Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Przestrzenna organizacja komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza ma wartość kliniczną. Strategia ta może być łatwo wykorzystana do wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w tkance nowotworowej. Immunoterapia zrewolucjonizowała leczenie nowotworów.

Jednak nie wszyscy pacjenci reagują dobrze. Strategia ta może służyć do zdefiniowania sygnatur tkankowo-immunologicznych, które mogą przewidzieć dobrą odpowiedź przeciwnowotworową. Przed przeprowadzeniem eksperymentu przetestuj kombinacje przeciwciał i techniki strippingu na tkankach kontrolnych i sprawdź, czy APP są dokładne w wykrywaniu markerów będących przedmiotem zainteresowania.

Ponieważ pisemne opisy metod analizy obrazu wykorzystują wyrafinowany język techniczny, połączenie tekstu z wideo ułatwia lepsze zrozumienie i odtworzenie metodologii. W celu pobrania antygenu z utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie skrawków tkanki, zanurz odparafinową próbkę tkanki w słoiku Coplin z roztworem do pobierania antygenu i umieść słoik w szybkowarze elektrycznym zawierającym wodę z kranu. Poziom wody nie powinien przekraczać połowy wysokości słoika, aby woda nie zmieszała się z roztworem do pobierania antygenu.

Zamknij pokrywę i zawór ciśnieniowy na szybkowarze i traktuj szkiełka wysokim ciśnieniem przez 10 minut. Po zakończeniu zabiegu odłącz kuchenkę, zwolnij ciśnienie i otwórz pokrywę. Po ostygnięciu szkiełek w szybkowarze przez 30 minut, umyj próbki dwa razy przez pięć minut w świeżym PBS na pranie w nowym słoiku Coplin, a następnie użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować barierę wokół każdego odcinka tkanki.

Następnie zanurz szkiełka w 0,1-molowej glicynie w PBS na 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przepłucz szkiełka dwa razy w PBS, jak pokazano. Po drugim płukaniu przenieś szkiełka do komory wilgotnościowej i przykryj każdy fragment tkanki roztworem blokującym. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej przepłukać sekcje dwa razy przez pięć minut w świeżym PBS-Tween na pranie, a następnie dodać do każdego szkiełka pierwszorzędowe przeciwciała, rozcieńczone w roztworze blokującym, chronione przed światłem.

Pod koniec inkubacji przepłukać szkiełka trzy razy w świeżym PBS-Tween przez pięć minut na pranie, a następnie oznaczyć skrawki odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przepłukać szkiełka trzykrotnie w świeżym PBS-Tween przez pięć minut na mycie. Następnie przepłucz go w wodzie podwójnie destylowanej.

Usuń nadmiar wody z każdego szkiełka i zamontuj chusteczki z podłożem montażowym uzupełnionym DAPI i szkiełkiem nakrywkowym. Po wyciśnięciu nadmiaru podłoża montażowego pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 20 minut w temperaturze pokojowej, chronione przed światłem, przed uzyskaniem obrazów dla wszystkich kanałów za pomocą skanera całych slajdów. Po zeskanowaniu otwórz obrazy w oprogramowaniu do analizy obrazu i kliknij kartę Tissuealign.

Aby zaimportować obrazy do wyrównania do zasobnika slajdów, wybierz pierwszy obraz do wyrównania z bazy danych. Po załadowaniu wszystkich obrazów kliknij przycisk Dalej w krokach przepływu pracy, aby połączyć obrazy, a następnie przeciągnij i upuść wszystkie obrazy, które mają zostać wyrównane do pierwszego obrazu. Gdy wszystkie obrazy zostały odpowiednio połączone, należy użyć co najmniej trzech pinezek na obraz, wskazujących homologiczne cechy tkanki na połączonych obrazach.

Użyj pinezki, aby prześledzić pierwszy obraz, aby sprawdzić jakość wynikowego wyrównania. Jeśli uzyskano zadowalające wyrównanie, kliknij przycisk Dalej, aby wyświetlić warstwy obrazu i zapisać obraz kompozytowy w bazie danych. Aby wykonać detekcję tkanki przy użyciu zdefiniowanego przez użytkownika protokołu APP 1, otwórz kartę Analiza obrazu i otwórz obraz złożony w module analizy obrazu.

Kliknij ikonę Otwórz aplikację i wybierz odpowiednią aplikację. Aby potwierdzić, że aplikacja działa, przejdź do wybranej lokalizacji tkanki i kliknij przycisk Podgląd. Jeśli wyniki są zadowalające, kliknij, aby przetworzyć obraz za pomocą wybranej aplikacji.

Podczas przetwarzania aplikacja określi, czy piksel jest powiązany z tkanką, aby umożliwić konwersję wszystkich pikseli związanych z tkanką w obszar zainteresowania. Nowo utworzony obszar zainteresowania można następnie przenieść na dowolny z wyrównanych obrazów. Na końcu analizy kliknij Plik i Zapisz, aby zapisać zmodyfikowany obraz z nowo utworzonym obszarem zainteresowania.

W celu segmentacji tkanki na zrąb i miąższ otwórz zakładkę Analiza obrazu i wybierz interesujące Cię pliki z bazy danych. Otwórz aplikację 2, aplikacja 2 wykorzystuje obraz barwiony PSR do segmentacji tkanek. Podgląd aplikacji 2 poprzez przetwarzanie obrazu w wybranym polu view.

Jeśli wyniki są zadowalające, kliknij przycisk Uruchom, aby przetworzyć aplikację 2 na pełnym obrazie. Obszar zainteresowania tkanki zostanie podzielony na zrąb i miąższ, a ich odpowiednie obszary zostaną określone. Nowo utworzone obszary zainteresowania dla zrębu i miąższu można przenieść na wyrównane obrazy, a następnie wyeksportować i zapisać zmodyfikowany obraz, jak pokazano.

Aby zidentyfikować i określić ilościowo interesujące populacje komórek, zaimportuj interesujący obraz podzielony na segmenty do modułu analizy obrazu. Po dostosowaniu koloru otwórz aplikację 3. APP 3 wykryje interesujące populacje komórek i określi je ilościowo w obrębie miąższu i zrębu.

Jeśli wyniki są zadowalające, uruchom aplikację 3 na pełnym obrazie. Wszystkie poszczególne komórki będące przedmiotem zainteresowania zostaną oznaczone, ich współrzędne tkankowe zostaną zapisane, a gęstości komórek będących przedmiotem zainteresowania w zrębie i obszarach miąższowych zostaną określone. Zmodyfikowany obraz można następnie zapisać zgodnie z ilustracją.

Aby wykonać mapowanie termiczne tkanek obiektów oznaczonych komórkami zainteresowania, otwórz odpowiedni protokół zdefiniowany przez użytkownika w oknie wyboru aplikacji i kliknij przycisk Uruchom, aby skłonić aplikację do użycia współrzędnych obiektów znakowanych przeciwciałami do wygenerowania mapy cieplnej. Obszary punktów aktywnych, wyróżnione na czerwono, zawierają największą gęstość populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania, podczas gdy obszary ciemnoniebieskie mają najniższą. Mapa cieplna określonej populacji komórek może zostać nałożona na wyrównane obrazy, aby dostarczyć dodatkowych informacji o tym, jak te komórki są zorganizowane w mikrośrodowisku guza.

Następnie wyeksportuj i zapisz mapę cieplną tkanki. Bardzo ważne jest zweryfikowanie specyfiki etykietowania, dokładności zaprojektowanych aplikacji oraz skuteczności usuwania i ponownego próbkowania różnych plam na tym samym odcinku. Dzięki integracji obrazowania seryjnego, sekwencyjnego etykietowania i wyrównywania tkanek można jednocześnie wizualizować więcej markerów i wydobywać więcej informacji z ograniczonych próbek klinicznych.

Barwienie H&E wyciętych skrawków tkanki nowotworowej umożliwia ocenę architektury tkanki, morfologii komórek i klinicznie istotnych parametrów, takich jak rodzaj nowotworu, stopień zaawansowania guza i ogólna infiltracja immunologiczna. Barwienie CD34 umożliwia wykrycie komórek śródbłonka. Barwienie cytokeratyną 8/18 ujawnia obecność komórek nabłonkowych, a barwienie aktyną anty-alfa mięśni gładkich pozwala na identyfikację fibrogennych, aktywowanych, gwiaździstych komórek wątroby.

Sondowanie przeciwciałami przeciwko CD68 i Desmin pozwala na wykrycie odpowiednio makrofagów i miofibroblastów. Aby lepiej scharakteryzować naciek immunologiczny nowotworu, można przeprowadzić barwienie pod kątem markerów limfocytów T i mieloperoksydazy. Barwienie Picro Sirius Red można również wykonać w celu uwidocznienia kolagenu fibrylarnego oraz ułatwienia segmentacji zrębu i miąższu.

Piksele związane z tkanką w wybarwionych sekcjach można zidentyfikować, aby umożliwić segmentację różnych przedziałów w określonym obszarze zainteresowania. Interesujące populacje komórek można następnie zidentyfikować w każdym regionie, co pozwala na wygenerowanie map tkankowych, dla których regiony o dużej gęstości dla danej populacji komórek są wyświetlane jako gorące punkty, a regiony o stosunkowo niskiej gęstości pojawiają się jako zimne punkty. Ta metodologia identyfikacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w próbkach tkanek może być dostosowana i zwalidowana dla określonych pytań badawczych i markerów będących przedmiotem zainteresowania.

Strategia ta może być zastosowana do mikromacierzy tkankowych w celu przeprowadzenia analizy o wysokiej przepustowości. Można go również połączyć z hybrydyzacją in situ w celu jednoczesnego badania ekspresji białek i genów in situ. Wykorzystaliśmy tę strategię do identyfikacji i mapowania komórek wytwarzających IL-17A in situ w zwłókniejącej tkance wątroby od pacjentów.

Jak wskazano w protokole, kilka odczynników jest niebezpiecznych chemicznie, a odpowiednie procedury należy wykonywać w kapturze chemicznym przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej i środków ostrożności.