Analiza mikrośrodowiska wątroby we wczesnej progresji niealkoholowego raka wątrobowokomórkowego związanego z stłuszczeniową chorobą wątroby u danio pręgowanego

Nasze modele i protokół raka wątroby danio pręgowanego zapewniają wyjątkową okazję do nieinwazyjnej wizualizacji in vivo mikrośrodowiska wątroby i krajobrazu immunologicznego za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Przezroczystość larw danio pręgowanego jest niewątpliwie główną zaletą tego systemu, który pozwala nam na wykonanie nieinwazyjnej mikroskopii przyżyciowej i uzyskanie wglądu w mikrośrodowisko i infiltrację komórek odpornościowych głębokich tkanek i narządów, takich jak wątroba. Nasz model nerczycowy indukowany dietą i techniki obrazowania opisane w tym protokole można łatwo zastosować do zawiłych interakcji komórka-komórka w innych chorobach wątroby lub dziedzinach badań, w tym w zespole metabolicznym i chorobach sercowo-naczyniowych.

Procedurę zademonstrują Cassia Michael, nasz technik laboratoryjny, oraz dr Francisco Juan Martinez-Navarro, adiunkt w moim laboratorium. Na początek zważ cztery gramy komercyjnej suchej karmy dla larw danio pręgowanego w dwóch 25-mililitrowych szklanych zlewkach, jednej dla normalnej diety, a drugiej dla diety 10% wysokiej zawartości cholesterolu lub HCD. Odważ 0,4 grama cholesterolu w szklanej zlewce o pojemności 10 mililitrów i przykryj zlewkę folią.

W dygestorii odmierz pięć mililitrów eteru dietylowego za pomocą 10-mililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 20. Następnie dodaj eter dietylowy do zwykłej zlewki dietetycznej i natychmiast wymieszaj go z suchą karmą za pomocą szpatułki. Odmierz kolejne pięć mililitrów eteru dietylowego za pomocą tej samej strzykawki i igły i dodaj je do zlewki zawierającej HCD.

Wymieszać natychmiast, zasysając strzykawką w górę i w dół. Szybko dodaj roztwór cholesterolu do zlewki HCD i natychmiast wymieszaj go szpatułką, aż roztwór będzie jednolity. Pozostaw zlewki w okapie na maksymalnie 24 godziny, aby całkowicie odparować eter dietylowy.

Następnego dnia zmiel dietę na drobne cząstki za pomocą tłuczka i moździerza. Przenieś każdą dietę do małej, oznakowanej plastikowej torby lub 50-mililitrowej probówki wirówkowej i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Ustaw transgeniczne żyłki do ryb w dniu minus jeden.

W dniu zerowym zbierz jaja w sitku siatkowym po tarle ryb. Za pomocą butelki do mycia z E3 dokładnie opłucz jajka i ostrożnie przenieś je na 10-centymetrowe szalki Petriego z podłożem E3. Oczyść płytki ze wszystkich zanieczyszczeń, które mogły nagromadzić się w skrzynkach hodowlanych, w tym martwych lub niezapłodnionych jaj, aby uniknąć niekontrolowanego wzrostu mikroorganizmów i wynikających z tego wad w rozwoju larw.

Następnie podziel jajka o gęstości 70 lub 80 jaj na naczynie zawierające 25 mililitrów E3. Pierwszego dnia należy sprawdzić i oczyścić martwe zarodki lub zarodki z wadami rozwojowymi pod lunetą preparacyjną wyposażoną w bazę do transilluminacji. Piątego dnia połącz larwy ze wszystkich szalek na 15-centymetrowej szalce Petriego i dodaj E3 bez błękitu metylenowego. Podziel larwy w karmnikach i nakarm je zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym.

Trzymaj larwy w pomieszczeniu danio pręgowanego lub w inkubatorze w temperaturze 28 stopni Celsjusza w cyklu ciemnego światła i karm je dwa razy dziennie od 5 do 12 dnia. Codziennie usuwaj resztki jedzenia, a także od 90 do 95% podłoża za pomocą systemu próżniowego przymocowanego do jednomililitrowej końcówki pipety. Następnie ostrożnie wlej nowy E3 bez błękitu metylenowego do jednego rogu karmnika, aby uniknąć uszkodzenia larw.

Alternatywnie larwy można podzielić na trzylitrowe zbiorniki z wodą systemową i umieścić jako samodzielną jednostkę systemową o niskim przepływie wody. Ta alternatywa oszczędza czas potrzebny na codzienny proces czyszczenia, a system filtracji pomaga utrzymać larwy w zdrowiu aż do punktu końcowego. W dniu 13 przygotuj naczynia do zbierania zgodnie z liczbą warunków eksperymentalnych, które zostały ustawione.

Wlej tyle E3 bez błękitu metylenowego, aby pokryć dno każdego naczynia. Następnie ostrożnie, za pomocą systemu próżniowego, zassaj wodę ze skrzynek do karmienia. Gdy poziom wody zacznie się obniżać, powoli podnieś karmnik, aby larwy podpłynęły do jednego z rogów, a następnie zasysaj w przeciwnym kierunku.

Gdy pozostanie tylko około 20 do 30 mililitrów płynu, ostrożnie zdekantuj larwy do przygotowanej szalki Petriego i umieść oznaczoną taśmę z pudełka do karmienia na pokrywie naczynia. Na stereomikroskopie fluorescencyjnym przebadaj znieczulone larwy pod kątem pożądanych markerów fluorescencyjnych. Następnie dodać trikainę E3 do komór urządzenia do nawijania i uwięzienia.

Usunąć pęcherzyki powietrza z komór i kanału ograniczającego za pomocą mikropipety P-200. Usuń cały nadmiar tricainy E3, pozostawiając tylko tyle objętości, aby wypełnić komory. Następnie przenieś znieczulone larwy do komory załadowczej urządzenia do zraniania i uwięzienia i umieść je w celu obrazowania lewego płata za pomocą narzędzia do rzęs.

Zobrazuj morfologię wszystkich wymaganych komórek w wątrobie pod mikroskopem konfokalnym, jak opisano w rękopisie tekstowym. Otwórz oprogramowanie Fiji. Następnie otwórz plik obrazu i zaznacz opcję Podziel kanały na karcie Opcje importu Bio-Format.

Po utworzeniu projekcji maksymalnej intensywności dla każdego kanału, utwórz ROI otaczający wątrobę larwy i zmierz obszar wątroby. Następnie dodaj pasek skali jako odniesienie i utwórz drugi zwrot z inwestycji, obejmujący obszar wątroby i 75 mikrometrów otaczającego obszaru. W menu Wtyczki wybierz opcję Analizuj, a następnie Licznik komórek i policz komórki odpornościowe w obszarze rekrutacji.

Zapisz liczbę zrekrutowanych komórek odpornościowych w arkuszu kalkulacyjnym. Oblicz gęstość neutrofili, makrofagów i limfocytów T, normalizując liczbę komórek odpornościowych na obszar wątroby. Larwy danio pręgowanego HCC karmione normalną dietą nie wykazują stłuszczenia wątroby, mierzonego za pomocą barwienia czerwienią olejową O.

Jednak larwy HCC karmione HCD wykazują znaczny wzrost stłuszczenia wątroby. Po ośmiu dniach ekspozycji na nadmiar cholesterolu zaobserwowano powiększenie wątroby u larw HCC. Aby ocenić powiększenie wątroby, oceniano obszar wątroby, obszar wątroby i objętość wątroby.

W HCC związanym z niealkoholowym stłuszczeniowym zapaleniem wątroby obszar hepatocytów wraz z obszarem jądrowym i stosunek jądra do cytoplazmy były zwiększone. Znaczny spadek cyrkularności jądrowej zaobserwowano również w grupie HCC karmionej dietą wysokotłuszczową. Za pomocą markera H2B-mCherry wykryto większą częstość występowania mikrojąder u larw HCC karmionych HCD.

Ocena naczyń krwionośnych wątroby wykazała znaczny wzrost gęstości naczyń u larw HCC karmionych HCD. Naciekanie makrofagów i neutrofili występowało zarówno w HCC, jak i HCC karmionym larwami HCD. Oznaczanie ilościowe neutrofili w makrofagach w wątrobie i jej otoczeniu wykazało znaczny wzrost liczby i gęstości komórek u larw HCC karmionych HCD.

Natomiast znaczny spadek gęstości limfocytów T w ogólnej liczbie zaobserwowano u larw HCC karmionych HCD. Czyszczenie zbiorników i karmienie są najważniejszymi krokami zapewniającymi żywotność larw i zapobiegającymi rozwojowi stłuszczenia lub przewlekłego zapalenia wątroby i układowego zapalenia w grupie kontrolnej z powodu złej jakości wody lub niewłaściwego karmienia. Można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia poklatkowa i analiza interakcji między różnymi komórkami zasiedlającymi wątrobę.

Ponadto można przeprowadzić poszukiwanie jednokomórkowego RNA w wypreparowanych wątrobach w różnych stadiach raka wątroby, aby w pełni zrozumieć, w jaki sposób krajobraz immunologiczny wątroby ewoluuje wraz z postępem choroby.