Znormalizowana metoda analizy sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby i ich fenestracji za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Ogólnym celem tej procedury jest analiza śródbłonka sinusoidalnego wątroby. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie wątroby i perfuzję jej utrwalaczem. Następnie wątroba jest cięta na bloki i odwadniana w ramach przygotowań do mikroskopii elektronowej.

Następnie próbki wątroby są napylane i badane pod mikroskopem elektronowym. Na koniec analizowane są mikrografie elektronowe i obliczana jest średnica i częstotliwość okien oraz porowatość procentowa. Ostatecznie mikroskopia elektronowa służy do wykazania zmian w sinusoidalnym śródbłonku wątroby w różnych warunkach.

Metoda ta daje nam wgląd w ultrastrukturę i morfologię naczyń krwionośnych wątroby w ich śródbłonku. Może być również używany do badania nerek i mózgu w ten sam sposób Wszystkie procedury z wykorzystaniem zwierząt są przeprowadzane zgodnie z lokalnymi przepisami. Ta praca została zatwierdzona przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt Lokalnego Okręgu Zdrowia w Sydney.

Dozwolone procedury są opisane w dokumentacji licencyjnej projektu i są zgodne z wytycznymi, które zapewniają dobrostan zwierzęcia przez cały czas. Jest to operacja, która nie daje szans na przeżycie. Po przygotowaniu utrwalacza, zgodnie z protokołem tekstowym, należy podgrzać bufor perfuzyjny i utrwalacz w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza.

Gdy zwierzę zostanie znieczulone pojedynczym wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy i ksylazyny, należy ocenić poziom uspokojenia poprzez wycofanie kończyn tylnych i uszczypnięcie ogona. Następnie nożyczkami wykonaj nacięcie w kształcie litery Y w brzuchu zwierzęcia, aby odsłonić wątrobę i żyłę wrotną. Następnie zawiąż dwa bardzo luźne szwy wokół żyły wrotnej, jeden proksymalnie do wątroby, a drugi bardziej dystalnie do wątroby.

Kanulować żyłę wrotną za pomocą kaniuli dożylnej o odpowiedniej wielkości. Następnie zaciśnij szwy, aby zabezpieczyć kaniulę. Teraz używając od pięciu do 20 mililitrów PBS ogrzanego do 37 stopni Celsjusza, rozpocznij perfuzję pod ciśnieniem 10 centymetrów H2O.

Unikaj przedostawania się pęcherzyków powietrza do wątroby, które mogłyby wytworzyć artefakty i zbyt wysokie ciśnienie powietrza, które uszkodzi wątrobę, przetnie CVA żyły brzusznej i piersiowej, aby umożliwić swobodne wyjście buforu z wątroby. Zapobiega to wysokiemu ciśnieniu wstecznemu, uszkodzeniom wątroby, komórek sinusoidalnych i śródbłonka lub LCC. Gdy wątroba jest wolna od krwi, zastąp PBS mikroskopią elektronową lub em, utrwalaczem i perfuzją, aż wątroba stwardnieje i będzie bardzo blada.

Około pięciu minut. Następnie skalpelem pokrój wątrobę na bloki o pojemności od jednego do dwóch milimetrów sześciennych. Użyj utrwalacza em do publikowania.

Utrwal tkankę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 do 72 godzin. Następnie przenieś tkankę do 0,1-molowego buforu sodowego Cate i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do 12 miesięcy, aby zamontować próbki do skaningowej mikroskopii elektronowej lub SEM. Po odwodnieniu próbek zgodnie z protokołem tekstowym, oznacz podstawę metalowych króćców SEM i nałóż dwustronną taśmę węglową na górną część króćców pod mikroskopem preparacyjnym, zwizualizuj próbki, aby zidentyfikować powierzchnię z najlepszymi sinusoidami dla SEM.

Koronka, wybrana powierzchnia skierowana do góry na powierzchnię taśmy węglowej króćca i mocno przyklej ją do króćca. Po wykonaniu powlekania napylającego i SEM zgodnie z protokołem tekstowym, otwórz obraz na obrazie J i użyj paska skali osadzonego na obrazie, aby ustawić skalę za pomocą narzędzia wielokąta na obrazie J śledź wokół całego płaskiego obszaru LSEC, w tym obszary z oknami i oknami, wyklucz wszelkie duże kawałki zanieczyszczeń znajdujące się na powierzchni komórki, które mogą zasłaniać okna. Aby zmierzyć średnicę okienka, umieść linię przez najdłuższą średnicę każdego okienka, wybierając narzędzie linii.

Naciśnij M, aby zmierzyć linię i D, aby trwale narysować linię na obrazie. Linia ta jest zdefiniowana jako średnica okienka i będzie teraz dostępna w polu wyników obrazu J.Zmierz wszystkie przerwy, które są większymi otworami w cytoplazmie LSEC powyżej 250 nanometrów, a także fenestracje. Oblicz obszar przerw, które nie są okrągłe, obrysowując je wokół nich i używając obrazu J, aby obliczyć ich obszar poza danymi z pola wyników na obrazie J do arkusza kalkulacyjnego programu Excel.

W celu dalszej analizy skorzystaj z poniższych wzorów do przeprowadzenia obliczeń okien. Średnia średnica okien jest równa średniej wszystkich średnic okien. Powierzchnia okien jest równa pi r do kwadratu, gdzie R jest obliczane na podstawie poszczególnych średnic okien.

Procent porowatości jest równy sigma pi R podniesionej do kwadratu na całkowitej analizowanej powierzchni, a mikrony razy 100 wykluczają z tego obliczenia sumę powierzchni przerw. Do prezentacji danych w publikacjach należy m.in. średnicę okien wraz ze stwierdzeniem potwierdzającym, że do określenia okien zastosowano średnice graniczne, częstość występowania i porowatość okien, a także stwierdzenie potwierdzające, czy w analizie uwzględniono luki oraz wykres rozkładu częstości okien okiennych i liczby bloków wątrobowych, a także obrazy. Małe powiększenie za pomocą SEM ujawnia płaską powierzchnię próbki wątroby z odsłoniętym obszarem wystarczająco dużym, aby zaobserwować wiele dużych naczyń wątrobowych i sinusoid, w tym drogę wrotną i centralną ES, jak pokazano tutaj.

Zapewnienie prawidłowego umieszczenia bloku wątroby na króćcu montażowym jest niezbędne do uzyskania wyraźnych obrazów sinusoid i należy unikać błyszczącej torebki, która zakrywa wszystkie szczegóły sinusoid wątroby. Z tego powodu, jak pokazano tutaj, większe powiększenie pozwala na obserwację okien LSEC. Płytki hepatocytów mogą wyglądać jak naczynia krwionośne, ale cechy takie jak BLI pomagają w orientacji.

Rysunek ten pokazuje, że wysokie ciśnienie profuzji może powodować artefakty, takie jak duże przerwy w śródbłonku, które uważa się za spowodowane koalescencją płytek LSEC SIV, które można łatwo zidentyfikować w SEM, unikając błony komórkowej bezpośrednio nad jądrami, które można zobaczyć jako wybrzuszenie pod powierzchnią LSEC, pomoże w dokładności obliczeń gęstości i porowatości okien. Wreszcie, kwantyfikacja średnicy, gęstości i częstotliwości okien LSEC zapewnia empiryczny pomiar okien i umożliwia pomiary zmian wywołanych przez choroby związane ze starzeniem się, toksyny lub terapie. Po procedurze perfuzji tkanka może być przetwarzana do innych technik, takich jak transmisyjna mikroskopia elektronowa, aby przyjrzeć się ultrastrukturze komórkowej, strukturze mitochondrialnej.

Może być również stosowany do histologii.