Name: Ex vivo Obrazowanie pourodzeniowej migracji komórek ziarnistych móżdżku za pomocą makroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj metodę obrazowania migracji komórek ziarnistych móżdżku szczura P10 za pomocą makroskopii konfokalnej ex vivo. Technika ta pozwala wizualizować dynamikę neuronów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Instytut Badań i Innowacji w Biomedycynie (IRIB), Platformę Obrazowania Komórek Normandii (PRIMACEN), Inserm, IBiSA, Uniwersytet w Rouen, Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego (EFRF - PeReNE, Interreg 4A), LARC-Neurosciences Network oraz Région Haute-Normandie.

Zwierzęta (samce lub samice szczurów rasy Wistar) urodziły się i były hodowane w akredytowanym ośrodku dla zwierząt (zatwierdzenie B.76-451-04), zgodnie z francuskim przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Eksperymenty przeprowadzono pod nadzorem uprawnionych badaczy (M.B, D.V. i L.G.) zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnoty Europejskiej (2010/63/UE z dnia 22 września 2010 r.) oraz francuskim Ministerstwem Rolnictwa.
1. Przygotowanie mediów i narzędzi
<ol>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego przygotować 1x BSS Hanka (HBSS) w sterylnej wodzie z 10x roztworu podstawowego zawierającego CaCl2 (1,85 g/l) / MgSO4 (0,9767 g / l) bez MgCl2. Dodać NaHCO3 (350 μg/ml) do 1x roztwór HBSS.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodać suplement N2 (ze 100-krotnego roztworu podstawowego) i roztwór penicyliny (100 jednostek/ml) -streptomycyny (0,1 mg/ml) do zmodyfikowanej mieszanki składników odżywczych F-12 (1: 1) firmy Dulbecco (DMEM).</li>
	<li>W sterylnych warunkach przygotować podwielokrotność (25 μl, 2 mM) cytoplazmatycznego barwnika fluorescencyjnego o nazwie Cell Tracker Green w DMSO (1,075 ml na 1 mg). Rozcieńczyć jedną podwielokrotność w 5 ml DMEM w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Przygotuj napełnione wiaderko na lód, aby utrzymać podłoże w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odkażaj blaty stołów laboratoryjnych i narzędzia za pomocą 70% etanolu.</li>
</ol>
2. Sekcja móżdżku od szczurów P10
<ol>
	<li>Szybko odetnij głowę szczeniętom szczura (P10) za pomocą zakrzywionych nożyczek operacyjnych za uszami, aby uzyskać początek rdzenia kręgowego.</li>
	<li>Z tyłu odciętej głowy wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry od szyi do nosa za pomocą cienkich nożyczek do tęczówki i oddziel skórę od czaszki cienkimi nożyczkami do tęczówki i kleszczami Dumont #3.</li>
	<li>Użyj cienkich nożyczek do tęczówki, aby delikatnie wykonać dwa boczne nacięcia od podstawy do obszaru rostralnego czaszki. Usuń wypreparowaną czaszkę za pomocą dwóch kleszczy #3. Odłącz mózg od wszelkich przylegających do czaszki za pomocą tych samych kleszczy.</li>
	<li>Przenieść mózg końcówką łyżki szpatułki na szalkę Petriego (Ø 35 mm) zawierającą 2 ml lodowatego podłoża HBSS.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego zawierającą mózg na większej szalce Petriego (Ø 100 mm) wypełnionej lodem i przenieść do stolika stereomikroskopu.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym wyizoluj móżdżek od mózgu poprzez dylatację za pomocą dwóch kleszczy #3. Podobnie należy usunąć resztki rdzenia kręgowego i błony szklanej.</li>
	<li>Przenieść móżdżek do nowej szalki Petriego wypełnionej HBSS (Ø 35 mm, 2 ml) za pomocą łyżki szpatułki i trzymać na lodzie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie ostrych plastrów móżdżku
<ol>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym przetnij móżdżek między robakiem a prawą półkulą, jak wskazuje strzałka z dwiema głowicami na rysunku 2A, za pomocą standardowej rękojeści skalpela #3 solidnej i ostrza chirurgicznego #15.</li>
	<li>Nałóż jedną kroplę kleju cyjanoakrylowego na krążek próbki wibratomu i odczekaj 15-25 sekund, aby wyeliminować toksyczne opary rozpuszczalnika.</li>
	<li>Zbierz przecięty móżdżek łyżką szpatułki i usuń nadmiar HBSS czystymi ręcznikami papierowymi.</li>
	<li>Zbliż móżdżek do krążka próbki. Przymocuj przyciętą krawędź do tarczy próbki i odczekaj 10 sekund.</li>
	<li>Włóż krążek z próbką do tacki buforowej z manipulatorem i obróć go tak, aby oś poprzeczna móżdżku była prostopadła do uchwytu noża. Zamocuj krążek z próbką za pomocą klucza imbusowego i delikatnie napełnij tackę buforową pożywką HBSS, aż móżdżek zostanie pokryty.</li>
	<li>Załaduj pokruszony lód do kąpieli chłodzącej.</li>
	<li>Wyczyść ostrze trzy razy 70% etanolem, aby usunąć olej.</li>
	<li>Włóż ostrze do uchwytu noża i zabezpiecz śrubą mocującą.</li>
	<li>Umieść krawędź ostrza tuż za tylną krawędzią (z punktu widzenia użytkownika) próbki i zdefiniuj ją jako punkt początkowy. Użyj polecenia forward, aby zdefiniować punkt końcowy za przednią krawędzią próbki.</li>
	<li>Wybierz prędkość cięcia na 2,5 i częstotliwość cięcia na 8. Wybierz grubość przycinania na 180 μm. Rozpocznij sekcję tkanek.</li>
	<li>Pobrać każdą sekcję za pomocą szklanej pipety Pasteura o szerokim otworze i przelać na płytkę Petriego zawierającą HBSS (Ø 35 mm) trzymaną na lodzie.</li>
	<li>Używając dwóch kleszczy #5, ostrożnie usuń opony mózgowe z móżdżku, gdy ingerujesz w ostrze. Zbierz maksymalnie 5 plasterków na móżdżek (ryc. 2B, C).</li>
	<li>Ostrożnie usuń opony mózgowe z plastrów móżdżku za pomocą dwóch kleszczy #5 pod mikroskopem stereoskopowym i delikatnie oddziel zraziki, aby lepiej obciążyć sondę.</li>
</ol>
4. Barwienie fluorescencyjne żywych interneuronów
<ol>
	<li>Przenieś plastry móżdżku za pomocą szklanej pipety Pasteura o szerokim otworze na płytkę 6-dołkową (maks. 3 plastry/na dołek). Odessać pożywkę HBSS.</li>
	<li>Inkubować plastry (maksymalnie 3 szt.) w 5 ml roztworu nasycającego barwnik fluorescencyjny (10 μM).</li>
	<li>Aby chronić przed światłem, przykryj mikropłytkę folią aluminiową. Umieść go na ruchomym stole żyroskopowym z prędkością 35 obr./min na 10 minut przy temperaturze pokojowej, aby ułatwić etykietowanie komórek.</li>
	<li>Przenieś plastry na membranę wkładu Transwell (wielkość porów 3,0 μm; Rysunek 2D) z pipetą Pasteura o szerokim otworze szklanym, ściętą. Zassać pożywkę za pomocą pipety.</li>
	<li>Wyjąć wkładkę i napełnić studzienkę 1,9 ml DMEM. Załóż wkładkę i dodaj 100 μl DMEM na wierzch plasterka, aby przykryć chusteczkę.</li>
	<li>Umieścić płytkę zawierającą wkładki hodowlane w komorze inkubatora (37 °C, 5% CO2) na 2 godziny, co wystarcza do zaobserwowania GC w ML. Ułóż tkanki płasko, aby umożliwić przyczepienie do membrany inkubatora (ryc. 2E). Upewnij się, że plastry nie wysychają.</li>
</ol>
5. Obrazowanie ex vivo za pomocą makroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Przenieś płytkę bez plastikowej pokrywki do inkubatora przymocowanego do statywu makroskopu konfokalnego. Umieść szklaną osłonę na wkładce płytki makroskopu. Utrzymuj temperaturę komory na poziomie 37,0 °C ± 0,5 °C i dostarczaj plastry ze stałym przepływem gazu (95%O2, 5% CO2) przez wkładkę płyty, aby utrzymać stałe pH. Poczekaj dodatkowe 2 godziny przed eksperymentem poklatkowym.</li>
	<li>Aby zobrazować migrację GC w wycinkach tkanki, należy oświetlić preparat światłem o długości fali 488 nm za pomocą diody laserowej za pomocą konfokalnego makroskopu skaningowego laserowego wyposażonego w suchy obiektyw X2 (odległość robocza: 39 mm, średnica: 58 mm, NA = 0,234) i wykryć emisję fluorescencji od 500 do 530 nm.
	<ol>
		<li>Aby precyzyjnie określić ruch GC, należy uzyskać obrazy z dodatkowym współczynnikiem powiększenia optycznego od 1,5 do 2,0. Zbieraj obrazy GN w jednej płaszczyźnie ogniskowej lub do 10 różnych płaszczyzn ogniskowych wzdłuż osi z co 30 minut przez maksymalnie 12 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W razie potrzeby zdjąć szklaną pokrywę i dodać małe objętości (1-10 μl) aktywatorów biologicznych lub inhibitorów do DMEM za pomocą pipety 10 μl, aby zbadać ich wpływ na migrację GC.</li>
</ol>
6. Śledzenie komórek
<ol>
	<li>Za każdym razem filmu wykonuj projekcję stosu z w trybie ecart-type w ImageJ. Moduluj poziomy kontrastu i jasności kolejnych obrazów, aby ułatwić identyfikację i śledzenie oznaczonych GC. Ręcznie zmapuj każdą pozycję na migawce referencyjnej (przy t = 0).
	<ol>
		<li>Użyj wtyczki "Śledzenie ręczne" w menu Analizuj cząstki i określ, klikając punkt ciężkości każdego ciała komórki podczas filmu poklatkowego. Wyeksportuj nieprzetworzone dane śledzenia do arkusza kalkulacyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zreorganizuj wyeksportowane surowe dane śledzenia z ImageJ za pomocą inteligentnego programu domowego (http://primacen.fr, napisanego w kodzie PHP), który identyfikuje każdą komórkę i powiązane pozycje. Korzystając z programu, oblicz całkowitą przebytą odległość i średnią prędkość migracji dla każdej komórki. Klasyfikuj i porównuj charakterystyki migracji komórek w warunkach kontrolnych i leczniczych pod odpowiednimi filtrami przy użyciu tego samego programu.</li>
</ol>

<ol><li>Komuro, Y., Kumada, T., Ohno, N., Foote, K. D., Komuro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+in+the+Cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Migration+and+Formation+of+Neuronal+Connections%3A+Comprehensive+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Migration in the Cerebellum.</a> Cellular Migration and Formation of Neuronal Connections: Comprehensive Developmental Neuroscience. 2, 281-297 (2013).</li>
<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22Development+of+the+cerebellar+system+in+relation+to+its+evolution%2C+structure%2C+and+functions%22">Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions</a>. , CRC Press. Boca Raton, FL. (1997).</li>
<li>Komuro, H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+modes+of+neuronal+migration+in+different+domains+of+developing+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct modes of neuronal migration in different domains of developing cerebellar cortex.</a> Journal of Neuroscience. 18 (4), 1478-1490 (1998).</li>
<li>Komuro, H., Yacubova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+cerebellar+granule+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent advances in cerebellar granule cell migration.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (6), 1084-1098 (2003).</li>
<li>Fahrion, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+neuronal+migration+deficits+in+a+mouse+model+of+fetal+Minamata+disease+by+increasing+neuronal+Ca2%2B+spike+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Rescue of neuronal migration deficits in a mouse model of fetal Minamata disease by increasing neuronal Ca2+ spike frequency.</a> Proceedings of National Academy of Sciences USA. 109 (13), 5057-5062 (2012).</li>
<li>Raoult, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+%28PACAP%29+stimulates+the+expression+and+the+release+of+tissue+plasminogen+activator+%28tPA%29+in+neuronal+cells%3A+involvement+of+tPA+in+the+neuroprotective+effect+of+PACAP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) stimulates the expression and the release of tissue plasminogen activator (tPA) in neuronal cells: involvement of tPA in the neuroprotective effect of PACAP.</a> Journal of Neurochemistry. 119 (5), 10-1111 (2011).</li>
<li>Cameron, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+cortical-layer-specific+control+of+neuronal+migration+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cerebellar cortical-layer-specific control of neuronal migration by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide.</a> Neuroscience. 146 (2), 697-712 (2007).</li>
<li>Renaud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plexin-A2+and+its+ligand%2C+Sema6A%2C+control+nucleus-centrosome+coupling+in+migrating+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Plexin-A2 and its ligand, Sema6A, control nucleus-centrosome coupling in migrating granule cells.</a> Nature Neuroscience. 4, 440-449 (2008).</li>
<li>Komuro, H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+granule+cell+migration%3A+a+confocal+microscopic+study+in+acute+cerebellar+slice+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations.</a> Journal of Neuroscience. 15 (2), 1110-1120 (1995).</li>
<li>Nielsen, H. S., Hannibal, J., Fahrenkrug, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+%28PACAP%29+in+the+postnatal+and+adult+rat+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex.</a> Neuroreport. 9 (11), 2639-2642 (1998).</li>
<li>Hannibal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenylate+cyclase-activating+peptide+in+the+rat+central+nervous+system%3A+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Journal of Comparative Neurology. 453 (4), 389-417 (2002).</li>
<li>Garcia-Rocha, M., Avila, J., Armas-Portela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-type+plasminogen+activator+%28tPA%29+is+the+main+plasminogen+activator+associated+with+isolated+rat+nerve+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Tissue-type plasminogen activator (tPA) is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones.</a> Neuroscience Letters. 180 (2), 123-126 (1994).</li>
<li>Ware, J. H., DiBenedetto, A. J., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+tissue+plasminogen+activator+mRNA+in+the+developing+rat+cerebellum+and+effects+of+inhibiting+tissue+plasminogen+activator+on+granule+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Localization of tissue plasminogen activator mRNA in the developing rat cerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration.</a> Journal of Neurobiology. 28 (1), 9-22 (1995).</li>
<li>Friedman, G. C., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+plasminogen+activator+mRNA+expression+in+granule+neurons+coincides+with+their+migration+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Tissue plasminogen activator mRNA expression in granule neurons coincides with their migration in the developing cerebellum.</a> Journal of Comparative Neurology. 360 (4), 658-670 (1995).</li>
<li>Seeds, N. W., Siconolfi, L. B., Haffke, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+extracellular+proteases+facilitate+cell+migration%2C+axonal+growth%2C+and+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neuronal extracellular proteases facilitate cell migration, axonal growth, and pathfinding.</a> Cell and Tissue Research. 290 (2), 367-370 (1997).</li>
<li>Basham, M. E., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+expression+in+the+neonatal+and+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen expression in the neonatal and adult mouse brain.</a> Journal of Neurochemistry. 77 (1), 318-325 (2001).</li>
<li>Bourgault, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+conformational+determinants+of+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+%28PACAP%29+for+activation+of+the+PAC1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular and conformational determinants of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) for activation of the PAC1 receptor.</a> Journal of Medical Chemistry. 52 (10), 3308-3316 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje hodowlę ostrych plastrów móżdżku szczura P10 w systemie Transwell oraz fluorescencyjne znakowanie GC zielonym barwnikiem fluorescencyjnym w celu zbadania migracji komórek podczas rozwoju postnatalnego za pomocą makroskopii konfokalnej. Protokół ten umożliwia obserwacje migracji komórek przez okres do 12 godzin i testowanie możliwych ról czynników regulujących migrację, w tym agonistów lub antagonistów neuropeptydów, inhibitorów enzymów, modulatorów sygnalizacji komórkowej lub substancji toksycznych podczas eksperymentu. Mały otwór we wkładzie membranowym z końcówką pipety jest niezbędny, aby ułatwić podawanie związków w pożywce inkubacyjnej. Aby ułatwić podawanie roztworu, można użyć domowej roboty pipety z zakrzywioną końcówką.
Jednym z problemów związanych z badaniami migracji komórek na żywych wycinkach tkanek jest to, że ruchy samej tkanki mogą utrudniać śledzenie komórek. Podczas gdy poprzednie podejścia proponowały delikatną stabilizację plastrów za pomocą nylonowej siatki lub cienkiej warstwy kolagenu z ogona szczura7,17, główną zaletą tej technologii jest proste i bezpośrednie przeniesienie 6-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej wycinki móżdżku na wkładki błonowe z inkubatora CO2 w celu makroskopu konfokalnego. Zintegrowane regulatory temperatury i CO2 zapewniają również odpowiednie i stałe parametry środowiskowe niezbędne do migracji komórek9. W związku z tym podczas obserwacji utrzymywane są warunki hodowli, a ruchy tkanek są zminimalizowane, ponieważ plastry są dobrze przymocowane do wkładki membranowej. Stabilizacja tkanki jest weryfikowana poprzez śledzenie położenia krawędzi plastra lub komórek Purkinjego, które powinny być ustalonymi odniesieniami podczas pozyskiwania. Ponadto plastry móżdżku (od 12 do 18) rozmieszczone w 6 dołkach płytki można szybko obserwować w szczegółach za pomocą zmotoryzowanego stolika i zoomu optycznego. Ze względu na dużą odległość roboczą (X2, 39 mm) suchego obiektywu, obserwacja epi jest wolna od zanurzenia, a podawanie związków w pożywce hodowlanej jest znacznie łatwiejsze. W związku z tym podobieństwa parametrów środowiskowych i hodowli w inkubatorze CO2 i makroskopii konfokalnej prowadzą do maksymalnej konserwacji próbki biologicznej.
Kolejną zaletą protokołu jest duże pole widzenia, a co za tym idzie duża liczba komórek, które można obserwować jednocześnie. Na przykład wcześniej ustaliliśmy, że gęstość fluorescencyjnych GC z migracją radialną w ML wynosiła 1124 ± 138 komórek/mm2 18. Makroskopia konfokalna (X2, NA = 0,234) ma niższą rozdzielczość boczną w porównaniu z mikroskopią konfokalną (40X, NA = 1,25), ale ciała komórkowe GC można łatwo śledzić, a średnia prędkość migracji jest porównywalna między tymi dwoma podejściamitechnologicznymi 7,18.
Oprócz ulepszeń technicznych w zakresie pozyskiwania obrazów, jakość wycinków tkanek i jakość etykietowania są kluczowymi punktami dla udanych eksperymentów. Zawsze trzymaj media i tkanki na lodzie podczas procesów preparowania, eliminuj olej z ostrzy wibratomu i nie używaj plasterków tkanki mających kontakt z klejem. Przekrój strzałkowy i poprzeczny są przystosowane odpowiednio do migracji promieniowej i stycznej. Stosować różne długości inkubacji w celu odpowiedniego wykrycia w różnych warstwach korowych móżdżku. Długi czas inkubacji (do 8 godzin) jest niezbędny do wykrycia migracji wielu GC w PCL i IGL. Ponieważ migracja GC jest procesem fizjologicznym podczas określonych okien czasoprzestrzennych, kontrola pozytywna polega na tym, że komórki muszą migrować prawidłowo. W szczególności liczne wrzecionowate GC w ML jest jednym z głównych wskaźników zdrowotnych dla strzałkowych plastrów móżdżku. Do rozpoczęcia eksperymentów sugeruje się obserwację ruchów GC w ML. Rzeczywiście, kształt GC z pionowo wydłużonym korpusem komórki powinien być traktowany jako punkt odniesienia do rozpoczęcia akwizycji z kolejnymi okresami kontrolnymi (2 godziny) i leczenia (2 godziny), które można łatwo wykonać w ML.
Barwniki fluorescencyjne, takie jak rodzina Cell Tracker lub białka fluorescencyjne wyrażane przez konstrukty genetyczne, mogą być wykorzystywane jako znaczniki w badaniach migracji komórek. Ze względu na powolną kinetykę migracji GC (1 stos co 30 minut), eksperymenty wielobarwne mogą być również wykonywane w trybie sekwencyjnym, ponieważ w systemie dostępne są 4 wiązki laserowe (405, 488, 532 i 633 nm). Biorąc pod uwagę dośrodkową i odśrodkową migrację promieniową, śledzenie innych interneuronów może być również realizowane18. W szczególności mniej liczne typy komórek można łatwiej zlokalizować dzięki dużemu polu widzenia. Wreszcie, protokół ten może być wykorzystany do badania migracji komórek na innych etapach rozwoju móżdżku, ale także w innych obszarach mózgu.

W rozwijającym się móżdżku, osiem różnych typów neuronów jest wytwarzanych sekwencyjnie między drugim tygodniem embrionalnym a drugim tygodniem po urodzeniu u gryzoni1. Niedojrzałe komórki ziarniste (GC), pochodzące początkowo z pierwotnej strefy rozrodczej, są ostatnimi neuronami wytwarzanymi z zewnętrznej warstwy ziarnistej (EGL), wtórnej strefy rozrodczej2. W ciągu pierwszych trzech tygodni po urodzeniu kora móżdżku jest ulistnioną strukturą zorganizowaną w czterech warstwach, w tym EGL, warstwę molekularną (ML), warstwę komórek Purkiniego (PCL) i wewnętrzną warstwę ziarnistą (IGL) (ryc. 1). Poprzez migrację dośrodkową niedojrzałe GK, interneurony glutaminergiczne, docierają do IGL w ciągu około 2 dni. W trzecim tygodniu po urodzeniu EGL zanika, a IGL tworzy tak zwaną warstwę ziarnistą (GL) w dorosłym móżdżku. W GL GC GC otrzymują pobudzające wejścia synaptyczne z włókien omszałych i jednobiegunowych komórek szczoteczki oraz hamujące wejścia synaptyczne z aksonów komórek Golgiego. W ML aksony GC tworzą synapsy pobudzające z neuronami GABA-ergicznymi, w tym komórkami Purkinjego, komórkami koszyczkowymi, komórkami gwiaździstymi i komórkami Golgiego2.
Obserwacja w czasie rzeczywistym ruchu komórek w ostrych wycinkach móżdżku uzyskanych od gryzoni po urodzeniu pokazuje, że GC zmieniają swój kształt równocześnie ze zmianami w modalności i szybkości migracji podczas ich trasy w korze móżdżku3. W ciągu pierwszych dwóch tygodni po urodzeniu prekursory GC aktywnie namnażają się w górnej części EGL. W środkowej części EGL postmitotyczne GC migrują stycznie w kierunku swojego większego procesu. Na granicy EGL-ML GC spowalniają swój ruch, komórki zaczynają wchodzić w krótki pionowy proces opadania do ML. W ML GC mają pionowo wydłużony korpus komórki, cienki proces końcowy i bardziej obszerny proces wiodący i migrują promieniście wzdłuż włókien glejowych Bergmanna. W PCL GC zatrzymują swój ruch, ale po dłuższej fazie postoju (2 godziny) przekraczają granicę PCL-IGL. W IGL GC migrują w kierunku dolnej części warstwy przy braku podparcia włókien glejowych. Gdy końcówki procesu prowadzącego zbliżą się do granicy IGL-istota biała (WM), GC zwalniają i zatrzymują swój ruch. Przekroje poprzeczne móżdżku są preferowane do badań migracji stycznej w EGL, podczas gdy plastry strzałkowe są dedykowane do migracji promieniowej w ML, PCL i IGL. Do tej pory zidentyfikowano pewne czynniki regulujące ruchy GC, w tym neuropeptydy (np. somatostatyna, PACAP), ale pełne mechanizmy zaangażowane w czasoprzestrzenną kontrolę migracji GC w każdej warstwie korowej są nadal w dużej mierze nieznane1,4,5,6.
Migracja GC była badana w ciągu ostatnich 20 lat za pomocą mikroskopii wideo- i konfokalnej przy użyciu oświetlenia światłem przechodzącym dla izolowanych komórek hodowlanych lub wykrywania fluorescencji dla ostrych wycinków móżdżku. Początkowo lipofilowe DiI, a ostatnio barwniki "Cell Tracker" i białka fluorescencyjne wyrażane w komórkach były używane do mikroskopii konfokalnej lub dwufotonowej7,8. Udane eksperymenty zależą od wielu konkretnych procedur, które sprawiają, że protokół jest prosty, ale nie łatwy. W szczególności ostre plastry muszą być stabilizowane podczas obserwacji, na ogół za pomocą domowej roboty siatki nylonowej9. Intensywność oświetlenia świetlnego musi być jak najniższa, aby uniknąć fototoksyczności i fotowybielania, jak proponuje podejście wielopunktowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Ponadto temperatura i CO2 są kluczowymi parametrami środowiskowymi, ponieważ niestabilność może wpływać na migrację neuronów. Aby ułatwić i udoskonalić procedury eksperymentalne, opracowaliśmy protokół makroskopii konfokalnej, który ogranicza ruchy warstw, zapewnia stałe parametry środowiskowe, zmniejsza fotobielenie, zwiększa pole widzenia (rzędu milimetrów), a co za tym idzie liczbę komórek (kilkadziesiąt), które można śledzić za pomocą analizy obrazu. W ten sposób plastry o grubości 180 μm są hodowane na wkładkach membranowych, a płytki 6-dołkowe są bezpośrednio przenoszone pod zmotoryzowany obiektyw 2X komercyjnego makrokopu konfokalnego wyposażonego w dużą komorę inkubacyjną, regulatory temperatury i CO2 oraz system kontroli wibracji. Time-lapsy i z-stacki są następnie wykonywane przez kilka godzin, a narzędzia farmakologiczne lub cząsteczki bioaktywne mogą być dodawane lub dostarczane w pożywce inkubacyjnej. Metoda ta może być również zaadaptowana do badania migracji innych typów neuronów w móżdżku lub mózgu na różnych etapach rozwoju.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowana pożywka orła (DMEM) mieszanina składników odżywczych F-12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1641</td><td></td></tr><tr><td>PACAP38</td><td>INRS, Kanada</td><td></td><td>Bourgault et al., 200919</td></tr><tr><td>PAI-1</td><td>Calbiochem</td><td>528208</td><td></td></tr><tr><td>suplement N-2</td><td>Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen</td><td>O973</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Zielony CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Poliestrowe wkładki Transwell-Clear</td><td>Corning</td><td>3452</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowy klaster do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych o średnicy 100 mm</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>Probówka polipropylenowa (15 ml)</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>Fisher Chemical</td><td>E/0800DF/21</td><td></td></tr><tr><td>Komora bezpieczeństwa biologicznego Wyciąg</td><td>Thermo Scientific</td><td>MSC9 Klasa II A2</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta o regulowanej objętości (0,5-10 &mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.018</td><td></td></tr><tr><td>Żyroskop-kołyska,</td><td></td> inkubator SSL3 <td></td><td></td></tr><tr><td>Stuart CO2, mikrotom wibracyjny Hera Cell 150</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, makroskop</td> konfokalny <td>VT1000S Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, kontroler temperatury TCS LSI</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>PeCon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2-kontroler</td><td>PeCon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop, M205 C</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne, zakrzywione,/</td><td>Medicon</td><td>03.03.17</td><td></td></tr><tr><td>Hartowane nożyczki do cienkiej tęczówki, proste, ostre/ostre</td><td>FST</td><td>149090-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 i #5 kleszcze</td><td>FST</td><td>11293-00 i 11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Ostrzy iniektorów Vibratome/jednoostrzowe</td><td>Leica Microsystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>Standardowa rękojeść skalpela #3 lita</td><td>FST</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne #15</td><td>Swann-Morton</td><td>205</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo obrazowanie pourodzeniowej migracji komórek ziarnistych móżdżku za pomocą makroskopii konfokalnej

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Podczas rozwoju postnatalnej, niedojrzałe komórki ziarniste (pobudzające interneurony) wykazują migrację styczną w zewnętrznej warstwie ziarnistej, a następnie migrację promieniową w warstwie molekularnej i warstwie komórek Purkinjego, aby dotrzeć do wewnętrznej warstwy ziarnistej kory móżdżku. Niewypłacalność w procesach migracyjnych indukuje śmierć komórki lub niewłaściwe rozmieszczenie neuronów, co prowadzi do deficytów w różnych funkcjach móżdżku. Migracja komórek ziarnistości dośrodkowej obejmuje kilka mechanizmów, takich jak chemotaksja i degradacja macierzy zewnątrzkomórkowej, aby skierować komórki w kierunku ich ostatecznej pozycji, ale czynniki regulujące migrację komórek w każdej warstwie korowej są znane tylko częściowo. W naszej metodzie ostre plastry móżdżku są przygotowywane ze szczurów P10, komórki ziarniste są znakowane fluorescencyjnym markerem cytoplazmatycznym, a tkanki są hodowane na wkładkach błonowych od 4 do 10 godzin przed rozpoczęciem monitorowania migracji komórek w czasie rzeczywistym za pomocą makroskopii konfokalnej w temperaturze 37 °C w obecności CO2 . Podczas migracji w różnych warstwach korowych móżdżku komórki ziarniste mogą być narażone na działanie agonistów lub antagonistów neuropeptydów, inhibitorów proteazy, blokerów efektorów wewnątrzkomórkowych, a nawet substancji toksycznych, takich jak alkohol lub metylortęć, w celu zbadania ich możliwej roli w regulacji migracji neuronów.

W wczesnym okresie postnatalnym w móżdżku komórki ziarniste (GC) wykazują istotne zmiany w trybie i prędkości migracji podczas przechodzenia przez różne warstwy kory1 (Rycina 1). W tej sekcji przedstawiono przykłady wyników, jakie można uzyskać, badając migrację GC w ich naturalnym środowisku komórkowym. Przekroje tkanki móżdżku szczura P10, znakowane zielonym barwnikiem fluorescencyjnym, poddano badaniu pod makroskopem konfokalnym (Rycina 3A), wykazując, że GC migrują radialnie w ML ze średnią prędkością 18 µm/hr (Rycina 3B, C). Do dziś rola interakcji i komunikacji między komórkami neuronalnymi a glejowymi, w tym czynniki regulacyjne i mechanizmy molekularne zaangażowane w kontrolę migracji komórek w każdej warstwie kory, pozostają w dużej mierze nieznane. W związku z tym głównym problemem jest zidentyfikowanie neuropeptydów, neurotransmiterów, neurotrofin i składników macierzy zewnątrzkomórkowej, które mogłyby odgrywać rolę w tych specyficznych dla warstw kory zmianach prędkości podczas procesu migracji. Polipeptyd aktywujący cyklazę adenylanową przysadki (PACAP) jest wykrywany głównie w PCL, ale także w ML i IGL podczas pierwszych dwóch tygodni postnatalnych u gryzoni7,10,11. Dodanie PACAP38 (10-6 M) do pożywki hodowlanej spowodowało 79% spadek prędkości GC w ML. Na przykład prędkość migracji GC w ML spadła z 11,9 µm/hr w warunkach kontrolnych do 2,5 µm/hr po podaniu PACAP38 (Rycina 4A). Tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) jest elementem kaskady proteolitycznej prowadzącej do degradacji składników macierzy zewnątrzkomórkowej (EM), takich jak cząsteczki adhezji komórkowej czy laminina12,13. tPA oraz plazminogen, będący substratem tPA, są wykrywane w warstwach kory podczas rozwoju postnatalnego móżdżku14,15,16. Podanie PAI-1 (10-7 M), inhibitora endogennego tPA, zredukowało migrację GC w ML o 78%. Na przykład prędkość migracji GC w ML spadła z 19,2 µm/hr w warunkach kontrolnych do 4,2 µm/hr po dodaniu PAI-1 (Rycina 4B). Wyniki te wskazują, że PACAP wywiera bezpośredni efekt hamujący na ruchy GC, a serynowa proteaza tPA ułatwia migrację GC w ML rozwijającego się móżdżku szczura.
<img alt="Schemat migracji komórek móżdżku; migracja radialna i styczna wzdłuż włókien; płaszczyzny poprzeczna i strzałkowa." src="/files/ftp_upload/52810/52810fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Reprezentacja 3D migracji GC w postnatalnej korze móżdżku. 1-4, Wydłużanie wypustek GC i migracja styczna w EGL. 5, Migracja radialna w ML wzdłuż włókien gleju Bergmanna. 6, Przejściowa faza stacjonarna w PCL. 7, Niezależna od gleju migracja radialna w IGL. 8, Zakończenie migracji GC w IGL. GC, komórka ziarnista, na czerwono; EGL, zewnętrzna warstwa ziarnista; B, glej Bergmanna, na ciemnofioletowo; G, komórka Golgiego, na żółto; cf, włókna pnące, na niebiesko; g, postmigracyjne komórki ziarniste, na jasnozielono; IGL, wewnętrzna warstwa ziarnista; mft, zakończenie włókna mszystego, na ciemnozielono; ML, warstwa molekularna; P, komórka Purkinjego, na jasnofioletowo; PCL, warstwa komórek Purkinjego. Rysunek zmodyfikowany na podstawie 5.
<img alt="Schemat przygotowania skrawków móżdżku i ustawienia Transwell do analizy tkanek mózgowych in vitro." src="/files/ftp_upload/52810/52810fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Hodowla ex vivo skrawków móżdżku szczurów P10. (A) Wypreparowany móżdżek szczura P10. Pasek skali = 6 mm. (B) Mikrograf żywego skrawka móżdżku o grubości 180 µm wykonany za pomocą stereomikroskopii. Pasek skali = 3 mm. (C) Przy większym powiększeniu widoczne są już cztery warstwy kory (EGL, ML, PCL, IGL) móżdżku. Pasek skali = 1 mm. (D) Po znakowaniu fluorescencyjnym skrawki tkanki umieszcza się na insertach hodowlanych (średnica 24 mm) w płytce 6-dołkowej. (E) Schematyczny przekrój insertu hodowlanego z membraną poliestrową przeznaczoną do hodowli tkanek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52810/52810fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Migracja neuronalna w móżdżku; mikroskopia, obrazowanie time-lapse, analiza wykresów odległość-czas." src="/files/ftp_upload/52810/52810fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Dynamiczna migracja GCs w warstwach korowych móżdżku szczura P10. (A) Makroskopowy obraz konfokalny (xyz, projekcja 2D) skrawka móżdżku szczura P10, w którym GCs są oznakowane zielonym cytoplazmatycznym barwnikiem fluorescencyjnym. Pasek skali = 75 µm. (B) Obrazowanie time-lapse pokazujące ruchy GC w ML za pomocą makroskopii konfokalnej przez 4 hr w warunkach kontrolnych. Symbol gwiazdki (*) oznacza somę GC. Upływ czasu (w min) jest wskazany na dole każdej mikrofotografii. Pasek skali = 10 µm. (C) Sekwencyjne zmiany odległości przebytej przez somę GC.
<img alt="Wykres porównujący wpływ PACAP i PAI-1 na szybkość migracji komórek w czasie w μm/h." src="/files/ftp_upload/52810/52810fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wpływ neuropeptydu i inhibitora proteazy na migrację GC. (A) Migrację GC śledzono w ML za pomocą makroskopii konfokalnej przez 2 hr w warunkach kontrolnych, a następnie przez 2 hr w obecności peptydu aktywującego cyklazę adenylanową przysadki (PACAP). (B) Migrację GC śledzono w ML za pomocą makroskopii konfokalnej przez 2 hr w warunkach kontrolnych, a następnie przez 2 hr w obecności inhibitora aktywatora plazminogenu-1 (PAI-1).

Podczas rozwoju móżdżku po urodzeniu, niedojrzałe komórki ziarniste pochodzące ze strefy zarodkowej wykazują różne sposoby migracji, aby dotrzeć do miejsca docelowego i ustanowić sieci neuronowe. Protokół ten opisuje przygotowanie wycinków móżdżku i konfokalne podejście makroskopowe stosowane do badania czynników regulujących migrację neuronów.

Ex vivo Obrazowanie pourodzeniowej migracji komórek ziarnistych móżdżku za pomocą makroskopii konfokalnej

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja migrujących neuronów w żywych skrawkach mózgu. Jest to realizowane poprzez wstępne wypreparowanie móżdżku od szczura w 10. dniu po urodzeniu (P 10). Kolejne kroki obejmują przygotowanie ostrych skrawków móżdżku oraz znakowanie neuronów sondą fluorescencyjną.Następnie przeprowadzany jest eksperyment time-lapse z wykorzystaniem makroskopowego obrazowania konfokalnego lub mikroskopii konfokalnej. Ostatnim etapem jest śledzenie neuronów na otrzymanych filmach. W ostateczności mikroskopię ex vivo stosuje się do wykazania roli czynników endogennych lub substancji toksycznych regulujących migrację neuronów.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna, jest to, że makroskopowe obrazowanie konfokalne zwiększa pole widzenia, pozostawiając skrawki kory mózgowej bezpośrednio na wkładce do probówki. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy napotkałem trudności z przenoszeniem i stabilizacją skrawków kory mózgowej podczas eksperymentów z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej. Rozpocznij od odsłonięcia czaszki głowy zdekapitowanego szczurka P 10; za pomocą precyzyjnych nożyczek irysowych wykonaj delikatnie dwa nacięcia boczne od podstawy do obszaru rostralnego czaszki. Następnie usuń wypreparowaną czaszkę za pomocą dwóch pęset nr 3, rozrywając wszelkie zrosty między mózgiem a czaszką.Następnie wyjmij mózg za pomocą końcówki łyżeczkowej szpatułki i umieść go w 35 milimetrowej płytce Petriego zawierającej 2 ml zimnego roztworu HBSS na lodzie. Teraz, pod mikroskopem stereoskopowym, odizoluj móżdżek od mózgu poprzez delikatne rozdzielenie go za pomocą dwóch pęset nr 3. Przenieś móżdżek łyżeczką do nowej płytki z lodowatym buforem.Następnie, używając tych samych narzędzi, usuń i wyrzuć pozostałości rdzenia kręgowego oraz błonę zewnętrzną. Przygotuj skalpel z rękojeścią nr 3 i ostrzem chirurgicznym nr 15. Korzystając z ostrza pod stereomikroskopem, odetnij móżdżek pomiędzy robakiem a prawą półkulą.Teraz przy wibratomie nałóż kroplę kleju cyjanoakrylowego na dysk do preparatów i odczekaj od 15 do 25 sekund, aż odparują rozpuszczalniki, przed przeniesieniem móżdżku na dysk. Następnie przymocuj krawędź móżdżku do dysku do preparatów i odczekaj 10 sekund. Teraz za pomocą manipulatora włóż dysk do preparatów do kuwety z buforem w taki sposób, aby oś poprzeczna móżdżku była prostopadła do uchwytu noża.Należy upewnić się, że dysk jest zabezpieczony za pomocą klucza imbusowego. Następnie ostrożnie należy pokryć móżdżek roztworem HBSS i wsypać kruszony lód do kąpieli chłodzącej. Aby wykonać plastry preparatu, należy ustawić oczyszczone ostrze tak, aby jego krawędź znajdowała się bezpośrednio za tylną krawędzią preparatu.Zdefiniuj ten punkt jako punkt początkowy mrożenia. Następnie użyj polecenia przesuń do przodu, aby zdefiniować punkt końcowy tuż za przednią krawędzią preparatu. Teraz ustaw grubość warstwy na 180 mikronów.Następnie ustaw prędkość krojenia na 2.5, a częstotliwość na osiem i rozpocznij krojenie preparatu. Pobierz do pięciu przekrojów z każdego móżdżku. Każdy przekrój pobierz za pomocą ściętej, szerokiej pipety szklanej typu boar.Przenieś sekcje do naczynia zawierającego zimny HBSS w lodzie. Po zebraniu plastrów pod mikroskopem stereoskopowym, ostrożnie usuń oponowe za pomocą dwóch pęset numer pięć. Następnie delikatnie rozdziel LOEs, aby ułatwić wprowadzanie sond.Po pokrojeniu preparatu, za pomocą szerokiej pipety z obciętym końcem, przenieś skrawki wraz z niewielką ilością HBSS do płytki sześciodołkowej, umieszczając do trzech skrawków w każdym dołku. Następnie, po odlaniu medium z każdego wypełnionego dołka, dodaj 5 mL roztworu ładującego zawierającego 10 µM barwnika fluorescencyjnego; aby chronić próbki przed światłem, przykryj płytkę folią. Następnie umieść płytkę na rotatorze ustawionym na 35 RPM.Pozostaw płytkę do inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby barwnik mógł oznakować komórki w dołkach. Następnie przenieś plasterki w sposób opisany wcześniej na membranę wkładki transwell z porami o rozmiarze 3 µm. Po tym odessać medium ładujące, pozostawiając jedynie plasterki.Teraz należy wyjąć wkład oraz plasterki, aby wypełnić dołek 1,9 ml DMEM. Następnie należy ponownie umieścić wkład i dodać kolejne 100 µl DMEM, aby przykryć tkanki. Tak przygotowany preparat inkubuje się przez dwie godziny, po których widoczne staną się komórki ziarniste.Przenieś płytkę bez pokrywy do komory inkubacyjnej z ciągłym przepływem gazu zainstalowanej na mikroskopie konfokalnym. Następnie nałóż szklaną osłonkę na wkład płytki mikroskopu konfokalnego w celu przeprowadzenia eksperymentów time-lapse. Pozostaw komórki w komorze do inkubacji przez kolejne dwie godziny przed kontynuacją procedury.Aby zwizualizować migrację komórek ziarnistych w skrawkach tkanki, należy oświetlić preparat światłem o długości fali 488 nanometrów i użyć suchego obiektywu 2x. Emisje fluorescencyjne w zakresie od 500 do 530 nanometrów należy wykryć za pomocą programu ImageJ. Dla każdego obrazu z filmu poklatkowego należy wykonać projekcję Z-stack w trybie odchylenia standardowego, a następnie dostosować poziom kontrastu i jasności każdego zdjęcia tak, aby znakowane komórki ziarniste były wyraźnie widoczne. Następnie z menu analizy cząsteczek (particle analysis) należy wybrać wtyczkę do śledzenia ręcznego (manual tracking plugin).Użyj wtyczki, aby kliknąć w centralny punkt każdego oznakowanego ciała komórki w całej sekwencji obrazów time-lapse. Następnie wyeksportuj surowe dane śledzenia do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy. Zreorganizuj wyeksportowane z programu Image J surowe dane śledzenia za pomocą autorskiego narzędzia, które identyfikuje każdą komórkę i powiązane z nią pozycje w programie.Oblicz całkowitą przebytą odległość oraz średnią prędkość migracji dla każdej komórki. W wczesnym postnatalnym móżdżku komórki ziarniste wykazują znaczące zmiany w sposobie i prędkości migracji podczas przechodzenia przez różne warstwy kory. Zbadano komórki ziarniste znakowane CTG w skrawkach tkanki móżdżku szczura w okresie PM.Jak opisano, komórki ziarniste migrowały radialnie w warstwie molekularnej ze średnią prędkością 18 microns per hour. Następnie wykorzystano inny preparat, aby zbadać wpływ leków, od których oczekiwano zmiany tempa migracji. Dodanie pay cap 38 do pożywki spowodowało spadek prędkości komórek ziarnistych w warstwie molekularnej o 79%, czyli do poziomu 2.5 microns per hour.Podanie PI one, inhibitora endogennej TPA, zredukowało prędkość migracji komórek ziarnistych o 78% w stosunku do prędkości kontrolnej, do poziomu 4,2 mikrona na godzinę. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak śledzić komórki w rozwijającym się pęcherzu teorii. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zapewnieniu odpowiednich i stałych parametrów środowiskowych, które są niezbędne dla migracji komórek po ich rozwoju.Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie neuronauk do zgłębiania procesów faktycznych w mózgu.

ex-vivo-imaging-postnatal-cerebellar-granule-cell-migration-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ex Vivo Obrazowanie migracji komórek ziarnistych móżdżku po urodzeniu przy użyciu mikroskopu konfokalnego

Opisujemy protokół obrazowania wideo w czasie rzeczywistym migracji neuronów w przedmózgowiu myszy. Migrację prekursorów neuronalnych oznakowanych wirusowo lub przeszczepionych rejestrowano w ostrych żywych skrawkach, wykorzystując szerokopolowe obrazowanie fluorescencyjne z relatywnie krótkim odstępem między akwizycjami, aby zbadać różne fazy migracji komórek, w tym czas trwania fazy stacjonarnej i migracyjnej oraz prędkość migracji.

Obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w ostrych skrawkach przedmózgowia dorosłej myszy

Źródło: Chan, U., et al., wykorzystując elektroporację poporodową in vivo do badania morfologii neuronów ziarnistości móżdżku i rozwoju synaps.J. Vis. Exp. (2021).Ten film przedstawia analizę rozwoju neuronów ziarnistości móżdżku poprzez obrazowanie wstępnie ustalonych wycinków tkanki mózgowej od myszy znakowanych białkiem fluorescencyjnym, Przechwytywanie obrazów stosu Z o wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopu konfokalnego i pomiar parametrów strukturalnych, w tym długości neurytów,...

Wizualizacja synaptogenezy neuronów ziarnistych móżdżku na różnych etapach rozwoju

Źródło: Bénard, M.,  i wsp. Ex vivo Obrazowanie migracji komórek ziarnistych móżdżku po urodzeniu za pomocą makroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje konfokalną metodę makroskopową do śledzenia ex vivo migracji komórek ziarnistych w wycinkach móżdżku z postnatalnych mózgów szczurów.

Obrazowanie ex vivo migracji komórek ziarnistych móżdżku po urodzeniu za pomocą makroskopii konfokalnej

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Morfogeneza i migracja neuronów są kluczowymi wydarzeniami leżącymi u podstaw prawidłowego rozwoju mózgu. W tym miejscu opisujemy metody genetycznej manipulacji hodowanymi neuronami ziarnistymi móżdżku i rozwijającym się móżdżkiem w celu oceny morfologii i cech migracyjnych neuronów.

Manipulacja genetyczna neuronów ziarnistych móżdżku in vitro i in vivo w celu zbadania morfologii i migracji neuronów

Zewnętrzna warstwa granulatu móżdżku jest miejscem największego wzmocnienia tranzytu w rozwijającym się mózgu. W tym miejscu przedstawiamy protokół ukierunkowany na modyfikację genetyczną tej warstwy w szczycie proliferacji przy użyciu elektroporacji ex vivo i hodowli plastrów móżdżku z embrionalnych zarodków piskląt dnia 14.

Ex vivo Hodowla wycinków móżdżku piskląt i przestrzennie ukierunkowana elektroporacja prekursorów komórek ziarnistych

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Ten protokół opisuje technikę przewlekłego wszczepiania okien czaszkowych, która może być używana do podłużnego obrazowania struktur nerwowo-glejowo-naczyniowych, interakcji i funkcji zarówno w zdrowych, jak i chorych warunkach. Służy jako alternatywa uzupełniająca dla metody obrazowania przezczaszkowego, która, choć często preferowana, ma pewne krytyczne ograniczenia.

Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji synaptogenezy ziarnistych neuronów w móżdżku myszy w trakcie poporodowego rozwoju mózgu, kiedy te komórki udoskonalają swoje struktury synaptyczne i tworzą synapsy, aby zintegrować się z ogólnym obwodem mózgu.

Wykorzystanie elektroporacji poporodowej in vivo do badania morfologii neuronów ziarnistych móżdżku i rozwoju synaps

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Poznaj metodę obrazowania migracji komórek ziarnistych móżdżku szczura P10 za pomocą makroskopii konfokalnej ex vivo. Technika ta pozwala wizualizować dynamikę neuronów w czasie rzeczywistym.

Ex vivo Obrazowanie pourodzeniowej migracji komórek ziarnistych móżdżku za pomocą makroskopii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów