Name: Trawienie mysiej wątroby do analizy cytometrycznej przepływowej komórek śródbłonka limfatycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Naucz się trawienia mysiej wątroby do analizy cytometrycznej komórek śródbłonka limfatycznego. Ta metoda umożliwia izolację i badanie fenotypu LEC na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Programom GI i Liver Innate Immune za wsparcie finansowe tego projektu. B.A.J.T. jest również finansowany przez R01 AI121209.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Kampusu Medycznego Anschutz Uniwersytetu Kolorado.
1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Przygotować 5 mg/ml roztworu DNazy I w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę trawiącą, dodając 5,000 U/ml kolagenazy IV do pożywki EHAA firmy Click.</li>
	<li>Przed użyciem podgrzać mieszaninę wytrawiającą w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Wykonać bufor izolacyjny, dodając 4,8% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS).</li>
	<li>Wykonać bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC), dodając 100 mM chlorku amonu, 10 mM KHCO3 i 0,1 mM EDTA do destylowanego H2O.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z wątroby myszy
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji za pomocą CO2 i zwichnięcia szyjki macicy.</li>
	<li>Spryskaj mysz 70% etanolem, aby zmoczyć jej sierść. Przypnij stopy myszy do deski preparcyjnej.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek preparacyjnych przeciąć skórę około 1 cm powyżej odbytu, uważając, aby przeciąć tylko skórę (około 1 mm). Odciągnij skórę od ciała za pomocą ząbkowanych kleszczy i włóż nożyczki między skórę a otrzewną. Otwórz nożyczki, aby oddzielić skórę od otrzewnej, a następnie przetnij skórę od nacięcia do szyi.</li>
	<li>Przypnij skórę do deski preparacyjnej za pomocą jednej szpilki pod każdym ramieniem i nad każdą nogą. Pociągnij worek otrzewnowy do góry i przetnij w górę w kierunku szyi. Chwyć płaty wątroby i przetnij tuż poniżej mostka. 
	Uwaga: Należy zachować ostrożność, jeśli którakolwiek część wątroby będzie używana do badań immunohistochemicznych (IHC).</li>
	<li>Przeciąć wokół wątroby i usunąć wątrobę z myszy i umieścić ją w 4 ml pożywki EHAA firmy Click.</li>
	<li>Za pomocą skalpela pokrój wątrobę na kawałki o średnicy ~1 mm.</li>
	<li>Dodać 500 μl mieszaniny wytrawiającej i 500 μl DNazy I (2 mg/ml) do wątroby.</li>
	<li>Inkubować wątrobę przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Po 15 minutach wymieszaj płyn za pomocą pipety o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Po 30 minutach inkubacji przenieść strawioną próbkę przez sitko o wielkości 100 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Delikatnie przepchnąć pozostałe kawałki przez filtr za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Umyć filtr 5 ml buforu izolacyjnego i delikatnie przepchnąć chusteczkę przez sitko grzbietem tłoka ze strzykawki o pojemności 1 ml. Powtarzaj tę czynność, aż filtr zostanie przemyty 25 ml buforu izolacyjnego.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut. Ostrożnie odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad z 4 ml buforu do lizy RBC. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Przemyć komórki 10 ml buforu izolacyjnego i odwirować przy 400 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Policz komórki na hemocytometrze, aby określić pełną liczbę wątroby.</li>
	<li>Zawieś komórki w 5 ml 20% jodiksanolu i ułóż je warstwami z 1 ml PBS.</li>
	<li>Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 15 minut bez przerwy.</li>
	<li>Usunąć warstwę między PBS a jodiksanolem i umieścić je przez filtr 100 μm w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przemyć komórki 10 ml buforu izolacyjnego i odwirować przy 400 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS z 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS).</li>
</ol>
3. Analiza cytometryczna przepływu pojedynczych komórek z wątroby
<ol>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i mikroskopu, używając wykluczenia błękitu trypanowego do pomiaru żywotnych komórek. Dodać 10 μl komórek do 10 μl błękitu trypanowego i natychmiast umieścić je na hemocytometrze i policzyć żywe komórki (nie niebieskie) pod mikroskopem. Następnie oblicz liczbę komórek na mikrolitr</li>.
	<li>Podwielokrotność około 5 milionów pozostałych komórek niemiąższowych do pojedynczego dołka 96-dołkowej płytki.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 90 μl PBS z 2% FBS.</li>
	<li>Dodaj anty-CD45 (1:200), anty-CD146 (1:200), anty-CD31 (1:200) i PDPN (1:200) rozcieńczone w 10 μl 10x 2,4G2 lub anty-CD16/32 (1:200). 
	nuta: Nie stosowano bloku Fc (2,4G2), gdy stosowano przeciwciało znakowane anty-CD16/32.</li>
	<li>Aby określić, gdzie należy ustawić bramki dodatnie i ujemne, uwzględnij barwnik fluorescencji minus jeden (FMO) dla każdego koloru i przeciwciało kontrolne izotypu.</li>
	<li>Aby określić żywe i martwe komórki, zabarwić markerem żywotności (np. duch czerwony 780). Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Przemyj komórki 100 μl PBS z 2% FBS.</li>
	<li>Użyj małej porcji komórek, aby dostosować ustawienia lasera i kompensacji w cytometrze przepływowym. Wybarwić komórki przeciwciałem przeciwko każdemu pojedynczemu fluoroforowi i jednym bez przeciwciała. 
	nuta: W zależności od używanego cytometru przepływowego należy ustalić matrycę kompensacyjną w celu usunięcia nakładania się widma.</li>
	<li>Umieść probówkę z próbką na sondzie cytometru i zbierz i zapisz wszystkie zdarzenia.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Patrząc na obszar rozproszenia bocznego w porównaniu z obszarem rozproszenia do przodu, bramka na "żywych" komórkach na podstawie rozmiaru i ziarnistości oraz barwnika znacznika żywotności.</li>
	<li>Następnie, używając CD45 Brilliant Violet 510 i CD31 PerCp Cy5.5, bramkuj komórki CD45-CD31 + za pomocą kontroli izotypu i FMO w celu określenia populacji dodatnich i ujemnych.</li>
	<li>Na koniec, używając CD146 v450 lub CD16 / 32 FITC i PDPN APC, weź komórki CD146-PDPN+ lub CD16/32- PDPN+, ponownie używając kontroli izotypu i FMO, aby określić populacje dodatnie i ujemne. Tymi komórkami są LEC.</li>
</ol>

<ol><li>Tanaka, M., Iwakiri, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatics+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphatics in the liver.</a> Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).</li>
<li>Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+vessel+expansion+and+function+in+the+development+of+hepatic+fibrosis+and+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).</li>
<li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li>
<li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node-resident+lymphatic+endothelial+cells+mediate+peripheral+tolerance+via+Aire-independent+direct+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).</li>
<li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerogenic+properties+of+lymphatic+endothelial+cells+are+controlled+by+the+lymph+node+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment.</a> PLoS One. 9 (2), e87740(2014).</li>
<li>Rouhani, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+lymphatic+endothelial+cells+expressing+peripheral+tissue+antigens+in+CD4+T-cell+tolerance+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction.</a> Nature Communications. 6, 6771(2015).</li>
<li>Tewalt, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelial+cells+induce+tolerance+via+PD-L1+and+lack+of+costimulation+leading+to+high-level+PD-1+expression+on+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells.</a> Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).</li>
<li>Dubrot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+stromal+cells+acquire+peptide-MHCII+complexes+from+dendritic+cells+and+induce+antigen-specific+CD4%28%2B%29+T+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).</li>
<li>Hirosue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+antigen+scavenging%2C+cross-presentation%2C+and+CD8%2B+T+cell+priming%3A+a+new+role+for+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).</li>
<li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-C+promotes+immune+tolerance+in+B16+melanomas+and+cross-presentation+of+tumor+antigen+by+lymph+node+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics.</a> Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).</li>
<li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessels+regulate+immune+microenvironments+in+human+and+murine+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).</li>
<li>Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+roles+of+lymphatic+vessels+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).</li>
<li>Dietrich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+lymphatic+vessels%2C+not+blood+vessels%2C+primarily+mediate+immune+rejections+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation.</a> Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).</li>
<li>Kedl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+Dendritic+Cells+acquire+archived+antigen+from+Lymphatic+Endothelial+Cells+for+antigen+presentation+during+lymph+node+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction.</a> Nature Communications. 8, 2034(2017).</li>
<li>Kedl, R. M., Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+archiving+by+lymph+node+stroma%3A+A+novel+function+for+the+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).</li>
<li>Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+capture+and+archiving+by+lymphatic+endothelial+cells+following+vaccination+or+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection.</a> Nature Communications. 5, 3989(2014).</li>
<li>Yokomori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+marker+podoplanin%2FD2-40+in+human+advanced+cirrhotic+liver--re-evaluations+of+microlymphatic+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities.</a> BMC Gastroenterology. 10, 131(2010).</li>
<li>Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+murine+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+characterized+by+the+expression+of+hyaluronan+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).</li>
<li>Dudas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospero-related+homeobox+1+%28Prox1%29+is+a+stable+hepatocyte+marker+during+liver+development%2C+injury+and+regeneration%2C+and+is+absent+from+%22oval+cells%22%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells".</a> Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).</li>
<li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li>
<li>Amatschek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+and+lymphatic+endothelial+cell-specific+differentiation+programs+are+stringently+controlled+by+the+tissue+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment.</a> Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).</li>
<li>Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+eliminates+T+cells+undergoing+antigen-triggered+apoptosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo.</a> Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).</li>
<li>Shay, T., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+Genome+Project+and+systems+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunological Genome Project and systems immunology.</a> Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Mouse+Liver+Contains+Two+Distinct+Populations+of+Cholangiocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).</li>
<li>Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lymphatic+System%3A+Integral+Roles+in+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity.</a> Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).</li>
<li>Olszewski, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymphatic+system+in+body+homeostasis%3A+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphatic+Research+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions.</a> Lymphatic Research and Biology. 1 (1), discussion 21-14 11-21 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niedawno wyszło na jaw ogólne znaczenie LEC w homeostazie i regulacji immunologicznej25. Znaczna część opublikowanej literatury limfatycznej koncentruje się na skórze i węzłach chłonnych; Jednak limfy znajdują się w całym ciele26 i dlatego potrzebne jest zrozumienie ich znaczenia w różnych narządach. Tutaj pokazujemy metodę, w której LEC w wątrobie można badać komórka po komórce, aby lepiej zrozumieć ich jednoczesną ekspresję różnych markerów powierzchniowych, cytokin, chem...

Rola naczyń limfatycznych i LEC w wątrobie nie jest dobrze poznana. Podczas gdy naczynia limfatyczne znajdują się w triadzie wrotnej wątroby1 i rozszerzają się podczas choroby2, bardzo niewiele wiadomo na temat funkcji i fenotypu LEC w wątrobie. Wraz z odkryciem markerów, które znajdują się głównie w LECs3, znaczenie tych komórek w różnych niszach tkankowych w homeostazie i chorobie wypełni znaczącą lukę w naszym zrozumieniu. LEC odgrywają główną rolę w utrzymaniu tolerancji obwodowej w węzłach chłonnych i nowotworach przerzutowych poprzez bezpośrednią interakcję z limfocytami T4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13. LEC w węźle chłonnym mogą promować odporność ochronną poprzez interakcje z migrującymi komórkami dendrytycznymi14,15,16. W związku z tym istnieje wiele ról dla LEC, które mogą być specyficzne dla tkanek i interakcji, w których są obecne. Jednak bardzo niewiele wiadomo na temat tego, w jaki sposób LEC oddziałują z komórkami odpornościowymi w tkance lub jak LEC funkcjonują w różnych układach narządów; w związku z tym ocena LEC na podstawie komórki w wątrobie lub innych narządach może prowadzić do postępów w sposobie, w jaki LEC programują odporność specyficzną dla tkanek. Podczas gdy większość literatury, która koncentruje się na LEC w wątrobie, wykorzystuje mikroskopię do wizualizacji LEC za pomocą jednego lub dwóch markerów i morfologii17, bardzo niewiele zrobiono, aby konkretnie ocenić LEC na podstawie komórki po komórce za pomocą cytometrii przepływowej, chociaż jedno badanie oceniło różnice między sinusoidalnymi komórkami śródbłonka wątroby (LSEC) a LEC18. Możliwość analizowania populacji LEC w wątrobie za pomocą cytometrii przepływowej pozwala na dogłębne badanie fenotypu LEC podczas normalnej homeostazy lub choroby.
Aby ocenić LEC za pomocą cytometrii przepływowej, potrzebne jest wiele znaczników powierzchniowych. Zazwyczaj LEC są wizualizowane przez ekspresję homeoboksu 1 związanego z prospero (Prox-1), receptora hialuronianu śródbłonka naczyń limfatycznych 1 (LYVE1) lub receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego 3 (VEGFR3) za pomocą mikroskopii. Jednak w wątrobie ekspresja tych markerów nie jest ograniczona do LEC. Prox-1 jest szeroko wyrażany przez hepatocyty podczas rozwoju, regeneracji i uszkodzenia wątroby19, a LYVE1 i VEGFR3 są wyrażane przez sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby18. W węźle chłonnym LEC są identyfikowane za pomocą cytometrii przepływowej jako skupiska różnicowania (CD) CD45-, CD31+ i podoplaniny+ (PDPN)16. Jednak to podejście jest zbyt minimalne, aby wyizolować LEC w wątrobie, ponieważ komórki CD45-CD31 + wychwytują komórki śródbłonka, a dominującą populacją komórek śródbłonka naczyń krwionośnych w wątrobie są LSEC. W związku z tym potrzebne są inne markery, aby odróżnić rzadką populację LEC od obfitej populacji LSEC. Zarówno CD16/32 (wyrażony przez dojrzałe LSEC18), jak i CD146 (powszechny marker komórek śródbłonka naczyniowego, który ulega ekspresji głównie w sinusoidach wątroby przez sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby20 z niewielką lub żadną ekspresją przez komórki śródbłonka limfatycznego21) były markerami kandydującymi.
Dlatego zoptymalizowaliśmy metodę izolacji i wizualizacji LEC w wątrobie za pomocą powyższych markerów, CD45, CD31, CD146, CD16/32 i PDPN do cytometrii przepływowej. Opisujemy zastosowanie kolagenazy IV, DNazy 1 i mechanicznej separacji do trawienia tkanek wątroby do zawiesiny jednokomórkowej. Opisano również zastosowanie gradientu gęstości jodeksanolu do izolacji komórek niemiąższowych (NPC) i eliminacji resztek komórkowych. Wreszcie, używając wielu markerów, określamy optymalną strategię bramkowania cytometrii przepływowej w celu identyfikacji LEC z wątroby z PDPN jako dominującym markerem.

<table><tbody><tr><td>Kliknięcia/EHAA media</td><td>Irvine Scientific</td><td>9195</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS002145</td><td>Deoksyrybonukleaza 1</td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td>Density Gradient Medium</td></tr><tr><td>V450 anty myszy CD146 (klon ME-9F1)</td> <td>BD nauki biologiczne</td><td>562232</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty myszy CD146 (klon ME-9F1)</td><td>Biolegend</td><td>134706</td><td>izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)</td></tr><tr><td>Pacific Blue anty myszy CD31 (klon 390)</td> <td>Biolegend</td><td>102422</td><td></td></tr><tr><td>PerCp / Cy5.5 anty myszy CD31 (klon 390)</td> <td>Biolegend</td><td>102420</td><td>Białka perydyninowo-chlorofilowe - cyjanina 5,5 (PerCP-Cy5,5)</td></tr> <tr><td>APC anty myszy PDPN (klon 8.1.1)</td><td>Biolegend</td><td>127410</td><td>Allofikocyjanina (APC), podoplanina (PDPN)</td></tr><tr><td>APC/Cy7 anty mysz CD45 (klon 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 anty myszy CD45 (klon 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103138</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty myszy CD16/32 (klon 93)</td><td>Biolegend</td><td>101306</td><td>Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)</td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5 anty myszy CD16/32 (klon 93)</td><td>Biolegend</td><td>101324</td><td>Białka perydyninowo-chlorofilowe-Cyjanina 5,5 (PerCP-Cy5,5)</td></tr> <tr><td>duch czerwony 780 barwnik żywotności</td><td>TONBO biosceinces</td><td>3-0865-T100</td><td></td></tr><tr><td>APC chomik syryjski IgG (klon SHG-1)</td><td>Biolegened</td><td>402102</td><td></td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5 szczur IgG2a (klon RTK2758)</td><td>Biolegend</td><td>400531</td><td></td></tr><tr><td>FITC szczur IgG2 (klon eBR2a)</td><td>ebioscience</td><td>1-4321-80</td><td></td></tr><tr><td>Przeciw myszy LYVE1 (klon 223322)R</td><td>& Systemy D</td><td>FAB2125A</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie Cytokeratyna (klon EPR17078)</td><td>abcam</td><td>ab181598</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysz F4/80 (klon Cl:A3-1)</td><td>Bio-rad</td><td>MCA497</td><td></td></tr><tr><td>BSA (frakcja V)</td><td>Fischer</td><td>BP1600-100</td><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Surowica osła</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR</td><td>E177</td><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) -dla buforu do lizy RBC,</td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td>, <td>Fischer</td><td>A687-500</td><td>, dla RBC, Bufor do lizy</td></tr>, <tr><td>Wodorowęglan potasu</td>, <td>Fischer</td><td>P184-500</td>, <td>dla RBC, Bufor do lizy</td></tr>, <tr><td>Skalpel</td>, <td>Feather</td><td>2975#21</td><td></td></tr>, <tr><td>100 &mu; Filtr siatkowy komórek</td><td>m Fischer</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>2.4G2</td><td>w domu/Blok ATCC</td><td>ATCC HB-197</td><td>FC w celu zahamowania niespecyficznego wiązania z komórkami Fc gamma + -wykonany z hybrydoma</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Atlanta biologiczne</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowa</td><td>Truline</td><td>TR2004</td><td></td></tr><tr><td>15 mL stożkowa</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Końcówka do pipet</td><td>USA</td><td>scientific 1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Końcówka do pipet L</td><td>USA scientific</td><td>1110-1700</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; Końcówka do pipety L</td><td>USA scientific</td><td>1111-3700</td><td></td></tr><tr><td>seriologiczna pipeta 10 ml</td><td>greiner bio-one</td><td>607107</td><td></td></tr><tr><td>seriologiczna pipeta 5 ml</td><td>greiner bio-one</td><td>606107</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator komórek</td><td>Fischer</td><td></td><td>Heracell 160i</td></tr><tr><td>BD FacsCanto II cytometr przepływowy</td><td>BD biosciences</td> Wirówka kliniczna <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman redlica wysiewająca</td><td></td><td>model X-14R</td></tr></tbody></table>

trawienie mysiej wątroby do analizy cytometrycznej przepływowej komórek śródbłonka limfatycznego

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

W wątrobie, naczynia limfatyczne znajdują się w triadzie portalowej, a ich opisaną funkcją jest usuwanie płynu śródmiąższowego z wątroby do węzłów chłonnych, gdzie można badać resztki komórkowe i antygeny. Jesteśmy bardzo zainteresowani zrozumieniem, w jaki sposób układ naczyniowy limfatyczny może być zaangażowany w stan zapalny i funkcjonowanie komórek odpornościowych w wątrobie. Jednak bardzo niewiele opublikowano ustanawiając protokoły trawienia do izolacji komórek śródbłonka limfatycznego (LEC) z wątroby lub specyficzne markery, które można wykorzystać do oceny LEC wątroby w przeliczeniu na komórkę. Dlatego zoptymalizowaliśmy metodę trawienia i barwienia wątroby w celu oceny populacji LEC w wątrobie. Jesteśmy przekonani, że opisana tutaj metoda będzie przydatna do identyfikacji i izolacji LEC z wątroby i wzmocni nasze zrozumienie, w jaki sposób LEC reagują na mikrośrodowisko wątroby.

Badania analizujące limfatykę wątroby opierały się głównie na immunohistochemii w celu ilościowego określenia częstotliwości występowania i średnicy naczyń limfatycznych w wątrobie. Metoda ta nie pozwala jednak na ocenę LEC w ujęciu pojedynczych komórek ani na analizę ekspresji wielu markerów, cytokin, chemokin lub czynników transkrypcyjnych. W związku z tym zbadaliśmy, czy LEC wątroby można wyizolować z organu i ocenić za pomocą cytometrii przepływowej. Poprzednie prace dotyczące izolacj...

Celem tego protokołu jest identyfikacja populacji komórek śródbłonka limfatycznego w wątrobie za pomocą opisanych markerów. Wykorzystujemy kolagenazę IV i DNazę oraz delikatne mielenie tkanki w połączeniu z cytometrią przepływową, aby zidentyfikować odrębną populację komórek śródbłonka limfatycznego.

Trawienie mysiej wątroby do analizy cytometrycznej przepływowej komórek śródbłonka limfatycznego

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie limfy i wątroby, takie jak to, w jaki sposób komórki śródbłonka limfatycznego (LEC) reagują na określone bodźce i jak przyczynia się to do patogenezy choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy ocenić fenotyp i funkcję komórek śródbłonka limfatycznego wątroby na podstawie każdej komórki i może być stosowana do dalszych zastosowań po sortowaniu komórek. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w biologię limfatyczną wątroby, może być również stosowana do oceny komórek śródbłonka limfatycznego z różnych tkanek, takich jak skóra i gruczoł sutkowy.Procedurę zademonstruje Jeffrey Finlon, profesjonalny asystent naukowy z mojego laboratorium. Aby przygotować zawiesinę jednokomórkową z wyizolowanych komórek wątroby, zacznij od spryskania myszy siedemdziesięcioprocentowym etanolem i przymocowania łap do deski sekcyjnej. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć skórę około jednego centymetra nad odbytem i użyj kleszczy zębatych, aby oderwać skórę od ciała.Włóż końcówki nożyczek między skórę a otrzewną i otwórz nożyczki, aby oddzielić tkanki przed kontynuowaniem nacinania skóry aż do szyi. Przymocuj skórę do deski preparacyjnej pod każdą kończyną przednią i nad każdą kończyną tylną, a następnie pociągnij worek otrzewnowy do góry, aby przedłużyć nacięcie w kierunku szyi. Chwyć płaty wątroby i przetnij tuż pod mostkiem, aby umożliwić rozwarstwienie wokół wątroby.Następnie przenieś narząd do czterech mililitrów pożywki EHAA firmy Click. Za pomocą skalpela pokrój wątrobę na kawałki o średnicy około jednego milimetra i strawij je w pięciuset mikrolitrach świeżo przygotowanego roztworu wytrawiającego i pięciuset mikrolitrach DNazy 1. Po piętnastu minutach w temperaturze trzydziestu siedmiu stopni Celsjusza użyj pipety o pojemności pięciuset mililitrów, aby dokładnie wymieszać tkanki i włóż pojemnik do inkubatora na kolejne piętnaście minut.Pod koniec inkubacji przenieść strawioną próbkę przez sitko o średnicy stu mikronów do stożkowej probówki o średnicy pięćdziesięciu mililitrów i za pomocą tłoka ze strzykawki o pojemności jednego mililitra delikatnie przecisnąć pozostałe kawałki tkanki przez siatkę. Umyj filtr pięcioma mililitrami buforu izolacyjnego i delikatnie przeciśnij pozostałą tkankę przez sitko. Zebrać izolowane komórki wątroby przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w czterech mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek.Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej umyj komórki w dziesięciu mililitrach buforu izolacyjnego i policz komórki na hemocytometrze, aby określić pełną liczbę wątroby. Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach dwudziestoprocentowego jodiksanolu i nałożyć zawiesinę komórek na jeden mililitr PBS. Oddzielić komórki przez separację gradientu gęstości i zebrać warstwę między PBS a jodiksanolem.Następnie przefiltruj komórki przez sitko o średnicy stu mikrometrów do nowej stożkowej rurki o pojemności pięćdziesięciu mililitrów. Umyj komórki w dziesięciu mililitrach świeżego buforu izolacyjnego i ponownie zawieś powstały osad w pięciuset mikrolitrach PBS, uzupełnionych dwuprocentową płodową surowicą bydlęcą lub FBS. Po policzeniu, podwielokrotność około pięć razy dziesięć do szóstych komórek niemiąższowych do każdej studzienki kontrolnej i doświadczalnej dziewięćdziesięciosześciodołkowej płytki do odwirowania i ponownie zawiesić granulki w dziewięćdziesięciu mikrolitrach PBS plus FBS na studzienkę.Dodać odpowiednie eksperymentalne i kontrolne koktajle przeciwciał pierwotnych do każdej studzienki i zabarwić wszystkie studzienki odpowiednim markerem żywotności. Najważniejszym krokiem w tej procedurze jest właściwe miareczkowanie przeciwciał i użycie kontroli typu lodu i kontroli fluorescencji-1 w celu walidacji barwienia. Po trzydziestu minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza odwirować przepłukać komórki stu mikrolitrami PBS plus FBS na stu stu mikrolitrów PBS plus FBS na studzienkę i przenieść komórki z każdej stustu stu mikrolitrów do indywidualnych pięciomililitrowych probówek do cytometrii przepływowej o objętości końcowej 400 mikrolitrów PBS plus FBS na probówkę.Następnie użyj niewielkiej objętości komórek, aby dostosować ustawienia lasera i kompensacji na cytometrze przepływowym i odczytać wszystkie zdarzenia dla każdej probówki. Po odczytaniu wszystkich probówek należy zaimportować dane do odpowiedniego programu do analizy cytometrii przepływowej. Bramka na żywych komórkach w oparciu o barwnik markera żywotności, w którym ujemna ekspresja jest uważana za żywą.Bramka na żywych komórkach w oparciu o wielkość i ziarnistość komórek, a także ich żywość marker ekspresji barwnika, a następnie bramkowanie na populacji komórek CD45 ujemnych CD31 dodatnich przy użyciu odpowiedniej kontroli izotypu i danych fluorescencji-1 w celu określenia populacji dodatnich i ujemnych. Następnie bramkują komórki CD45 ujemne CD31 dodatnie zgodnie z ich ekspresją CD16 / 32 i podoplaniny, aby umożliwić identyfikację CD45 ujemnych CD31 dodatnich, CD16 / 32 ujemnych śródbłonka limfatycznego podoplaniny dodatniej i CD45 ujemnych CD31, CD16 / 32 dodatnich podoplaniny ujemnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby. Emfatyczne komórki śródbłonka wyrażają naczynie limfatyczne i śródbłonkowe hialuronianowe, ale nie CD146.Wyizolowane przez wątrobę komórki CD16 / 32 dodatnie CD16 / 32, jak wykazano, są również CD146 dodatnie i podoplaninowo-dodatnie, podczas gdy CD31 dodatnie komórki CD16 / 32 są głównie CD146 ujemne i albo podoplaniny dodatnie, albo ujemne. Dodatniość określono na podstawie barwienia fluorescencyjną-1. Komórki śródbłonka limfatycznego wątroby są CD146 ujemne i PDPN dodatnie.Ani śródbłonek naczyniowy, ani mysie makrofagi wątrobowe nie wykazują ekspresji podoplaniny. Barwienie podoplaniną może być również stosowane do odróżniania cholangiocytów od naczyń limfatycznych na podstawie odrębnych struktur jądrowych dróg żółciowych, a także przez barwienie cytokeratyną 7. Ponieważ tylko komórki śródbłonka limfatycznego wykazują współekspresję receptora 3 czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych i białka 1 homeobox Prospero w wątrobie, markery te mogą być dalej wykorzystywane do potwierdzenia czystości posortowanej populacji komórek śródbłonka limfatycznego wątroby.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkiej pracy i utrzymywaniu komórek na lodzie. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak sortowanie przepływowe populacji LEC, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak profilowanie transkrypcyjne LEC. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią limfatyczną specyficzną dla wątroby do zbadania, w jaki sposób limfa wpływa na choroby wątroby u myszy i ludzi.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ komórki śródbłonka limfatycznego są rzadką, stopniową populacją w wątrobie i metoda musi być wykonana szybko.

digestion-murine-liver-for-flow-cytometric-analysis-lymphatic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metoda cytometrii przepływowej do identyfikacji i analizy molekularnej mysich progenitorów i prekursorów erytroidalnych specyficznych dla stadium różnicowania, bezpośrednio w świeżo pobranym szpiku kostnym, śledzionie lub wątrobie płodowej myszy. Analiza opiera się na markerach powierzchniowych CD71, Ter119 oraz wielkości komórek.

Identyfikacja i analiza prekursorów erytroidalnych myszy z wykorzystaniem analizy cytometrycznej CD71/TER119

Niniejszy artykuł przedstawia metodę opartą na cytometrii przepływowej do badania składu immunologicznego aorty. W pracy zaprezentowano również dodatkową technikę, która umożliwia oddzielne badanie otaczającej osłonki zewnętrznej oraz ściany naczynia. Metoda ta otwiera możliwości przeprowadzania analiz fenotypowych leukocytów aortalnych oraz zastosowania wielu testów immunologicznych w badaniach nad miażdżycą.

Analiza cytometryczna komórek odpornościowych w aortach mysich

Rośnie zainteresowanie ilościową charakterystyką limfocytów jelitowych ze względu na coraz większą świadomość, że komórki te odgrywają kluczową rolę w różnych chorobach jelitowych i ogólnoustrojowych. W tym protokole opisujemy, jak izolować populacje pojedynczych komórek z różnych przedziałów jelita cienkiego w celu późniejszej charakterystyki cytometrii przepływowej.

Izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego

Urazom wątroby towarzyszy ekspansja komórek progenitorowych, które reprezentują niejednorodną populację komórek. Nowatorska klasyfikacja tego przedziału komórkowego pozwala na rozróżnienie wielu podzbiorów. Opisana tutaj metoda ilustruje analizę cytometrii przepływowej i izolację różnych podzbiorów o wysokiej czystości, które można wykorzystać do dalszych testów.

Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

Opisano prosty i niezawodny model gryzoni indukowany dietą dla niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH), osiągnięty dzięki trzymaniu zwierząt bez SPF i podawaniu specyficznej diety wysokotłuszczowej. Opisujemy identyfikację podzbiorów komórek odpornościowych wątroby i tkanki tłuszczowej w celu podsumowania ludzkich warunków immunologicznych poprzez wystawienie myszy na zarazki środowiskowe.

Zaawansowany mysi model niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby w połączeniu z cukrzycą typu 2

Ten protokół zapewnia metodę trawienia całych oczu do pojedynczej zawiesiny komórkowej w celu wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływu w celu identyfikacji specyficznych jednojądrzastych populacji fagocytarnych oczu, w tym monocytów, mikrogleju, makrofagów i komórek dendrytycznych.

Trawienie całych oczu myszy do wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływowej fagocytów jednojądrzastych

W tym badaniu prezentujemy skuteczny i powtarzalny protokół izolowania populacji immunologicznych mysiego układu oddechowego. Zapewniamy również metodę identyfikacji wszystkich wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych, które znajdują się w płucach zdrowych myszy, przy użyciu 9-kolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza cytometrii przepływowej w celu identyfikacji wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych płuc myszy

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Obecny protokół opisuje szczegółowy protokół chirurgiczny izolowania przepływającej limfy jelitowej w odpowiedzi na infuzje składników odżywczych dodwunastnicy u myszy. Pozwala to na fizjologiczne określenie całkowitego wchłaniania lipidów w jelitach oraz syntezy i wydzielania chylomikronu w odpowiedzi na różne eksperymentalne składniki odżywcze.

Izolacja przepływającej limfy krezkowej u myszy w celu ilościowego określenia in vivo kinetyki wchłaniania lipidów w diecie i wydzielania chylomikronu

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację żywych populacji immunologicznych i nieimmunologicznych z płuc myszy w stanie ustalonym i po zakażeniu grypą. Zapewnia również strategie bramkowania do identyfikacji podzbiorów komórek nabłonkowych i szpikowych.

Izolacja żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy

Naucz się trawienia mysiej wątroby do analizy cytometrycznej komórek śródbłonka limfatycznego. Ta metoda umożliwia izolację i badanie fenotypu LEC na poziomie pojedynczych komórek.

Trawienie mysiej wątroby do analizy cytometrycznej przepływowej komórek śródbłonka limfatycznego

Przeglądaj więcej filmów