Name: Znormalizowana metoda analizy sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby i ich fenestracji za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Poznaj znormalizowaną metodę analizy fenestracji komórek śródbłonka wątroby za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Protokół umożliwia precyzyjne pomiary średnicy, gęstości i porowatości fenestracji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

UWAGA: Wszystkie procedury związane z wykorzystaniem zwierząt są przeprowadzane zgodnie z lokalnymi przepisami. Nasza praca jest zatwierdzona przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt Lokalnego Okręgu Zdrowia w Sydney. Dozwolone procedury są opisane w dokumentacji licencyjnej projektu i są zgodne z wytycznymi, które zapewniają dobrostan zwierzęcia przez cały czas. Należy zapewnić przestrzeganie przepisów dotyczących doświadczeń na zwierzętach obowiązujących w kraju, w którym praca jest wykonywana.
1. Protokół przygotowania utrwalacza EM
<ol>
	<li>Na 100 ml utrwalacza przygotować paraformaldehyd, dodając 2 g proszku paraformaldehydu do 25 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej, podgrzać do 65 °C, ciągle mieszając mieszadłem magnetycznym. 
	UWAGA: Aldehyd glutarowy, paraformaldehyd i bufor kakodylanu sodu są substancjami niebezpiecznymi i zawsze należy się z nimi obchodzić w oparach.</li>
	<li>Podgrzewać w temperaturze 65 ºC przez 2 minuty, a następnie pozostawić do ostygnięcia. W razie potrzeby dodawać kroplami roztwór wodorotlenku sodu, mieszając do całkowitego uzyskania klarownego roztworu. 
	UWAGA: wodorotlenek sodu jest niebezpieczny, należy obchodzić się z nim ostrożnie.</li>
	<li>Dodać 10 ml bulionowego aldehydu glutarowego klasy EM, 50 ml 0,2 M buforu kakodylanu sodu i 2 g sacharozy i wymieszać mieszadłem magnetycznym. Dodać 2 ml 1,0 M CaCl2.</li>
	<li>Doprowadzić do pH 7,4 przed przygotowaniem roztworu do objętości 100 ml wodą destylowaną. Końcowy utrwalacz zawiera 2,5 % aldehydu glutarowego, 2 % paraformaldehydu, 2 mmol CaCl2, 2 % sacharozy w 0,1 M buforze kakodylowym. Upewnij się, że całkowita osmolalność wynosi 440 mOsmol/L. Zużyć w ciągu 24 godzin od przygotowania.</li>
</ol>
2. Fiksacja perfuzyjna wątroby
<ol>
	<li>Ciepły bufor perfuzyjny i utrwalacz do 35 - 37 ºC. Właściwa temperatura buforu do wykrwawiania i utrwalacza pomaga zapewnić integralność tkanek.</li>
	<li>Znieczulić zwierzę pojedynczym wstrzyknięciem dootrzewnowym 50 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny.</li>
	<li>Gdy zwierzę znajduje się w głębokim znieczuleniu, ocenianym na podstawie wycofania kończyn tylnych i uszczypnięcia ogona, wykonuje się nacięcie w kształcie litery Y nożyczkami w brzuchu zwierzęcia, aby odsłonić wątrobę i żyłę wrotną. 
	UWAGA: Upewnij się, że sprzęt jest czysty, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek mikroorganizmami i ogólnymi zanieczyszczeniami, które będą łatwo widoczne na SEM.</li>
	<li>Zawiąż dwa bardzo luźne szwy wokół żyły wrotnej, jeden proksymalnie do wątroby, drugi bardziej dystalnie do wątroby.</li>
	<li>Kankaniuj żyłę wrotną za pomocą kaniuli dożylnej o odpowiedniej wielkości (18 G dla szczurów, 22 G dla myszy). Zaciśnij szwy, aby zabezpieczyć kaniulę.</li>
	<li>Rozpocząć perfuzję roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, ogrzanej do temperatury 37 °C i pod ciśnieniem 10 cmH200. Do wykrwawienia wątroby zwykle potrzeba od 5 do 20 ml PBS. 
	UWAGA: Nie pozwól, aby pęcherzyki powietrza dostały się do wątroby przez rurki podłączone do kaniuli, ponieważ indukują one artefakty wtórne do embolizacji i ciśnienia; Uszkodzenie hepatocytów, sinusoid i okien LSEC następuje, jeśli ciśnienie perfuzji jest zbyt wysokie.</li>
	<li>Przeciąć żyłę główną jamy brzusznej i piersiowej, aby umożliwić swobodne wydostanie się buforu z wątroby. Zapobiega to uszkodzeniom LSEC spowodowanym wysokim ciśnieniem wstecznym.</li>
	<li>Gdy wątroba jest wolna od krwi, zastąp PBS utrwalaczem EM i wykonuj perfuzję przez około 5 minut, aż wątroba stwardnieje i będzie bardzo blada.</li>
	<li>Przerwij perfuzję i pokrój utrwaloną wątrobę na 1 - 2 mm3 bloki za pomocą ostrego skalpela.</li>
	<li>Tkanka po utrwaleniu w utrwalaczu EM przez 24 - 72 godziny w temperaturze 4 ºC. 
	UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, niedostateczna fiksacja powoduje więcej artefaktów niż nadmierna fiksacja.</li>
	<li>Zmienić utrwalacz po okresie po utrwaleniu na 0,1 M bufor kakodylanu sodu do przechowywania w temperaturze 4 ºC. 
	UWAGA: Próbki przechowywane w ten sposób będą przechowywane przez znaczny okres czasu (do 12 miesięcy), jednak w celu uzyskania najlepszych wyników zaleca się terminowe wtórne utrwalenie i badanie.</li>
</ol>
3. Perfuzja igły
UWAGA: Fiksacja igłą to wariant fiksacji perfuzyjnej, który polega na wstrzyknięciu utrwalacza bezpośrednio do tkanki wątroby poddanej biopsji. Celem jest, aby utrwalacz został przepłukany przez naczynia krwionośne w celu ich wykrwawienia i wystawienia całego bloku tkankowego na działanie utrwalacza. Należy zachować ostrożność, aby utrzymać niskie ciśnienie wstrzykiwania, aby uniknąć odleżyn18,19.
<ol>
	<li>Usuń mały kawałek wątroby od zwierzęcia lub osoby badanej i spłucz solą fizjologiczną, aby usunąć krew i zanieczyszczenia.</li>
	<li>Narysuj zwykłą sól fizjologiczną do strzykawki wyposażonej w igłę o cienkiej grubości (zwykle strzykawkę insulinową).</li>
	<li>Sól fizjologiczną należy wstrzykiwać bardzo powoli do wątroby, aż krew zostanie wypłukana z tkanki. Może być konieczne wykonanie kilku wstrzyknięć.</li>
	<li>Pobrać utrwalacz EM do innej strzykawki wyposażonej w igłę o cienkiej grubości (zwykle strzykawkę insulinową).</li>
	<li>Utrwalacz należy wstrzykiwać bardzo powoli do wątroby, aż stanie się twarda i brązowa. Może być konieczne wykonanie kilku wstrzyknięć.</li>
	<li>Pokrój utrwaloną wątrobę na 1 - 2 mm3 bloki za pomocą ostrego skalpela. Inkubować w utrwalaczu EM przez 24 - 72 godziny w temperaturze 4 °C. Przemyć 3 razy w 0,1 M buforze kakodylanu sodu przed rozpoczęciem wtórnego utrwalania.</li>
</ol>
4. Przygotowanie do skaningowej mikroskopii elektronowej
<ol>
	<li>Przemyć próbkę 3 razy w 0,1 M buforze kakodylanu sodu. Aby utrwalić lipidy, należy umieścić próbkę w 2% tetratlenku osmu w 0,1 M buforze kakodylanu sodu przez 2 godziny 
	UWAGA: Całkowite mycie jest bardzo ważne, ponieważ aldehyd glutarowy i tetratlenek osmu reagują krzyżowo i generują artefakty na SEM.</li>
	<li>Przepłukać próbki w rosnących stężeniach etanolu, aby rozpocząć odwadnianie. Najpierw płukać w 50 % etanolu przez 5 minut; następnie 3 razy przez 5 minut z 70% etanolem; spłukać 3 razy przez 5 minut 90% etanolem; płukać 2 razy przez 5 minut w 100 % etanolu; i na koniec płukać 2 razy przez 10 minut w 100% etanolu (sito molekularne).</li>
	<li>Usunąć cały etanol z próbek i zastąpić go heksametylodylazanem (HMDS) w dymioracji i pozostawić na 10 minut. Usunąć HMDS z próbek tkanek i pozostawić do odparowania. 
	UWAGA: HMDS jest wysoce higroskopijny, gdy jest zimny, dlatego przed użyciem do ostatniego etapu odwadniania należy pozostawić do osiągnięcia temperatury regulowanej.</li>
	<li>Opcjonalnie należy natychmiast zamontować próbki lub umieścić je w eksykatorze do momentu, aż będą gotowe do zamontowania w SEM.</li>
</ol>
5. Montaż
UWAGA: Prawidłowe zamontowanie próbki zmaksymalizuje liczbę wyraźnie zaznaczonych sinusoid dostępnych do analizy w ramach SEM.
<ol>
	<li>Oznacz podstawę metalowych króćców SEM i nałóż dwustronną przewodzącą taśmę węglową na górną część króćców.</li>
	<li>Wizualizuj próbki za pomocą mikroskopu preparacyjnego, aby zidentyfikować powierzchnię z najlepszymi sinusoidami dla późniejszego SEM. Umieść tę powierzchnię w górę na powierzchni taśmy węglowej króćca.</li>
	<li>Mocno przyklej próbki do kikuta, próbki są teraz gotowe do napylania.</li>
</ol>
6. Powłoka
UWAGA: Pokrycie próbki cienką warstwą przewodzącego metalu (złota lub platyny) w powlekarce napylającej uziemia próbkę i chroni ją przed uszkodzeniem przez wiązkę elektronów. Jeśli powłoka jest zbyt gruba, interesujące struktury mogą być zasłonięte.
<ol>
	<li>Umieść klocki w komorze próżniowej automatycznej powlekarki do drobnego napylania, ustaw tryb obrotu i automatycznego napylania na 45 sekund. Użyj powłoki platynowej dla drobniejszych detali, jednak odpowiednie jest również złoto.</li>
	<li>Nałożyć cienką warstwę farby węglowej na zewnętrzne powierzchnie zamontowanych próbek wątroby, uważając, aby nie pokryć powierzchni sinusoidalnych.</li>
	<li>Po pokryciu próbek platyną i wyschnięciu farby węglowej są one gotowe do obserwacji na SEM. Próbki można przechowywać w eksykatorze.</li>
</ol>
7. Korzystanie ze skaningowego mikroskopu elektronowego
<ol>
	<li>Umieść próbki w skaningowym mikroskopie elektronowym i zwróć mikroskop do próżni.</li>
	<li>Wykorzystanie standardowych procedur operacyjnych mikroskopu do wizualizacji próbek poprzez rozpoczęcie od małego powiększenia, stopniowo zwiększając powiększenie.</li>
	<li>Upewnij się, że mikroskop jest odpowiednio dostosowany do odległości roboczej, wielkości plamki i astygmatyzmu.</li>
	<li>Sprawdź integralność fiksacji. Jeśli LSEC jest w większości wolny od szczelin i zawiera otwory o średnicy 30 - 250 nm, oznacza to, że przygotowanie próbki zakończyło się sukcesem.</li>
	<li>Jeśli sinusoidy są pełne szczelin lub pozbawione okienek, oznacza to, że przygotowanie próbki nie powiodło się lub występuje znaczna patologia. W takim przypadku należy pokroić próbkę bardzo drobną żyletką, a powierzchnie cięcia ponownie pokryć i przeanalizować pod kątem pomyślnie utrwalonych sinusoid.</li>
	<li>Przy powiększeniu około 15 000-20 000 × wybierz płaskie powierzchnie LSEC, które są wolne od zanieczyszczeń z dobrym mocowaniem i gdzie okienka są wyraźnie widoczne (zwykle zawierające co najmniej 10 okien).</li>
	<li>Zapisz obrazy co najmniej 10 sinusoid na wątrobę, z różnych obszarów bloków, używając co najmniej dwóch bloków na wątrobę. Pobranie próbek 10 mikrofotografii w powiększeniu 15 000 - 20 000 × na zwierzę jest na ogół wystarczające, aby kwantyfikacja fenestracji była reprezentatywna dla całej wątroby.</li>
</ol>
8. Analiza
UWAGA: Oprogramowanie ImageJ, które można pobrać bezpłatnie z NIH, jest wykorzystywane do ilościowego określania średnicy i częstotliwości okien (<a href="http://imagej.nih.gov/ij">www.imagej.nih.gov/ij</a>).
<ol>
	<li>Otwórz obraz J i ustaw skalę za pomocą paska skali osadzonego w obrazie (zrzut ekranu 1).</li>
	<li>Korzystając z narzędzia wielokąta w ImageJ, obrysuj cały płaski obszar LSEC, w tym obszary z fenestracją i defenestracją. Nie śledź tylko płytek sitowych, ponieważ spowoduje to fałszywe nadmuchanie porowatości. Wyklucz wszelkie duże kawałki zanieczyszczeń, które znajdują się na powierzchni komórki, a które mogą zasłaniać okna.</li>
	<li>Aby zmierzyć średnicę okienka, prześledź linię przez najdłuższą średnicę każdego okienka, wybierając narzędzie linii, i naciśnij "m", aby zmierzyć linię, i "d" (narysuj), aby trwale narysować linię na obrazie. Linia ta jest definiowana jako średnica okienka. Długość linii będzie teraz dostępna w polu wyników ImageJ (zrzut ekranu 2).</li>
	<li>Zmierz wszystkie przerwy, które są większymi otworami w cytoplazmie LSEC powyżej 250 nm, a także fenestracje. Luki są często artefaktami odzwierciedlającymi słabą perfuzję lub fiksację, jednak luki mogą również wystąpić w wyniku choroby i toksyczności. Dane dotyczące luk zostaną wyłączone z obliczeń parametrów okien w dalszej części analizy.</li>
	<li>Obszar przerw, które nie są okrągłe, należy obliczyć, śledząc wokół przerw i obliczając ich pole na obrazie ImageJ.</li>
	<li>Wklej dane z pola wyników w ImageJ do arkusza kalkulacyjnego EXCEL w celu dalszej analizy.</li>
</ol>
9. Obliczenia
<ol>
	<li>Średnia średnica okien = średnia wszystkich średnic okien (bez uwzględnienia szczelin, gdzie szczeliny wynoszą ≥ 250 nm).</li>
	<li>Powierzchnia okien = πr2, gdzie r, promień, oblicza się na podstawie średnicy poszczególnych okien (r = d / 2), bez uwzględnienia przerw.</li>
	<li>Porowatość (%) = (Σ (πr2)/całkowita analizowana powierzchnia - Σ (powierzchnia przerw =)) (μm2)) × 100.</li>
	<li>Częstotliwość okien = całkowita liczba okien/ (całkowita analizowana powierzchnia-Σ (powierzchnia szczelin) (μm2).</li>
</ol>
10. Prezentacja danych dotyczących stolarki
UWAGA: Jeśli to możliwe, publikacje zawierające kwantyfikację danych dotyczących fenestracji powinny zawierać następujące informacje
<ol>
	<li>Średnica okien wraz z oświadczeniem potwierdzającym, jakie średnice graniczne zostały użyte do zdefiniowania okien (zwykle między 50 a 250 nm), częstotliwość fenestracji (liczba/μm2) i porowatość (%).</li>
	<li>Do analizy należy dołączyć stwierdzenie potwierdzające, czy w analizie uwzględniono luki, wykres rozkładu częstości średnicy okien oraz liczbę wątrób, bloków, obrazów i okien</li>.
</ol>

<ol><li>Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCogger%2C+VC+%22The+Liver%3A+Biology+and+Pathobiology%22">The Liver: Biology and Pathobiology</a>. Arias, I. M., et al. , John Wiley & Sons, Ltd. 387-404 (2009).</li>
<li>Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoproteins+and+the+liver+sieve%3A+the+role+of+fenestrated+sinusoidal+endothelium+in+lipoprotein+metabolism%2C+atherosclerosis%2C+and+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis.</a> Hepatology. 21, 863-874 (1995).</li>
<li>Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+sieve%3A+considerations+concerning+the+structure+and+function+of+endothelial+fenestrae%2C+the+sinusoidal+wall+and+the+space+of+Disse%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse.</a> Hepatology. 5 (4), 683-692 (1985).</li>
<li>Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+feeding+and+fasting+on+fenestrations+in+the+liver+sinusoidal+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology%22%5BJournal%5D)">The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell.</a> Pathology. 42 (3), 255-258 (2010).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+serotonin+receptor-2B+rescues+small-for-size+liver+graft+failure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice.</a> Hepatology. 53 (1), 253-262 (2011).</li>
<li>Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Loss+of+Responsiveness+to+2%2C5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine+in+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 514-518 (2013).</li>
<li>Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+age+is+associated+with+ultrastructural+changes+in+isolated+rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 59 (1), 65-69 (2010).</li>
<li>Le Couteur, D. G., et al. Calorie Restriction, Aging and Longevity. Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R., et al. , 191-216 (2010).</li>
<li>McLean, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+pseudocapillarization+of+the+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Age-related pseudocapillarization of the human liver.</a> J Pathol. 200 (1), 112-117 (2003).</li>
<li>Le Couteur, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudocapillarization+and+associated+energy+limitation+in+the+aged+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver.</a> Hepatology. 33 (3), 537-543 (2001).</li>
<li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+acute+oxidative+stress+on+the+ultrastructure+of+the+perfused+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver.</a> Pharmacol Toxicol. 89 (6), 306-311 (2001).</li>
<li>Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+liver+injury%3A+defenestration+in+noncirrhotic+livers-a+scanning+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study.</a> Hepatology. 7 (1), 77-82 (1987).</li>
<li>Jamieson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+liver+sinusoidal+endothelium+in+a+baboon+model+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes.</a> Diabetologia. 50 (9), 1969-1976 (2007).</li>
<li>Fraser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+perfusion+pressure+damages+the+sieving+ability+of+sinusoidal+endothelium+in+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers.</a> Br J Exp Pathol. 61 (2), 222-228 (1980).</li>
<li>Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electron+microscopic+study+of+the+fenestrated+endothelial+lining+of+rat+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ultrastruct+Res%22%5BJournal%5D)">An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids.</a> J Ultrastruct Res. 31 (1), 125-150 (1970).</li>
<li>Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrastructural+characterization+of+the+endothelial+cell+in+the+rat+liver+sinusoid+under+normal+and+various+experimental+conditions%2C+as+a+contribution+to+the+distinction+between+endothelial+and+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ultrastruct+Res%22%5BJournal%5D)">An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells.</a> J Ultrastruct Res. 38 (5), 528-562 (1972).</li>
<li>Fahimi, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+and+immersion+fixation+of+rat+liver+with+glutaraldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde.</a> Lab Invest. 16 (5), 736-750 (1967).</li>
<li>Wisse, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+for+electron+microscopy+of+human+and+other+liver%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Fixation methods for electron microscopy of human and other liver.</a> World J Gastroenterol. 16 (23), 2851-2866 (2010).</li>
<li>Vreuls, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jet-fixation%3A+a+novel+method+to+improve+microscopy+of+human+liver+needle+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies.</a> Hepatology. 59 (2), 737-739 (2014).</li>
<li>Furrer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+reverts+age-related+capillarization+and+failure+of+regeneration+in+the+liver+through+a+VEGF-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108 (7), 2945-2950 (2011).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OxLDL+induced+injury+and+defenestration+of+HLSECs+via+LOX-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1.</a> J Mol Endocrinol. , (2014).</li>
<li>May, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+model+for+conditional+induction+and+rescue+of+portal+hypertension+reveals+a+role+of+VEGF-mediated+regulation+of+sinusoidal+fenestrations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations.</a> PLoS One. 6 (7), e21478(2011).</li>
<li>Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+can+act+as+vascular+permeability+factor+in+the+hepatic+sinusoids+through+upregulation+of+porosity+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 280 (2), 481-485 (2001).</li>
<li>Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD47-binding+peptide+of+thrombospondin-1+induces+defenestration+of+liver+sinusoidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells.</a> Liver Int. 33 (9), 1386-1397 (2013).</li>
<li>Wack, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinusoidal+ultrastructure+evaluated+during+the+revascularization+of+regenerating+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver.</a> Hepatology. 33 (9), 363-378 (2001).</li>
<li>Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sinusoidal+wall+permeability+and+liver+fatty+change+after+two-thirds+hepatectomy%3A+An+ultrastructural+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat.</a> Hepatology. 21 (2), 539-544 (1995).</li>
<li>Straub, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic-stimulated+liver+sinusoidal+capillarization+in+mice+requires+NADPH+oxidase%E2%80%93generated+superoxide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide.</a> J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).</li>
<li>Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+endothelial+cells+of+developing+rat+liver+in+the+transition+from+fetal+to+postnatal+life%5BTitle%5D)+AND+%22JJ+Ultrastruct+Mol+Struct+Res%22%5BJournal%5D)">Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life.</a> JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).</li>
<li>Jamieson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caloric+restriction+reduces+age-related+pseudocapillarization+of+the+hepatic+sinusoid%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid.</a> Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).</li>
<li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperlipidemia+and+surfactants%3A+the+liver+sieve+is+a+link%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link.</a> Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).</li>
<li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+oxidative+stress+on+the+liver+sieve%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The effects of oxidative stress on the liver sieve.</a> J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).</li>
<li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li>
<li>Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+atomic+force+microscopy+study+on+living+skin+fibroblasts+and+liver+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).</li>
<li>Monkemoller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+fenestrations+in+liver+sinusoidal+endothelial+cells+by+optical+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy.</a> Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Możliwość dokładnego i powtarzalnego pomiaru stanu śródbłonka sinusoidalnego wątroby jest ważnym krokiem w zrozumieniu biologii tych wysoce wyspecjalizowanych komórek. Nowsze techniki, takie jak mikroskopia oświetlenia strukturalnego32, mikroskopia sił atomowych33 i d-STORM (bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcyjna) 34 dostarczą ważnych informacji dotyczących morfologii tych komórek in vitro , ale SEM pozostaje podstawową metodologią wizualizacji i pomiaru ich struk...

Sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby (LSEC) są wysoce zróżnicowanymi komórkami śródbłonka, które wyściełają ścianę sinusoidy wątrobowej. LSEC są perforowane okienkami, które są nieprzepomierzone, transkomórkowe pory o średnicy 50-250 nm. Do 20% powierzchni LSEC jest pokryta fenestracjami, które zwykle występują w grupach od dziesiątek do setek zwanych płytkami sitowymi1-3 (ryc. 1). Fenestracje umożliwiają przenoszenie osocza i nanosubstratów między krwią a hepatocytami, tworząc wysoce wydajny system ultrafiltracji. Stolarki są dynamicznymi strukturami - zarówno ich wielkość, jak i liczba mogą ulegać zmianie w odpowiedzi na różne stany fizjologiczne, leki i choroby. Na przykład okienka są większe u osób na czczo niż w stanie nakarmionym4; 2-di-jodoamfetamina zwiększa liczbę okien; 5,6 i zmniejszenie wielkości i liczby okien na komórkę występuje w starzeniu się i wielu stanach chorobowych7-13. Dokładny pomiar wielkości i liczby okien jest ważny dla zrozumienia, w jaki sposób na morfologię LSEC wpływają różne stany chorobowe, toksyczne i fizjologiczne; ich wpływ na czynność wątroby; oraz do opracowywania interwencji terapeutycznych modulujących fenestrację1.
Badanie okien jest trudne. Średnica okien leży poniżej rozdzielczości konwencjonalnej mikroskopii świetlnej, więc wcześniej możliwa była tylko obserwacja za pomocą mikroskopii elektronowej zarówno w nienaruszonej tkance wątroby, jak i hodowanych LSEC. Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM) jest najczęściej używany do badania wielkości, częstotliwości i porowatości okien (procent błony LSEC, która jest perforowana przez fenestracje), ponieważ SEM pozwala na obserwację dużych obszarów powierzchni śródbłonka i pomiar tysięcy, jeśli nie dziesiątek tysięcy okien. Pomimo jego użyteczności, wyniki badań opartych na SEM dla parametrów LSEC, takich jak wielkość, liczba, częstotliwość i porowatość okien, różnią się znacznie w literaturze (tabela 1).
Okienka i płyty sitowe są delikatnymi strukturami, które kurczą się, pękają, rozszerzają lub łączą podczas przygotowywania próbek, dlatego konieczne jest staranne przetwarzanie, aby zachować ich integralność. Podwyższone ciśnienie perfuzji14; nieprawidłowa osmolarność utrwalacza i15; niewystarczające utrwalenie lub czas utrwalenia; i szybkość odwadniania i suszenia po utrwaleniu to obszary przetwarzania SEM, które mogą wytwarzać artefakty zakłócające zachowanie ultrastruktury (ryc. 2). Utrata okien ("defenestracja") i kurczenie się okien może wystąpić w wyniku słabego mocowania, co skutkuje zmniejszeniem średnicy okien i porowatości komórek. Metody poprawy konserwacji próbek do analizy SEM zostały opisane wcześniej 15-17 i zostaną omówione tutaj wraz z dodatkowymi wskazówkami, jak poprawić konserwację próbek. Głównym celem konserwacji próbki jest usunięcie krwi z sinusoid, tak aby można było uwidocznić powierzchnię LSEC i uniknąć uszkodzenia LSEC przez wysokie ciśnienie lub opóźnione utrwalenie. Cała perfuzja utrwalacza w wątrobie przez żyłę wrotną jest preferowaną metodą zespolenia wątroby. Jak opisano szczegółowo w innym miejscu,16,18 perfuzja musi być przeprowadzana pod niskim ciśnieniem (np. 10 cm H20), aby uniknąć artefaktów perfuzji związanych z ciśnieniem i uszkodzenia LSEC, zwykle objawiającego się dużymi przerwami w błonie komórkowej. Jednak rozsądną fiksację można często uzyskać za pomocą perfuzji igłowej biopsji wątroby od ludzi i zwierząt, jak opisano szczegółowo w innym miejscu19. Technika ta polega na bezpośrednim wstrzykiwaniu utrwalacza do tkanki, aż krew zostanie wypłukana z próbki, a tkanka stanie się twarda i utrwalona. Utrwalenie próbek do mikroskopii elektronowej musi być wykonane tak szybko, jak to możliwe po ustaniu przepływu krwi, aby zapobiec zmianom ultrastrukturalnym zachodzącym w wyniku niezwykle szybkich procesów autolitycznych w wątrobie.
Prezentujemy również metodę analizy obrazu, która minimalizuje włączenie artefaktów i standaryzuje pomiar okien. Różnice w doborze sinusoid do mikrofotografii, analizie obrazu artefaktów oraz pomiarze powierzchni komórek pod kątem porowatości i częstotliwości fenestracji doprowadziły do poważnych rozbieżności w opublikowanych wynikach. Ustandaryzowane podejście do oceny i pomiaru okien oraz minimalne wymagania dotyczące prezentacji danych nie zostały jasno omówione w literaturze4,10,20-31.

<table><tbody><tr><td>25% aldehyd glutarowy klasy EM</td><td>ProSciTech</td><td>C001</td><td>Przechowywać zapasy w temperaturze -20 C do czasu, gdy będą potrzebne, unikać ponownego zamrażania</td></tr><tr><td>Proszek paraformaldehydu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>Zawsze przygotowuj Paraformaldehyd świeży</td></tr><tr><td>Kakodylan sodu</td><td>w proszku Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td>Przygotuj 0,2 M bulionu, pH 7,4, rozpuszczając proszek w dH2O, stosowany głównie w 0,1 M, przygotowując rozcieńczenie 1:2</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>Przygotuj 1 M CaCl2rozpuszczając proszek w dH2O</td></tr><tr><td>Tretroxide osmu</td><td>ProSciTech</td><td>C011</td><td>Przed użyciem umyj ampułki w słabym kwasie, aby uniknąć zanieczyszczenia. Przygotuj 2 % bulionu w szklanej butelce</td></tr><tr><td>Etanol - Absolute</td><td>Sigma Aldrich</td><td>459836&nbsp;</td><td>100% etanol musi być wysokiej jakości i przechowywany na sicie molekularnym</td></tr><tr><td>Inne gatunki etanolu</td><td>Labtech</td><td>EL5</td><td>Przygotuj stopniowane etanole z dH2O</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane</td><td>Sigma</td><td>Aldrich 52619&nbsp;</td><td>Przed użyciem pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej</td></tr><tr><td>Kaniule</td><td>Terumo</td><td>TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C</td><td>18 G jest odpowiednie dla większości szczurów, 22 G jest odpowiednie dla większości myszy, ale dobrze jest mieć kilka 24 G pod ręką w przypadku bardzo małych myszy</td></tr><tr><td>Przewodząca taśma węglowa</td><td>ProSciTech</td><td>IA0201</td><td></td></tr><tr><td>Farba węglowa</td><td>ProSciTech</td><td>I003</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td></td><td></td><td>Musi być uzyskana na podstawie licencji</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td></td><td></td><td>Musi być uzyskany na podstawie licencji</td></tr><tr><td>Sito molekularne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208647</td><td>Usuwa wodę ze 100% etanolu</td></tr></tbody></table>

znormalizowana metoda analizy sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby i ich fenestracji za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Komórki śródbłonka sinusoidalnego wątroby są bramą do wątroby, ich transkomórkowe fenestracje pozwalają na niezakłócony transfer małych i rozpuszczonych substancji z krwi do miąższu wątroby w celu metabolizmu i przetwarzania. Fenestracje są strukturami dynamicznymi - zarówno ich rozmiar, jak i liczba mogą być zmieniane w odpowiedzi na różne stany fizjologiczne, leki i choroby, co czyni je ważnym celem modulacji. Zrozumienie, w jaki sposób na morfologię LSEC wpływają różne stany chorobowe, toksyczne i fizjologiczne oraz jak te zmiany wpływają na czynność wątroby, wymaga dokładnego pomiaru wielkości i liczby okien. W tym artykule opisujemy techniki utrwalania i przetwarzania skaningowej mikroskopii elektronowej stosowane w naszym laboratorium w celu zapewnienia powtarzalnego przygotowania próbki i dokładnej interpretacji. Metody obejmują utrwalanie perfuzji, wtórne utrwalanie i odwadnianie, przygotowanie do skaningowego mikroskopu elektronowego i analizę. Na koniec przedstawiamy metodę krok po kroku do standaryzowanej analizy obrazu, która przyniesie korzyści wszystkim badaczom w tej dziedzinie.

Wstępna wizualizacja przy niskim powiększeniu za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej ukazuje płaską powierzchnię preparatu wątroby z odsłoniętym obszarem wystarczająco dużym, aby zaobserwować wiele dużych naczyń wątrobowych i zatoki (Rysunek 1A). Prawidłowe umieszczenie bloku wątroby na kolumnie montażowej jest kluczowe dla uzyskania wyraźnych obrazów zatok; z tego powodu należy unikać włączania w obraz kapsuły Glissona (Rysunek 1B). Zwiększenie powiększenia pozwala na dokładniej...

Fenestrowana komórka śródbłonka wątroby sinusoidalnej jest biologicznie ważnym systemem filtrów, na który duży wpływ mają różne choroby, toksyny i stany fizjologiczne. Zmiany te mają znaczący wpływ na pracę wątroby. Opisano metody standaryzacji pomiaru wielkości i liczby okien w tych komórkach.

Znormalizowana metoda analizy sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby i ich fenestracji za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza śródbłonka zatok wątrobowych. Osiąga się to najpierw poprzez wyizolowanie wątroby i jej perfuzję utrwalaczem. Następnie wątrobę tnie się na bloki i odwadnia w celu przygotowania do mikroskopii elektronowej.Następnie próbki wątroby poddaje się napylaniu i bada pod mikroskopem elektronowym. Na koniec analizuje się mikrografie elektronowe, obliczając średnicę i częstotliwość występowania fenestracji oraz procentową porowatość. Ostatecznie mikroskopia elektronowa służy do wykazania zmian w śródbłonku zatok wątrobowych w różnych warunkach.Metoda ta pozwala na poznanie ultrastruktury i morfologii naczyń krwionośnych wątroby w obrębie ich śródbłonka. Może być ona również stosowana w analogiczny sposób do badania nerek i mózgu. Wszystkie procedury z wykorzystaniem zwierząt są przeprowadzane zgodnie z lokalnym prawodawstwem. Praca ta została zatwierdzona przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt Sydney Local Health District.Dopuszczalne procedury są opisane w dokumentacji licencyjnej projektu i są zgodne z wytycznymi zapewniającymi stałą opiekę nad dobrostanem zwierząt. Jest to zabieg nieprzeżywalny. Po przygotowaniu utrwalacza zgodnie z protokołem tekstowym, należy podgrzać bufor perfuzyjny i utrwalacz do temperatury od 35 do 37 °C.Po znieczuleniu zwierzęcia pojedynczym wstrzyknięciem ketaminy i ksylazyny do jamy otrzewnowej, należy ocenić poziom sedacji poprzez sprawdzenie odruchu cofania kończyn tylnych oraz uciśnięcie ogona. Następnie, używając nożyczek z tępymi końcami, wykonaj nacięcie w kształcie litery Y w jamie brzusznej zwierzęcia, aby odsłonić wątrobę i żyłę wrotną. Następnie zawiąż dwa bardzo luźne szwy wokół żyły wrotnej – jeden bliżej wątroby, a drugi bardziej dystalnie w stosunku do wątroby.Wprowadź kaniulę dożylną o odpowiednim rozmiarze do żyły wrotnej. Następnie zaciśnij szwy, aby unieruchomić kaniulę. Teraz, używając od 5 do 20 mililitrów PBS podgrzanego do 37 °C, rozpocznij perfuzję przy ciśnieniu 10 cm H2O.Należy unikać przedostawania się pęcherzyków powietrza do wątroby, co mogłoby spowodować powstanie artefaktów oraz zbyt wysokie ciśnienie powietrza, które uszkodziłoby narząd; należy przeciąć żyłę główną brzuszna i klatki piersiowej, aby umożliwić swobodny odpływ buforu z wątroby. Zapobiega to wysokiemu ciśnieniu wstecznemu oraz uszkodzeniom wątroby, komórek sinusoidalnych, śródbłonka lub LCCs. Po całkowitym wypłukaniu krwi z wątroby należy zastąpić PBS utrwalaczem do mikroskopii elektronowej (em) i prowadzić perfuzję do momentu, aż wątroba stwardnieje i stanie się bardzo blada.Około pięciu minut. Następnie za pomocą skalpela należy pociąć wątrobę na bloki o wymiarach od jednego do dwóch milimetrów sześciennych. Do utrwalenia należy użyć utrwalacza em.Utrwal tkankę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 do 72 godzin. Następnie przenieś tkankę do 0,1 molarnego buforu octanowego sodu i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez maksymalnie 12 miesięcy w celu przygotowania preparatów do skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Po odwodnieniu próbek zgodnie z protokołem tekstowym, opisz podstawy metalowych uchwytów do SEM i pod mikroskopem stereoskopowym naklej dwustronną taśmę węglową na górną część uchwytów; obejrzy próbki, aby zidentyfikować powierzchnię z najlepiej widocznymi zatokami do analizy SEM.Połóż koronkę wybraną powierzchnią do góry na taśmę węglową podstawki i mocno ją przytwierdź. Po przeprowadzeniu napylania i obrazowania SEM zgodnie z protokołem tekstowym, otwórz obraz w programie ImageJ i użyj paska skali osadzonego na zdjęciu, aby ustawić skalę. Za pomocą narzędzia wielokąta (polygon tool) w ImageJ obrysuj cały płaski obszar LSEC, wliczając w to obszary okienkowate i nieokienkowate; pomiń wszelkie duże fragmenty zanieczyszczeń na powierzchni komórki, które mogą zasłaniać okienka. Aby zmierzyć średnicę okienka, wybierz narzędzie linii (line tool) i poprowadź linię przez najdłuższy wymiar każdego okienka.Naciśnij M, aby zmierzyć linię, oraz D, aby trwale narysować linię na obrazie. Linia ta jest zdefiniowana jako średnica fenestracji i będzie teraz dostępna w oknie wyników programu Image J. Zmierz wszystkie szczeliny będące większymi otworami w cytoplazmie LSEC o rozmiarze powyżej 250 nanometrów, a także fenestracje. Oblicz pole powierzchni szczelin, które nie są okrągłe, obrysowując je i wykorzystując program Image J do obliczenia ich powierzchni, a następnie przenieś dane z okna wyników programu Image J do arkusza kalkulacyjnego Excel.Do dalszej analizy należy wykorzystać następujące wzory do obliczeń fenestracji. Średnica średnia fenestracji jest równa średniej ze wszystkich średnic fenestracji. Pole powierzchni fenestracji jest równe pi r kwadrat, gdzie R jest obliczone na podstawie poszczególnych średnic fenestracji.Procent porowatości oblicza się jako suma pi R kwadrat podzielona przez całkowitą analizowaną powierzchnię w mikronach pomnożona przez 100; z obliczeń tych należy wyłączyć sumaryczną powierzchnię luk. Aby przedstawić dane w publikacjach, należy podać średnicę fenestracji wraz z oświadczeniem potwierdzającym, że do zdefiniowania fenestracji wykorzystano średnice brzegowe, a także częstotliwość występowania fenestracji i porowatość. Należy również zamieścić informację, czy luki zostały uwzględnione w analizie, a także wykres rozkładu częstotliwości średnic fenestracji i liczbę bloków wątroby oraz zdjęcia. Obrazowanie SEM przy niskim powiększeniu ukazuje płaską powierzchnię preparatu wątroby z obszarem odsłoniętym na tyle dużym, aby można było zaobserwować wiele dużych naczyń wątrobowych i sinusoid, w tym drogę wrotą oraz żyłę środkową, jak pokazano tutaj.Zapewnienie prawidłowego umieszczenia bloku wątroby na stubie montażowym jest niezbędne do uzyskania wyraźnych obrazów zatok, przy czym należy unikać błyszczącej torebki, która przesłania wszelkie szczegóły zatok wątrobowych. Z tego powodu, jak pokazano tutaj, większe powiększenie pozwala na obserwację fenestracji LSEC. Płyty hepatocytów mogą przypominać naczynia krwionośne, jednak cechy takie jak BLI pomagają w orientacji.Rysunek ten pokazuje, że wysokie ciśnienie perfuzji może powodować artefakty, takie jak duże przerwy w śródbłonku, prawdopodobnie wynikające z koalescencji blaszek SIV LSEC, które są łatwo identyfikowalne w SEM; unikanie błon komórkowych znajdujących się bezpośrednio nad jądrami, co objawia się jako wybrzuszenie pod powierzchnią LSEC, pomoże w dokładnym obliczeniu gęstości fenestracji i porowatości. Wreszcie, kwantyfikacja średnicy, gęstości i częstotliwości występowania fenestracji LSEC zapewnia empiryczny pomiar fenestracji i umożliwia pomiar zmian wywołanych przez starzenie, chorobę, toksyny lub terapie. Po procedurze perfuzji tkankę można poddać obróbce do innych technik, takich jak transmisyjna mikroskopia elektronowa, w celu zbadania ultrastruktury komórkowej oraz struktury mitochondriów.Można go również wykorzystać do badań histologicznych.

a-standardized-method-for-analysis-liver-sinusoidal-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zstandaryzowana metoda analizy komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby i ich fenestracji za pomocą skaningowej mikroskopii elektronownej

Badania nad śródbłonkiem sinusoidalnym wątroby (SECs) muszą być prowadzone z wykorzystaniem komórek pierwotnych pobranych od zwierząt, ponieważ nie istnieją linie komórkowe tego typu. Metoda ta opiera się na trawieniu wątroby i centryfugacji różnicowej w celu oczyszczenia SECs do późniejszej hodowli i przeprowadzania eksperymentów.

In vivo endocytoza w wątrobie z następującą puryfikacją komórek wątroby poprzez perfuzję wątroby

Rekrutacja leukocytów do wątroby odbywa się w wyspecjalizowanych kanałach sinusoid wątrobowych, które są wyściełane unikalnymi komórkami śródbłonka sinusoidalnego wątroby.  Mikroskopia z kontrastem fazowym rekrutacji leukocytów przez ludzki śródbłonek sinusoidalny wątroby w warunkach fizjologicznego naprężenia ścinającego może ułatwić wyjaśnienie mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw tego procesu.

Test adhezji przepływowej do badania rekrutacji leukocytów do ludzkiego śródbłonka sinusoidalnego wątroby w warunkach naprężeń ścinających

Celem tego protokołu jest uzyskanie wysokiej żywotności i wysokiej wydajności hepatocytów i komórek śródbłonka sinusoidalnego z wątroby. Osiąga się to poprzez perfuzję wątroby roztworem kolagenazy typu IV przez żyłę wrotną, a następnie wirowanie różnicowe w celu uzyskania hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka.

Oczyszczanie hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka z perfuzji wątroby myszy

Celem tego protokołu jest identyfikacja populacji komórek śródbłonka limfatycznego w wątrobie za pomocą opisanych markerów. Wykorzystujemy kolagenazę IV i DNazę oraz delikatne mielenie tkanki w połączeniu z cytometrią przepływową, aby zidentyfikować odrębną populację komórek śródbłonka limfatycznego.

Trawienie mysiej wątroby do analizy cytometrycznej przepływowej komórek śródbłonka limfatycznego

Tutaj prezentujemy protokół barwienia immunofluorescencyjnego, aby bezpośrednio obserwować komórki śródbłonka aorty myszy. Technika ta jest przydatna podczas badania fenotypu komórkowego i molekularnego komórek śródbłonka w różnych wzorcach przepływu oraz w rozwoju miażdżycy.

Stosowanie barwienia immunofluorescencyjnego en face do bezpośredniej obserwacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych

Ten protokół przedstawia rutynową metodę korzystania z seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBF-SEM), potężnej techniki obrazowania 3D. Skuteczne zastosowanie SBF-SEM zależy od prawidłowych technik utrwalania i barwienia tkanek, a także od starannego rozważenia ustawień obrazowania. Protokół ten zawiera praktyczne rozważania dotyczące całego tego procesu.

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa ze skaningiem blokowym (SBF-SEM) próbek tkanek biologicznych

Tutaj prezentujemy, jak wygenerować model danio pręgowanego związanego z niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby (NAFLD) w celu zbadania wpływu nadwyżki cholesterolu na mikrośrodowisko wątroby i krajobraz komórek odpornościowych.

Analiza mikrośrodowiska wątroby we wczesnej progresji niealkoholowego raka wątrobowokomórkowego związanego z stłuszczeniową chorobą wątroby u danio pręgowanego

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Obecny protokół optymalizuje metody perfuzji/decelularyzacji wątroby in situ i mikroskopii dwufotonowej w celu stworzenia niezawodnej platformy do wizualizacji dynamiki przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) podczas niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH).

Obrazowanie 3D macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby w mysim modelu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby

Prosty i wszechstronny protokół do pozyskiwania trójwymiarowych szczegółów miejsc kontaktu błony między organellami w hepatocytach z wątroby lub komórek w innych tkankach.

Trójwymiarowa charakterystyka miejsc kontaktu między organellami w hepatocytach przy użyciu mikroskopii elektronowej o przekroju szeregowym

Tutaj opisujemy wzbogacanie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby za pomocą zoptymalizowanej metody różnicowego ultrawirowania.

Metoda wzbogacania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby

Poznaj znormalizowaną metodę analizy fenestracji komórek śródbłonka wątroby za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Protokół umożliwia precyzyjne pomiary średnicy, gęstości i porowatości fenestracji.

Znormalizowana metoda analizy sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby i ich fenestracji za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal

Znormalizowana metoda analizy sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby i ich fenestracji za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów