SpOT właściwą tkankę za każdym razem w blokach wielotkankowych

Ogólnym celem tej procedury jest skonstruowanie narzędzia wspomagającego identyfikację tkanek w wielotkankowych blokach parafinowych. Osiąga się to poprzez najpierw połączenie HistoGel z barwnikiem do znakowania tkanek w celu utworzenia jaskrawo zatyczki żelowej. Drugim krokiem jest przetworzenie i zatopienie kolorowych zatyczek HistoGel zgodnie ze standardowymi technikami przetwarzania tkanek i zatapiania.

Następnie stosuje się stempel do biopsji w celu usunięcia małych cylindrów. Są to znaczniki orientacji próbki lub plamki. Ostatnim krokiem jest osadzenie plamki w bloku wielotkankowym z lokalizacją plamki i starannie udokumentowaną każdą próbką w celu łatwego odniesienia.

Ostatecznie, plamka zapewnia wyraźną wizualną wskazówkę do orientacji i identyfikacji próbki w mikromacierzach tkankowych i blokach wielotkankowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak szwy lub asymetryczne rdzenie, jest to, że miejsce nie zmienia tkanki i pozwala na elastyczność w ułożeniu próbek w celu optymalnej analizy. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy otrzymaliśmy prośby od badaczy o połączenie próbek tkanek od wielu zwierząt w jeden blok parafinowy, aby zaoszczędzić pieniądze i uprościć analizę. Aby przygotować plamy, zacznij od dodania 50 miligramów biochemicznego BSA do jednego mililitra barwnika do znakowania tkanek w 15-mililitrowej stożkowej probówce.

Mieszaj mieszaninę przez co najmniej jedną minutę, aż całkowicie się rozpuści. Następnie załaduj dziewięć mililitrów żelu do przetwarzania hydroksyetylu aros do 15-mililitrowej stożkowej rurki i podgrzej ją w kuchence mikrofalowej o mocy 30%. Pulsuj ciepłem w dziesięciosekundowych odstępach, aż żel całkowicie się rozpuści.

Teraz połącz stopiony żel procesowy i roztwór barwnika BSA w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i dokładnie wymieszaj pipetą. Następnie zwiruj roztwór i przenieś go do lodówki na kilka godzin, aby stężał. Po stwardnieniu usuń stały dylator w żelu, delikatnie uwalniając go wąską szpatułką.

Pokrój wtyczkę na odcinki o grubości pięciu milimetrów. Nie używaj zaokrąglonych końcówek. Przenieś od trzech do sześciu sekcji do kasety histologicznej i zanurz je w 70% etanolu, zmieniaj 70% roztwór etanolu co dwie do czterech godzin i co najmniej trzy razy w ciągu 24 godzin, aż korki zostaną całkowicie odwodnione.

Będą wypłukiwać część barwnika znakującego do roztworu etanolu. Stosowanie zmian świeżego etanolu początkowo pomaga wypłukać część nadmiaru barwnika, co skutkuje czystszą zatyczką, która jest mniej podatna na wypłukiwanie koloru. Następnie przenieś kasety do 80% etanolu, a następnie do 95% etanolu na jedną godzinę w każdej kąpieli.

Barwnik może wyciekać z korka żelowego, co może mieć wpływ na inne tkanki i płynne odczynniki w automatycznym procesorze tkanek. W związku z tym zdecydowanie zaleca się ręczne odwadnianie. Jednak zautomatyzowane przetwarzanie jest równie skuteczne.

Zakończ odwodnienie, wykonując trzy prania w 100% etanolu przez godzinę każde. Oczyścić próbki, zanurzając je trzykrotnie w węglowodorach atynowych lub ksylenach na jedną godzinę w każdej kąpieli. Teraz przeniknij do sekcji za pomocą trzech godzinnych kąpieli.

W stopionej parafinie. Osadź przetworzone skrawki jak zwykle, a gdy blok osiągnie temperaturę pokojową, użyj igły do dziurkowania skórnego, aby wykonać rdzenie punktowe. Jeden blok może wytwarzać rdzenie o średnicy 22 milimetrów lub nawet więcej rdzeni o średnicy 1,5 milimetra.

Zacznij od sporządzenia diagramu, aby wskazać pożądane lokalizacje i tożsamość wszystkich poszczególnych fragmentów tkanki, które mają być osadzone razem, oraz lokalizację miejsca. Przygotuj kopię, którą będziesz mieć pod ręką. Skuteczne wykorzystanie znaczników orientacji próbki wymaga przejrzystej i łatwej do naśladowania mapy próbek biologicznych, która dokładnie wyszczególnia wszystkie próbki biologiczne, ich lokalizację i położenie względem miejsca.

Po przetworzeniu kawałków tkanki ułóż je na stacji zatapiania. Zgodnie ze schematem orientacji tkanki, prawidłowa orientacja jest absolutnie krytyczna. Ważne jest również, aby rdzeń punktowy był wyższy niż wszystkie kawałki tkanki, które zostaną osadzone w bloku.

Po zakończeniu układania tkanek osadź plamki. Trzymaj każde miejsce pionowo za pomocą kleszczy, aż parafina zastygnie, aby się nie przewróciła. Minuta lub dwie powinny wystarczyć.

W przypadku ręcznego zestawu TMA napełnij formę TMA stopioną parafiną. Gdy forma stygnie, przymocuj plamy w podobny sposób na marginesach tablicy. Teraz przekrój i poplam sekcje plamą.

Stosując standardowe podejście, wykonuje się tutaj sekcje o długości pięciu mikronów. Aby ułożyć sekcje na szkiełkach, należy je zanurzyć w kąpieli wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza, a następnie przenieść do dodatnio naładowanych szkiełek szklanych. Po przymocowaniu do szkiełek susz je w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez co najmniej 20 minut.

Szkiełka można teraz barwić ręcznie lub za pomocą automatycznego systemu barwienia. W przypadku rutynowego barwienia h i d specjalne plamy lub plamy chemii immunologicznej pojawiały się jako okrągłe jaskrawo zabarwione. w bloku parafinowym oraz we wszystkich sekcjach parafinowych.

Plamki pozwoliły na łatwą orientację i identyfikację tkanek w wielotkankowych blokach zawierających podobnie wyglądające tkanki pochodzące od różnych osób i grup badanych. W przypadku zastosowania w tkance, plamki mikromacierzy pozwoliły na wykorzystanie każdego rdzenia do cennych próbek tkanki, a plamki można było łatwo wybrać w sąsiedztwie rdzenia mikromacierzy tkankowej. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że dokładna i jasna dokumentacja próbki biologicznej i miejsca w bloku ma kluczowe znaczenie dla jej pomyślnego wykorzystania.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak łatwo utworzyć i używać znacznika orientacji próbki jako pomocy w identyfikacji tkanek w wielotkankowych blokach parafinowych.