Trawienie mysiej wątroby do analizy cytometrycznej przepływowej komórek śródbłonka limfatycznego
7 stycznia 2019
Celem tego protokołu jest identyfikacja populacji komórek śródbłonka limfatycznego w wątrobie za pomocą opisanych markerów. Wykorzystujemy kolagenazę IV i DNazę oraz delikatne mielenie tkanki w połączeniu z cytometrią przepływową, aby zidentyfikować odrębną populację komórek śródbłonka limfatycznego.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie limfy i wątroby, takie jak to, w jaki sposób komórki śródbłonka limfatycznego (LEC) reagują na określone bodźce i jak przyczynia się to do patogenezy choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy ocenić fenotyp i funkcję komórek śródbłonka limfatycznego wątroby na podstawie każdej komórki i może być stosowana do dalszych zastosowań po sortowaniu komórek. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w biologię limfatyczną wątroby, może być również stosowana do oceny komórek śródbłonka limfatycznego z różnych tkanek, takich jak skóra i gruczoł sutkowy.
Procedurę zademonstruje Jeffrey Finlon, profesjonalny asystent naukowy z mojego laboratorium. Aby przygotować zawiesinę jednokomórkową z wyizolowanych komórek wątroby, zacznij od spryskania myszy siedemdziesięcioprocentowym etanolem i przymocowania łap do deski sekcyjnej. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć skórę około jednego centymetra nad odbytem i użyj kleszczy zębatych, aby oderwać skórę od ciała.
Włóż końcówki nożyczek między skórę a otrzewną i otwórz nożyczki, aby oddzielić tkanki przed kontynuowaniem nacinania skóry aż do szyi. Przymocuj skórę do deski preparacyjnej pod każdą kończyną przednią i nad każdą kończyną tylną, a następnie pociągnij worek otrzewnowy do góry, aby przedłużyć nacięcie w kierunku szyi. Chwyć płaty wątroby i przetnij tuż pod mostkiem, aby umożliwić rozwarstwienie wokół wątroby.
Następnie przenieś narząd do czterech mililitrów pożywki EHAA firmy Click. Za pomocą skalpela pokrój wątrobę na kawałki o średnicy około jednego milimetra i strawij je w pięciuset mikrolitrach świeżo przygotowanego roztworu wytrawiającego i pięciuset mikrolitrach DNazy 1. Po piętnastu minutach w temperaturze trzydziestu siedmiu stopni Celsjusza użyj pipety o pojemności pięciuset mililitrów, aby dokładnie wymieszać tkanki i włóż pojemnik do inkubatora na kolejne piętnaście minut.
Pod koniec inkubacji przenieść strawioną próbkę przez sitko o średnicy stu mikronów do stożkowej probówki o średnicy pięćdziesięciu mililitrów i za pomocą tłoka ze strzykawki o pojemności jednego mililitra delikatnie przecisnąć pozostałe kawałki tkanki przez siatkę. Umyj filtr pięcioma mililitrami buforu izolacyjnego i delikatnie przeciśnij pozostałą tkankę przez sitko. Zebrać izolowane komórki wątroby przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w czterech mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek.
Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej umyj komórki w dziesięciu mililitrach buforu izolacyjnego i policz komórki na hemocytometrze, aby określić pełną liczbę wątroby. Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach dwudziestoprocentowego jodiksanolu i nałożyć zawiesinę komórek na jeden mililitr PBS. Oddzielić komórki przez separację gradientu gęstości i zebrać warstwę między PBS a jodiksanolem.
Następnie przefiltruj komórki przez sitko o średnicy stu mikrometrów do nowej stożkowej rurki o pojemności pięćdziesięciu mililitrów. Umyj komórki w dziesięciu mililitrach świeżego buforu izolacyjnego i ponownie zawieś powstały osad w pięciuset mikrolitrach PBS, uzupełnionych dwuprocentową płodową surowicą bydlęcą lub FBS. Po policzeniu, podwielokrotność około pięć razy dziesięć do szóstych komórek niemiąższowych do każdej studzienki kontrolnej i doświadczalnej dziewięćdziesięciosześciodołkowej płytki do odwirowania i ponownie zawiesić granulki w dziewięćdziesięciu mikrolitrach PBS plus FBS na studzienkę.
Dodać odpowiednie eksperymentalne i kontrolne koktajle przeciwciał pierwotnych do każdej studzienki i zabarwić wszystkie studzienki odpowiednim markerem żywotności. Najważniejszym krokiem w tej procedurze jest właściwe miareczkowanie przeciwciał i użycie kontroli typu lodu i kontroli fluorescencji-1 w celu walidacji barwienia. Po trzydziestu minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza odwirować przepłukać komórki stu mikrolitrami PBS plus FBS na stu stu mikrolitrów PBS plus FBS na studzienkę i przenieść komórki z każdej stustu stu mikrolitrów do indywidualnych pięciomililitrowych probówek do cytometrii przepływowej o objętości końcowej 400 mikrolitrów PBS plus FBS na probówkę.
Następnie użyj niewielkiej objętości komórek, aby dostosować ustawienia lasera i kompensacji na cytometrze przepływowym i odczytać wszystkie zdarzenia dla każdej probówki. Po odczytaniu wszystkich probówek należy zaimportować dane do odpowiedniego programu do analizy cytometrii przepływowej. Bramka na żywych komórkach w oparciu o barwnik markera żywotności, w którym ujemna ekspresja jest uważana za żywą.
Bramka na żywych komórkach w oparciu o wielkość i ziarnistość komórek, a także ich żywość marker ekspresji barwnika, a następnie bramkowanie na populacji komórek CD45 ujemnych CD31 dodatnich przy użyciu odpowiedniej kontroli izotypu i danych fluorescencji-1 w celu określenia populacji dodatnich i ujemnych. Następnie bramkują komórki CD45 ujemne CD31 dodatnie zgodnie z ich ekspresją CD16 / 32 i podoplaniny, aby umożliwić identyfikację CD45 ujemnych CD31 dodatnich, CD16 / 32 ujemnych śródbłonka limfatycznego podoplaniny dodatniej i CD45 ujemnych CD31, CD16 / 32 dodatnich podoplaniny ujemnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby. Emfatyczne komórki śródbłonka wyrażają naczynie limfatyczne i śródbłonkowe hialuronianowe, ale nie CD146.
Wyizolowane przez wątrobę komórki CD16 / 32 dodatnie CD16 / 32, jak wykazano, są również CD146 dodatnie i podoplaninowo-dodatnie, podczas gdy CD31 dodatnie komórki CD16 / 32 są głównie CD146 ujemne i albo podoplaniny dodatnie, albo ujemne. Dodatniość określono na podstawie barwienia fluorescencyjną-1. Komórki śródbłonka limfatycznego wątroby są CD146 ujemne i PDPN dodatnie.
Ani śródbłonek naczyniowy, ani mysie makrofagi wątrobowe nie wykazują ekspresji podoplaniny. Barwienie podoplaniną może być również stosowane do odróżniania cholangiocytów od naczyń limfatycznych na podstawie odrębnych struktur jądrowych dróg żółciowych, a także przez barwienie cytokeratyną 7. Ponieważ tylko komórki śródbłonka limfatycznego wykazują współekspresję receptora 3 czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych i białka 1 homeobox Prospero w wątrobie, markery te mogą być dalej wykorzystywane do potwierdzenia czystości posortowanej populacji komórek śródbłonka limfatycznego wątroby.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkiej pracy i utrzymywaniu komórek na lodzie. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak sortowanie przepływowe populacji LEC, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak profilowanie transkrypcyjne LEC. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią limfatyczną specyficzną dla wątroby do zbadania, w jaki sposób limfa wpływa na choroby wątroby u myszy i ludzi.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ komórki śródbłonka limfatycznego są rzadką, stopniową populacją w wątrobie i metoda musi być wykonana szybko.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół ma na celu identyfikację populacji komórek śródbłonka limfatycznego w wątrobie przy użyciu specyficznych markerów. Metoda ta łączy traktowanie kolagenazą IV i DNazą z cytometrią przepływową w celu wyizolowania odrębnych komórek śródbłonka limfatycznego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia układu limfatycznego
Wstęp
- Komórki śródbłonka limfatycznego (LECs) odgrywają kluczową rolę w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych.
- Zrozumienie reakcji LEC na bodźce może dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmów powstawania chorób.
- Metoda ta pozwala na ocenę fenotypu i funkcji LEC na poziomie pojedynczej komórki.
- Można ją dostosować do użytku z LEC pochodzącymi z różnych tkanek, w tym ze skóry i gruczołów mlekowych.
Cel badania
- Zbadanie zachowania śródbłonkowe komórek limfatycznych wątroby w odpowiedzi na specyficzne bodźce.
- Wniesienie wkładu w zrozumienie patogenezy chorób związanych z biologią układu limfatycznego.
- Umożliwienie dalszych zastosowań po posortowaniu komórek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek z izolowanych komórek wątroby.
- Wykorzystanie kolagenazy IV i DNazy do trawienia tkanek.
- Cytometria przepływowa w celu identyfikacji i sortowania komórek.
- Techniki sekcji w celu pobrania tkanek z modeli mysich.
Główne wyniki
- Pomyślna identyfikacja odrębnych populacji limfatycznych komórek śródbłonka.
- Wgląd w fenotyp i funkcję LEC wątroby.
- Potencjalne zastosowania w badaniu LEC z różnych tkanek.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez wyspecjalizowanego specjalistę.
Wnioski
- Metoda ta stanowi cenne narzędzie do badania limfatycznych komórek śródbłonka.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie biologii układu limfatycznego wątroby oraz jej znaczenia w zdrowiu i chorobie.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę w szerszym zakresie zastosowań w badaniach nad układem limfatycznym.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia analizę limfatycznych komórek śródbłonkowych (LECs) z wątroby myszy w rozdzielczości pojedynczych komórek, wypełniając krytyczną lukę w narzędziach służących do badania specyficznej dla wątroby biologii naczyń limfatycznych. Poprzez dostarczenie powtarzalnej metody izolacji i fenotypowania rzadkich populacji LEC, protokół ten wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w ramach działań związanych z walidacją celów terapeutycznych w kontekście zapalenia wątroby, ruchu komórek odpornościowych oraz zwłóknienia. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, umożliwiając bezpośrednią ocenę odpowiedzi LEC na bodźce w systemie istotnym dla przebiegu choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie fenotypu i funkcji limfatycznych komórek śródbłonka na poziomie pojedynczych komórek w celu wyjaśnienia mechanizmów biologicznych w patofizjologii wątroby.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowany schemat trawienia i barwienia w celu izolacji żywych LEC z tkanki wątroby do dalszych analiz funkcjonalnych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie mierzalnych odczytów markerów LEC na poziomie pojedynczych komórek (np. podoplaniny, CD31, CD45, VEGFR3, Prox1), co wspiera standaryzację i powtarzalność testów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych odpowiednich do wysokoprzepustowego przesiewania związków modulujących aktywność limfatycznych komórek śródbłonka lub ścieżki specyficzne dla wątroby.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie systemów istotnych dla chorób, umożliwiając izolację komórek śródbłonka limfatycznego (LEC) wątroby w celu zbadania ich roli w stanach zapalnych, nadzorze immunologicznym oraz progresji włóknienia.
- Wartość operacyjna: Ułatwia ciągłość translacyjną od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej, dostarczając powtarzalnej metody wzbogacania frakcji LEC w wielu różnych warunkach eksperymentalnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po identyfikację wiodących związków (lead identification), szczególnie w projektach skoncentrowanych na biologii układu limfatycznego wątroby, modulacji odpornościowej lub terapiach celowanych w zręb.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie analizy fenotypowej LEC wątroby w odpowiedzi na bodźce eksperymentalne.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy zawiesiny komórkowe o zdefiniowanych markerach śródbłonkowych i limfatycznych, co pozwala na wiarygodną ocenę związków w formatach 96-dołkowych.
- Analityka: Umożliwia ilościowe odczyty z cytometrii przepływowej w celu porównania częstotliwości występowania LEC, stanu aktywacji oraz koekspresji markerów funkcjonalnych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkrywcze z ciągłością przedkliniczną, umożliwiając izolację LEC do dalszych zastosowań, takich jak profilowanie transkrypcyjne lub testy funkcjonalne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do badania limfatycznych komórek śródbłonka nie tylko w wątrobie, ale także w innych tkankach, takich jak skóra i gruczoł mlekowy, co maksymalizuje efektywność wykorzystania zasobów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dotyczącej udziału limfatycznych komórek śródbłonka w procesach chorobowych wątroby.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność izolacji LEC dzięki standaryzacji trawienia enzymatycznego, separacji w gradiencie gęstości oraz bramkowania w wieloparametrycznej cytometrii przepływowej.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go, dostarczając wczesnych, istotnych biologicznie informacji dotyczących mechanizmów zapośredniczonych przez układ limfatyczny w patofizjologii wątroby.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów modulujących funkcję limfatyczną wątroby z uwzględnieniem ryzyka poprzez bezpośrednią ocenę fenotypową populacji LEC.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w sekcji tkanek mysich, trawieniu enzymatycznym oraz wielokolorowej cytometrii przepływowej z zastosowaniem odpowiednich kontroli kompensacji.
- Metoda zależy od dostępu do cytometrów przepływowych, wirówek oraz odczynników, w tym kolagenazy IV, DNazy 1, jodiksanolu oraz paneli przeciwciał przeciwko CD31, CD45, podoplaninie, CD16/32, VEGFR3 i Prox1.
- Konieczna jest standaryzacja strategii bramkowania i miareczkowania przeciwciał pomiędzy zespołami w celu zapewnienia spójności wyników między laboratoriami i partiami eksperymentalnymi.
- Adaptacja metody do innych tkanek (np. skóry, gruczołu mlekowego) może wymagać optymalizacji czasu trawienia oraz etapów przecierania przez sito, w zależności od gęstości i komórkowości tkanki.
- Ograniczenia praktyczne obejmują niską częstotliwość występowania oraz kruchość limfatycznych komórek śródbłonka wątroby, co wymaga szybkiego przetwarzania i pracy w niskiej temperaturze w celu zachowania żywotności i integralności markerów.
