Trawienie mysiej wątroby do analizy cytometrycznej przepływowej komórek śródbłonka limfatycznego

Celem tego protokołu jest identyfikacja populacji komórek śródbłonka limfatycznego w wątrobie za pomocą opisanych markerów. Wykorzystujemy kolagenazę IV i DNazę oraz delikatne mielenie tkanki w połączeniu z cytometrią przepływową, aby zidentyfikować odrębną populację komórek śródbłonka limfatycznego.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie limfy i wątroby, takie jak to, w jaki sposób komórki śródbłonka limfatycznego (LEC) reagują na określone bodźce i jak przyczynia się to do patogenezy choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy ocenić fenotyp i funkcję komórek śródbłonka limfatycznego wątroby na podstawie każdej komórki i może być stosowana do dalszych zastosowań po sortowaniu komórek. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w biologię limfatyczną wątroby, może być również stosowana do oceny komórek śródbłonka limfatycznego z różnych tkanek, takich jak skóra i gruczoł sutkowy.

Procedurę zademonstruje Jeffrey Finlon, profesjonalny asystent naukowy z mojego laboratorium. Aby przygotować zawiesinę jednokomórkową z wyizolowanych komórek wątroby, zacznij od spryskania myszy siedemdziesięcioprocentowym etanolem i przymocowania łap do deski sekcyjnej. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć skórę około jednego centymetra nad odbytem i użyj kleszczy zębatych, aby oderwać skórę od ciała.

Włóż końcówki nożyczek między skórę a otrzewną i otwórz nożyczki, aby oddzielić tkanki przed kontynuowaniem nacinania skóry aż do szyi. Przymocuj skórę do deski preparacyjnej pod każdą kończyną przednią i nad każdą kończyną tylną, a następnie pociągnij worek otrzewnowy do góry, aby przedłużyć nacięcie w kierunku szyi. Chwyć płaty wątroby i przetnij tuż pod mostkiem, aby umożliwić rozwarstwienie wokół wątroby.

Następnie przenieś narząd do czterech mililitrów pożywki EHAA firmy Click. Za pomocą skalpela pokrój wątrobę na kawałki o średnicy około jednego milimetra i strawij je w pięciuset mikrolitrach świeżo przygotowanego roztworu wytrawiającego i pięciuset mikrolitrach DNazy 1. Po piętnastu minutach w temperaturze trzydziestu siedmiu stopni Celsjusza użyj pipety o pojemności pięciuset mililitrów, aby dokładnie wymieszać tkanki i włóż pojemnik do inkubatora na kolejne piętnaście minut.

Pod koniec inkubacji przenieść strawioną próbkę przez sitko o średnicy stu mikronów do stożkowej probówki o średnicy pięćdziesięciu mililitrów i za pomocą tłoka ze strzykawki o pojemności jednego mililitra delikatnie przecisnąć pozostałe kawałki tkanki przez siatkę. Umyj filtr pięcioma mililitrami buforu izolacyjnego i delikatnie przeciśnij pozostałą tkankę przez sitko. Zebrać izolowane komórki wątroby przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w czterech mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek.

Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej umyj komórki w dziesięciu mililitrach buforu izolacyjnego i policz komórki na hemocytometrze, aby określić pełną liczbę wątroby. Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach dwudziestoprocentowego jodiksanolu i nałożyć zawiesinę komórek na jeden mililitr PBS. Oddzielić komórki przez separację gradientu gęstości i zebrać warstwę między PBS a jodiksanolem.

Następnie przefiltruj komórki przez sitko o średnicy stu mikrometrów do nowej stożkowej rurki o pojemności pięćdziesięciu mililitrów. Umyj komórki w dziesięciu mililitrach świeżego buforu izolacyjnego i ponownie zawieś powstały osad w pięciuset mikrolitrach PBS, uzupełnionych dwuprocentową płodową surowicą bydlęcą lub FBS. Po policzeniu, podwielokrotność około pięć razy dziesięć do szóstych komórek niemiąższowych do każdej studzienki kontrolnej i doświadczalnej dziewięćdziesięciosześciodołkowej płytki do odwirowania i ponownie zawiesić granulki w dziewięćdziesięciu mikrolitrach PBS plus FBS na studzienkę.

Dodać odpowiednie eksperymentalne i kontrolne koktajle przeciwciał pierwotnych do każdej studzienki i zabarwić wszystkie studzienki odpowiednim markerem żywotności. Najważniejszym krokiem w tej procedurze jest właściwe miareczkowanie przeciwciał i użycie kontroli typu lodu i kontroli fluorescencji-1 w celu walidacji barwienia. Po trzydziestu minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza odwirować przepłukać komórki stu mikrolitrami PBS plus FBS na stu stu mikrolitrów PBS plus FBS na studzienkę i przenieść komórki z każdej stustu stu mikrolitrów do indywidualnych pięciomililitrowych probówek do cytometrii przepływowej o objętości końcowej 400 mikrolitrów PBS plus FBS na probówkę.

Następnie użyj niewielkiej objętości komórek, aby dostosować ustawienia lasera i kompensacji na cytometrze przepływowym i odczytać wszystkie zdarzenia dla każdej probówki. Po odczytaniu wszystkich probówek należy zaimportować dane do odpowiedniego programu do analizy cytometrii przepływowej. Bramka na żywych komórkach w oparciu o barwnik markera żywotności, w którym ujemna ekspresja jest uważana za żywą.

Bramka na żywych komórkach w oparciu o wielkość i ziarnistość komórek, a także ich żywość marker ekspresji barwnika, a następnie bramkowanie na populacji komórek CD45 ujemnych CD31 dodatnich przy użyciu odpowiedniej kontroli izotypu i danych fluorescencji-1 w celu określenia populacji dodatnich i ujemnych. Następnie bramkują komórki CD45 ujemne CD31 dodatnie zgodnie z ich ekspresją CD16 / 32 i podoplaniny, aby umożliwić identyfikację CD45 ujemnych CD31 dodatnich, CD16 / 32 ujemnych śródbłonka limfatycznego podoplaniny dodatniej i CD45 ujemnych CD31, CD16 / 32 dodatnich podoplaniny ujemnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby. Emfatyczne komórki śródbłonka wyrażają naczynie limfatyczne i śródbłonkowe hialuronianowe, ale nie CD146.

Wyizolowane przez wątrobę komórki CD16 / 32 dodatnie CD16 / 32, jak wykazano, są również CD146 dodatnie i podoplaninowo-dodatnie, podczas gdy CD31 dodatnie komórki CD16 / 32 są głównie CD146 ujemne i albo podoplaniny dodatnie, albo ujemne. Dodatniość określono na podstawie barwienia fluorescencyjną-1. Komórki śródbłonka limfatycznego wątroby są CD146 ujemne i PDPN dodatnie.

Ani śródbłonek naczyniowy, ani mysie makrofagi wątrobowe nie wykazują ekspresji podoplaniny. Barwienie podoplaniną może być również stosowane do odróżniania cholangiocytów od naczyń limfatycznych na podstawie odrębnych struktur jądrowych dróg żółciowych, a także przez barwienie cytokeratyną 7. Ponieważ tylko komórki śródbłonka limfatycznego wykazują współekspresję receptora 3 czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych i białka 1 homeobox Prospero w wątrobie, markery te mogą być dalej wykorzystywane do potwierdzenia czystości posortowanej populacji komórek śródbłonka limfatycznego wątroby.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkiej pracy i utrzymywaniu komórek na lodzie. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak sortowanie przepływowe populacji LEC, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak profilowanie transkrypcyjne LEC. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią limfatyczną specyficzną dla wątroby do zbadania, w jaki sposób limfa wpływa na choroby wątroby u myszy i ludzi.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ komórki śródbłonka limfatycznego są rzadką, stopniową populacją w wątrobie i metoda musi być wykonana szybko.