Znormalizowana metoda analizy sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby i ich fenestracji za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza śródbłonka zatok wątrobowych. Osiąga się to najpierw poprzez wyizolowanie wątroby i jej perfuzję utrwalaczem. Następnie wątrobę tnie się na bloki i odwadnia w celu przygotowania do mikroskopii elektronowej.

Następnie próbki wątroby poddaje się napylaniu i bada pod mikroskopem elektronowym. Na koniec analizuje się mikrografie elektronowe, obliczając średnicę i częstotliwość występowania fenestracji oraz procentową porowatość. Ostatecznie mikroskopia elektronowa służy do wykazania zmian w śródbłonku zatok wątrobowych w różnych warunkach.

Metoda ta pozwala na poznanie ultrastruktury i morfologii naczyń krwionośnych wątroby w obrębie ich śródbłonka. Może być ona również stosowana w analogiczny sposób do badania nerek i mózgu. Wszystkie procedury z wykorzystaniem zwierząt są przeprowadzane zgodnie z lokalnym prawodawstwem. Praca ta została zatwierdzona przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt Sydney Local Health District.

Dopuszczalne procedury są opisane w dokumentacji licencyjnej projektu i są zgodne z wytycznymi zapewniającymi stałą opiekę nad dobrostanem zwierząt. Jest to zabieg nieprzeżywalny. Po przygotowaniu utrwalacza zgodnie z protokołem tekstowym, należy podgrzać bufor perfuzyjny i utrwalacz do temperatury od 35 do 37 °C.

Po znieczuleniu zwierzęcia pojedynczym wstrzyknięciem ketaminy i ksylazyny do jamy otrzewnowej, należy ocenić poziom sedacji poprzez sprawdzenie odruchu cofania kończyn tylnych oraz uciśnięcie ogona. Następnie, używając nożyczek z tępymi końcami, wykonaj nacięcie w kształcie litery Y w jamie brzusznej zwierzęcia, aby odsłonić wątrobę i żyłę wrotną. Następnie zawiąż dwa bardzo luźne szwy wokół żyły wrotnej – jeden bliżej wątroby, a drugi bardziej dystalnie w stosunku do wątroby.

Wprowadź kaniulę dożylną o odpowiednim rozmiarze do żyły wrotnej. Następnie zaciśnij szwy, aby unieruchomić kaniulę. Teraz, używając od 5 do 20 mililitrów PBS podgrzanego do 37 °C, rozpocznij perfuzję przy ciśnieniu 10 cm H2O.

Należy unikać przedostawania się pęcherzyków powietrza do wątroby, co mogłoby spowodować powstanie artefaktów oraz zbyt wysokie ciśnienie powietrza, które uszkodziłoby narząd; należy przeciąć żyłę główną brzuszna i klatki piersiowej, aby umożliwić swobodny odpływ buforu z wątroby. Zapobiega to wysokiemu ciśnieniu wstecznemu oraz uszkodzeniom wątroby, komórek sinusoidalnych, śródbłonka lub LCCs. Po całkowitym wypłukaniu krwi z wątroby należy zastąpić PBS utrwalaczem do mikroskopii elektronowej (em) i prowadzić perfuzję do momentu, aż wątroba stwardnieje i stanie się bardzo blada.

Około pięciu minut. Następnie za pomocą skalpela należy pociąć wątrobę na bloki o wymiarach od jednego do dwóch milimetrów sześciennych. Do utrwalenia należy użyć utrwalacza em.

Utrwal tkankę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 do 72 godzin. Następnie przenieś tkankę do 0,1 molarnego buforu octanowego sodu i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez maksymalnie 12 miesięcy w celu przygotowania preparatów do skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Po odwodnieniu próbek zgodnie z protokołem tekstowym, opisz podstawy metalowych uchwytów do SEM i pod mikroskopem stereoskopowym naklej dwustronną taśmę węglową na górną część uchwytów; obejrzy próbki, aby zidentyfikować powierzchnię z najlepiej widocznymi zatokami do analizy SEM.

Połóż koronkę wybraną powierzchnią do góry na taśmę węglową podstawki i mocno ją przytwierdź. Po przeprowadzeniu napylania i obrazowania SEM zgodnie z protokołem tekstowym, otwórz obraz w programie ImageJ i użyj paska skali osadzonego na zdjęciu, aby ustawić skalę. Za pomocą narzędzia wielokąta (polygon tool) w ImageJ obrysuj cały płaski obszar LSEC, wliczając w to obszary okienkowate i nieokienkowate; pomiń wszelkie duże fragmenty zanieczyszczeń na powierzchni komórki, które mogą zasłaniać okienka. Aby zmierzyć średnicę okienka, wybierz narzędzie linii (line tool) i poprowadź linię przez najdłuższy wymiar każdego okienka.

Naciśnij M, aby zmierzyć linię, oraz D, aby trwale narysować linię na obrazie. Linia ta jest zdefiniowana jako średnica fenestracji i będzie teraz dostępna w oknie wyników programu Image J. Zmierz wszystkie szczeliny będące większymi otworami w cytoplazmie LSEC o rozmiarze powyżej 250 nanometrów, a także fenestracje. Oblicz pole powierzchni szczelin, które nie są okrągłe, obrysowując je i wykorzystując program Image J do obliczenia ich powierzchni, a następnie przenieś dane z okna wyników programu Image J do arkusza kalkulacyjnego Excel.

Do dalszej analizy należy wykorzystać następujące wzory do obliczeń fenestracji. Średnica średnia fenestracji jest równa średniej ze wszystkich średnic fenestracji. Pole powierzchni fenestracji jest równe pi r kwadrat, gdzie R jest obliczone na podstawie poszczególnych średnic fenestracji.

Procent porowatości oblicza się jako suma pi R kwadrat podzielona przez całkowitą analizowaną powierzchnię w mikronach pomnożona przez 100; z obliczeń tych należy wyłączyć sumaryczną powierzchnię luk. Aby przedstawić dane w publikacjach, należy podać średnicę fenestracji wraz z oświadczeniem potwierdzającym, że do zdefiniowania fenestracji wykorzystano średnice brzegowe, a także częstotliwość występowania fenestracji i porowatość. Należy również zamieścić informację, czy luki zostały uwzględnione w analizie, a także wykres rozkładu częstotliwości średnic fenestracji i liczbę bloków wątroby oraz zdjęcia. Obrazowanie SEM przy niskim powiększeniu ukazuje płaską powierzchnię preparatu wątroby z obszarem odsłoniętym na tyle dużym, aby można było zaobserwować wiele dużych naczyń wątrobowych i sinusoid, w tym drogę wrotą oraz żyłę środkową, jak pokazano tutaj.

Zapewnienie prawidłowego umieszczenia bloku wątroby na stubie montażowym jest niezbędne do uzyskania wyraźnych obrazów zatok, przy czym należy unikać błyszczącej torebki, która przesłania wszelkie szczegóły zatok wątrobowych. Z tego powodu, jak pokazano tutaj, większe powiększenie pozwala na obserwację fenestracji LSEC. Płyty hepatocytów mogą przypominać naczynia krwionośne, jednak cechy takie jak BLI pomagają w orientacji.

Rysunek ten pokazuje, że wysokie ciśnienie perfuzji może powodować artefakty, takie jak duże przerwy w śródbłonku, prawdopodobnie wynikające z koalescencji blaszek SIV LSEC, które są łatwo identyfikowalne w SEM; unikanie błon komórkowych znajdujących się bezpośrednio nad jądrami, co objawia się jako wybrzuszenie pod powierzchnią LSEC, pomoże w dokładnym obliczeniu gęstości fenestracji i porowatości. Wreszcie, kwantyfikacja średnicy, gęstości i częstotliwości występowania fenestracji LSEC zapewnia empiryczny pomiar fenestracji i umożliwia pomiar zmian wywołanych przez starzenie, chorobę, toksyny lub terapie. Po procedurze perfuzji tkankę można poddać obróbce do innych technik, takich jak transmisyjna mikroskopia elektronowa, w celu zbadania ultrastruktury komórkowej oraz struktury mitochondriów.

Można go również wykorzystać do badań histologicznych.