Izometryczna i ekscentryczna ocena generowania sił mięśni szkieletowych wyizolowanych z mysich modeli dystrofii mięśniowych

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar właściwości mechanicznych mięśni szkieletowych wyizolowanych od myszy. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie mięśnia prostownika długiego palca lub mięśnia EDL, a także mięśnia przepony zwierzęcia. Po przygotowaniu paska przepony przypnij EDL i pasek membrany do naczynia z natlenionym roztworem pierścienia, a następnie przywiąż pętle do szwów na obu końcach mięśni.

Następnie EDL lub pasek membranowy jest mocowany w kąpieli narządowej między dwiema elektrodami przymocowanymi do przetwornika siły lub dźwigni na jednym końcu i dostosowywany do optymalnej długości w oparciu o siłę skurczu. Ostatnim krokiem jest stymulacja mięśnia za pomocą szeregu protokołów mechanicznych i pomiar produkcji siły. Ostatecznie obliczenia produkcji siły, odporności na uszkodzenia, siły, częstotliwości, zależności i innych właściwości są wykorzystywane do pokazania siły i integralności oraz innych właściwości mięśnia, a także, w stosownych przypadkach, skutków leczenia lub modyfikacji genetycznej.

Technika ta może być wykorzystana do przetestowania potencjalnych terapii dystrofii mięśniowych, ponieważ większość z tych terapii ma na celu odzyskanie siły mięśni i zmniejszenie ich kruchości. Chociaż nie jesteśmy pierwszymi, którzy wykorzystują tę technikę, rutynowo używamy jej do badania wielu różnych modeli myszy i oceny funkcji ich mięśni, a także do charakteryzowania i oceny wielu terapii dystrofii mięśniowych. Oprócz dr Catherine Morewood, zademonstrujemy tę procedurę na przykładzie dwóch członków naszego rdzenia oceny fizjologicznej, dr Min Liu, pracownika naukowego i pana Iana, specjalisty ds. badań.

Myszy użyte w tej procedurze są znieczulane za pomocą ketaminy i ksylazyny, aby upewnić się, że nie odczuwają bólu ani niepokoju, ale mięśnie pozostają dobrze dotlenione przez krążenie. Po potwierdzeniu przez uszczypnięcie palca u nogi, że zwierzę jest wystarczająco znieczulone, unieruchomij jego wysokie kończyny za pomocą taśmy medycznej i usuń skórę dolnej przedniej kończyny tylnej, aby odsłonić mięśnie tego obszaru, utrzymuj mięśnie wilgotne za pomocą PBS w regularnych odstępach czasu. Pod lunetą sekcyjną wykonaj małe nacięcie boczne do kolana, aby odsłonić ścięgno proksymalne prostownika długiego palca lub mięśnia EDL.

W tym obszarze znajdują się dwa ścięgna i oba powinny zostać przecięte, aby umożliwić usunięcie EDL w kostce przyśrodkowej. Przetnij ścięgno mięśnia piszczelowego przedniego lub TA, aby odsłonić dystalne ścięgna EDL, które rozciągają się wzdłuż kości śródstopia. Podnieś mięsień TA z drogi.

Uważaj, aby nie przeciąć ani nie dotknąć EDL pod spodem. Wróć do dystalnych ścięgien EDL i odetnij każde z nich. Następnie chwyć ścięgna i delikatnie odciągnij EDL od reszty kończyny.

Powinien swobodnie uwalniać się od bliższego końca. Usuń mięsień EDL i umieść w naczyniu preparacyjnym wypełnionym schłodzonymi, natlenionymi wyżymaczkami. Przypnij mięsień przez ścięgna na mniej więcej długości spoczynkowej, która jest długością występującą in vivo.

Długość jest zbyt krótka, gdy mięsień jest zwinięty w naczyniu i zbyt długa, jeśli mięsień ciągnie za szpilki preparacyjne. Przywiąż szwy do ścięgien jak najbliżej mięśnia, ale nie dotykając mięśnia. Przypnij mięsień na mniej więcej długości spoczynkowej za pomocą szwów.

Aby rozpocząć tę procedurę. Wykonaj nacięcie w skórze zwierzęcia poddanego eutanazji. Do odsłaniania jamy brzusznej i klatki piersiowej.

Otwórz jamę brzuszną i przetnij ścianę ciała tuż pod żebrami za pomocą nożyczek do kości i zaczynając od wprowadzenia przepony. Przeciąć wokół całej klatki piersiowej zgodnie z linią żeber i przeciąć kręgosłup. Przeciąć naczynia krwionośne biegnące przez środek przepony, aby można było łatwo usunąć przeponę.

Zdejmij membranę z myszy i umieść w naczyniu preparacyjnym wypełnionym natlenionymi dzwonkami. Delikatnie porusz membranę w naczyniu, aby zmyć krew. W razie potrzeby odśwież rozwiązanie dzwonka.

Następnie wytnij mały pasek przepony od środkowego ścięgna do żeber wzdłuż orientacji włókien w środkowej części bocznych przepony hemi. Pasek powinien mieć szerokość od dwóch do czterech milimetrów. Przywiąż szwy do ścięgna centralnego, przywiąż szwy do każdego z bocznie wystających końców żeber, a następnie zwiąż je ze sobą, aby utworzyć dużą pętlę za pomocą nożyczek do kości.

Wytnij żebro po obu stronach paska, pozostawiając około jednego do dwóch milimetrów, zwis żebra po obu stronach membrany. Ocena generowania siły paskowej izolowanych mięśni szkieletowych jest wykonywana za pomocą systemu do badania mięśni in vitro w celu zamontowania mięśni w kąpieli mechanicznej, uchwycenia szwów i użycia ich do przymocowania mięśnia do sztywnego słupka na jednym końcu i do przetwornika siły na drugim końcu. Dobrym przybliżeniem jest długość mięśni w spoczynku.

Jak pokazano wcześniej, kąpiel jest wypełniona natleniznym roztworem dzwonka utrzymywanym w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Aby przedłużyć stabilność mięśni do testu, mięśnie powinny odpoczywać przez pięć minut w tej kąpieli przed testami funkcjonalnymi, tak aby temperatura mięśni była równa 22 stopnie Celsjusza, aby ustalić ponadmaksymalne warunki stymulacji. Po umieszczeniu mięśnia w kąpieli użyj pojedynczych 0,5 milisekundowych impulsów stymulacyjnych, aby wygenerować drgawki i monitorować siłę wyjściową.

Stopniowo zwiększaj prąd, aż siła osiągnie maksymalny, ale stały poziom, zwiększ prąd do 10% więcej niż ten poziom dla pozostałych eksperymentów, aby ustalić optymalną długość, najpierw upewnij się, że mięsień nie jest luźny, ale też nie nauczony. Dobrym przybliżeniem jest długość mięśnia spoczynkowego, jak pokazano wcześniej. Za pomocą izometrycznych stymulacji drgawkowych stopniowo dostosowuj długość mięśnia, aż do uzyskania maksymalnej siły.

Odpocznij mięsień około 10 sekund między każdym skurczem. Optymalna długość mięśni jest osiągana, gdy siła skurczu jest maksymalna Zapisz długość mięśnia za pomocą suwmiarki z noniuszem. W przypadku EDL jest to długość między połączeniami ścięgnistymi mięśni

W przypadku przepony jest to długość między centralnym połączeniem ścięgnistym mięśnia ścięgnistym a przyczepem mięśnia do żebra. Aby określić maksymalną izometryczną siłę Titanica, stymuluj mięśnie ustawione na optymalnej długości mięśni przez okres 500 milisekund za pomocą serii impulsów 0,5 milisekundy przy super maksymalnej stymulacji i przy częstotliwości fuzji. Plateau dla mięśni EDL jest zwykle osiągane przy 120 Hz, a dla mięśni przepony o częstotliwości 100 Hz stymuluje się trzy razy z odpowiednią częstotliwością z pięciominutowymi przerwami między atakami stymulacji dla każdego mięśnia po pięciominutowym odpoczynku.

Po wykonaniu skurczów izometrycznych rozpocznij procedurę skurczów ekscentrycznych. Stymuluj mięśnie przy 80 Hz izometrycznie przez początkowe 500 milisekund, a następnie 10% optymalne rozciągnięcie długości mięśni w końcowej stymulacji 200 milisekund. Powtórz wzorzec stymulacji z pięciominutowymi przerwami pomiędzy nimi.

Aby uzyskać żądaną liczbę skurczów ekscentrycznych, zmierz siłę dla każdego skurczu w okresie poprzedzającym rozciąganie. Obliczyć spadek siły między pierwszym a ostatnim skurczem po zakończeniu testu funkcjonalnego. Skróć długość mięśnia i delikatnie usuń mięsień z przetwornika i słupka.

Umieść mięsień z powrotem w naczyniu preparacyjnym z dzwonkami. Usunąć szwy z mięśni dla mięśnia EDL. Zablokuj mięsień dwukrotnie, a następnie zważ go przed dalszą obróbką.

Będzie to ważne przy obliczaniu pola przekroju poprzecznego i siły właściwej dla mięśnia przepony moczyć się w 0,1% plusów i pomarańczowym, membranie i przepuszczalnym barwniku przez 15 do 20 minut. Zapewni to wskaźnik uszkodzenia przepony, odetnie mięsień przepony od przyczepu kostnego, a także ścięgna centralnego. Jest to konieczne, aby zapewnić dokładną wagę mięśnia przed ważeniem i późniejszym przygotowaniem.

Pole przekroju poprzecznego lub CSA oblicza się przy użyciu następującego wzoru, gdzie L nad LO to stosunek długości włókien do mięśni, a 1,06 to gęstość mięśni oczekiwane wartości sił izometrycznych u dzikich typów C 57 i dystrofii mięśniowej lub mięśni M-D-X-E-D-L od 12-tygodniowych zwierząt pokazano na tym rysunku. Ponieważ mięśnie MDX wykazują kompensacyjną hipertrofię, całkowita siła do tytanicznej może być wyższa w mięśniach MDX w porównaniu z grupą kontrolną typu dzikiego dopasowaną do wieku. Bardziej odpowiednią miarą funkcjonalnej mocy wyjściowej jest siła właściwa, w której siła jest znormalizowana dla pola przekroju poprzecznego.

Aby obliczyć tę wartość, siła właściwa zależy od wrodzonej zdolności funkcjonalnej mięśnia, przy czym osłabienie mięśni dystroficznych jest bardziej widoczne, gdy weźmie się pod uwagę zarówno siłę bezwzględną, jak i pole przekroju poprzecznego. W tym badaniu zaobserwowano, że mięśnie EDL myszy MDX generują około 20 do 25% niższych sił właściwych niż u myszy typu dzikiego w wieku od 10 do 26 tygodni. W przypadku przepony do porównań ma znaczenie tylko siła właściwa, ponieważ preparat jest fragmentem mięśnia zależnym od rozwarstwienia.

Porównanie siły właściwej między mięśniem typu dzikiego C 57 oznaczonym niebieską linią a mięśniem przepony MDX oznaczonym czerwonymi paskami odzwierciedla postępującą patologię w tej tkance. Moc wyjściowa siły izometrycznej zmniejsza się wraz z wiekiem, tak że w wieku sześciu miesięcy mięśnie przepony myszy MDX wytwarzają nie więcej niż połowę funkcjonalnej mocy wyjściowej pasków przepony z dopasowanych wiekowo kontroli typu dzikiego. Przykład skurczów mimośrodowych z badania przepony pokazano na tym rysunku.

Z każdym kolejnym mimośrodowym wyjściem siły skurczu zmniejsza się w paskach przepony zarówno u dzikich myszy typu C 57 pokazanych na niebiesko, jak i myszy MDX pokazanych na czerwono. Jednak utrata siły jest bardziej dramatyczna w próbkach mięśni myszy MDX, prawdopodobnie z powodu braku dystrofiny i powiązanych z nią białek po opanowaniu. Technikę tę można wykonać w ciągu około godziny dla pojedynczego mięśnia, jeśli jest wykonywana prawidłowo zgodnie z tą techniką.

Inne metody, takie jak western blotting lub inne pomiary biochemiczne, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy leczenie zmieniło poziom białka lub znormalizowało integralność mięśni. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozciąć EDL i membranę od myszy oraz jak mierzyć i analizować wytwarzanie siły przed i po skurczach ekscentrycznych.