Wizualizacja synaptogenezy neuronów ziarnistych móżdżku na różnych etapach rozwoju

Zacznij od wstępnie utrwalonych wycinków tkanki mózgowej pobranych z wczesnych i późnych stadiów postnatalnych myszy.

Wycinek zawiera neurony ziarniste móżdżku lub CGN, wyrażające białko fluorescencyjne.

Za pomocą mikroskopu konfokalnego skup się na pojedynczym fluorescencyjnym CGN.

Przechwytuj obrazy z-stack na różnych głębokościach, aby stworzyć trójwymiarowy widok neuronu.

Korzystając z oprogramowania do obrazowania, śledź neuryty neuronów lub długie projekcje, w tym dendryty i aksony.

Zmierz długość dendrytu od korpusu komórki do jej końca.

Analizuj tworzenie się szponów dendrytycznych, wyspecjalizowanych struktur na końcach dendrytów, gdzie odbierane są sygnały z innych neuronów.

Oceń również powierzchnię i objętość neuronu.

We wczesnej fazie postnatalnej neurony wykazują zwiększoną liczbę dendrytów, bez tworzenia się pazurów.

Tymczasem w późnym etapie postnatalnym dendrytów jest mniej, ale zwiększa się ich długość i liczba pazurów.

Tak więc wraz z wiekiem CGN ulegają synaptogenezie i tworzą połączenia z innymi komórkami w celu przekazywania sygnału.

Aby zbadać morfologię pojedynczych elektroporowanych CGN ze strzałkowych odcinków mózgu eksperymentalnego szczeniaka, wykonaj obrazy stosu z prędkością 0,5 mikrometra na stos pod mikroskopem konfokalnym. Obraz po jednej komórce na okno obrazu, aby umożliwić łatwą analizę obrazu i rekonstrukcję 3D. Analizuj długość neurytów i tworzenie się pazurów dendrytycznych w sposób zaślepiony za pomocą prostego znacznika neurytów.

Prześlij jednokanałowe obrazy stosu elektroporowanych CGN-ów na Fidżi i kliknij Wtyczki, Segmentacja i Prosty Neurite Tracer. Wybierz opcję Utwórz nową przeglądarkę 3D z menu rozwijanego. Przewiń do podstawy dendrytu łączącego się z somą komórkową i rozpocznij kąpiel, klikając skrzyżowanie. Ręcznie prześledź ścieżkę, klikając sekcje, w których sygnał wypełnienia komórek jest najjaśniejszy, i naciskając Y, aby zachować ślad.

Śledź do końca dendrytu i potwierdź ścieżkę, naciskając F. Alternatywnie, śledź aż do podstawy pazura. Następnie prześledź pazur od podstawy struktury aż do końca najdłuższego neurytu. Śledź gałęzie drugorzędne i trzeciorzędne, przytrzymując Control w systemie Windows lub Alt w systemie Mac OS i klikając ścieżkę. Potwierdź ścieżkę, naciskając F. Zwróć uwagę, że pomiary ścieżek są widoczne w osobnym oknie. Zsumuj wszystkie rozmiary gałęzi pazurów, aby uzyskać całkowitą długość każdego pazura.