Ręczna budowa mikromacierzy tkankowej metodą taśmową i ręcznym mikromacierzem

Mikromacierz tkankowa (TMA) jest ważnym narzędziem badawczym, które łączy małe przykładowe fragmenty tkanki znane jako rdzenie tkanek z utrwalonych w formalinie bloków tkanek zatopionych w parafinie, zwanych blokami dawczymi, w pojedynczy blok parafinowy. Metoda taśmowa jest w pełni ręczną metodą konstrukcyjną, która odwraca proces budowy poprzez odlewanie bloku wokół pionowych rdzeni, a tym samym jest kompatybilna z nieidealnymi blokami dawczymi i wykorzystuje niedrogie, powszechnie dostępne jednorazowe ręczne mikromacierze tkankowe. Wieloetapowy przebieg tego procesu zostanie zademonstrowany przez pana Lee Wisnera i dr Brandona Larsena.

Jednym z najważniejszych pojęć, o których należy pamiętać podczas konstruowania bloków TMA, jest fakt, że tkanki w blokach tkanek zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie są w rzeczywistości strukturami trójwymiarowymi = wymiarowymi. Opracowaliśmy tutaj animację, aby pomóc wyjaśnić tę koncepcję. To, co tu widzisz, to animacja przedstawiająca blok tkanki zatopionej w parafinie utrwalonej w formalinie, pokazujący trójwymiarową naturę tej tkanki w bloku.

Możesz zobaczyć, że tkanka jest widoczna w górnej części bloku i ten obszar jest dość duży. Gdybyśmy byli w stanie widzieć promieniami rentgenowskimi i widzieć przez blok, moglibyśmy zobaczyć, że tkanka nie jest w rzeczywistości jednolicie ukształtowana głębiej w tym bloku, prawie jak góra lodowa w oceanie, gdzie to, co widzimy na powierzchni, może nie reprezentować tego, co jest poniżej. W obrębie tego bloku tkankowego mogą znajdować się dodatkowe fragmenty tkanki, które nie są widoczne na powierzchni.

Mogą występować obszary martwicy lub śmierci tkanki w środku tej tkanki głębiej. Patolog powinien faktycznie przejrzeć ten dwuwymiarowy przekrój z górnej części tego bloku tkanki, a następnie dodać adnotacje do tego slajdu, aby pokazać obszary, które zawierają tkankę będącą przedmiotem zainteresowania, wykluczając martwicę lub inne rodzaje tkanek, które w rzeczywistości nie są interesujące. Aby ułatwić prawidłowe pobranie próbki rdzenia tkanki, patolog powinien zrobić trzy rzeczy.

Najpierw, za pomocą pisaka do oznaczania szkiełka, patolog zaznaczy interesującą go tkankę na szkiełku, aby można było uniknąć innych tkanek. Po drugie, jeśli w tym obszarze zainteresowania znajdują się obszary, których należy unikać, patolog może użyć tego samego pisaka do znakowania, aby wymazać te obszary, które nie powinny być pobierane. I na koniec, najlepiej używając innego koloru pisaka, patolog powinien zaznaczyć te obszary, które są idealne w obszarze zainteresowania do pobierania próbek rdzeniowych i budowy TMA.

Ważne jest, aby pamiętać, że po zakończeniu tego procesu skład tkanki może zmienić się głębiej w środku od miejsca, w którym pobierana jest próbka rdzenia, a my pokażemy to tutaj na animacji, że lokalizacja rdzenia określi skład tego rdzenia, który będzie się różnił w zależności od głębokości tkanki i tego, co jest obecne w tym bloku. Na przykład tutaj pierwszy rdzeń, który ilustrujemy, przechwytuje część tkanki w jej górnej połowie, ale głębiej w bloku nie ma już żadnej tkanki, z której ten rdzeń został uzyskany, więc pobrano tylko próbkę wosku parafinowego. Drugi rdzeń, który tutaj zilustrowaliśmy, przechwycił tkankę na całej swojej długości, ponieważ tkanka jest obecna na całej głębokości tego bloku w tym miejscu.

Trzeci rdzeń przechwycił część tkanki, a następnie przechwycił część wosku parafinowego w środku, gdzie nie było tkanki, a następnie przechwycił nieco więcej tkanki na jej dolnym końcu, gdzie znajdowała się tkanka w dolnej części tego bloku. Po zakończeniu przeglądu patologicznego sporządź ostateczną listę bloków dawczych, które mają być użyte w budowie TMA, a następnie utwórz mapę TMA. Mapa TMA jest schematycznym obrysem, gdzie będą znajdować się rdzenie w ukończonym TMA i montowanych na suwaku odcinkach tkanek wyciętych z wynikowego TMA.

W celach orientacyjnych upewnij się, że mapa TMA unika umieszczania rdzeni w równej macierzy, takiej jak macierz trzy na trzy lub cztery na cztery, i zawiera co najmniej jeden znacznik orientacji. Ponieważ metoda taśmowa odwraca proces budowy poprzez rozlewanie stopionego wosku wokół odwróconych rdzeni, wymaga to stworzenia drugiej mapy znanej jako mapa konstrukcyjna, która jest lustrzanym odbiciem mapy TMA. Mapa budowy pokazuje, gdzie każdy rdzeń musi zostać umieszczony podczas budowy, aby pojawił się we właściwym miejscu w ukończonym TMA.

Po utworzeniu map przygotuj metalową formę bazową TMA. Aby ułatwić rozmieszczenie rdzenia, użyj jednorazowej papierowej siatki w kratkę. Przytnij papierową siatkę w kratkę na wymiar i przymocuj kawałek podwójnej taśmy klejącej z tyłu siatki.

Umieść siatkę i taśmę w metalowej tacce i dodaj drugi kawałek podwójnej taśmy klejącej na wierzchu siatki. Nałóż sprawdzony przez patologię szkiełko H&E na blok tkanki FFPE, który ma zostać przedziurkowany, i użyj oznaczeń patologa, aby określić, gdzie blok tkanki ma zostać przebity. Za pomocą ręcznego ręcznego dziurkacza rdzeniowego, jednorazowego lub wielokrotnego użytku, przebij blok dawcy FFPE w odpowiednim obszarze.

Jeśli używasz dziurkacza wielokrotnego użytku, upewnij się, że jest on czyszczony przed i po każdym wkłuciu w tkankę. Wysuń rdzeń rdzeniowy z przebijaka koronowego. Użyj szpikulca do igieł, aby umieścić wyrzucony rdzeń na krzyżu nitkowym siatki pokrytej podwójną taśmą.

Upewnij się, że rdzeń jest umieszczony w odwrócony, pionowy sposób, tak aby tkankowy koniec rdzenia stykał się z taśmą i znajdował się we właściwym miejscu, jak oznaczono na mapie konstrukcyjnej. Powtarzaj, aż wszystkie bloki dawcze zostaną wydrążone, a rdzenie zostaną umieszczone we właściwych pozycjach. Gdy wszystkie rdzenie znajdą się na swoim miejscu, oznacz plastikową kasetę i umieść ją na metalowej podstawie zawierającej rdzenie.

Wysokość rdzeni nie powinna przekraczać głębokości metalowej tacy, ponieważ wysokie rdzenie zostaną przechylone lub przewrócone po umieszczeniu kasety na miejscu. Delikatnie wlej stopioną parafinę przez kasetę do tacki z rdzeniami. Pozwól, aby stopiona parafina przelała się, aby upewnić się, że w korpusie TMA nie ma pęcherzyków powietrza.

Upewnij się, że parafina wypełnia się do górnej części kasety w taki sposób, aby kaseta była osadzona i mocno związana z blokiem parafiny po jego zestaleniu. Pozostaw blok do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 30 minut i nie przesuwaj go w tym czasie. Wstaw blok do lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dodatkowe 30 minut, aby całkowicie zastygł.

Po całkowitym związaniu delikatnie oddziel metalową podstawę formy i usuń podwójną taśmę klejącą z bloku parafinowego. Po skonstruowaniu TMA użyj mikrotomu, aby podzielić nowy TMA. Po odpowiednim zlicowaniu bloku należy pobrać pełne wycinki tkanki.

Przenieś skrawki do wstępnie podgrzanej łaźni wodnej i zamontuj skrawki tkanki na wsuwaniu. Po wyschnięciu należy przesłać reprezentatywne sekcje do barwienia H&E i wszelkich dodatkowych barwień immunohistochemicznych, które mogą być wymagane. Prześlij poplamione skrawki TMA do oceny patologicznej.

W celu walidacji TMA patolog powinien przejrzeć szkiełko H&E z bloku TMA i przejrzeć każde okrągłe miejsce pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy obecna jest tkanka będąca przedmiotem zainteresowania. Kluczowym elementem procesu budowy jest identyfikacja tkanek będących przedmiotem zainteresowania w danym bloku dawczym, z którego powinien zostać pozyskany rdzeń TMA. Pierwsza kolumna tego rysunku przedstawia przykładowy dawca H&Es z oznaczeniami patologa.

Druga kolumna pokazuje wybity obszar tkanek barwionych H&E. Trzecia kolumna przedstawia wybarwioną H&E tkankę rdzeni TMA, które zostały pobrane z bloków dawczych w obszarach pokazanych w kolumnach pierwszej i drugiej. Patolog może wyświetlić dopasowany blok dawcy i rdzeń TMA H&E razem, aby sprawdzić, czy obszar zainteresowania został pobrany i że skład tkanki jest taki sam.

Istnieją dwa podstawowe wskaźniki pomyślnego ukończenia TMA metodą taśmową. Pierwszym z nich jest obecność kropek rdzenia tkankowego w oczekiwanych miejscach i odległości od siebie, co ocenia się za pomocą oględzin. Obrazy pokazane w A i B przedstawiają dwa pomyślnie ukończone TMA metodą taśmową i odpowiadające im slajdy H&E.

Oględziny tych bloków TMA pokazują, że rdzenie są obecne i regularnie rozmieszczone w każdym TMA i odpowiadających im sekcjach. Niektóre z głównych problemów konstrukcyjnych, które mogą pojawić się podczas procesu budowy metodą taśmową, obejmują oddzielenie bloku i kasety z powodu przedwczesnego usunięcia metalowej podstawy przed zestaleniem, jak pokazano na rysunku C. Przewrócenie się rdzenia i/lub dryf rozmieszczenia osadzonych rdzeni, jak pokazano na rysunku D, może wystąpić podczas nadmiernie turbulentnego nalewania stopionej parafiny, które mogą być pogorszone przez słabo przylegającą dwustronną taśmę klejącą. Ten rysunek pokazuje, że plama H&E dla każdego z rdzeni jest przykładowym TMA.

Wszystkie miejsca, z wyjątkiem jednego, są obecne w H&E. Rysunek pokazuje również, że niektóre rdzenie są obecne jako kompletne okrągłe kropki tkankowe, podczas gdy inne nie są całkowicie obecne. Taka utrata tkanki nie jest rzadkością i może być spowodowana niewystarczającą powierzchnią blokową, aby w pełni odsłonić wszystkie rdzenie.

Alternatywnie, obecność niekompletnej lub całkowitego braku tkanki może wynikać ze złej jakości tkanki tego rdzenia, co może skutkować utratą tkanki podczas procesu barwienia. Na kolejnym rysunku przeprowadzono immunohistochemię i barwienie RNA ISH na odcinkach TMA w celu dalszej walidacji TMA. Jak pokazano tutaj, można stosować różne barwniki w zależności od tkanki użytej do budowy TMA.

Vimentin jest stosowany jako kontrola jakości. U6 jest wskaźnikiem jakości RNA. EBER służy do określania statusu EBV.

A CD20 jest markerem komórek B wskazującym na obecność komórek B. Oto kilka plam, które można wykorzystać, aby pomóc w walidacji TMA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak wykonać mikromacierz tkankową przy użyciu metody taśmowej i dlaczego TMA są ważnymi narzędziami badawczymi oszczędzającymi czas i zasoby.

Należy również zrozumieć, że budowa TMA nie jest procesem idealnym i że ciągłe wytyczne patologiczne i przegląd są krytycznymi elementami nie tylko podczas procesu budowy, ale także w badaniach immunohistochemicznych wykonywanych na odcinkach TMA, aby upewnić się, że tkanka będąca przedmiotem zainteresowania jest rzeczywiście obecna w sekcji TMA.