, aby ustawić przesunięcie (offset) na zero, a następnie kliknij przycisk Home, aby ustawić otwór w przysłonie (pinhole) w pozycji domyślnej. W menu rozwijanym ustaw rozmiar skanowania na 1024 na 1024 piksele.Kliknij optimize, aby otworzyć okno konfiguracji rozmiaru XYZ i zaznacz pole perfect voxel pod sugerowanym krokiem Z. Wybierz obiektyw 20x i dostosuj intensywność laserów tak, aby obraz nie był niedoświetlony ani prześwietlony. Po ustawieniu wszystkich parametrów otwórz menu acquire. Wybierz scan large image, a następnie w sekcji area wybierz current position is at top left corner.Następnie ustaw liczbę pól w osi X i Y na trzy na trzy i kliknij skanuj. Aby określić liczbę jąder kardiomiocytów, kliknij pomiar, pomiar ręczny, a następnie zliczanie. Wybierz jądra z sygnałem H2B-mCherry, znakując je i zliczając.Następnie należy wybrać komórki pozytywne pod kątem alfa-aktyniny, aby określić liczbę kardiomiocytów. Aby policzyć kardiomiocyty w fazach G1, S i G2 z jądrowymi sygnałami EGFP analiny, należy wybrać opcję pomiar (measure), pomiar ręczny (manual measurement) i liczby (counts). Zaznaczyć jądra wykazujące ekspresję EGFP analiny i H2B-mCherry poprzez kliknięcie, a następnie ręcznie policzyć kardiomiocyty z sygnałami EGFP analiny specyficznymi dla mitozy, takimi jak pierścienie kurczliwe i ciała środkowe (mid-bodies).Następnie należy kliknąć pomiar (measure), pomiar ręczny (manual measurement), a następnie liczniki (counts) i zaznaczyć kardiomiocyty z sygnałami EGFP analin specyficznymi dla mitozy, sygnałami cytoplazmatycznymi, pierścieniamiu kurczliwymi oraz ciałami środkowymi. W porównaniu z kontrolami negatywnymi, kardiomiocyty przetransfekowane miRNA i siRNA wykazują indukcję aktywności cyklu komórkowego. Kardiomiocyty przeprowadzające endoreduplikację wykazują wyłącznie jądrową ekspresję EGFP analin, podczas gdy kardiomiocyty przechodzące podział komórkowy wykazują ekspresję EGFP analin w lokalizacjach typowych dla fazy M.Po trawieniu enzymatycznym tkanki serca w aparacie Langendorffa przedsionki i komory można oddzielić mechanicznie i analizować niezależnie, co pozwala na wizualizację transgenicznych kardiomiocytów komorowych H2B-mCherry z wysoką liczbą dwojądrzastych kardiomiocytów pozytywnych pod kątem H2B-mCherry. W przeciwieństwie do nich, większość kardiomiocytów przedsionkowych jest jednojądrzasta. Trawienie enzymatyczne nie prowadzi do uzyskania w 100% populacji pojedynczych komórek, co ujawnia wzór poprzecznych prążków w barwieniu na alfa-aktyninę, co dodatkowo ułatwia rozróżnienie dwojądrzastych kardiomiocytów, wykazujących ciągły wzór prążkowania, od dubletów komórkowych.Aby przeanalizować indeks bi-jądrowości kardiomiocytów w grubych skrawkach, konieczne jest ręczne przewijanie stosu obrazów, ponieważ jądra niekoniecznie znajdują się w jednej płaszczyźnie Z, przy czym barwienie aglutyniną z zarodków pszenicy umożliwia detekcję granic komórkowych. Rekonstrukcje 3D utrwalonych skrawków serc dorosłych myszy transgenicznych pozwalają na detekcję i zautomatyzowane liczenie haczyków oraz jąder zbarwionych i pozytywnych pod kątem H2B-mCherry w celu określenia proporcji jąder kardiomiocytów w tkance w warunkach fizjologicznych. Po opanowaniu techniki, dysocjacja serca może zostać ukończona w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ciągłości pracy, aby utrzymać żywotność komórek przez cały czas trwania eksperymentu. Po zastosowaniu tej procedury możliwe jest przesiewanie mikroRNA lub innych małych cząsteczek pod kątem ich efektów indukujących proliferację w ponatalnych kardiomiocytach.

visualization-cell-cycle-variations-determination-nucleation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Jądra komórek serca są izolowane metodą sedymentacji gęstościowej i znakowane immunologicznie przeciwciałami przeciwko materiałowi pericentriolarnemu 1 (PCM-1) w celu identyfikacji i sortowania jąder kardiomiocytów za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

Mutacje, które prowadzą do wrodzonych wad serca, korzystają z badań in vivo struktury serca podczas rozwoju, ale badania strukturalne w wysokiej rozdzielczości na embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy solidną metodę immunofluorescencji i analizy obrazu w celu oceny struktur specyficznych dla kardiomiocytów w rozwijającym się sercu myszy.

Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

Kwantyfikacja obrotu kardiomiocytów jest wyzwaniem. Opisany tutaj protokół w istotny sposób przyczynia się do rozwiązania tego wyzwania, umożliwiając dokładne i czułe określenie ilościowe wytwarzania jąder neokardiomiocytów i ploidalności jąder.

Jednoczesna ocena syntezy i ploidalności DNA kardiomiocytów: metoda wspomagająca ilościowe określanie regeneracji i obrotu kardiomiocytów

Opisujemy protokół do wolumetrycznego obrazowania komórek znakowanych białkiem fluorescencyjnym głęboko w nienaruszonych sercach embrionalnych i pourodzeniowych. Wykorzystując metody oczyszczania tkanek w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca, pojedyncze komórki znakowane białkiem fluorescencyjnym wewnątrz serca embrionalnego lub pourodzeniowego mogą być wyraźnie i dokładnie zobrazowane.

Obrazowanie oczyszczonych serc embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki

Konwencjonalne metody inicjowania różnicowania sercowego ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) na podstawie agregatu zawiesinowego są nękane niejednorodnością hodowli pod względem wielkości i kształtu agregatu. W tym miejscu opisujemy solidną metodę różnicowania serca wykorzystującą mikrostudzienki do generowania agregatów hPSC o kontrolowanej wielkości, hodowanych w warunkach sprzyjających pracy serca.

Optymalizacja wielkości agregatu w mikrostudzienkach do różnicowania serca ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na podstawie zawiesiny

Ten manuskrypt opisuje krok po kroku protokół generowania i kwantyfikacji różnych przeprogramowanych podtypów serca przy użyciu retrowirusowego dostarczania Gata4, Hand2, Mef2c i Tbx5 za pośrednictwem retrowirusa.

Ocena podtypów kardiomiocytów po przeprogramowaniu fibroblastów embrionalnych myszy za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego

Celem tej pracy jest opracowanie metody powtarzalnego izolowania kardiomiocytów od serca dorosłego człowieka oraz mierzenia zawartości DNA i zarodkowania.

Izolacja kardiomiocytów ze stałych serc do analizy immunocytochemicznej i ploidalnej

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stanowią alternatywę dla wykorzystywania zwierząt do przedklinicznych badań przesiewowych kardiotoksyczności. Ograniczeniem dla powszechnego stosowania hiPSC-CM w przedklinicznych badaniach przesiewowych toksyczności jest niedojrzały, podobny do płodu fenotyp komórek. Poniżej przedstawiono protokoły solidnego i szybkiego dojrzewania hiPSC-CM.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe kardiotoksyczności z wykorzystaniem dojrzałych, indukowanych przez człowieka monowarstw kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę wizualizacji cyklu komórkowego w kardiomiocytach postnatalnych myszy transgenicznej. Technika fluorescencyjna umożliwia rozróżnienie podziału komórkowego od zmian ploidalności w badaniach regeneracji serca.

Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

Przeglądaj więcej filmów