Name: Izometryczna i ekscentryczna ocena generowania sił mięśni szkieletowych wyizolowanych z mysich modeli dystrofii mięśniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Poznaj metodę oceny siły mięśni szkieletowych myszy z dystrofią mięśniową poprzez izometryczne i ekscentryczne skurcze. Technika ta pozwala porównać funkcję mięśni zdrowych i chorych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Paul D. Wellstone Cooperative Research Center (AR052646).

Wszystkie procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Pensylwanii.
1. Sekcja i przygotowanie EDL (około 30 min)
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy należy upewnić się, że podczas zabiegu nie odczuwają bólu ani niepokoju, ale mięśnie pozostają dobrze dotlenione przez krążenie. Rutynowo używamy koktajlu ketamina/ksylazyna (100/10 mg/kg) wstrzykiwanego przez IP. Operacyjna płaszczyzna znieczulenia jest określana przez całkowity brak odruchów odstawienia pedału lub podpalenia lub brak reakcji skurczowej ucha.</li>
	<li>Unieruchomij tylne kończyny za pomocą taśmy medycznej i usuń skórę dolnej przedniej kończyny tylnej, aby odsłonić mięśnie tego obszaru. Utrzymuj mięśnie wilgotne, stosując PBS w regularnych odstępach czasu.</li>
	<li>Pod lunetą sekcyjną wykonaj małe nacięcie boczne do kolana, aby odsłonić ścięgno proksymalne mięśnia EDL. W tym obszarze znajdują się dwa ścięgna i oba powinny zostać przecięte, aby umożliwić usunięcie EDL.</li>
	<li>W kostce przyśrodkowej przetnij ścięgno mięśnia TA, aby odsłonić dystalne ścięgna EDL, które rozciągają się wzdłuż śródstępu. Unieś mięsień TA z drogi, uważając, aby nie przeciąć ani nie dotknąć EDL pod spodem. Wróć do dystalnych ścięgien EDL, odetnij każde z nich i przeciągnij je przez kostkę, a następnie chwytając ścięgna, delikatnie odciągnij EDL od reszty kończyny. Powinien swobodnie uwolnić się od bliższego końca, ale jeśli nie, wróć do bocznego nacięcia, aby upewnić się, że ścięgno zostało przecięte. Usuń mięsień i umieść w naczyniu preparacyjnym wypełnionym schłodzonymi, natlenionymi Ringerami. Przypnij mięsień przez ścięgna na mniej więcej długości spoczynkowej, która jest długością występującą in vivo. Długość jest zbyt krótka, gdy mięsień jest zwiotczały w naczyniu i zbyt długa, jeśli mięsień ciągnie za szpilki preparacyjne.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji natychmiast po usunięciu mięśni przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Przywiąż szwy do ścięgien, jak najbliżej mięśnia, ale nie dotykając mięśnia. Przypnij mięsień na mniej więcej długości spoczynkowej za pomocą szwów.</li>
</ol>
2. Sekcja i przygotowanie membrany (około 30 min)
<ol>
	<li>Eutanazja myszy przed tą procedurą przez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu, jeśli ta sama mysz jest poddana obu sekcji, lub przez CO2, a następnie potwierdzenie zwichnięcia szyjki macicy. </li>
	<li>Wykonaj nacięcie w skórze, aby odsłonić jamę brzuszną i klatkę piersiową. Otwórz jamę brzuszną i przetnij ścianę ciała tuż pod żebrami. Za pomocą nożyczek do kości i zaczynając od przyczepu przepony, przeciąć wokół całej klatki piersiowej zgodnie z linią żeber i przeciąć kręgosłup. Przeciąć naczynia krwionośne biegnące przez środek przepony, aby można było łatwo usunąć przeponę.</li>
	<li>Zdejmij membranę z myszy i umieść w naczyniu preparacyjnym wypełnionym natlenionymi Dzwonkami. Delikatnie porusz membranę w naczyniu, aby zmyć krew. W razie potrzeby odśwież rozwiązanie Ringers.</li>
	<li>Wytnij mały pasek przepony od środkowego ścięgna do żeber wzdłuż orientacji włókien w środkowej części bocznych półprzepony. Pasek powinien mieć szerokość od 2 do 4 mm. Za pomocą nożyczek do kości odetnij żebro po obu stronach paska, pozostawiając około 1-2 mm zwisu żebra po obu stronach paska przepony.</li>
	<li>Przywiąż szwy do środkowego ścięgna. Przywiąż szew do każdego z bocznie wystających końców żeber, a następnie zwiąż je ze sobą, aby utworzyć dużą pętlę.</li>
	<li>Z każdej membrany można uzyskać dwa paski (po jednym z każdej strony).</li>
</ol>
3. Trening mięśni w kąpieli mechanicznej
<ol>
	<li>Chwyć szwy i użyj ich, aby przymocować mięsień do sztywnego słupka na jednym końcu i do przetwornika siły na drugim końcu.</li>
	<li>Dostosuj długość, aby upewnić się, że mięsień nie jest luźny, ale nie jest napięty. Dobrym przybliżeniem jest spoczynkowa długość mięśnia, jak w 1,4 - 1,5.</li>
	<li>Kąpiel powinna być wypełniona natlenionym roztworem Ringera utrzymywanym w temperaturze 22 °C, aby przedłużyć stabilność mięśni do testów. Mięśnie powinny odpoczywać w tej kąpieli przez 5 minut przed testami funkcjonalnymi, tak aby temperatura mięśni była zrównoważona do 22 °C.</li>
</ol>
4. Skurcze izometryczne
<ol>
	<li>Ustal supramaksymalne warunki stymulacji. Po umieszczeniu mięśnia w kąpieli użyj pojedynczych impulsów stymulacyjnych o długości 0,5 ms, aby wygenerować drganie i monitorować moc wyjściową. Stopniowo zwiększaj prąd, aż siła osiągnie maksymalny, ale stały poziom. Zwiększ prąd do 10% więcej niż ten poziom dla pozostałych eksperymentów.</li>
	<li>Ustal optymalną długość. Za pomocą izometrycznych stymulacji drgawek stopniowo reguluj długość mięśnia, aż do uzyskania maksymalnej siły. Odpocznij mięsień ~10 sekund między każdym skurczem. Optymalna długość mięśnia (Lo) jest osiągana, gdy siła skurczu jest maksymalna. Rejestruj długość mięśnia (długość między połączeniami mięśniowo-ścięgnistymi w przypadku EDL oraz między centralnym połączeniem mięśniowo-ścięgnistym a przyczepem mięśnia do żebra) za pomocą suwmiarki z noniuszem.</li>
	<li>Maksymalna izometryczna siła tężcowa. Stymulować mięśnie ustawione w Lo przez okres 500 ms, z serią impulsów 0,5 ms przy supramaksymalnej stymulacji i przy częstotliwości fuzji (od plateau zależności częstotliwość-siła (np. Ref: 8). Plateau dla mięśni EDL jest zwykle osiągane przy 120 Hz, a dla mięśni przepony przy 100 Hz. Stymuluj 3 razy z odpowiednią częstotliwością z okresami odpoczynku wynoszącymi 5 minut między atakami stymulacji dla każdego mięśnia.</li>
</ol>
5. Skurcze ekscentryczne
<ol>
	<li>Pozwól mięśniom odpocząć 5 minut między wykonywaniem skurczów izometrycznych i ekscentrycznych.</li>
	<li>Stymuluj mięśnie przy 80 Hz izometrycznie przez początkowe 500 ms, a następnie rozciągaj się o 10% w końcowej stymulacji 200 ms (szybkość rozciągania 0,5 lo / s).</li>
	<li>Powtórz schemat stymulacji z 5-minutowymi przerwami między nimi, aby uzyskać pożądaną liczbę skurczów ekscentrycznych.</li>
	<li>Zmierz siłę dla każdego skurczu w okresie poprzedzającym rozciąganie. Oblicz spadek siły między pierwszym a ostatnim skurczem.</li>
</ol>
6. Usuwanie mięśni z aparatu
<ol>
	<li>Skróć długość mięśnia, aby umożliwić delikatne usunięcie mięśnia z przetwornika i wkładu z powrotem do naczynia preparacyjnego z Ringerem.</li>
	<li>Usuń szwy z mięśni.</li>
	<li>W przypadku mięśnia EDL należy dwukrotnie osuszyć mięsień, a następnie zważyć go przed dalszą obróbką (np. zamrożeniem, utrwaleniem itp.). Będzie to ważne przy obliczaniu pola przekroju poprzecznego i siły właściwej.</li>
	<li>W przypadku mięśnia przepony namocz 0,1% prokion orange, barwnik nieprzepuszczalny dla błony przez 15-20 minut. Zapewni to wskaźnik uszkodzeń preparacji.</li>
	<li>Wypreparuj mięsień z dala od przyczepu kostnego, a także ścięgno centralne. Jest to konieczne, aby zapewnić dokładną wagę mięśnia. Osuszyć jak powyżej przed ważeniem i późniejszym przygotowaniem.</li>
	<li>Obliczać Pole przekroju poprzecznego (CSA): 
	CSA (mm2) = masa (mg) / [(Lo mm) * (L/Lo) * (1,06 mg/mm3)], 
	gdzie L/Lo to stosunek długości włókna do długości mięśni (0,45 dla EDL, 1,0 dla przepony)5, a 1,06 to gęstość mięśnia.</li>
</ol>

<ol><li>Barton, E. R., Khurana, T. S., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+isometric+force+of+isolated+mouse+muscles+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22TREAT-NMD%22%5BJournal%5D)">Measuring isometric force of isolated mouse muscles in vitro.</a> TREAT-NMD. , (2008).</li>
<li>Barton, E. R., Morris, L., Musaro, A., Rosenthal, N., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+I+counters+muscle+decline+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice.</a> J. Cell Biol. 157, 137-148 (2002).</li>
<li>Barton, E. R., Morris, L., Kawana, M., Bish, L. T., Toursel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+L-arginine+benefits+mdx+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of L-arginine benefits mdx skeletal muscle function.</a> Muscle Nerve. 32, 751-760 (2005).</li>
<li>Barton, E. R., Wang, B. J., Brisson, B. K., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaphragm+displays+early+and+progressive+functional+deficits+in+dysferlin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Diaphragm displays early and progressive functional deficits in dysferlin-deficient mice.</a> Muscle Nerve. 42 (1), 22-229 (2010).</li>
<li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young%2C+adult+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J. Physiol. 404, 71-82 (1988).</li>
<li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul. Disord. 17 (1), 47-55 (2007).</li>
<li>Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+power+output+of+fast+and+slow+skeletal+muscles+from+mdx+mice+6-28+months+old%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old.</a> J. Physiol. 535 (Pt. 2), 591-600 (2001).</li>
<li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myo-mechanical+Analysis+of+Isolated+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle.</a> J. Vis. Exp. (48), e2582(2011).</li>
<li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li>
<li>Salomonsson, S., Grundtman, C., Zhang, S. J., Lanner, J. T., Li, C., Katz, A., Wedderburn, L. R., Nagaraju, K., Lundberg, I. E., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+MHC+class+I+in+transgenic+mice+results+in+reduced+force-generating+capacity+in+slow-twitch+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Upregulation of MHC class I in transgenic mice results in reduced force-generating capacity in slow-twitch muscle.</a> Muscle Nerve. 39 (5), 674-6782 (2009).</li>
<li>Stedman, H. H., Sweeney, H. L., Shrager, J. B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mdx+mouse+diaphragm+reproduces+the+degenerative+changes+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature. 352, 536-539 (1991).</li>
<li>Welch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTC124+targets+genetic+disorders+caused+by+nonsense+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.</a> Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).</li>
</ol>

Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu jest sponsorowany przez Aurora Scientific.

Celem tego artykułu jest dostarczenie wskazówek dotyczących wykonywania izolowanych funkcji mięśni na dwóch mięśniach myszy - EDL i przeponie. Ocena tych mięśni może dostarczyć informacji na temat tego, czy kandydaci terapeutyczni na choroby mięśni są korzystne. W przypadku obu mięśni głównym czynnikiem w uzyskaniu solidnych danych jest czysta sekcja. Dlatego przećwiczenie i doskonalenie początkowego etapu izolacji jest niezbędne przed przejściem do testów funkcjonalnych. Ponadto ustalenie funkcjonalnych punktów odniesienia dla prawidłowych mięśni ma kluczowe znaczenie przed dokonaniem porównań z mięśniami dystroficznymi lub między zabiegami. Zapewni to, że wyniki badań nie będą podlegały dużej zmienności wynikającej z umiejętności osoby przeprowadzającej eksperymenty. Zastosowanie barwnika nieprzepuszczalnego dla membrany może pomóc w optymalizacji przygotowania do sekcji, ponieważ inkubacja dowolnego mięśnia w roztworze zawierającym taki barwnik oznaczy większość uszkodzonych włókien i może służyć jako wskaźnik sukcesu sekcji. Zminimalizowanie liczby włókien uszkodzonych w mięśniu pomoże zoptymalizować pomiar. Włókna uszkodzone przez rozwarstwienie fluoryzują znacznie jaśniej niż te uszkodzone przez skurcz ekscentryczny, a więc jeśli barwnik jest również używany podczas procesu mechanicznego, można użyć intensywności barwnika do rozróżnienia tych dwóch rodzajów uszkodzeń.
Rozwarstwienie pasków membrany prawie zawsze spowoduje uszkodzenie włókien, po prostu dlatego, że przecinając wzdłuż włókien, niektóre nieuchronnie ulegają zniszczeniu. Absorpcja barwnika jest silna w tych uszkodzonych włóknach i zwykle ogranicza się do zewnętrznych krawędzi preparatu. Średnio obserwujemy pasmo uszkodzonych włókien o szerokości ~3 włókien (~120 μm) po obu stronach paska mięśniowego. Jeśli uszkodzona opaska obejmuje więcej niż 15% mięśnia, dane są odrzucane. Preparat membrany ma również ograniczenia co do optymalnego rozmiaru dla środków funkcjonalnych. Odkryliśmy, że kawałki przepony szersze niż 5 mm zaczynają się składać, ponieważ centralne wiązanie ścięgna znajduje się tylko w jednym punkcie. Powoduje to zmniejszenie siły właściwej w preparacie. Odkryliśmy również, że węższe paski mają również mniejszą siłę właściwą, co naszym zdaniem wynika z tego, że liczba włókien uszkodzonych podczas preparacji stanowi większą część całkowitej liczby włókien. Na przykład, jeśli 0,1 mm z każdej strony jest uszkodzone, oznacza to, że 5% (pasek 2x0,1 mm / 4 mm) nie przyczynia się do działania siły, podczas gdy jeśli pasek ma tylko 1 mm, to 20% preparatu mięśniowego jest uszkodzone. Tak więc zarówno szerokość uszkodzonego obszaru, jak i szerokość całego preparatu są ważnymi czynnikami, które należy kontrolować.
Pomiary maksymalnego napięcia izometrycznego wymagają stymulacji wszystkich włókien mięśniowych w mięśniu. Ze względu na to, że istnieje ogromna zmienność w elementach składowych aparatu funkcyjnego, musi to być określone dla każdej indywidualnej konfiguracji. Na przykład wielkość wanny lub rodzaj stymulatora mogą wpływać na intensywność stymulacji. Stymulacja drgań jest rozsądnym sposobem na określenie warunków stymulacji supramaksymalnej. Po ustaleniu tego dla konkretnej konfiguracji i mięśni, można go wykorzystać do kolejnych badań.
W przeciwieństwie do tego, optymalna długość danego mięśnia musi być mierzona dla każdego preparatu przy użyciu procesu iteracyjnego opisanego powyżej. Gwarantuje to, że nakładanie się grubych i cienkich włókien jest optymalne i mierzona jest maksymalna zdolność generowania siły potencjalnej. Alternatywne procedury mogą opierać się na wzorcach dyfrakcyjnych związanych z prążkami mięśniowymi, ale wymaga to dodatkowego sprzętu, który nie został tutaj opisany.
Rutynowo stosujemy czas trwania stymulacji wynoszący 500 ms, co mieści się w środkowym zakresie tego parametru używanego przez innych badaczy w tej dziedzinie. Chociaż może to powodować pewne zmęczenie mięśnia podczas skurczu, co jest widoczne w "ugięciu" w produkcji maksymalnej siły, samo w sobie może to być pouczające. Na przykład różnicę w zmęczeniu można osiągnąć za pomocą różnych rodzajów terapii, w tym tych, które są ukierunkowane na obchodzenie się z wapniem, stąd ugięcie obowiązujące podczas aktywnego skurczu może służyć jako wskaźnik poprawy. Alternatywnie, utrata siły może wskazywać, że szwy na ścięgnach nie są wystarczająco napięte i że ślizgają się podczas skurczu. Mięsień musi zostać usunięty z kąpieli, a szwy muszą zostać ponownie zawiązane, jeśli tak się stanie. Stosujemy również serię 3 skurczów tężcowych, co pomaga ocenić stabilność preparatu. Ponownie, zsuwanie się szwów doprowadziłoby do utraty siły między skurczami, co wymagałoby ponownego wiązania szwów. Duże mięśnie mogą również generować niedotlenione rdzenie, co prowadzi do utraty siły podczas protokołu. Wielkość mięśni jest czynnikiem ograniczającym wykonywanie izolowanych testów funkcji mięśni, w których mięśnie EDL o masie większej niż 20 mg tracą siłę przy każdym skurczu i nie mogą być podtrzymywane przez superfuzję w kąpieli. Paski membranowe nie cierpią z powodu tych samych powikłań, ponieważ są wystarczająco cienkie, aby zapewnić przedłużoną żywotność w kąpieli.
Inne mięśnie mogą być wykorzystywane do izolowanych funkcji mięśni, w tym mięsień płaszczkowaty, który jest powszechnie używany, ale nie opisano tutaj. Wiele z tych samych procedur można zastosować w przypadku mięśnia płaszczkowatego w zakresie przygotowania i testów funkcjonalnych. Jednak główne różnice dotyczą częstotliwości stymulacji i parametrów skurczów ekscentrycznych. Wykorzystanie mięśnia płaszczkowatego do funkcji uzupełnia działanie pozostałych dwóch mięśni, dlatego należy je traktować jako część "standardowego pakietu" do oceny myszy dystroficznych 4, 7.
Skurcz ekscentryczny zapewnia wskaźnik kruchości skurczu i ważne jest, aby stosować protokół, który powoduje umiarkowaną utratę siły w mięśniach u zwierząt typu dzikiego i znaczną utratę siły w nieleczonych mięśniach dystroficznych, tak aby istniał szeroki zakres dynamiki do porównań. Brak jakiejkolwiek utraty siły w normalnych mięśniach sugeruje, że skurcz ekscentryczny jest zbyt łagodny i nie będzie wystarczający do odróżnienia terapii, które nie są skuteczne, od tych, które są naprawdę korzystne. Jednak dramatyczna utrata siły w normalnych mięśniach poddanych ekscentrycznemu skurczowi może być zbyt duża, aby wydobyć różnice związane z chorobą. Nasz protokół dla EDL i membrany wykorzystuje szybkość rozciągania 0,5 Lo/s, aby uzyskać 10% zmianę długości. Zazwyczaj wykonujemy 5 skurczów ekscentrycznych, które skutkują niewielką utratą siły w normalnych mięśniach i znaczną utratą siły w mięśniach dystroficznych. Z pewnością wszystkie te parametry można zmieniać, aby zwiększyć ogólną zmianę długości, tempo rozciągania lub liczbę skurczów ekscentrycznych w celu rozróżnienia różnic między chorymi i zdrowymi mięśniami, a także na skutki określonego rodzaju mutacji lub leczenia, które jest badane. Tak długo, jak istnieje wyraźna różnica między normalnymi a chorymi mięśniami, istnieje złoty standard, po który można sięgnąć, jeśli chodzi o leczenie.
Podsumowując, protokół ten ustanawia wytyczne dotyczące wykonywania skurczów izometrycznych i ekscentrycznych i, miejmy nadzieję, identyfikuje potencjalne pułapki, których należy unikać podczas ustawiania tej techniki w laboratorium.

Pomiary funkcji mięśni przyczyniają się do oceny potencjalnych metod leczenia patologii mięśni, jak również do określenia mechanizmów leżących u podstaw fizjologii tej tkanki. W przypadku chorób mięśni wykorzystanie modeli mysich stało się kluczowym elementem zrozumienia powiązań między genotypem a fenotypem oraz rozszerzenia tej wiedzy na projektowanie i testowanie potencjalnych środków terapeutycznych. W szczególności dystrofie mięśniowe polegały na myszach w celu oceny tych czynników i ustalenia danych przedklinicznych wymaganych do przejścia do badań na pacjentach. Częsta miara wyniku wykorzystuje izolowaną funkcję mięśni do określenia siły, co ma zastosowanie w szerokim zakresie badań. Inną miarą jest zastosowanie skurczów ekscentrycznych lub wydłużających się w celu określenia zmian w integralności błony mięśniowej, która jest niewystarczająca w dystrofii mięśniowej Duchenne'a, oraz mysiego modelu tej choroby (mdx). Dlatego ważne jest, aby tego typu pomiary były czułe i powtarzalne.
Mięsień EDL (prostownik palca długiego) myszy był szeroko stosowany do izolowanych funkcji mięśni ze względu na jego idealną geometrię i rozmiar, w tym jednolitą orientację włókien i ostateczne ścięgna 2, 5, 6, 10, 12. Metody izometrycznych pomiarów funkcjonalnych mięśni EDL zostały opisane w poprzedniej publikacji JoVE 8, a także w Treat-NMD SOP 1. Rozszerzyliśmy opis tych metod o skurcze zarówno izometryczne, jak i mimośrodowe. Cechy charakterystyczne choroby są widoczne w EDL, w tym wzmożone cykle zwyrodnienia/regeneracji i zmniejszona moc wyjściowa.
Przepona myszy wykazuje najszybszy patologiczny postęp dystrofii mięśniowej w porównaniu do innych mięśni u myszy 11. W wieku 6 miesięcy skumulowane zwłóknienie obejmuje około 50% mięśnia. Powoduje to znaczne osłabienie siły wyjściowej 11. Dlatego środki terapeutyczne, które mogą zapobiegać infiltracji zwłóknienia, mogą być skutecznie oceniane w przeponie.
Utrata dystrofiny w mięśniach prowadzi do zwiększonej kruchości i zwiększonych uszkodzeń skurczowych we wszystkich mięśniach 9. Dlatego wiele terapii dystrofii mięśniowej Duchenne'a jest ukierunkowanych na zastąpienie dystrofiny. W związku z tym testem, który stał się niezbędny do oceny tych strategii, jest skurcz ekscentryczny, który może rozróżnić mięsień normalny i dystroficzny, a także określić, jakie korzyści ma dana strategia dla ochrony mięśnia dystroficznego przed uszkodzeniem skurczowym 2, 3, 4, 12. Ta procedura wymaga albo serwomotoru dwutrybowego, który może modulować/rejestrować długość i siłę, albo metody szybkiej regulacji długości oddzielonej od przetwornika siły.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; System testowania mięśni</td><td><a href="http://www.aurorascientific.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aurora Scientific</a></td><td>1200A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>źródło światła ACE</td><td>Schott-Fostec</td><td>A20500</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki anatomiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>Krzywe nożyczki preparacyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>alternatywne narzędzie do sekcji</td></tr><tr><td>Zakrzywione ostrza skalpela nr 12</td><td>Fine Science Tools</td><td>10012-00</td><td>alternatywne narzędzie do sekcji</td></tr><tr><td>Nożyce do kości</td><td>Fine Science Tools</td><td>16044-10</td><td></td></tr><tr><td>S&amp;amp;Pęseta do wiązania szwów w kształcie litery T</td><td>Fine Science Tools</td><td>00272-13</td><td></td></tr><tr><td>pinceta Dumont SS - kątowa</td><td>Fine Science Tools</td><td>11203-25</td><td></td></tr><tr><td>Pleciona nici jedwabna rozmiar 6-0</td><td>Teleflex Medical</td><td>07-30-10</td><td></td></tr><tr><td>Taśma medyczna</td><td>Transport</td><td>3M</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy 100 mg/ml</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td>Dawka końcowa wynosi 80 mg/kg</td></tr><tr><td>Wstrzyknięcie TranquiVed (ksylazyna 100 mg/ml)</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-234-11</td><td>Dawka końcowa wynosi 10 mg/kg</td></tr><tr><td>Pomarańczowy reaktywny 14</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-8254</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Składniki roztworu Ringera&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Roztwór jest równoważony gazem z zawartością 95% O2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; oraz 5% CO2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, końcowe pH 7,4</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Stężenie końcowe: 118 mM</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td>Stężenie końcowe: 4,7 mM</td></tr><tr><td>Dwuwodnian chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Stężenie końcowe: 2,5 mM</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednodstawny</td><td>Fisher Scientific</td><td>P-285</td><td>Stężenie końcowe: 1,2 mM</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>J.T. Baker</td><td>2500-01</td><td>Stężenie końcowe: 0,57 mM</td></tr><tr><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy (HEPES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td>Stężenie końcowe: 5,95 g/L</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Stężenie końcowe: 5,5 mM</td></tr></tbody></table>

izometryczna i ekscentryczna ocena generowania sił mięśni szkieletowych wyizolowanych z mysich modeli dystrofii mięśniowych

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Kluczowe dla oceny potencjalnych terapii chorób mięśniowych są czułe i powtarzalne fizjologiczne oceny funkcji mięśni. Ponieważ wiele badań przedklinicznych opiera się na mysich modelach tych chorób, izolowana funkcja mięśni stała się jednym ze standardów przy podejmowaniu decyzji o Go/NoGo w przekazywaniu kandydatów na leki pacjentom. Zademonstrujemy przygotowanie mięśni prostownika długiego palca (EDL) i przepony do testów funkcjonalnych, które są dominującymi mięśniami wykorzystywanymi w tych badaniach. Geometria mięśni EDL jest idealna do izolowanych preparatów mięśniowych, z dwoma łatwo dostępnymi ścięgnami i niewielkimi rozmiarami, które można wspomóc superfuzją w kąpieli. Przepona wykazuje głęboką postępującą patologię u zwierząt dystroficznych i może służyć jako platforma do oceny wielu potencjalnych terapii przeciwdziałających zwłóknieniu i promujących stabilność włókien mięśniowych. Pokazane zostaną protokoły rutynowych testów, w tym skurcze izometryczne i mimośrodowe. Siła izometryczna zapewnia ocenę siły, a skurcze ekscentryczne pomagają ocenić stabilność sarkolemmy, która jest zaburzona w wielu typach dystrofii mięśniowych. Przedstawione zostaną również porównania oczekiwanych wyników między mięśniami z mięśni typu dzikiego a mięśniami dystroficznymi. Pomiary te mogą uzupełniać morfologiczne i biochemiczne pomiary homeostazy tkanek, a także oceny funkcji mięśni na całych zwierzętach.

Oczekiwane wartości sił izometrycznych mięśni EDL zwierząt w wieku 12 tygodni przedstawiono na Rysunku 1. Ponieważ mięśnie mdx wykazują hipertrofię kompensacyjną, całkowita siła tetaniczna może być wyższa w mięśniu mdx w porównaniu z grupą kontrolną typu dzikiego w tym samym wieku. Bardziej odpowiednim miernikiem wydajności funkcjonalnej jest jednak siła specyficzna (Rysunek 2), gdzie w celu obliczenia tej wartości siłę normalizuje się względem pola przekroju poprzecznego. Siła specyficzna zależy od wrodzonej zdolności funkcjonalnej mięśnia, przy czym osłabienie mięśni dystroficznych jest bardziej widoczne, gdy uwzględni się zarówno siłę absolutną, jak i pole przekroju poprzecznego. W naszych badaniach mięśnie EDL myszy mdx generują siły specyficzne o około 20 - 25% niższe niż mięśnie myszy typu dzikiego w tym samym wieku (od 10 do 26 tygodnia życia).
W przypadku przepony do porównań istotna jest wyłącznie siła specyficzna, ponieważ preparat stanowi fragment mięśnia zależny od przeprowadzonej sekcji. Porównanie siły specyficznej między przeponą typu dzikiego a przeponą myszy mdx odzwierciedla postępującą patologię w tej tkance. Izometryczna siła skurczu maleje wraz z wiekiem (Rysunek 3), tak że w wieku 6 miesięcy mięśnie przepony myszy mdx generują nie więcej niż połowę wydajności funkcjonalnej pasków przepony od dopasowanych wiekowo kontroli typu dzikiego.
Przykład skurczów ekscentrycznych podczas badania przepony przedstawiono na Rysunku 4. Przy każdym kolejnym skurczu ekscentrycznym siła skurczu maleje w paskach przepony zarówno u myszy typu dzikiego (C57), jak i myszy mdx. Jednak utrata siły jest bardziej gwałtowna w próbkach mięśni myszy mdx, co prawdopodobnie wynika z braku dystrofiny i powiązanych z nią białek.
<img alt="Wykres siły w funkcji czasu; porównanie skurczu mięśni C57 i mdx; średnia siła; wykres analizy danych" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
 Rysunek 1. Izometryczna siła tężcowa w mięśniach EDL myszy szczepu dzikiego oraz mdx w wieku 12 tygodni. Siła bezwzględna może być wyższa w mięśniach EDL mdx w tym samym wieku ze względu na hipertrofię kompensacyjną.
<img alt="Wykres równowagi statycznej; pokazuje zależność siły specyficznej (Sp Force) od czasu, porównując wyniki skurczu mięśni myszy C57 i mdx." src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Izometryczna siła tężcowa znormalizowana przez pole przekroju poprzecznego mięśnia to siła specyficzna, która wykazuje obniżoną wydajność funkcjonalną mięśni EDL myszy mdx w porównaniu z myszami typu dzikiego. Przebiegi pochodzą od tych samych myszy, co na Rysunku 1.
<img alt="Wykres słupkowy siły specyficznej w funkcji tygodni wieku; badanie spadku siły mięśniowej związanej z wiekiem." src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Postępująca utrata zdolności generowania siły, oceniana za pomocą siły specyficznej, jest najbardziej widoczna w przeponie myszy mdx (czerwone słupki) w porównaniu z typem dzikim (C57 na niebieskiej linii).
<img alt="Spadek siły mięśni w grupie C57 vs mdx; wykres; względna siła vs liczba skurczów ekscentrycznych; analiza porównawcza." src="/files/ftp_upload/50036/50036fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
 Rysunek 4. Utrata siły w funkcji liczby skurczów ekscentrycznych dla mięśni przepony u 12-tygodniowych myszy C57 i mdx. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM dla N=4 mięśni na genotyp.

Pomiary funkcji mięśni przyczyniają się do oceny potencjalnych metod leczenia patologii mięśni, jak również do określenia mechanizmów leżących u podstaw fizjologii tej tkanki. Zademonstrujemy przygotowanie mięśni prostownika długiego palca i przepony do testów funkcjonalnych. Pokazane zostaną protokoły skurczów izometrycznych i ekscentrycznych, a także różnice w wynikach między mięśniami dystroficznymi, reprezentującymi stan patologiczny, a mięśniami typu dzikiego.

Izometryczna i ekscentryczna ocena generowania sił mięśni szkieletowych wyizolowanych z mysich modeli dystrofii mięśniowych

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar właściwości mechanicznych mięśni szkieletowych wyizolowanych od myszy. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie mięśnia prostownika długiego palca lub mięśnia EDL, a także mięśnia przepony zwierzęcia. Po przygotowaniu paska przepony przypnij EDL i pasek membrany do naczynia z natlenionym roztworem pierścienia, a następnie przywiąż pętle do szwów na obu końcach mięśni.Następnie EDL lub pasek membranowy jest mocowany w kąpieli narządowej między dwiema elektrodami przymocowanymi do przetwornika siły lub dźwigni na jednym końcu i dostosowywany do optymalnej długości w oparciu o siłę skurczu. Ostatnim krokiem jest stymulacja mięśnia za pomocą szeregu protokołów mechanicznych i pomiar produkcji siły. Ostatecznie obliczenia produkcji siły, odporności na uszkodzenia, siły, częstotliwości, zależności i innych właściwości są wykorzystywane do pokazania siły i integralności oraz innych właściwości mięśnia, a także, w stosownych przypadkach, skutków leczenia lub modyfikacji genetycznej.Technika ta może być wykorzystana do przetestowania potencjalnych terapii dystrofii mięśniowych, ponieważ większość z tych terapii ma na celu odzyskanie siły mięśni i zmniejszenie ich kruchości. Chociaż nie jesteśmy pierwszymi, którzy wykorzystują tę technikę, rutynowo używamy jej do badania wielu różnych modeli myszy i oceny funkcji ich mięśni, a także do charakteryzowania i oceny wielu terapii dystrofii mięśniowych. Oprócz dr Catherine Morewood, zademonstrujemy tę procedurę na przykładzie dwóch członków naszego rdzenia oceny fizjologicznej, dr Min Liu, pracownika naukowego i pana Iana, specjalisty ds. badań.Myszy użyte w tej procedurze są znieczulane za pomocą ketaminy i ksylazyny, aby upewnić się, że nie odczuwają bólu ani niepokoju, ale mięśnie pozostają dobrze dotlenione przez krążenie. Po potwierdzeniu przez uszczypnięcie palca u nogi, że zwierzę jest wystarczająco znieczulone, unieruchomij jego wysokie kończyny za pomocą taśmy medycznej i usuń skórę dolnej przedniej kończyny tylnej, aby odsłonić mięśnie tego obszaru, utrzymuj mięśnie wilgotne za pomocą PBS w regularnych odstępach czasu. Pod lunetą sekcyjną wykonaj małe nacięcie boczne do kolana, aby odsłonić ścięgno proksymalne prostownika długiego palca lub mięśnia EDL.W tym obszarze znajdują się dwa ścięgna i oba powinny zostać przecięte, aby umożliwić usunięcie EDL w kostce przyśrodkowej. Przetnij ścięgno mięśnia piszczelowego przedniego lub TA, aby odsłonić dystalne ścięgna EDL, które rozciągają się wzdłuż kości śródstopia. Podnieś mięsień TA z drogi.Uważaj, aby nie przeciąć ani nie dotknąć EDL pod spodem. Wróć do dystalnych ścięgien EDL i odetnij każde z nich. Następnie chwyć ścięgna i delikatnie odciągnij EDL od reszty kończyny.Powinien swobodnie uwalniać się od bliższego końca. Usuń mięsień EDL i umieść w naczyniu preparacyjnym wypełnionym schłodzonymi, natlenionymi wyżymaczkami. Przypnij mięsień przez ścięgna na mniej więcej długości spoczynkowej, która jest długością występującą in vivo.Długość jest zbyt krótka, gdy mięsień jest zwinięty w naczyniu i zbyt długa, jeśli mięsień ciągnie za szpilki preparacyjne. Przywiąż szwy do ścięgien jak najbliżej mięśnia, ale nie dotykając mięśnia. Przypnij mięsień na mniej więcej długości spoczynkowej za pomocą szwów.Aby rozpocząć tę procedurę. Wykonaj nacięcie w skórze zwierzęcia poddanego eutanazji. Do odsłaniania jamy brzusznej i klatki piersiowej.Otwórz jamę brzuszną i przetnij ścianę ciała tuż pod żebrami za pomocą nożyczek do kości i zaczynając od wprowadzenia przepony. Przeciąć wokół całej klatki piersiowej zgodnie z linią żeber i przeciąć kręgosłup. Przeciąć naczynia krwionośne biegnące przez środek przepony, aby można było łatwo usunąć przeponę.Zdejmij membranę z myszy i umieść w naczyniu preparacyjnym wypełnionym natlenionymi dzwonkami. Delikatnie porusz membranę w naczyniu, aby zmyć krew. W razie potrzeby odśwież rozwiązanie dzwonka.Następnie wytnij mały pasek przepony od środkowego ścięgna do żeber wzdłuż orientacji włókien w środkowej części bocznych przepony hemi. Pasek powinien mieć szerokość od dwóch do czterech milimetrów. Przywiąż szwy do ścięgna centralnego, przywiąż szwy do każdego z bocznie wystających końców żeber, a następnie zwiąż je ze sobą, aby utworzyć dużą pętlę za pomocą nożyczek do kości.Wytnij żebro po obu stronach paska, pozostawiając około jednego do dwóch milimetrów, zwis żebra po obu stronach membrany. Ocena generowania siły paskowej izolowanych mięśni szkieletowych jest wykonywana za pomocą systemu do badania mięśni in vitro w celu zamontowania mięśni w kąpieli mechanicznej, uchwycenia szwów i użycia ich do przymocowania mięśnia do sztywnego słupka na jednym końcu i do przetwornika siły na drugim końcu. Dobrym przybliżeniem jest długość mięśni w spoczynku.Jak pokazano wcześniej, kąpiel jest wypełniona natleniznym roztworem dzwonka utrzymywanym w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Aby przedłużyć stabilność mięśni do testu, mięśnie powinny odpoczywać przez pięć minut w tej kąpieli przed testami funkcjonalnymi, tak aby temperatura mięśni była równa 22 stopnie Celsjusza, aby ustalić ponadmaksymalne warunki stymulacji. Po umieszczeniu mięśnia w kąpieli użyj pojedynczych 0,5 milisekundowych impulsów stymulacyjnych, aby wygenerować drgawki i monitorować siłę wyjściową.Stopniowo zwiększaj prąd, aż siła osiągnie maksymalny, ale stały poziom, zwiększ prąd do 10% więcej niż ten poziom dla pozostałych eksperymentów, aby ustalić optymalną długość, najpierw upewnij się, że mięsień nie jest luźny, ale też nie nauczony. Dobrym przybliżeniem jest długość mięśnia spoczynkowego, jak pokazano wcześniej. Za pomocą izometrycznych stymulacji drgawkowych stopniowo dostosowuj długość mięśnia, aż do uzyskania maksymalnej siły.Odpocznij mięsień około 10 sekund między każdym skurczem. Optymalna długość mięśni jest osiągana, gdy siła skurczu jest maksymalna Zapisz długość mięśnia za pomocą suwmiarki z noniuszem. W przypadku EDL jest to długość między połączeniami ścięgnistymi mięśni.W przypadku przepony jest to długość między centralnym połączeniem ścięgnistym mięśnia ścięgnistym a przyczepem mięśnia do żebra. Aby określić maksymalną izometryczną siłę Titanica, stymuluj mięśnie ustawione na optymalnej długości mięśni przez okres 500 milisekund za pomocą serii impulsów 0,5 milisekundy przy super maksymalnej stymulacji i przy częstotliwości fuzji. Plateau dla mięśni EDL jest zwykle osiągane przy 120 Hz, a dla mięśni przepony o częstotliwości 100 Hz stymuluje się trzy razy z odpowiednią częstotliwością z pięciominutowymi przerwami między atakami stymulacji dla każdego mięśnia po pięciominutowym odpoczynku.Po wykonaniu skurczów izometrycznych rozpocznij procedurę skurczów ekscentrycznych. Stymuluj mięśnie przy 80 Hz izometrycznie przez początkowe 500 milisekund, a następnie 10% optymalne rozciągnięcie długości mięśni w końcowej stymulacji 200 milisekund. Powtórz wzorzec stymulacji z pięciominutowymi przerwami pomiędzy nimi.Aby uzyskać żądaną liczbę skurczów ekscentrycznych, zmierz siłę dla każdego skurczu w okresie poprzedzającym rozciąganie. Obliczyć spadek siły między pierwszym a ostatnim skurczem po zakończeniu testu funkcjonalnego. Skróć długość mięśnia i delikatnie usuń mięsień z przetwornika i słupka.Umieść mięsień z powrotem w naczyniu preparacyjnym z dzwonkami. Usunąć szwy z mięśni dla mięśnia EDL. Zablokuj mięsień dwukrotnie, a następnie zważ go przed dalszą obróbką.Będzie to ważne przy obliczaniu pola przekroju poprzecznego i siły właściwej dla mięśnia przepony moczyć się w 0,1% plusów i pomarańczowym, membranie i przepuszczalnym barwniku przez 15 do 20 minut. Zapewni to wskaźnik uszkodzenia przepony, odetnie mięsień przepony od przyczepu kostnego, a także ścięgna centralnego. Jest to konieczne, aby zapewnić dokładną wagę mięśnia przed ważeniem i późniejszym przygotowaniem.Pole przekroju poprzecznego lub CSA oblicza się przy użyciu następującego wzoru, gdzie L nad LO to stosunek długości włókien do mięśni, a 1,06 to gęstość mięśni oczekiwane wartości sił izometrycznych u dzikich typów C 57 i dystrofii mięśniowej lub mięśni M-D-X-E-D-L od 12-tygodniowych zwierząt pokazano na tym rysunku. Ponieważ mięśnie MDX wykazują kompensacyjną hipertrofię, całkowita siła do tytanicznej może być wyższa w mięśniach MDX w porównaniu z grupą kontrolną typu dzikiego dopasowaną do wieku. Bardziej odpowiednią miarą funkcjonalnej mocy wyjściowej jest siła właściwa, w której siła jest znormalizowana dla pola przekroju poprzecznego.Aby obliczyć tę wartość, siła właściwa zależy od wrodzonej zdolności funkcjonalnej mięśnia, przy czym osłabienie mięśni dystroficznych jest bardziej widoczne, gdy weźmie się pod uwagę zarówno siłę bezwzględną, jak i pole przekroju poprzecznego. W tym badaniu zaobserwowano, że mięśnie EDL myszy MDX generują około 20 do 25% niższych sił właściwych niż u myszy typu dzikiego w wieku od 10 do 26 tygodni. W przypadku przepony do porównań ma znaczenie tylko siła właściwa, ponieważ preparat jest fragmentem mięśnia zależnym od rozwarstwienia.Porównanie siły właściwej między mięśniem typu dzikiego C 57 oznaczonym niebieską linią a mięśniem przepony MDX oznaczonym czerwonymi paskami odzwierciedla postępującą patologię w tej tkance. Moc wyjściowa siły izometrycznej zmniejsza się wraz z wiekiem, tak że w wieku sześciu miesięcy mięśnie przepony myszy MDX wytwarzają nie więcej niż połowę funkcjonalnej mocy wyjściowej pasków przepony z dopasowanych wiekowo kontroli typu dzikiego. Przykład skurczów mimośrodowych z badania przepony pokazano na tym rysunku.Z każdym kolejnym mimośrodowym wyjściem siły skurczu zmniejsza się w paskach przepony zarówno u dzikich myszy typu C 57 pokazanych na niebiesko, jak i myszy MDX pokazanych na czerwono. Jednak utrata siły jest bardziej dramatyczna w próbkach mięśni myszy MDX, prawdopodobnie z powodu braku dystrofiny i powiązanych z nią białek po opanowaniu. Technikę tę można wykonać w ciągu około godziny dla pojedynczego mięśnia, jeśli jest wykonywana prawidłowo zgodnie z tą techniką.Inne metody, takie jak western blotting lub inne pomiary biochemiczne, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy leczenie zmieniło poziom białka lub znormalizowało integralność mięśni. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozciąć EDL i membranę od myszy oraz jak mierzyć i analizować wytwarzanie siły przed i po skurczach ekscentrycznych.

isometric-eccentric-force-generation-assessment-skeletal-muscles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena wytwarzania siły izoometrycznej i mimośrodowej przez mięśnie szkieletowe izolowane z mysich modeli dystrofii mięśniowych

Aby ocenić efekty in vivo interwencji terapeutycznych w chorobach mięśni, konieczne są metody ilościowego pomiaru generowanej siły oraz podatności na zmęczenie w leczonych mięśniach. Szczegółowo opisujemy podejście do oceny właściwości miomechanicznych w wyizolowanym mięśniu kończyny tylnej myszy. Analiza ta stanowi solidną metodę ilościowego określania wpływu modyfikacji genetycznej na funkcję mięśni, a także porównywania terapii w modelach mysich chorób mięśni.

Analiza miomechaniczna wyizolowanego mięśnia szkieletowego

Opisujemy małoinwazyjną i bezbolesną metodę pomiaru siły mięśni kończyn tylnych u psów oraz reakcji mięśni na powtarzające się skurcze ekscentryczne.

Test funkcji mięśni psów in vivo

Opisano mysi model przezskórnej elektrycznej stymulacji nerwowo-mięśniowej (NMES), bezpiecznej i niedrogiej metody klinicznej, zastosowany do mięśni przedziału przedniego. Model ten ma tę zaletę, że wykorzystuje zmodyfikowane, powszechnie dostępne urządzenie kliniczne w celu wywołania ukierunkowanych i specyficznych skurczów mięśni u myszy.

Mysi model treningu mięśniowego za pomocą neuromuskularnej stymulacji elektrycznej

Opisujemy metodę bezpośredniego pomiaru siły mięśniowej, mocy mięśniowej, kinetyki skurczu oraz podatności na zmęczenie izolowanych mięśni szkieletowych w układzie in vitro z wykorzystaniem stymulacji polowej. Dzięki zastosowaniu różnych protokołów stymulacji można uzyskać cenne informacje na temat właściwości gospodarki Ca2+ oraz mechanizmu skurczowego mięśnia.

Ex Vivo ocena kurczliwości, męczliwości i alternansu w izolowanych mięśniach szkieletowych

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Zmiany w kurczliwości mięśni kończyn i pasywnych właściwościach mechanicznych są ważnymi biomarkerami chorób mięśni.  W tym manuskrypcie opisano testy fizjologiczne do pomiaru tych właściwości w mysich mięśniach prostownika długiego palca długiego i piszczelowych przednich.

Ocena funkcji mięśni mięśnia prostownika długiego mięśnia ex vivo i mięśnia piszczelowego przedniego in situ u myszy

Podstawową miarą wyników w badaniach klinicznych dotyczących zaburzeń nerwowo-mięśniowych jest ogólna poprawa funkcji mięśni. Dlatego ocena wpływu potencjalnych związków terapeutycznych na wydajność mięśni przed klinicznym badaniem w modelach mysich ma ogromne znaczenie. Poniżej opisujemy kilka testów funkcjonalnych, aby rozwiązać ten problem.

Ocena wydajności funkcjonalnej w modelu myszy Mdx

Pomiar funkcji kurczliwości mięśni szkieletowych gryzoni jest użytecznym narzędziem, które może być używane do śledzenia postępu choroby, jak również skuteczności interwencji terapeutycznej. Opisujemy tutaj nieinwazyjną ocenę in vivo mięśni zginaczy grzbietowych, która może być powtarzana w czasie u tej samej myszy.

Nieinwazyjna ocena funkcji mięśni zginacza grzbietowego u myszy

Prezentowany tutaj jest protokół do oceny właściwości kurczliwych miofibryli mięśni prążkowanych z rozdzielczością nano-Newtona. Protokół wykorzystuje konfigurację z opartą na interferometrii sondą siły optycznej. Taka konfiguracja generuje dane o wysokim stosunku sygnału do szumu i umożliwia ocenę kinetyki kurczliwości miofibryli.

Izolowanie miofibryli z biopsji mięśni szkieletowych i określanie funkcji skurczu za pomocą przetwornika siły o rozdzielczości nano-Newtona

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

Funkcja mięśni szkieletowych może być oceniana poprzez ilościowe określenie kurczliwości izolowanych włókien mięśniowych, tradycyjnie przy użyciu pracochłonnych, niskoprzepustowych metod. W tym miejscu opisujemy opartą na optyce, wysokoprzepustową metodę ilościowego określania kurczliwości włókien mięśniowych osadzonych w hydrożelu. Podejście to ma zastosowanie w badaniach przesiewowych leków i opracowywaniu terapii.

Wysokoprzepustowe pomiary kurczliwości nienaruszonych włókien mięśniowych myszy zanurzonych w hydrożelu przy użyciu systemu opartego na optyce

Poznaj metodę oceny siły mięśni szkieletowych myszy z dystrofią mięśniową poprzez izometryczne i ekscentryczne skurcze. Technika ta pozwala porównać funkcję mięśni zdrowych i chorych.

Izometryczna i ekscentryczna ocena generowania sił mięśni szkieletowych wyizolowanych z mysich modeli dystrofii mięśniowych

Przeglądaj więcej filmów