Name: SpOT właściwą tkankę za każdym razem w blokach wielotkankowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Poznaj metodę tworzenia Specimen Orientation Tag (SpOT) do identyfikacji tkanek w blokach parafinowych z wieloma tkankami. Technika wykorzystuje HistoGel i barwnik do znakowania, zapewniając wyraźny znacznik wizualny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Brentowi Harrisowi za krytyczną recenzję manuskryptu. Badania te zostały przeprowadzone w Lombardi Comprehensive Cancer Center Histopathology & Tissue Shared Resource, który jest częściowo wspierany przez grant NIH/NCI P30-CA051008. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Cancer Institute lub National Institutes of Health.

1. Budowa SpOT
<ol>
	<li>Dodać 50 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 1 ml barwnika do znakowania tkanek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml lub probówce do mikrofugi o pojemności 2 ml i wirować przez 1 minutę lub aż do całkowitego rozpuszczenia. 
	Uwaga: W przypadku tego protokołu należy użyć biochemicznego BSA stopnia. Podczas gdy inne gatunki i czystości nie zostały przetestowane, oczekuje się, że klasa i czystość nie będą miały znaczącego wpływu na sukces SpOT.</li>
	<li>Podgrzej 9 ml żelu do przetwarzania agarozy hydroksyetylowej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w kuchence mikrofalowej o mocy 30% przez 10 sekund, aż żel całkowicie się rozpuści.</li>
	<li>Połączyć stopiony żel do obróbki i roztwór barwnika-BSA w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml i dokładnie wymieszać pipetą. Wiruj roztwór.</li>
	<li>Umieść stożkową rurkę w lodówce na kilka godzin lub do zestalenia.</li>
	<li>Użyj długiej, cienkiej, metalowej szpatułki lub sondy, aby delikatnie uwolnić kolorową zatyczkę żelową ze stożkowej tubki.</li>
	<li>Za pomocą skalpela lub żyletki przeciąć korek żelowy poprzecznie na odcinki o grubości 5 mm. Usuń zaokrąglone końce i wyrzuć jako odpad (Rysunek 2A).</li>
	<li>Umieść skrawki żelu płasko w kasetach histologicznych i przytrzymaj 70% etanolu przez 1 godzinę. Zmieniaj 70% roztwór etanolu co 2-4 godziny przez co najmniej 3 zmiany w ciągu 24 godzin.</li>
	<li>Ręcznie przetworzyć skrawki żelu przez serię etanolu (po 1 godzinie: 70% etanolu, 80% etanolu, 95% etanolu, 100% etanolu (3x zmiany), a następnie oczyścić w roztworze klarującym 3x po 1 godzinie każdy (np. w tym protokole zastosowano węglowodory alifatyczne (substytut ksylenów)), dopuszczalne są również ksyleny) i naciekać stopioną parafiną (3x po 1 godzinie), ręcznie lub w procesorze tkankowym. 
	Uwaga: Przed całkowitym odwodnieniem w 100% etanolu barwnik może wyciekać z korka żelowego, co może mieć wpływ na inne tkanki i płynne odczynniki w automatycznym procesorze tkanek. W związku z tym zdecydowanie zaleca się ręczne ponowne wypełnianie, jednak automatyczne przetwarzanie jest równie skuteczne.</li>
	<li>Osadzanie wielu przetworzonych skrawków żelu przy użyciu standardowej metodologii zatapiania parafiny (rysunek 2B). Pozwól blokom ostygnąć i stwardnieć, a następnie osiągnij temperaturę pokojową.</li>
	<li>Użyj igły do dziurkowania skórnego o pożądanym rozmiarze, aby usunąć rdzenie SpOT z osadzonych odcinków żelu, aż do wyczerpania bloku (Rysunek 2C). Pojedynczy blok może dostarczyć do 20 rdzeni x 2mm2. Przechowuj rdzenie w chłodnym miejscu. Użyj stempla skórnego w tym protokole, patrz rysunki, 1,5 mm (rysunki 1D i 2D) lub 2 mm (rysunki 1B, 1C i 2C).</li>
</ol>
2. Używanie SpOT do orientowania bloków bez tablicy
<ol>
	<li>Utwórz diagram orientacji tkanki, aby wskazać żądane lokalizacje i tożsamości wszystkich poszczególnych fragmentów tkanki, które mają być osadzone razem, oraz lokalizację SpOT. 
	UWAGA: Diagram orientacji tkanki jest ilustrowaną mapą, która zawiera fizyczne lokalizacje wszystkich fragmentów tkanek oznaczonych identyfikatorami oraz lokalizację SpOT. Może być tworzony elektronicznie lub może być rysowany ręcznie. Diagram powinien być wykonany przy użyciu dowolnej metody, która najbardziej odpowiada technikowi i badaczowi korzystającemu z produktu końcowego. Mapa ta posłuży jako przewodnik dla badacza, dzięki czemu próbki będą mogły być łatwo zidentyfikowane podczas analizy mikroskopowej. Mapa użyta w tym protokole została narysowana ręcznie. Przedstawia blok tkankowy i szklane szkiełko mikroskopowe, przy czym każdy kawałek tkanki i SpOT są narysowane i oznaczone w tej samej pozycji, co rzeczywisty blok tkankowy i szkiełko.</li>
	<li>Kawałki tkanek należy przetwarzać normalnie, upewniając się, że pozostają one prawidłowo zidentyfikowane na wszystkich etapach ubruttowiania i przetwarzania. W tym protokole przetwarzaj tkanki przez 1 godzinę każda: 70% etanolu, 80% etanolu, 95% etanolu, 100% etanolu (x3 zmiany), węglowodory alifatyczne (substytut ksylenów) (zmiany x3) i parafina infiltracyjna stopionych tkanek w temperaturze 60 °C (zmiany x3). 
	UWAGA: Wszystkie tkanki powinny być przetwarzane zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi histologicznymi. Może to być zmienne w zależności od indywidualnej procedury laboratoryjnej, wielkości i rodzaju tkanki, ale nie wpłynie to na możliwość korzystania ze SpOT jako narzędzia orientacyjnego.</li>
	<li>Ułóż kawałki tkanek na stacji osadzania we właściwych przypisanych miejscach zgodnie ze schematem orientacji tkanki. Użyj diagramu orientacji tkanki jako odniesienia, aby poprowadzić technika, jak ułożyć SpOT i kawałki tkanek w każdym bloku. 
	UWAGA: W tym protokole technik zatapiania umieścił ręcznie narysowaną mapę orientacyjną obok stacji zatapiania i ułożył kawałki tkanek na stacji zatapiania dokładnie w takim samym układzie, jak narysowano na schemacie. Gwarantuje to, że wszystkie fragmenty tkanek pozostają prawidłowo identyfikowalne w produkcie końcowym. Jest to absolutnie niezbędne do skutecznego stosowania bloków wielotkankowych.</li>
	<li>Upewnij się, że rdzeń SpOT jest wyższy niż wszystkie kawałki tkanki, które mają być osadzone w bloku.</li>
	<li>Osadź kawałki tkanki, a następnie SpOT na końcu (poprzecznie) we właściwych miejscach zgodnie ze schematem orientacji tkanki przy użyciu standardowej metodologii zatapiania. W razie potrzeby trzymaj SpOT (s) pionowo za pomocą kleszczy, aż parafina zestali się na tyle, że SpOT (s) nie przewrócą się (1-2 min).</li>
	<li>Przekrój i zabarwić skrawki parafiny SpOT przy użyciu standardowej metodologii.
	<ol>
		<li>Pozostawić sekcje unoszące się na powierzchni łaźni wodnej w temperaturze 40 °C i przykleić do dodatnio naładowanego szkiełka szkiełkowego (nienaładowane szkiełka nie zostały przetestowane). Szkiełka suszyć w suszarce w temperaturze 60 °C przez co najmniej 20 minut.</li>
		<li>Umieść szkiełka w automatycznym barwieniu i przepuść przez następujące odczynniki: ksyleny (ksyleny 1-5 min, ksyleny 2 i 3-2 min, każdy), 100% etanol (2 min), 95% etanol (1 min), 80% etanol (30 sek), 70% etanol (30 sek), bieżąca woda z kranu (2 min), hematoksylina (1,5 min), bieżąca woda z kranu (3 min), kwaśny alkohol (1 min), bieżąca woda z kranu (2 min), odczynnik do niebieszczenia (1 min), bieżąca woda (2 min), 80% etanol (30 sek), eozyna (1 min), bieżąca woda (10 sek.), 80% etanol (1 min), 100% etanol (3 zmiany po 2 min), ksyleny (3 zmiany po 30 sek.).</li>
		<li>Przykryj szkiełka szklanymi szkiełkami nakrywkowymi, zamontowanymi za pomocą medium montażowego. 
		UWAGA: W tym protokole histotechnik podzielił bloki parafiny na mikrotomie na odcinki 5 μm. Do tego protokołu użyliśmy automatycznego barwienia, jednak takie same rezultaty można uzyskać poprzez barwienie ręczne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. SpOT w TMA (Ręczny zestaw TMA)
<ol>
	<li>Należy utworzyć diagram orientacji tkanki, zgodnie z opisem w ppkt 2.1 i przypisać żądane lokalizacje SpOT.</li>
	<li>Napełnij formę TMA stopioną parafiną w stacji zatapiania. Gdy forma stygnie, osadź SpOT na końcu na marginesach formy TMA w żądanych miejscach wskazanych na schemacie orientacji tkanki. W razie potrzeby trzymaj SpOT (s) pionowo za pomocą kleszczy, aż parafina zestali się na tyle, że SpOT (s) nie przewrócą się (1-2 min).</li>
	<li>Zmontuj rdzenie TMA zgodnie ze wskazówkami producenta i z uwzględnieniem lokalizacji SpOT (s) na marginesach macierzy (rysunek 2D) i postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami cięcia i barwienia. 
	UWAGA: Proszę zapoznać się z krokiem 2.6, aby zapoznać się z metodami cięcia i barwienia stosowanymi w tym protokole.</li>
</ol>

<ol><li>Jawhar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarray%3A+a+rapidly+evolving+diagnostic+and+research+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Saudi.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue microarray: a rapidly evolving diagnostic and research tool.</a> Ann. Saudi. Med. 29 (2), 123-127 (2009).</li>
<li>Dhir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Bio%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays: an overview.</a> Methods Mol. Bio. 441, 91-103 (2008).</li>
<li>Parsons, M., Grabsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Histopath%22%5BJournal%5D)">How to make tissue microarrays.</a> Diagn. Histopath. 15 (3), 142-150 (2009).</li>
<li>Saxena, R., Bade, S. Ch. 7 Tissue Microarray – Construction and Quality Assurance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaxena%2C+R+%22Immunohistochemical+Staining+Methods+6th+ed%22">Immunohistochemical Staining Methods 6th ed</a>. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.dako.com/08002_ihc_staining_methods_5ed.pdf">http://www.dako.com/08002_ihc_staining_methods_5ed.pdf</a> (2013).</li>
<li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O., Sauter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays+%28TMAs%29+for+high-throughput+molecular+pathology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1-5 (2001).</li>
<li>Rangel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tissue+microarray%3A+helpful+hints%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histotech%22%5BJournal%5D)">The tissue microarray: helpful hints.</a> J.Histotech. 25 (2), 93-100 (2002).</li>
<li>Hammer, A., Williams, B., Dietz, H., Hamilton-Dutoit, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+immunophenotyping+of+43+ferret+lymphomas+using+tissue+microarray+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Path%22%5BJournal%5D)">High-throughput immunophenotyping of 43 ferret lymphomas using tissue microarray technology.</a> Vet. Path. 44, 196-203 (2007).</li>
<li>Eckel-Passow, J., Lohse, C., Sheinin, Y., Crispen, P., Krco, C., Kwon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays%3A+one+size+does+not+fit+all%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays: one size does not fit all.</a> Diagn Pathol. 5, 48-57 (2010).</li>
<li>Lin, Y., Hatem, J., Wang, J., Quinn, A., Hicks, D., Tang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarray-based+immunohistochemical+study+can+significantly+underestimate+the+expression+of+HER2+and+progesterone+receptor+in+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Tissue microarray-based immunohistochemical study can significantly underestimate the expression of HER2 and progesterone receptor in ductal carcinoma in situ of the breast.</a> Biotech. Histochem. 86 (5), 345-350 (2011).</li>
<li>Wampfler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+optimal+numbers+of+cores+based+on+tissue+microarray+antibody+assessment+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Sci.+Ther%22%5BJournal%5D)">Determining the optimal numbers of cores based on tissue microarray antibody assessment in non-small cell lung cancer.</a> J Cancer Sci. Ther. 3, 120-124 (2011).</li>
<li>Quagliata, L., Schlageter, M., Quintavalle, C., Tornillo, L., Terracciano, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+players+in+hepatocarcinogenesis%3A+Limits+and+opportunities+of+using+tissue+microarray+%28TMA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microarray%22%5BJournal%5D)">Identification of new players in hepatocarcinogenesis: Limits and opportunities of using tissue microarray (TMA).</a> Microarray. 3, 91-102 (2014).</li>
<li>Miettinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+generating+multitissue+blocks+without+special+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunohistochem.+Mol.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A simple method for generating multitissue blocks without special equipment.</a> Immunohistochem. Mol. Morphol. 20 (4), 410-412 (2012).</li>
<li>Jones, M., Calabresdi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-gelatin+for+embedding+tissues+prior+to+paraffin+processing%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing.</a> BioTechniques. 42, 569-570 (2007).</li>
<li>Carson, F., Hladik, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarson%2C+F+%22Histotechnology%3A+A+Self-Instructional+Text%22">Histotechnology: A Self-Instructional Text</a>. , 3rd ed, American Society for Clinical Pathology Press. Chicago, IL. (2009).</li>
<li>Suvarna, S., Layton, C., Bancroft, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSuvarna%2C+S+%22Bancroft%E2%80%99s+Theory+and+Practice+of+Histological+Techniques.+7th+ed%22">Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques. 7th ed</a>. , 7th ed, Churchill Livingstone Elsevier Ltd. London, UK. (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomyślne przygotowanie i wykorzystanie SpOT wymaga starannego przestrzegania kilku kroków technicznych. Topienie agarozy hydroksyetylowej powinno odbywać się powoli i na małym ogniu. Szybkie topnienie w wysokiej temperaturze może spowodować pewien rozpad agarozy w celu uzyskania mniej niż optymalnych rezultatów. Podczas cięcia zatyczek obciążonych barwnikiem na kawałki do obróbki należy upewnić się, że grubość każdego kawałka jest większa niż 4,5 mm i nie przekracza 7 mm. Zaokrąglone końce są usuwane jako odpady, poniewa...

Możliwość osadzenia próbek tkanek od wielu osób w jednym bloku parafinowym umożliwia łatwe porównywanie obok siebie zabiegów i osób, eliminuje zmienność między preparatami oraz zmniejsza koszty i nakład pracy związany z cięciem i barwieniem próbek. Te wielotkankowe bloki są zwykle produkowane jako mikromacierze tkankowe (TMA) lub bloki parafinowe zawierające tkanki od wielu osób w układzie bez macierzy. Utrzymanie tożsamości próbki ma kluczowe znaczenie dla powodzenia każdej analizy wielotkankowej. Naukowcy korzystają z TMA od czasu ich opracowania, aby poprawić wydajność analizy, zmniejszyć zmienność między szkiełkami, chronić cenne zasoby tkankowe oraz skrócić czas i koszty eksperymentów1. Prawidłowa orientacja TMA może być osiągnięta przy użyciu różnych metod, w tym pustych miejsc, rzędów lub kolumn między rdzeniami tkanek2-4, asymetrycznego rozmieszczenia grup rdzeni3, 5 (np. kontrola vs. leczenie), rdzeni "beacon"6 i wyznaczonych rdzeni orientacyjnych znajdujących się poza matrycą TMA3. Chociaż metody te działają dobrze w przypadku TMA, większość z nich zużywa cenną przestrzeń rdzenia TMA, a TMA z przerwami i spacjami jako identyfikatorami mogą stać się mylące, ponieważ rdzenie tkanek wyczerpują się z czasem. Ponadto metody te nie są odpowiednie do stosowania w blokach wielotkankowych bez formatu tablicy, ponieważ opierają się na anomaliach w ściśle uporządkowanym wzorcu jednolitych rdzeni mikromacierzy jako identyfikatorach. Większość nieustawionych w szyku bloków wielotkankowych musi pomieścić niejednorodne tkanki i, z definicji, nie wyświetlać ustrukturyzowanej siatki tablicy, która sprawia, że te aberracje wyróżniają się jako punkty orientacyjne.
Chociaż korzystanie z TMA ma wiele zalet, jedną z największych wad jest mały rozmiar rdzeni, który nie zawsze jest reprezentatywny dla w dużej mierze heterogenicznej tkanki1. Nieułożone bloki wielotkankowe zapewniają wiele korzyści TMA, ale zawierają większe próbki tkanek lub całe narządy z badań na zwierzętach. Mikromacierze tkankowe wykorzystujące pojedyncze rdzenie mają różną zgodność z całymi sekcjami tkanek w oparciu o białko będące przedmiotem zainteresowania, a wiele z nich wymaga wielu rdzeni w celu zwiększenia zgodności7-11. Ze względu na złożoność i niejednorodny charakter niektórych fenotypów biomarkerów, TMA wykorzystujące nawet dużą liczbę rdzeni (>10) mogą być nadal niewystarczające i mogą wymagać do analizy metod innych niż mikromacierze8. Ponadto budowa TMA jest czasochłonna, wymagająca technicznie i wymaga początkowych kosztów oraz inwestycji w matrycę tkankową lub dostępu do niej. Niemacierzowane bloki wielotkankowe można wykonać w dowolnym podstawowym laboratorium przy znacznie mniejszym nakładzie czasu i wysiłku i stanowią ważną alternatywę dla badań, które wymagają większej ilości tkanki, niż pozwalają na to matryce, lub jako sposób na obniżenie kosztów i uproszczenie analizy.
Niezgrupowane bloki wielotkankowe podobnie wymagają niezawodnego znacznika orientacji do śledzenia identyfikacji próbki, jednak rozwój tych markerów został ograniczony. Znaczna część literatury opisującej orientację tkanek koncentruje się na prawidłowej orientacji fizjologicznej przy osadzaniu poszczególnych fragmentów tkanki, takich jak tatuowanie tkanki tuszem12, wstępne zatapianie tkanek w agar-żelatynie przed przetwarzaniem13 i oznaczanie niektórych tkanek nacięciami14 lub szwami15. Chociaż metody te są funkcjonalne, nie są idealne jako markery w blokach wielotkankowych ze względu na ich ograniczenia. Szew zostanie szybko przecięty i może nie być widoczny w każdym przekroju. Techniki wstępnego zatapiania z użyciem agar-żelatyny mogą utrzymać tkankę we właściwej orientacji podczas przetwarzania i zatapiania, ale nie zapewniają wizualnej wskazówki do rozróżnienia wielu próbek w bloku parafinowym i szkiełkach. Nacięcia lub barwnik na tkance mogą komplikować analizę lub pomijać ważne szczegóły morfologiczne. Alternatywnie, tożsamość tkankowa w nieustawionym bloku wielotkankowym może być zachowana poprzez osadzenie fragmentów tkanki w układzie asymetrycznym, ale wymaga to 3 lub więcej fragmentów tkanki i może nie pozwolić na optymalne ułożenie tkanek do analizy.
Znacznik Orientacji Próbki (SpOT) został opracowany jako łatwa i tania metoda do wyraźnej identyfikacji tkanek w blokach wielotkankowych i oferuje wiele korzyści w porównaniu z istniejącymi metodami orientacji. SpOT to mały, kolorowy rdzeń składający się z żelu do przetwarzania agarozy hydroksyetylowej i barwnika do znakowania tkanek oraz infiltrowany parafiną (ryc. 2C). Rdzeń SpOT jest osadzony na końcu obok pojedynczej tkanki w wielotkankowym bloku parafinowym i pojawia się jako jaskrawo kolorowa kropka w bloku i w każdej sekcji (ryc. 1A-D), wyraźnie wskazując prawidłową orientację bloku i sekcji w celu łatwej identyfikacji tkanki.

<table><tbody><tr><td>Histogel Żel do przetwarzania próbek</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html" target="_blank">http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html</a></td></tr><tr><td>Trójkąt do znakowania tkanek</td><td>Biomedical Sciences, Inc. </td><td>TMD-5</td><td>Każdy barwnik do znakowania tkanek najprawdopodobniej byłby wystarczający.</td></tr><tr><td>Arraymold Kit A 2 mm (60 rdzeni)</td><td>Arraymold</td><td>20015A</td><td>Każdy ręczny układ tkanek będzie działał podobnie.</td></tr></tbody></table>

spot właściwą tkankę za każdym razem w blokach wielotkankowych

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Wielotkankowe bloki parafinowe zapewniają wysoką wydajność analizy ze zwiększoną wydajnością, jednorodnością eksperymentalną oraz zmniejszonym czasem i kosztami. Mikromacierze tkankowe stanowią większość wielotkankowych bloków parafinowych, ale coraz częściej naukowcy używają niemacierzowanych bloków zawierających większe tkanki od wielu osób, co może zapewnić wiele zalet mikromacierzy tkankowych bez znacznych inwestycji w planowanie i sprzęt. Kluczowym elementem każdej analizy wielotkankowej jest metoda orientacji stosowana do identyfikacji każdej pojedynczej tkanki. Chociaż istnieją metody pozwalające na utrzymanie prawidłowej orientacji i identyfikacji tkanek w blokach wielotkankowych, większość z nich nie nadaje się dobrze do bloków nieułożonych w układ, może zajmować cenne miejsce w matrycy i/lub jest trudna do wytworzenia w standardowym laboratorium histologicznym. Znacznik orientacji próbki (SpOT) to proste, niedrogie narzędzie orientacyjne, które jest wyraźnie widoczne w blokach parafinowych i wszystkich przekrojach tkanki, co zapewnia niezawodną identyfikację próbki w układach szykowych i nieszykowych. SpOT zapewnia przewagę nad istniejącymi metodami orientacji dla bloków bez układu, ponieważ nie wymaga żadnej bezpośredniej modyfikacji tkanki i pozwala na elastyczność w ułożeniu kawałków tkanki.

SpOT pojawia się jako okrągła, jaskrawokolorowa kropka w bloku parafinowym (Rysunek 1A oraz 2D), we wszystkich przekrojach parafinowych i pozostaje na szkiełku przedmiotowym podczas procedury barwienia H&amp;E lub IHC (Rysunki 1B-1D oraz 2D). Ten wyraźny sygnał wizualny pomaga zarówno technikowi histologowi, jak i badaczowi w identyfikacji każdego pojedynczego fragmentu tkanki oraz ułatwia komunikację, ponieważ technik może wykorzystać t...

Celem Znacznika Orientacji Próbki (SpOT) jest działanie jako narzędzie orientacyjne, które pomaga w identyfikacji poszczególnych tkanek w wielotkankowych blokach parafinowych. Protokoły te pokazują, w jaki sposób można go łatwo skonstruować z powszechnych, tanich materiałów histologicznych i służy jako niezawodny marker wizualny w blokach i przekrojach parafiny.

SpOT właściwą tkankę za każdym razem w blokach wielotkankowych

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie narzędzia wspomagającego identyfikację tkanek w parafinowych blokach wielotkankowych. Osiąga się to najpierw poprzez połączenie HistoGel z barwnikiem do znakowania tkanek w celu utworzenia jaskrawokolorowego zatyczki żelowej. Drugim krokiem jest przetworzenie i zatopienie kolorowych zatyczek HistoGel zgodnie ze standardowymi technikami przetwarzania i zatapiania tkanek.Następnie, za pomocą wycinaka do biopsji, usuwa się małe cylindry. Są to znaczniki orientacyjne preparatu lub tzw. spoty. Ostatnim krokiem jest zatopienie spotu w bloku wielotkankowym, przy czym lokalizacja spotu oraz każdej próbki zostaje starannie udokumentowana w celu łatwego odniesienia.Ostatecznie plamka stanowi wyraźny sygnał wizualny ułatwiający orientację i identyfikację preparatów w mikromacierzach tkankowych oraz wieloprzysadzkowych blokach tkankowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak szwy czy asymetryczne rdzenie, jest fakt, że plamka nie zmienia struktury tkanki i pozwala na elastyczność w rozmieszczeniu próbek w celu optymalizacji analizy. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy otrzymaliśmy prośby od badaczy o połączenie preparatów tkankowych od wielu zwierząt w jednym bloku parafinowym, aby zredukować koszty i uprościć analizę. Aby przygotować plamki, należy najpierw dodać 50 mg BSA klasy biochemicznej do 1 mL barwnika do znakowania tkanek w 15 mL probówce stożkowej.Mieszaninę należy wortexować przez co najmniej jedną minutę, aż do całkowitego rozpuszczenia. Następnie do probówki stożkowej o pojemności 15 ml należy wprowadzić dziewięć mililitrów żelu przetwarzającego hydroxyethyl aros i podgrzać go w kuchence mikrofalowej przy mocy 30%. Podgrzewanie należy przeprowadzać w odstępach dziesięciosekundowych, aż do całkowitego stopienia żelu.Następnie połącz roztopiony żel do nakładania i roztwór BSA z barwnikiem w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml i wymieszaj dokładnie za pomocą pipety. Następnie wymieszaj roztwór w wortexie i przełóż go do lodówki na kilka godzin w celu zestalenia. Po stwardnieniu ostrożnie wyjmij zestalony żel z dylatatorem, delikatnie uwalniając go za pomocą wąskiej szpatułki.Pokrój wtyk na plastry o grubości pięciu milimetrów. Nie należy używać zaokrąglonych końców. Przenieś od trzech do sześciu plastrów do kasety histologicznej i zanurz je w 70%Ethanol; wymieniaj roztwór 70%ethanol co dwie do czterech godzin, co najmniej trzy razy w ciągu 24 godzin, aż wtyki zostaną całkowicie odwodnione.Barwnik znacznikowy będzie częściowo wymywać się do roztworu etanolu. Początkowe zastosowanie świeżych porcji etanolu pomaga usunąć nadmiar barwnika, co skutkuje czystszym wkładem, z którego kolor będzie wymywać się w mniejszym stopniu. Następnie przenieś kasety do 80% etanolu, a potem do 95% etanolu na jedną godzinę w każdej kąpieli.Barwnik może wyciekać z zatyczki żelowej, co mogłoby wpłynąć na inne tkanki oraz odczynniki ciekłe w automatycznym procesorze tkankowym. W związku z tym wysoce zaleca się ręczne odwodnienie. Niemniej jednak przetwarzanie automatyczne jest równie skuteczne.Zakończ odwadnianie, przeprowadzając trzy przemycia w 100% etanolu przez godzinę każde. Przejaśnij próbki, zanurzając je w węglowodorach aromatycznych lub ksylenach trzykrotnie, po jednej godzinie w każdej kąpieli. Następnie przeprowadź infiltrację przekrojów w trzech godzinnych kąpielach.W roztopionej parafinie. Osadź przetworzone skrawki w sposób rutynowy, a gdy blok osiągnie temperaturę pokojową, użyj igły do biopsji punch, aby pobrać rdzenie z wybranych miejsc. Z jednego bloku można uzyskać 22 rdzenie o średnicy 1 mm lub jeszcze więcej rdzeni o średnicy 1,5 mm.Zacznij od sporządzenia schematu, na którym zaznaczysz pożądane lokalizacje i tożsamość wszystkich poszczególnych fragmentów tkanek, które mają zostać razem zatopione, a także położenie punktu orientacyjnego. Przygotuj kopię do bieżącego wglądu. Skuteczne wykorzystanie znaczników orientacji preparatów wymaga przejrzystej i łatwej do śledzenia mapy biospecyimenów, która precyzyjnie określa wszystkie biospecimeny, ich lokalizację oraz położenie względem punktu orientacyjnego.Po przetworzeniu fragmentów tkanki, ułóż je na stacji do zatapiania. Zgodnie ze schematem orientacji tkanki, prawidłowe ustawienie jest absolutnie kluczowe. Niezwykle ważne jest również, aby rdzeń próbki był wyższy niż wszystkie fragmenty tkanki, które zostaną zatopione w bloczku.Po zakończeniu rozmieszczania tkanek, przeprowadź zastyganie preparatów w parafinie. Przytrzymuj każdy fragment tkanki pionowo za pomocą pęsety, aż parafina stwardnieje, aby zapobiec jego przechyleniu. Powinno to zająć jedną lub dwie minuty.W przypadku manualnego zestawu do tworzenia TMA, wypełnij formę TMA roztopioną parafiną. Podczas stygnięcia formy, przymocuj próbki w podobny sposób na krawędziach matrycy. Następnie wykonaj skrawki i przeprowadź barwienie preparatów z naniesionymi próbkami.Stosując standardową metodę, wykonuje się tutaj skrawki o grubości 5 µm. Aby przenieść skrawki na szkiełka, należy je wypłynąć w kąpieli wodnej o temperaturze 40 °C, a następnie przenieść na dodatnio naładowane szkiełka szklane. Po przytwierdzeniu do szkiełek należy je suszyć w temperaturze 60 °C przez co najmniej 20 minut.Preparaty mogą zostać teraz zabarwione ręcznie lub w automatycznym systemie barwienia. W przypadku rutynowego barwienia H&amp;E, barwień specjalnych lub immunohistochemii, miejsca zainteresowania pojawiły się jako okrągłe, intensywnie zabarwione obszary w bloku parafinowym oraz we wszystkich skrawkach parafinowych.Plamki umożliwiają łatwą orientację i identyfikację tkanek w blokach wielotkankowych zawierających podobnie wyglądające tkanki od różnych osobników i grup badawczych. W przypadku zastosowania w matrycy tkankowej (tissue microarray), plamki pozwalają na wykorzystanie każdego rdzenia do cennych próbek tkanek, a same plamki można łatwo wyodrębnić w sąsiedztwie rdzenia matrycy. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że dokładna i przejrzysta dokumentacja biospektimenu oraz plamki w bloku jest kluczowa dla pomyślnego wykorzystania materiału.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak w prosty sposób tworzyć i wykorzystywać znacznik orientacji preparatu jako pomoc w identyfikacji tkanek w blokach parafinowych zawierających wiele tkanek.

spot-the-correct-tissue-every-time-in-multi-tissue-blocks

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikromacierze tkankowe stanowią efektywną metodę jednoczesnego pozyskiwania informacji z wielu tkanek. Reprezentatywne fragmenty tkanek są łączone w jednym bloku parafiny. Przekroje z bloku wykorzystuje się do immunohistochemii oraz analizy wzorców ekspresji białek. Skanowanie cyfrowe pozwala na wygenerowanie odpowiadających im obrazów w celu dystrybucji danych.

Produkcja macierzy mikrotkankowych, barwienie immunohistochemiczne i digitalizacja w ramach projektu Human Protein Atlas

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Prezentujemy podejście do rejestracji obrazów do trójwymiarowej (3D) histologicznej rekonstrukcji objętości, które ułatwia badanie zmian zachodzących w narządzie na poziomie makrostruktur składających się z komórek. Korzystając z tego podejścia, zbadaliśmy zmiany 3D między gruczołami sutkowymi typu dzikiego i Igfbp7-null.

Rekonstrukcja trójwymiarowej objętości histologicznej i jej zastosowanie do badania mysich gruczołów sutkowych

Protokół ma na celu optymalizację konstrukcji i jakości mikromacierzy tkankowych do badań nad biomarkerami. Obejmuje aspekty planowania i projektowania, patologii cyfrowej, wirtualnych adnotacji do slajdów i automatycznego układania tkanek.

Protokół mikromacierzy tkankowej nowej generacji (ngTMA) do badań biomarkerów

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Pokazano praktyczne zastosowanie i wydajność metod generowania reprezentatywnych próbek tkanek modeli zwierzęcych świń dla szerokiego spektrum dalszych analiz w projektach biobanków, w tym wolumetrii, systematycznego losowego pobierania próbek i różnicowego przetwarzania próbek tkanek dla jakościowych i ilościowych analiz morfologicznych i molekularnych.

Strategie pobierania próbek i przetwarzanie próbek tkanek z biobanku z modeli biomedycznych świń

Tutaj opisujemy prostą i przystępną strategię wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w utrwalonych w formalinie odcinkach tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie. Metodologia ta łączy istniejące techniki obrazowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i analizy wieloparametrowej testów obrazowania.

Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Opisujemy protokoły oceny stopnia transdukcji przez peptydy penetrujące komórki, wykorzystując systemy obrazowania ex vivo, a następnie zatapianie parafiny, cięcie i konfokalną mikroskopię fluorescencyjną na przykładzie peptydu celującego w serce. W naszym protokole pojedyncze zwierzę może być wykorzystane do uzyskania obu rodzajów oceny obrazowej tych samych narządów, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt potrzebnych do badań o połowę.

Obrazowanie in vivo skuteczności transdukcji peptydu ukierunkowanego na serce

Ten artykuł opisuje metody generowania, leczenia lekami i analizy eksplantatów pochodzących od pacjentów do oceny reakcji na leki nowotworowe w żywym, istotnym dla pacjenta, przedklinicznym systemie modelowym.

Eksplantaty nowotworów pochodzące od pacjentów jako "żywa" platforma przedkliniczna do przewidywania oporności na leki u pacjentów

Ten protokół opisuje metodę taśmy, jak ręcznie konstruować mikromacierz tkankową przy użyciu bloków donorowych FFPE o różnych głębokościach.

Ręczna budowa mikromacierzy tkankowej metodą taśmową i ręcznym mikromacierzem

Poznaj metodę tworzenia Specimen Orientation Tag (SpOT) do identyfikacji tkanek w blokach parafinowych z wieloma tkankami. Technika wykorzystuje HistoGel i barwnik do znakowania, zapewniając wyraźny znacznik wizualny.

SpOT właściwą tkankę za każdym razem w blokach wielotkankowych

Przeglądaj więcej filmów