Name: Analiza mikrośrodowiska wątroby we wczesnej progresji niealkoholowego raka wątrobowokomórkowego związanego z stłuszczeniową chorobą wątroby u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Poznaj metodę nieinwazyjnego obrazowania mikrośrodowiska wątroby i dynamiki komórek odpornościowych w modelu NASH-związanego raka wątrobowokomórkowego u larw Danio rerio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor chciałby podziękować technikom z Albert Einstein College of Medicine, Clintonowi DePaolo i Spartakowi Kalininowi za pomoc i konserwację naszych linii do danio pręgowanego. FJMN jest wspierany przez Instytut Badań nad Rakiem oraz Fundację Raka Fibrolamellar.

<ol><li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease-Related+Hepatocellular+Carcinoma%3A+A+Problem+of+Growing+Magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Seminals+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic Fatty Liver Disease-Related Hepatocellular Carcinoma: A Problem of Growing Magnitude.</a> Seminals in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li>
<li>El-Serag, H. B., Kanwal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+hepatocellular+carcinoma+in+the+United+States%3A+where+are+we%3F+Where+do+we+go%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of hepatocellular carcinoma in the United States: where are we? Where do we go.</a> Hepatology. 60 (5), 1767-1775 (2014).</li>
<li>Estes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+NAFLD+disease+burden+in+China%2C+France%2C+Germany%2C+Italy%2C+Japan%2C+Spain%2C+United+Kingdom%2C+and+United+States+for+the+period+2016-2030%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Modeling NAFLD disease burden in China, France, Germany, Italy, Japan, Spain, United Kingdom, and United States for the period 2016-2030.</a> Journal of Hepatology. 69 (4), 896-904 (2018).</li>
<li>Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+epidemic+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease+demonstrates+an+exponential+increase+in+burden+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease.</a> Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).</li>
<li>Meli, R., Mattace Raso, G., Calignano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+innate+immune+response+in+non-alcoholic+Fatty+liver+disease%3A+metabolic+complications+and+therapeutic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of innate immune response in non-alcoholic Fatty liver disease: metabolic complications and therapeutic tools.</a> Frontiers in Immunology. 5, 177(2014).</li>
<li>Ganz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+non-alcoholic+steatosis+to+steatohepatitis+and+fibrosis+parallels+cumulative+accumulation+of+danger+signals+that+promote+inflammation+and+liver+tumors+in+a+high+fat-cholesterol-sugar+diet+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Progression of non-alcoholic steatosis to steatohepatitis and fibrosis parallels cumulative accumulation of danger signals that promote inflammation and liver tumors in a high fat-cholesterol-sugar diet model in mice.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 193(2015).</li>
<li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAFLD+causes+selective+CD4%28%2B%29+T+lymphocyte+loss+and+promotes+hepatocarcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NAFLD causes selective CD4(+) T lymphocyte loss and promotes hepatocarcinogenesis.</a> Nature. 531 (7593), 253-257 (2016).</li>
<li>Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+drugs+for+NAFLD%3A+lessons+from+basic+models+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+International%22%5BJournal%5D)">New drugs for NAFLD: lessons from basic models to the clinic.</a> Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).</li>
<li>Wrighton, P. J., Oderberg, I. M., Goessling, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((There+is+something+fishy+about+liver+cancer%3A+Zebrafish+models+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">There is something fishy about liver cancer: Zebrafish models of hepatocellular carcinoma.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 347-363 (2019).</li>
<li>Goessling, W., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+important+tool+for+liver+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An important tool for liver disease research.</a> Gastroenterology. 149 (6), 1361-1377 (2015).</li>
<li>Huo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+profiles+of+tumor-associated+neutrophils+reveal+prominent+roles+in+enhancing+angiogenesis+in+liver+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic profiles of tumor-associated neutrophils reveal prominent roles in enhancing angiogenesis in liver tumorigenesis in zebrafish.</a> Science Reports. 9 (1), 1509(2019).</li>
<li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+neutrophils+and+macrophages+promote+gender+disparity+in+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated neutrophils and macrophages promote gender disparity in hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li>
<li>Capece, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+microenvironment+in+hepatocellular+carcinoma%3A+A+pivotal+role+for+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">The inflammatory microenvironment in hepatocellular carcinoma: A pivotal role for tumor-associated macrophages.</a> Biomed Research International. 2013, 187204(2013).</li>
<li>de Oliveira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+modulates+innate+immune-mediated+inflammation+and+early+progression+of+NAFLD-associated+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Metformin modulates innate immune-mediated inflammation and early progression of NAFLD-associated hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Journal of Hepatology. 70 (4), 710-721 (2019).</li>
<li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+device+for+improved+experimental+manipulation+of+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging device for improved experimental manipulation of zebrafish larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56340(2017).</li>
<li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((zWEDGI%3A+Wounding+and+entrapment+device+for+imaging+live+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">zWEDGI: Wounding and entrapment device for imaging live zebrafish larvae.</a> Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).</li>
<li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+chemical+inhibitors+of+beta-catenin-driven+liver+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of chemical inhibitors of beta-catenin-driven liver tumorigenesis in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).</li>
<li>Sapp, V., Gaffney, L., EauClaire, S. F., Matthews, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fructose+leads+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+that+is+reversed+by+mechanistic+target+of+rapamycin+%28mTOR%29+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fructose leads to hepatic steatosis in zebrafish that is reversed by mechanistic target of rapamycin (mTOR) inhibition.</a> Hepatology. 60 (5), 1581-1592 (2014).</li>
<li>Park, K. H., Ye, Z. W., Zhang, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid-enriched+diet+induces+hepatic+steatosis+and+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid-enriched diet induces hepatic steatosis and injury in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (6), 497-504 (2019).</li>
<li>Progatzky, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+cholesterol+directly+induces+acute+inflammasome-dependent+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Dietary cholesterol directly induces acute inflammasome-dependent intestinal inflammation.</a> Nature Communication. 5, 5864(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wraz ze zwiększoną częstością występowania HCC, w szczególności HCC indukowanego przez NASH, ogromne znaczenie ma posiadanie bardziej wydajnych modeli do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych zaangażowanych w HCC związane z NASH. Dekonwolucja interakcji komórka-komórka w wątrobie ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia progresji choroby wątroby i hepatokarcynogenezy. Podejście opisane w tym protokole oferuje unikalny sposób analizy progresji choroby wątroby in vivo i nieinwazyjnie.
Przygotowanie diety ma kluczowe znaczenie dla powodzenia w ustanowieniu modelu HCC związanego z NASH. Ważne jest, aby eter dietylowy całkowicie odparował wewnątrz dygestorium, aby uniknąć szkodliwych skutków podczas przygotowywania diety dla danio pręgowanego. Aby stosować te diety z larwami (5-12 dni po zapłodnieniu), niezwykle ważne jest zmielenie diety na drobne cząstki, aby zapewnić pobieranie pokarmu przez larwy. Zastosowanie znakowanych fluorescencyjnie analogów kwasów tłuszczowych można wykorzystać do oceny spożycia pokarmu przez larwy.
Przed umieszczeniem larw w skrzynkach hodowlanych i rozpoczęciem procedury karmienia ważne jest, aby upewnić się, że pobieranie próbek doświadczalnych jest ujednolicone poprzez zmieszanie larw z różnych płytek. Ten krok jest ważny, ponieważ różne mikrośrodowiska, począwszy od dnia 0, są promowane w każdej z płytek i mogą wpływać na odpowiedź zapalną.
Kolejnym ważnym krokiem jest policzenie larw, aby dowiedzieć się, ile pokarmu jest potrzebne do każdego pudełka do karmienia. Jeśli ilość pokarmu nie jest odpowiednia do liczby larw obecnych w każdym pudełku, wystąpi jeden z dwóch scenariuszy: 1) larwy będą niedożywione; 2) Larwy będą przekarmione. Niedokładne karmienie doprowadzi do niezdrowych warunków związanych z niedożywieniem lub przeżywieniem, takich jak stany zapalne, które drastycznie wpłyną na mikrośrodowisko wątroby. Jeśli dojdzie do niedokładnego karmienia, larwy będą wykazywać problemy z ruchem. Na tym etapie rozwoju larwy powinny intensywnie pływać, dlatego w przypadku zauważenia problemów z poruszaniem się larwy były wychowywane w niezdrowych warunkach (niedożywienie lub narażenie na toksyczne dawki cholesterolu z powodu przekarmienia). Z tego powodu procedury żywieniowe muszą być ściśle kontrolowane zarówno dla diet normalnych, jak i wzbogaconych w cholesterol. Niektóre testy można wykonać, aby szybko określić dokładność żerowania i zdrowia larw, w tym obecność powiększenia wątroby (wielkość wątroby) oraz zapalenie tkanek i narządów, zwłaszcza wątroby i jelit (widoczny zwiększony naciekanie neutrofili i makrofagów).
Codzienne czyszczenie i wymiana 95% E3 ma kluczowe znaczenie dla ograniczenia rozwoju mikroorganizmów w karmnikach oraz poprawy zdrowia i przeżywalności larw. Alternatywnie, larwy można umieścić w samodzielnym systemie stojaków. Aby uzyskać najlepsze wyniki, umieść 60-80 larw w 3-litrowym zbiorniku. Utrzymuj przepływ wody na minimalnym poziomie, dostosowując przepływ do trybu szybkiego kapania i karmiąc larwy 3-4 mg dwa razy dziennie (rano i po południu). Przepływ wody powinien być regularnie sprawdzany, aby zapewnić prawidłowy przepływ w każdym zbiorniku. W naszym laboratorium metoda ta daje nam 95-100% przeżycia przy krótkotrwałym karmieniu 10% HCD. Ponadto metoda ta znacznie zmniejszyła nakład pracy związany z codziennym czyszczeniem i wymianą wody niezbędną w opisanym protokole żywienia statycznego.
Podczas gdy zastosowaliśmy dietę wzbogaconą w 10% cholesterolem, aby wywołać NASH w krótkotrwałej ekspozycji (5 dni wystarczy, aby wywołać stłuszczeniowe zapalenie wątroby), zmiany w diecie mogą być przeprowadzone i rozszerzone o użycie fruktozy 18, kwasów tłuszczowych (takich jak kwas palmitynowy)19 lub protokołów żywieniowych, które można rozszerzyć za pomocą diety wzbogaconej w 4% cholesterol20. Obecnie istnieje niewiele skutecznych celów terapeutycznych dla HCC i żaden dla NASH. Wykorzystanie modeli danio pręgowanego to wyjątkowa okazja do poszerzenia naszej wiedzy na temat hepatokarcynogenezy, ale także nieporównywalnego systemu kręgowców do wykonywania wielkoprzepustowych badań przesiewowych leków. Techniki opisane w tym protokole ułatwią przyszłe odkrycia i cele terapeutyczne w chorobach wątroby i hepatokarcynogenezie.

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest agresywnym nowotworem o ograniczonych możliwościach terapeutycznych. Stwierdzono, że ponad 30% wszystkich pacjentów z HCC jest otyłych i ma NASH, agresywną formę NAFLD1,2,3,4. Spożywanie diet bogatych w kalorie drastycznie zwiększa dostępność kwasów tłuszczowych, które powodują miejscowe i ogólnoustrojowe zmiany metaboliczne oraz wywołują stłuszczenie, uszkodzenie hepatocytów, stan zapalny i zwłóknienie - wszystkie kluczowe cechy NASH. Progresja NASH do HCC wiąże się z akumulacją lipidów w wątrobie, co wywołuje stan zapalny i zmienia skład komórek odpornościowych5,6,7. Szczególnie interesujące i ważne jest zrozumienie, w jaki sposób mikrośrodowisko wątroby i krajobraz komórek odpornościowych zmieniają się podczas progresji choroby wątroby i jak zmieniają się one pod wpływem pewnych czynników etiologicznych. Aby lepiej określić wpływ, jaki nadmiar cholesterolu ma na mikrośrodowisko wątroby i krajobraz komórek odpornościowych, opracowaliśmy unikalny model HCC związanego z NASH u danio pręgowanego. Zastosowanie tego modelu pozwoliło nam lepiej zrozumieć wpływ diety i przeżywienia na mikrośrodowisko wątroby i postęp choroby wątroby.
Modele ssaków, takie jak myszy i próbki tkanek ludzkich, były niezbędne do zrozumienia patogenezy stłuszczeniowego zapalenia wątroby i stłuszczenia8. Myszy są preferowanym modelem chorób wątroby i raka, ale brakuje im przejrzystości optycznej na poziomie komórkowym, podczas gdy próbki tkanek ludzkich często nie mają środowiska 3D, które modele zwierzęce są w stanie naśladować. Te przeszkody sprawiły, że danio pręgowany stał się potężnym modelem w społeczności naukowej. Danio pręgowany ma niezwykłe podobieństwa do ludzi, z co najmniej 70% ochroną genów. Utrzymują mikrośrodowisko wątroby, skład komórkowy wątroby, funkcję, sygnalizację i reakcję na urazy9,10. Stosując dietę wysokocholesterolową (HCD) w połączeniu z uznanym transgenicznym modelem HCC danio pręgowanego, opracowaliśmy model HCC związanego z NASH danio pręgowanego.
Tutaj prezentujemy protokół wyjaśniający, jak wygenerować model zebry HCC związany z NASH oraz jak badać mikrośrodowisko wątroby i zajmować się wczesnymi cechami nowotworów in vivo. Korzystając z nieinwazyjnej mikroskopii konfokalnej w połączeniu z transgenicznymi liniami danio pręgowanego z fluorescencyjnie znakowaną błoną i jądrem hepatocytów, możemy zająć się wczesnymi cechami nowotworu, analizując morfologię wątroby (obszar, objętość i powierzchnię), morfologię komórek i jądrów (obszar hepatocytów, obszar jądrowy, stosunek N:C, okrągłość jądrowa, punktacja mikrojąder / przepukliny jądrowej) i angiogenezę (gęstość naczyń). Mikrośrodowisko komórek odpornościowych jest również ważną cechą hepatokarcynogenezy11,12,13,14, dlatego pokazujemy również, jak analizować skład komórek odpornościowych wątroby u larw HCC związanych z NASH, przy użyciu transgenicznych linii danio pręgowanego z oznaczonymi komórkami odpornościowymi (neutrofile, makrofagi i limfocyty T). Opisane techniki są unikalne dla modelu i niezwykle przydatne do oceny mikrośrodowiska wątroby i składu komórek odpornościowych w progresji choroby wątroby.

<table><tbody><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td>Łatwo ulega degradacji. Przechowywać -20&deg;C.</td></tr><tr><td>Zestaw nośny Corning Netwells 15 mm</td><td>Fisher</td><td>07-200-223</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki Corning Netwells</td><td>Fisher</td><td>07-200-212</td><td></td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Fisher</td><td>60-046-380</td><td>Bardzo lotny.</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #55 dumostar</td><td>Fisher</td><td>NC9504088</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Pasteur Pipety 5,75 cala</td><td>Fisher</td><td>22-183624</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd (PFA)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauka</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Dieta Złotej Perły 5&ndash; 50 nm Active Spheres</td><td>Solanka Shrimp Direct</td> <td>-</td> <td>Można użyć dowolnego komercyjnego suchego proszku dla larw.</td></tr><tr><td>Pipety z podziałką</td><td>Fisher</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4, 10X, 10 sztuk</td><td>Crystalgen</td><td>221-1422-10</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego 100X20MM</td><td>Fisher</td><td>08-747D</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Czerwony olej roztwór O 0,5% izopropanol</td><td>Sigma</td><td>O1391-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Vactrap</td><td>VWR</td><td>76207-630</td><td>System próżniowy do zbierania larw</td></tr><tr><td><silny>mikroskopy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Duży</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem</td><td>Nikon</td><td>Nikon CSU-W1</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>S9i z transpodświetlaną bazą</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Open-source program do przetwarzania obrazów Java.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.6</td><td>Płaszczyzna bitowa; Instrumenty Oksfordzkie.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza mikrośrodowiska wątroby we wczesnej progresji niealkoholowego raka wątrobowokomórkowego związanego z stłuszczeniową chorobą wątroby u danio pręgowanego

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Rak wątroby jest obecnie trzecią najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem na świecie, a rak wątrobowokomórkowy (HCC) stanowi 75-90% wszystkich przypadków raka wątroby. Wraz z wprowadzeniem skutecznych metod leczenia i zapobiegania i leczenia wirusowego zapalenia wątroby typu B/C, niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) i bardziej agresywna forma znana jako niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH) szybko stają się głównymi czynnikami ryzyka rozwoju HCC we współczesnych społeczeństwach. Aby lepiej zrozumieć rolę, jaką NASH odgrywa w rozwoju HCC, zaprojektowaliśmy gryberowo związanego z HCC. Przejrzystość optyczna i podatność genetyczna larw danio pręgowanego sprawiają, że są one atrakcyjnym i potężnym modelem do badania mikrośrodowiska wątroby i składu komórek odpornościowych za pomocą nieinwazyjnego obrazowania fluorescencyjnego na żywo. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać model zebry HCC związany z NASH do zbadania wpływu nadwyżki cholesterolu w mikrośrodowisku wątroby i jej wpływu na skład komórek odpornościowych we wczesnych stadiach choroby. Najpierw karmimy larwy HCC (s704Tg), które wyrażają aktywowaną beta-kateninę specyficzną dla hepatocytów, dietą o 10% wysokiej zawartości cholesterolu przez 8 dni, aby opracować model HCC związany z NASH. Tutaj opisujemy, jak wykorzystać różne linie transgeniczne do oceny kilku wczesnych cech nowotworu złośliwego w wątrobie za pomocą nieinwazyjnej mikroskopii konfokalnej, takich jak obszar wątroby, morfologia komórek i jądra (obszar hepatocytów, obszar jądrowy, stosunek jądra do cytoplazmy (stosunek N: C), okrągłość jądrowa, ocena mikrojąder / przepukliny jądrowej) i angiogeneza. Następnie, używając linii transgenicznych ze znakowanymi komórkami odpornościowymi (neutrofile, makrofagi i limfocyty T) pokazujemy, jak analizować skład komórek odpornościowych wątroby u larw HCC związanych z NASH. Opisane techniki są przydatne do oceny mikrośrodowiska wątroby i składu komórek odpornościowych we wczesnych stadiach hepatokarcynogenezy, ale można je również modyfikować w celu badania takich cech w innych modelach chorób wątroby.

Poprzez wprowadzenie krótkotrwałej diety wysokocholesterolejowej do modelu raka hepatokomórkowego (HCC) u rybek zebrafish, wykazującego nadekspresję specyficznej dla hepatocytów konstytutywnie aktywnej formy Beta-kateniny (s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)17, jesteśmy w stanie stworzyć niemammalijny model kręgowca dla HCC powiązanego z NASH. Postęp choroby wątroby można monitorować na wczesnym etapie, mierząc stłuszczenie wątroby, wielkość wątroby, morfologię jąder hepatocytów, angiogenezę oraz naciek komórek odpornościowych (Rysunek 1).
Larwy HCC karmione standardową dietą wykazują brak lub łagodne stłuszczenie wątroby, oceniane za pomocą barwienia Oil Red O. Natomiast larwy HCC karmione dietą wysokocholesterolową wykazują znaczny wzrost stłuszczenia wątroby (Rycina 2).
Powszechnym markerem chorób wątroby jest hepatomegalia17. Aby ocenić wielkość wątroby, larwy HCC można skrzyżować z linią transgeniczną specyficznie wykazującą marker fluorescencyjny w hepatocytach, taką jak Tg(fabp10a:H2BmCherry). W celu oceny hepatomegalii analizuje się powierzchnię wątroby (2D), pole powierzchni wątroby oraz objętość wątroby (3D). Po 8 dniach ekspozycji na nadmiar cholesterolu u larw HCC zaobserwowano powiększenie wątroby (Rycina 3).
Wykorzystując nieinwazyjną obrazowanie żywych organizmów, transgeniczne linie ryb wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w błonach hepatocytów (takich jak Tg(fabp10a:Life-actin-EGFPP)) oraz w jądrach hepatocytów (takich jak Tg(Fabp10a:H2B-mCherry)) mogą być użyte do oceny zmian w morfologii komórkowej i jądrowej związanych z procesem nowotworowym w hepatocytach. Powierzchnia hepatocytów była zwiększona w przypadku HCC powiązanego z NASH (Rysunek 4A,B,D), podobnie jak powierzchnia jądra (Rysunek 4C,E) oraz stosunek wielkości jądra do cytoplazmy (Rysunek 4F). W grupie HCD+HCC zaobserwowano również istotny spadek kolistości jądra (Rysunek 4G). Lipotoksyczność wywołuje uszkodzenia DNA, co jest cechą kancerogenezy objawiającą się obecnością mikrąder). Wykorzystując marker H2B-mCherry, zaobserwowaliśmy większą częstość występowania mikrąder w larwach z HCC karmionych dietą bogatą w cholesterol (Rysunek 4H).
Układ naczyniowy wątroby można łatwo ocenić w modelach zebrafish, wykorzystując transgeniczne linie znakowane, takie jak Tg(kdrl:mCherry) lub Tg(fli:EGFP), które znakują naczynia krwionośne. Znaczący wzrost gęstości naczyń zaobserwowano u larw HCC+HCD (Rysunek 5).
Aby zaobserwować odpowiedź zapalną wywołaną we wczesnej fazie HCC związanego z NASH, transgeniczna linia ryb wykazująca ekspresję białek fluorescencyjnych w makrofagach i neutrofilach, taka jak Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP), została skrzyżowana z transgeniczną linią HCC. Infiltracja neutrofili i makrofagów występuje zarówno w HCC, jak i w HCC karmionych HCD, co oceniono poprzez ilościowe określenie liczby i gęstości neutrofili/makrofagów w wątrobie i jej sąsiedztwie (obszar otaczający do 75µm) (Rycina 6A-H). Niemniej jednak, w grupie HCC+HCD odnotowano istotny wzrost liczby i gęstości neutrofili (Ryciny 6F-H). W 13. dniu po zapłodnieniu układ odporności adaptacyjnej jest już funkcjonalny. Wykorzystując transgeniczną linię ryb wykazującą ekspresję białka fluorescencyjnego w limfocytach T, taką jak Tg(lck:EGFP), w połączeniu z transgeniczną linią HCC, oceniono wpływ nadmiaru cholesterolu na rekrutację limfocytów T do wątroby. W larwach HCC karmionych HCD zaobserwowano istotny spadek gęstości i całkowitej liczby limfocytów T (Rycina 6I-K).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Transgeniczne linie Danio pręgowanego</td>
			<td >Referencja ZFIN</td>
			<td >Analiza</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Casper</td>
			<td >roya9; mitfaw2</td>
			<td >Staza hepatyczna</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus /   fabp10a:H2B-mCherry )</td>
			<td >s704Tg /  uwm41Tg</td>
			<td >Morfologia wątroby</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP)</td>
			<td >s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg</td>
			<td >Morfologia hepatocytów i jąder</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Venus; fli:EGFP)</td>
			<td >s704Tg / y1Tg</td>
			<td >Angiogeneza</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus;  mfap4:Tomato-CAAX; lyzC:BFP)</td>
			<td >s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg</td>
			<td >Rekrutacja makrofagów i neutrofili</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; lck:EGFP)</td>
			<td >s704Tg / cz1Tg</td>
			<td >Rekrutacja limfocytów T</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Transgeniczne linie zebrafish do wykorzystania w różnych testach.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liczba larw</td>
			<td>Rozmiar pojemnika do karmienia</td>
			<td>Dzienna ilość pokarmu (mg)</td>
			<td>Objętość E3 (ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-40</td>
			<td>Małe pudełko lęgowe</td>
			<td>3-4</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-80</td>
			<td>Mały/duży pojemnik hodowlany</td>
			<td>6-8</td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-150</td>
			<td>Duży pojemnik do rozrodu</td>
			<td>10-15</td>
			<td>500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Warunki konfiguracji karmników.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fenotyp</td>
			<td>Metoda punktacji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proszę dostarczyć tekst źródłowy do przetłumaczenia.</td>
			<td>Jądra prawidłowe, brak mikrojąder lub wypadania fragmentów chromatyny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Łagodny</td>
			<td>Niska liczba mikrojąder (mniej niż 5 na pole widzenia) i/lub wypadnięcie (herniacja)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umiarkowany/ciężki</td>
			<td>Umiarkowana do wysokiej liczba mikrojąder (więcej niż 5 w polu widzenia) i/lub wypukliny</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Punktacja mikrojąder i wypadania jądrowego.
<img alt="Schemat analizy wątroby rybek danio-ostrobramkowych; obrazowanie, morfologia, angiogeneza, proces komórek odpornościowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat protokołu podsumowujący główne etapy eksperymentu i podejście analityczne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment HCC; schemat stresu oksydacyjnego, pipeta, obrazy histologiczne, wykres stłuszczenia, analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Analiza kontrolna stłuszczenia wątroby - barwienie ORO. Larwy HCC karmiono dietą o normalnej lub wysokiej zawartości cholesterolu, a następnie wykonano barwienie Oil Red O (ORO) w celu oceny stłuszczenia wątroby. (A) Schemat płytki 12-dołkowej do sekwencyjnego barwienia ORO z wykorzystaniem wkładów z siatką. (B) Zdjęcie narzędzia z rzęsą używanego do manipulowania larwami. (C) Reprezentatywne obrazy wątrób zabarwionych Oil Red; larwy HCC i HCC+HCD. (D) Wykres chi-kwadrat przedstawiający procent larw z różnym stopniem oceny stłuszczenia wątroby. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza hepatocytów; wykres powierzchni i objętości obszaru wątroby; porównanie HCC i HCC+HCD; mikroskopia, dane." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy rozmiaru wątroby. Transgeniczne larwy HCC wykazujące ekspresję markera wątroby (Tg(fabp10a:H2B-mCherry)) obrazowano na żywo i nieinwazyjnie, przy użyciu odwróconego konfokalnego mikroskopu dyskowego z systemem zWEDGI. (A) Reprezentatywne rekonstrukcje 3D wątrób w larwach HCC i HCC+HCD. (B-D) Wykres przedstawiający zmiany morfologiczne wątroby, w tym pole powierzchni wątroby (B), powierzchnię całkowitą wątroby (C) oraz objętość wątroby (D) w larwach HCC i HCC+HCD. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia hepatocytów, analiza F-aktyny (biała), jąder (magenta), wykres pola powierzchni jąder hepatocytów, HCC vs. HCC+HCD." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne obrazy morfologii hepatocytów i jąder. Wykonano obrazy transgenicznych linii HCC wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych w błonach hepatocytów (Tg(fabp10a:Life-actin-EGFP)) i w jądrach hepatocytów (Tg(fabp10a:H2B-mCherry)). (A-C) Reprezentatywne rekonstrukcje 3D F-aktyny i jąder hepatocytów larw HCC oraz HCC+HCD. Otwarte groty strzałek wskazują powiększone jądra; białe groty strzałek wskazują jądra o zmienionym kształcie; czerwone strzałki wskazują mikrojądra i herniację jądrową. (D-G) Wykresy przedstawiające średnie wartości parametrów komórkowych i jądrowych w 13-dniowych larwach HCC i HCC+HCD. (D) Pole powierzchni hepatocytów. (E) Pole powierzchni jądra. (F) Stosunek jądro:cytoplazma. (G) Kolistość jądra. Każda kropka reprezentuje średnie wartości na larwę. Wykresy punktowe przedstawiają średnią ±SEM (H) Wykresy chi-kwadrat przedstawiające procent larw z różnym wynikiem oceny mikrojąder i herniacji jądrowej. Pasek skali = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie gęstości naczyń w HCC, obrazy mikroskopowe z wykresami przedstawiającymi indeks gęstości w wątrobie (p&lt;0.0001)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywne obrazy unaczynienia wątroby. Transgeniczne linie HCC z ekspresją białek fluorescencyjnych w jądrach hepatocytów (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry)) oraz w komórkach śródbłonka (Tg)fli:EGFP)). (A) Reprezentatywne rekonstrukcje 3D unaczynienia wątroby w larwach HCC i HCC+HCD. (B-C) Wykres przedstawiający indeks gęstości naczyń w odniesieniu do powierzchni wątroby (B) oraz objętości (C) w larwach HCC i HCC+HFCD. Wykresy punktowe przedstawiają średnią ±SEM. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunofluorescencja, gęstość makrofagów i neutrofili w wątrobie, HCC vs HCC+HCD, wykres i mikroskopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Reprezentatywne obrazy krajobrazu komórek odpornościowych wątroby. Transgeniczna linia HCC wykazująca ekspresję białek fluorescencyjnych w makrofagach i neutrofiliach (Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP)) lub w limfocytach T (Tg(lck-EGFP). (A,C,F>) Reprezentatywne rekonstrukcje 3D wątrób i rekrutacji leukocytów do obszaru wątroby w 13-dniowych larwach HCC i HCC+HCD. (B>) Schemat obrazowanego obszaru wątroby. (D-E) Wykres przedstawiający gęstość (D>) i liczbę (E>) makrofagów w obszarze wątroby u larw HCC i HCC+HCD. (G-H) Wykres przedstawiający gęstość (G) i liczbę (H) neutrofili w obszarze wątroby u larw HCC i HCC+HCD. (G>) Reprezentatywne rekonstrukcje 3D rekrutacji limfocytów T do obszaru wątroby u larw HCC i HCC+HCD. (H-I) Wykres przedstawiający gęstość (H>) i liczbę (I>) limfocytów T w obszarze wątroby u larw HCC i HCC+HCD. Wykresy kropkowe przedstawiają średnią ±SEM. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig06large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Tabela buforów i roztworów <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/JoVE_Table_of_buffersandsolutions.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Tutaj prezentujemy, jak wygenerować model danio pręgowanego związanego z niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby (NAFLD) w celu zbadania wpływu nadwyżki cholesterolu na mikrośrodowisko wątroby i krajobraz komórek odpornościowych.

Analiza mikrośrodowiska wątroby we wczesnej progresji niealkoholowego raka wątrobowokomórkowego związanego z stłuszczeniową chorobą wątroby u danio pręgowanego

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

Nasze modele i protokół raka wątroby danio pręgowanego zapewniają wyjątkową okazję do nieinwazyjnej wizualizacji in vivo mikrośrodowiska wątroby i krajobrazu immunologicznego za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Przezroczystość larw danio pręgowanego jest niewątpliwie główną zaletą tego systemu, który pozwala nam na wykonanie nieinwazyjnej mikroskopii przyżyciowej i uzyskanie wglądu w mikrośrodowisko i infiltrację komórek odpornościowych głębokich tkanek i narządów, takich jak wątroba. Nasz model nerczycowy indukowany dietą i techniki obrazowania opisane w tym protokole można łatwo zastosować do zawiłych interakcji komórka-komórka w innych chorobach wątroby lub dziedzinach badań, w tym w zespole metabolicznym i chorobach sercowo-naczyniowych.Procedurę zademonstrują Cassia Michael, nasz technik laboratoryjny, oraz dr Francisco Juan Martinez-Navarro, adiunkt w moim laboratorium. Na początek zważ cztery gramy komercyjnej suchej karmy dla larw danio pręgowanego w dwóch 25-mililitrowych szklanych zlewkach, jednej dla normalnej diety, a drugiej dla diety 10% wysokiej zawartości cholesterolu lub HCD. Odważ 0,4 grama cholesterolu w szklanej zlewce o pojemności 10 mililitrów i przykryj zlewkę folią.W dygestorii odmierz pięć mililitrów eteru dietylowego za pomocą 10-mililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 20. Następnie dodaj eter dietylowy do zwykłej zlewki dietetycznej i natychmiast wymieszaj go z suchą karmą za pomocą szpatułki. Odmierz kolejne pięć mililitrów eteru dietylowego za pomocą tej samej strzykawki i igły i dodaj je do zlewki zawierającej HCD.Wymieszać natychmiast, zasysając strzykawką w górę i w dół. Szybko dodaj roztwór cholesterolu do zlewki HCD i natychmiast wymieszaj go szpatułką, aż roztwór będzie jednolity. Pozostaw zlewki w okapie na maksymalnie 24 godziny, aby całkowicie odparować eter dietylowy.Następnego dnia zmiel dietę na drobne cząstki za pomocą tłuczka i moździerza. Przenieś każdą dietę do małej, oznakowanej plastikowej torby lub 50-mililitrowej probówki wirówkowej i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Ustaw transgeniczne żyłki do ryb w dniu minus jeden.W dniu zerowym zbierz jaja w sitku siatkowym po tarle ryb. Za pomocą butelki do mycia z E3 dokładnie opłucz jajka i ostrożnie przenieś je na 10-centymetrowe szalki Petriego z podłożem E3. Oczyść płytki ze wszystkich zanieczyszczeń, które mogły nagromadzić się w skrzynkach hodowlanych, w tym martwych lub niezapłodnionych jaj, aby uniknąć niekontrolowanego wzrostu mikroorganizmów i wynikających z tego wad w rozwoju larw.Następnie podziel jajka o gęstości 70 lub 80 jaj na naczynie zawierające 25 mililitrów E3. Pierwszego dnia należy sprawdzić i oczyścić martwe zarodki lub zarodki z wadami rozwojowymi pod lunetą preparacyjną wyposażoną w bazę do transilluminacji. Piątego dnia połącz larwy ze wszystkich szalek na 15-centymetrowej szalce Petriego i dodaj E3 bez błękitu metylenowego. Podziel larwy w karmnikach i nakarm je zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym.Trzymaj larwy w pomieszczeniu danio pręgowanego lub w inkubatorze w temperaturze 28 stopni Celsjusza w cyklu ciemnego światła i karm je dwa razy dziennie od 5 do 12 dnia. Codziennie usuwaj resztki jedzenia, a także od 90 do 95% podłoża za pomocą systemu próżniowego przymocowanego do jednomililitrowej końcówki pipety. Następnie ostrożnie wlej nowy E3 bez błękitu metylenowego do jednego rogu karmnika, aby uniknąć uszkodzenia larw.Alternatywnie larwy można podzielić na trzylitrowe zbiorniki z wodą systemową i umieścić jako samodzielną jednostkę systemową o niskim przepływie wody. Ta alternatywa oszczędza czas potrzebny na codzienny proces czyszczenia, a system filtracji pomaga utrzymać larwy w zdrowiu aż do punktu końcowego. W dniu 13 przygotuj naczynia do zbierania zgodnie z liczbą warunków eksperymentalnych, które zostały ustawione.Wlej tyle E3 bez błękitu metylenowego, aby pokryć dno każdego naczynia. Następnie ostrożnie, za pomocą systemu próżniowego, zassaj wodę ze skrzynek do karmienia. Gdy poziom wody zacznie się obniżać, powoli podnieś karmnik, aby larwy podpłynęły do jednego z rogów, a następnie zasysaj w przeciwnym kierunku.Gdy pozostanie tylko około 20 do 30 mililitrów płynu, ostrożnie zdekantuj larwy do przygotowanej szalki Petriego i umieść oznaczoną taśmę z pudełka do karmienia na pokrywie naczynia. Na stereomikroskopie fluorescencyjnym przebadaj znieczulone larwy pod kątem pożądanych markerów fluorescencyjnych. Następnie dodać trikainę E3 do komór urządzenia do nawijania i uwięzienia.Usunąć pęcherzyki powietrza z komór i kanału ograniczającego za pomocą mikropipety P-200. Usuń cały nadmiar tricainy E3, pozostawiając tylko tyle objętości, aby wypełnić komory. Następnie przenieś znieczulone larwy do komory załadowczej urządzenia do zraniania i uwięzienia i umieść je w celu obrazowania lewego płata za pomocą narzędzia do rzęs.Zobrazuj morfologię wszystkich wymaganych komórek w wątrobie pod mikroskopem konfokalnym, jak opisano w rękopisie tekstowym. Otwórz oprogramowanie Fiji. Następnie otwórz plik obrazu i zaznacz opcję Podziel kanały na karcie Opcje importu Bio-Format.Po utworzeniu projekcji maksymalnej intensywności dla każdego kanału, utwórz ROI otaczający wątrobę larwy i zmierz obszar wątroby. Następnie dodaj pasek skali jako odniesienie i utwórz drugi zwrot z inwestycji, obejmujący obszar wątroby i 75 mikrometrów otaczającego obszaru. W menu Wtyczki wybierz opcję Analizuj, a następnie Licznik komórek i policz komórki odpornościowe w obszarze rekrutacji.Zapisz liczbę zrekrutowanych komórek odpornościowych w arkuszu kalkulacyjnym. Oblicz gęstość neutrofili, makrofagów i limfocytów T, normalizując liczbę komórek odpornościowych na obszar wątroby. Larwy danio pręgowanego HCC karmione normalną dietą nie wykazują stłuszczenia wątroby, mierzonego za pomocą barwienia czerwienią olejową O.Jednak larwy HCC karmione HCD wykazują znaczny wzrost stłuszczenia wątroby. Po ośmiu dniach ekspozycji na nadmiar cholesterolu zaobserwowano powiększenie wątroby u larw HCC. Aby ocenić powiększenie wątroby, oceniano obszar wątroby, obszar wątroby i objętość wątroby.W HCC związanym z niealkoholowym stłuszczeniowym zapaleniem wątroby obszar hepatocytów wraz z obszarem jądrowym i stosunek jądra do cytoplazmy były zwiększone. Znaczny spadek cyrkularności jądrowej zaobserwowano również w grupie HCC karmionej dietą wysokotłuszczową. Za pomocą markera H2B-mCherry wykryto większą częstość występowania mikrojąder u larw HCC karmionych HCD.Ocena naczyń krwionośnych wątroby wykazała znaczny wzrost gęstości naczyń u larw HCC karmionych HCD. Naciekanie makrofagów i neutrofili występowało zarówno w HCC, jak i HCC karmionym larwami HCD. Oznaczanie ilościowe neutrofili w makrofagach w wątrobie i jej otoczeniu wykazało znaczny wzrost liczby i gęstości komórek u larw HCC karmionych HCD.Natomiast znaczny spadek gęstości limfocytów T w ogólnej liczbie zaobserwowano u larw HCC karmionych HCD. Czyszczenie zbiorników i karmienie są najważniejszymi krokami zapewniającymi żywotność larw i zapobiegającymi rozwojowi stłuszczenia lub przewlekłego zapalenia wątroby i układowego zapalenia w grupie kontrolnej z powodu złej jakości wody lub niewłaściwego karmienia. Można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia poklatkowa i analiza interakcji między różnymi komórkami zasiedlającymi wątrobę.Ponadto można przeprowadzić poszukiwanie jednokomórkowego RNA w wypreparowanych wątrobach w różnych stadiach raka wątroby, aby w pełni zrozumieć, w jaki sposób krajobraz immunologiczny wątroby ewoluuje wraz z postępem choroby.

analysis-liver-microenvironment-during-early-progression-non

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Aby pomóc ocenić mechanizmy molekularne leżące u podstaw regeneracji wątroby u danio pręgowanego za pomocą dróg żółciowych, stworzyliśmy model uszkodzenia wątroby, w którym hepatocyty wykazujące ekspresję nitroreduktazy są genetycznie ablowane po leczeniu metronidazolem.  W tym protokole opisujemy, jak umiejętnie manipulować, monitorować i analizować ablację hepatocytów i regenerację wątroby napędzaną przez żółć.

Ablacja specyficzna dla hepatocytów u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji wątroby napędzanej przez drogi żółciowe

Trwałe zwłóknienie z odkładaniem się nadmiernej ilości białek macierzy zewnątrzkomórkowej prowadzi do marskości wątroby. Nadużywanie alkoholu jest jedną z głównych przyczyn ciężkich chorób wątroby. Stworzyliśmy model zwłóknienia wątroby danio pręgowanego indukowanego etanolem, aby zbadać mechanizmy i strategie promowania regeneracji hepatocytów po uszkodzeniu wywołanym alkoholem.

Opracowanie modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji hepatocytów za pośrednictwem komórek progenitorowych

Danio pręgowany staje się cennym modelem przetwarzania lipidów w diecie i chorób metabolicznych. Opisano protokoły żywienia larw bogatych w lipidy, obrazowanie na żywo fluorescencyjnych analogów lipidów w diecie oraz ilościowe oznaczanie spożycia pokarmu. Techniki te można zastosować do różnych technik badań przesiewowych, obrazowania i dociekań opartych na hipotezach.

Paradygmat żywienia wysokotłuszczowego dla larw danio pręgowanego: karmienie, obrazowanie na żywo i kwantyfikacja spożycia pokarmu

Ten protokół opisuje analizy histologiczne wątroby larw danio pręgowanego, które były leczone 2% etanolem przez 24 godziny. Takie ostre leczenie etanolem powoduje stłuszczenie wątroby i obrzęk naczyń krwionośnych wątroby.

Analizy histologiczne ostrego alkoholowego uszkodzenia wątroby u danio pręgowanego

Tutaj demonstrujemy metodę ilościowego określania wielkości wątroby u larw danio pręgowanego, umożliwiając ocenę wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na wzrost i rozwój wątroby.

Kwantyfikacja wielkości wątroby u larw danio pręgowanego za pomocą mikroskopii jasnego pola

Tutaj udostępniamy protokół krok po kroku, z poradami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi do analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.

Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza

Recellularna macierz zewnątrzkomórkowa zdecelularizowanej wątroby szczura może być używana jako humanizowany, trójwymiarowy model ex vivo do badania dystrybucji i ekspresji transgenu wirusa lub wektora wirusowego.

Badanie wektorów wirusowych w trójwymiarowym modelu wątroby wypełnionym ludzką linią komórkową raka wątrobowokomórkowego HepG2

Zdolność klonów przerzutowych do kolonizacji odległych miejsc zależy od ich zdolności do proliferacji i/lub zdolności do przetrwania w mikrośrodowisku gospodarza bez znaczącej proliferacji. W tym miejscu przedstawiamy model zwierzęcy, który umożliwia ilościową wizualizację obu typów kolonizacji wątroby przez klony z przerzutami.

Zaawansowany zwierzęcy model przerzutów jelita grubego w wątrobie: techniki obrazowania i właściwości klonów z przerzutami

Szczegółowo opisujemy klinicznie istotny model raka jelita grubego z przerzutami do wątroby (CRLM) oraz wpływ reperfuzji niedokrwienia wątroby (I/R) na wzrost guza i przerzuty. Model ten może pomóc w lepszym zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw indukowanego przez operację wzrostu przerzutów do wątroby.

Mysi model przerzutowych guzów wątroby w warunkach uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego

Ortotopowe modele myszy z przerzutowym czerniakiem błony naczyniowej oka ludzkiej wątroby zostały stworzone przy użyciu technik chirurgicznej implantacji ortotopowej z technikami wstrzykiwania kawałków guza pochodzących od pacjenta i igieł z hodowanymi ludzkimi liniami komórkowymi czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej.

Generowanie ortotopowej platformy ksenoprzeszczepu ludzkiego czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej wątroby u myszy z niedoborem odporności

Poznaj metodę nieinwazyjnego obrazowania mikrośrodowiska wątroby i dynamiki komórek odpornościowych w modelu NASH-związanego raka wątrobowokomórkowego u larw Danio rerio.

Analiza mikrośrodowiska wątroby we wczesnej progresji niealkoholowego raka wątrobowokomórkowego związanego z stłuszczeniową chorobą wątroby u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Analiza mikrośrodowiska wątroby we wczesnej progresji niealkoholowego raka wątrobowokomórkowego związanego z stłuszczeniową chorobą wątroby u danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów