Obrazowanie ex vivo migracji komórek ziarnistych móżdżku po urodzeniu za pomocą makroskopii konfokalnej

Zacznij od wycinka móżdżku uzyskanego z mózgu młodego szczura po urodzeniu w wielodołkowej płytce zawierającej pożywkę.

Usuń pożywkę i inkubuj plasterek w cytoplazmatycznym roztworze barwnika fluorescencyjnego, aby oznaczyć komórki ziarniste (GC).

Przenieś plasterek na membranę z wkładką transwell i usuń nadmiar barwnika.

Wyjmij wkładkę i napełnij studzienkę mediami. Następnie załóż wkładkę i dodaj pożywkę, aby zakryć chusteczkę.

Inkubować, aby tkanka mogła przyczepić się do błony wprowadzonej.

Przenieść płytkę do inkubatora podłączonego do makroskopu konfokalnego i nałożyć na nią szklaną osłonę.

Ustaw warunki hodowli, kontynuuj inkubację tkanki, a następnie rozpocznij obrazowanie.

Po oświetleniu laserowym oznaczone GC fluoryzują.

Przechwytuj obrazy poklatkowe, aby zobrazować radialną migrację GC przez warstwę molekularną móżdżku.

Korzystając z oprogramowania do obrazowania, przeanalizuj odległość migracji GC.

Po pokrojeniu próbki użyj pipety ze ściętą białą bańką, aby przenieść je z odrobiną HBSS na płytkę sześciodołkową. Załaduj do trzech plasterków do każdej studzienki. Następnie, po opróżnieniu pożywki w każdej załadowanej studzince, dodaj pięć mililitrów roztworu ładującego zawierającego 10 mikromoli barwnika fluorescencyjnego. Aby chronić próbki przed światłem, przykryj płytkę folią. Następnie umieść płytkę na mutatorze ustawionym na 35 obr./min. Pozwól płytce inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby barwnik mógł oznaczyć komórki.

Teraz przenieś plastry jak poprzednio na membranę wkładki transwell, która ma trzy pory mikronowe. Następnie zasysaj pożywkę ładującą, pozostawiając tylko plastry. Teraz wyjmij wkładkę i plastry, aby napełnić studzienkę 1,9 mililitra DMEM. Następnie włóż wkładkę z powrotem i dodaj kolejne 100 mikrolitrów DMEM, aby pokryć tkanki.

Inkubuj ten preparat przez dwie godziny, po czym będą widoczne komórki ziarniste. Przenieś płytkę bez pokrywy do komory środowiskowej ze stałym przepływem gazu na makroskopie konfokalnym. Następnie umieść szklaną osłonę na wkładce płytki makroskopu konfokalnego. W przypadku eksperymentów poklatkowych pozwól komórkom inkubować w komorze przez dodatkowe dwie godziny przed kontynuowaniem.

Aby zobrazować komórki ziarnistości migrujące w wycinkach tkanki, należy oświetlić preparat światłem o długości 488 nanometrów i użyć suchego obiektywu 2X. Wykrywanie emisji fluorescencji w zakresie od 500 do 530 nanometrów. Korzystając z ImageJ, dla każdego obrazu filmu poklatkowego wykonaj projekcję stosu Z w trybie odchylenia standardowego.

Dostosuj poziomy kontrastu i jasności każdego obrazu, aby oznaczone komórki granulek były dobrze widoczne. Teraz wybierz wtyczkę Ręczne śledzenie z menu analizy cząstek. Użyj wtyczki, aby kliknąć centralny punkt każdej oznaczonej bryły komórki w całej sekwencji obrazu poklatkowego. Następnie wyeksportuj surowe dane śledzenia do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.

Reorganizuj wyeksportowane surowe dane śledzenia z ImageJ za pomocą narzędzia stworzonego w inteligentnym domu, które identyfikuje każdą komórkę i powiązane pozycje. Korzystając z programu, oblicz całkowitą przebytą odległość i średnią prędkość migracji dla każdej komórki.