Ex vivo Obrazowanie pourodzeniowej migracji komórek ziarnistych móżdżku za pomocą makroskopii konfokalnej

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja migrujących neuronów w żywych wycinkach mózgu. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie móżdżku od szczura P 10. Kolejnym krokiem jest przygotowanie ostrych wycinków móżdżku i znakowanie neuronów sondą fluorescencyjną.

Następnie eksperyment poklatkowy jest wykonywany za pomocą obrazowania makrokonfokalnego lub mikroskopii konfokalnej. Ostatnim krokiem jest śledzenie neuronów w powstałych filmach. Ostatecznie mikroskopia ex vivo służy do pokazania roli czynników endogennych lub substancji toksycznych, które regulują migrację neuronów.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna, jest to, że obrazowanie makrokonfokalne zwiększa wrażenie pozostawiania wycinków sztuki mózgowej bezpośrednio umieszczonych na wkładce pachwiny. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, gdy miałem trudności z przenoszeniem i stabilizacją wycinków sztuki mózgowej do eksperymentów z mikroskopią konfokalną Zacznij od uzyskania dostępu do czaszki odciętej głowy szczeniaka szczura P 10, używając cienkich nożyczek tęczówkowych, delikatnie wykonaj dwa boczne nacięcia od podstawy do obszaru rostralnego czaszki. Następnie usuń wypreparowaną czaszkę za pomocą dwóch kleszczy numer trzy, zrywając wszelkie zrosty między mózgiem a czaszką.

Teraz zgarnij mózg łyżką szpatułki i włóż go do 35-milimetrowej szalki Petriego z dwoma mililitrami zimnego HBSS na lodzie. Teraz, pod mikroskopem stereoskopowym, odizoluj móżdżek od mózgu za pomocą ran szarpanych D za pomocą dwóch kleszczy numer trzy. Przełóż móżdżek do nowego naczynia z lodowatym buforem.

Następnie za pomocą tych samych narzędzi usuń i wyrzuć resztki rdzenia kręgowego i błonę peelingową. Przygotuj solidną rękojeść skalpela numer trzy z ostrzem chirurgicznym numer 15. Używając ostrza pod mikroskopem stereoskopowym, przetnij móżdżek między werusem a prawą półkulą.

Teraz na vibrato nałóż kroplę kleju cyjanokrylanowego na krążek próbki i odczekaj 15 do 25 sekund, aż para rozpuszczalnika rozproszy się przed przeniesieniem móżdżku do dysku. Następnie przymocuj krawędź móżdżku do dysku próbki i odczekaj 10 sekund. Teraz za pomocą manipulatora włóż krążek z próbką do tacki buforowej tak, aby oś poprzeczna móżdżku była prostopadła do uchwytu noża.

Pamiętaj, aby zabezpieczyć tarczę za pomocą klucza aluminiowego. Następnie ostrożnie przykryj móżdżek HBSS i załaduj pokruszony lód do kąpieli chłodzącej. Aby pokroić próbkę, umieść oczyszczone ostrze tak, aby jego krawędź znajdowała się tuż za tylną krawędzią próbki.

Zdefiniuj to jako punkt wyjścia do oblodzenia. Następnie użyj polecenia forward, aby zdefiniować punkt końcowy jako znajdujący się tuż za przednią krawędzią próbki. Teraz ustaw grubość plastra na 180 mikronów.

Następnie ustaw prędkość cięcia na 2,5, a częstotliwość na osiem i rozpocznij cięcie próbki. Zbierz do pięciu plasterków na móżdżek. Zebrać każdą sekcję za pomocą ściętej pipety z szerokiego szkła dzikowego.

Przełóż skrawki do naczynia zawierającego zimny HBSS na lodzie. Po zebraniu plastrów pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie usuń opony mózgowe za pomocą dwóch kleszczy numer pięć. Delikatnie oddziel również LOE, aby uzyskać lepsze ładowanie sondy.

Po pokrojeniu próbki użyj ściętej szerokiej pipety do knurów, aby przenieść je z odrobiną HBSS do sześciodołkowej płytki załadowanej do trzech plasterków w każdym dołku. Następnie, po opróżnieniu pożywki w każdym załadowanym, dobrze dodać pięć mililitrów roztworu ładującego zawierającego 10 mikromolów barwnika fluorescencyjnego, aby chronić próbki przed światłem, przykryć płytkę folią. Następnie umieść płytkę na mutatorze ustawionym na 35 obr./min.

Pozwól płytce inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby barwnik mógł oznaczyć komórki w dołkach. Teraz przenieś plastry jak poprzednio na membranę wkładki transwell, która ma trzy pory mikronowe. Następnie zasysaj pożywkę ładującą, pozostawiając tylko plastry.

Teraz wyjmij wkładkę i plasterki, aby napełnić studzienkę 1,9 mililitra DMEM. Następnie włóż wkładkę z powrotem i dodaj kolejne 100 mikrolitrów DMEM, aby pokryć tkanki. Inkubuj ten preparat przez dwie godziny, po czym będą widoczne komórki ziarniste.

Przenieść płytkę bez pokrywy do komory środowiskowej o stałym przepływie gazu pod mikroskopem konfokalnym. Następnie umieść szklaną osłonę na wkładce płytki mikroskopu konfokalnego do eksperymentów poklatkowych. Pozwól komórkom inkubować w komorze przez dodatkowe dwie godziny przed kontynuowaniem.

Aby uwidocznić komórki ziarnistości migrujące w wycinkach tkanki, należy oświetlić preparat światłem o długości 488 nanometrów i użyć soczewki o długości dwóch x sucho. Wykrywanie emisji fluorescencyjnych w zakresie od 500 do 530 nanometrów za pomocą obrazu J. Dla każdego obrazu filmu poklatkowego wykonaj projekcję Zacka w trybie odchylenia standardowego, dostosuj poziomy kontrastu i jasności każdego obrazu, aby oznaczone komórki ziarnistości były dobrze widoczne. Teraz wybierz wtyczkę do ręcznego śledzenia z menu analizy cząstek.

Użyj wtyczki, aby kliknąć centralny punkt każdej oznaczonej bryły komórki w całej sekwencji obrazu poklatkowego. Następnie wyeksportuj surowe dane śledzenia do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy. Zreorganizuj wyeksportowane surowe dane śledzenia z obrazu J za pomocą inteligentnego, domowego narzędzia, które identyfikuje każdą komórkę i powiązane pozycje za pomocą programu.

Oblicz całkowitą odległość przebytą i średnią prędkość migracji dla każdej komórki. We wczesnym okresie poporodowym móżdżku komórki ziarniste wykazują znaczące zmiany w trybie i szybkości migracji, gdy przekraczają różne warstwy kory mózgowej. Zbadano komórki ziarniste znakowane KTG w wycinkach tkanki móżdżku szczura PM.

Zgodnie z opisem, komórki ziarniste migrowały promieniście w warstwie molekularnej ze średnią prędkością 18 mikronów na godzinę. Inny preparat został następnie wykorzystany do przetestowania działania leków, które miały zmienić tempo migracji. Zastosowanie limitu wynagrodzeń 38 do pożywki hodowlanej spowodowało zmniejszenie prędkości komórek ziarnistości w warstwie molekularnej o 79%, do 2,5 mikrona na godzinę.

Podanie PI one, inhibitora endogennego TPA, zmniejszyło szybkość migracji komórek ziarnistych o 78% z prędkości kontrolnej do 4,2 mikrona na godzinę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak śledzić komórki w rozwijającym się balonie teorii. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o zapewnieniu odpowiednich i stałych parametrów środowiskowych niezbędnych do migracji komórek po ich rozwoju.

Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neuronauk do zbadania procesów zachodzących w mózgu.