Name: Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji efektorów bakteryjnych w komórkach roślinnych przy użyciu systemu split superfolder GFP. Technika ta umożliwia badanie interakcji roślina-patogen z wykorzystaniem Nicotiana benthamiana i Arabidopsis thaliana.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez Program Badań Podstawowych za pośrednictwem Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (NRF-2018R1A2A1A05019892) dla DC oraz przez grant z Centrum Hodowli Molekularnej Roślin (PMBC) programu Next Generation Biogreen 21 Administracji Rozwoju Obszarów Wiejskich (PJ013201) dla EP. Dziękujemy centrum obrazowania Narodowego Centrum Instrumentacji Zarządzania Środowiskiem do Zapewnij mikroskop konfokalny do filmowania.

Uwaga: Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
1. Przygotowanie materiałów roślinnych (4 tygodnie)
<ol>
	<li>Przygotowanie dla roślin N. benthamiana
	<ol>
		<li>Zasiej 2 nasiona N. benthamiana na powierzchni gleby każdej doniczki, przykryj tacę plastikową kopułą i pozwól nasionom wykiełkować w komorze wzrostu o temperaturze 25 °C i wilgotności 60% z 16/8-godzinnym cyklem fotoperiodu jasnego/ciemnego.</li>
		<li>Po dwóch tygodniach wybierz i wyrzuć najmniejszą sadzonkę z każdej doniczki i kontynuuj uprawę roślin w tych samych warunkach wzrostu, jakie zastosowano do kiełkowania w kroku 1.1.1. Dodawaj 1 l wody na tacę co dwa dni. 
		Uwaga: Warunki wzrostu roślin mogą się różnić w zależności od laboratorium. Dlatego postępuj zgodnie z regularnym protokołem podlewania, aby wyhodować roślinę w zdrowym stanie.</li>
		<li>W ciągu tygodnia przenieś rośliny na nową tacę i ułóż je z odpowiednią przestrzenią do dalszego wzrostu. Kontynuuj uprawę roślin w warunkach opisanych w kroku 1.1.1, aż będą gotowe do infiltracji w wieku 4 tygodni. 
		Uwaga: Wzrost roślin może się różnić w zależności od warunków wzrostu w różnych laboratoriach. Zwykle okazuje się, że 4-tygodniowe rośliny N. benthamiana mają około sześciu liści.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat dla roślin transgenicznych A. thaliana
	<ol>
		<li>Zapoznaj się z Tabelą Materiałów i zamów transgeniczne nasiona Arabidopsis.</li>
		<li>Namocz ~ 50 - 100 transgenicznych nasion Arabidopsis w 1 ml wody destylowanej i przechowuj je w temperaturze 4 °C przez 3 dni w ciemności, aby zsynchronizować początek kiełkowania.</li>
		<li>Zasiej ~ 2 - 3 nasiona na powierzchni gleby tacki na rośliny i przykryj tacę plastikową kopułą. Pozwól nasionom wykiełkować w temperaturze 23 °C, wilgotności 60% w 10/14-godzinnym cyklu fotoperiodycznym jasnym/ciemnym. 
		Uwaga: Nasiona powinny być homozygotami. Zalecamy jednak ponowne potwierdzenie obecności transgenu w partii. W takim przypadku wysterylizuj nasiona, myjąc 70% etanolem przez 2 min, 50% wybielaczem (około 2% podchlorynu) zawierającym 0,05% trytonu X-100 przez 5 minut. Następnie przemyj 5 - 6 razy sterylną wodą podwójnie destylowaną (ddH2O). Po sterylizacji rozwarstwić je w temperaturze 4 °C przez 3 dni i umieścić na pożywce do kiełkowania roślin zawierającej 25 μg/l higromycyny B w celu wyselekcjonowania roślin transgenicznych.</li>
		<li>Po tygodniu pozostaw tylko jedną roślinę na korek i kontynuuj uprawę roślin w tych samych warunkach wzrostu, które zastosowano w kroku 1.2.3. 
		Uwaga: Do zakażenia P. syringae wykorzystano czterotygodniowe rośliny. Podlewaj rośliny co drugi dzień, aby utrzymać rośliny w zdrowiu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie kultury Pseudomonas (~1 tydzień)
<ol>
	<li>Budowa plazmidu do transformacji Pseudomonas
	<ol>
		<li>Zapoznaj się z Tabelą materiałów i zamów żądany wektor(y) systemu dostarczania efektorów opartego na T3SS vector25.</li>
		<li>Wstaw interesujący nas gen efektorowy do wektora dostarczania efektora za pomocą klonowania rekombinacji specyficznej dla miejsca25. 
		Uwaga: Monitorując subkomórkową lokalizację białka efektorowego o pełnej długości, umieść gen o pełnej długości w pBK-GW-1-2 lub pBG-GW-1-2. Możliwe jest również wybranie pBK-GW-1-4 lub pBG-GW-1-4 zawierających 2x sfGFP11 w celu zwiększenia sygnału fluorescencji. W przypadku efektora częściowego pozbawionego peptydu sygnałowego należy zastosować pBK-GW-2-2 lub pBK-GW-2-4. Szczegółowe informacje na temat wektorów dostarczania efektorów można znaleźć w Park et al.25.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć plazmid przenoszący efektor połączony ze znacznikiem sfGFP11 w P. syringae pv. Pomidor (Pst) CUCPB5500 przy użyciu standardowej elektroporanacji29. 
	Uwaga: W razie potrzeby można użyć innych szczepów Pseudomonas. System znaczników sfGFP11 jest skonstruowany dla szerokiego zakresu wektorów30, a ekspresja genu efektora jest regulowana przez promotor AvrRpm1, który jest porównywalny np. z Pseudomonas fluorescens (EthAn)31.</li>
	<li>Delikatnie rozprowadzić przekształcone komórki bakteryjne na powierzchni płytek agarowych King's B zawierających 100 μg/ml ryfampicyny i 25 μg/ml kanamycyny lub 25 μg/ml gentamycyny. Inkubować w temperaturze 28 °C przez 2 dni.</li>
	<li>Zaszczepić jedną kolonię w płynnej pożywce King's B antybiotykami odpowiednimi dla użytego wektora i hodować komórki przez noc w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.</li>
	<li>Zrób bulion glicerolowy. Dodać autoklawizowany glicerol do końcowego stężenia 50% i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Przejściowa ekspresja sfGFP1-10OPT ukierunkowanego na organelle u N. benthamiana (4 dni)
<ol>
	<li>Przygotowanie kultury Agrobacterium
	<ol>
		<li>Zamów żądany wektor(y) plazmidu (sfGFP1-10)OPT ukierunkowanego na organelle (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Przekształć plazmid (plazmidy) w komórki szczepu Agrobacterium tumefaciens GV310132. Hodować komórki na podłożu agarowym Luria-Bertani (LB) uzupełnionym 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny w temperaturze 28 °C przez 2 dni.</li>
		<li>Z pojedynczej kolonii na pożywce agarowej LB zaszczepić komórki w 5 ml płynnej pożywki LB uzupełnionej 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny. Hodować komórki przez noc w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.</li>
		<li>Zebrać komórki przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 10 minut. Odleć pożywkę sklarowaną nad osadem i ponownie zawiesić osad w 1 ml świeżo przygotowanego buforu infiltracyjnego.</li>
		<li>Zmierzyć ilość Agrobacterium, uzyskując wartość gęstości optycznej (OD) przy absorbancji 600 nm (Abs 600 nm). Dostosuj OD600 bakterii do 0,5 za pomocą bufora infiltracyjnego. 
		Uwaga: 1 ml zawiesiny wystarcza do infiltracji w dwóch miejscach.</li>
		<li>Pozostaw kulturę w temperaturze pokojowej na delikatnym bujaku na 1 - 5 godzin przed infiltracją.</li>
		<li>Zrób otwór w środku liści, który ma być infiltrowany za pomocą końcówki o pojemności 10 μl. Użyj 1-mililitrowej strzykawki bezigłowej, aby naciekać zawiesiny Agrobacterium. Ostrożnie i powoli wstrzyknąć około 500 μl zawiesin przygotowanych w kroku 3.1.5 w stronę przyosiową liścia za pomocą strzykawki. Powtórz infiltrację na co najmniej trzech różnych roślinach w celu uzyskania kontrprób eksperymentalnych. 
		Uwaga: Ze względów zdrowotnych i bezpieczeństwa podczas infiltracji należy nosić okulary ochronne.</li>
		<li>Zetrzyj pozostałą zawiesinę bakteryjną na liściach i zaznacz granicę naciekanego obszaru.</li>
		<li>Utrzymuj naciekane rośliny w tych samych warunkach wzrostu, co w kroku 1.1.1 przez 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Inokulacja Pseudomonas (4 dni)
<ol>
	<li>Przekształcony szczep Pseudomonas z glicerolu należy przetworzyć w kroku 2.5 na pożywce agarowej King's B odpowiednimi antybiotykami w temperaturze 28 °C przez 2 dni. 
	Uwaga: Zdrowie Pseudomonas jest bardzo krytyczne. Jeśli kolonie nie tworzą się dobrze, przed kontynuowaniem ponownie przełóż komórki lub rozmnoż je w płynnym pożywce króla.</li>
	<li>Zaszczepić pętlę komórek Pseudomonas w płynnym podłożu z glutaminianu mannitolu (MG) w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez noc.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 10 minut. Odlewać pożywkę sklarowaną nad osadem, ponownie zawiesić osad w 10 mM MgCl2 i dostosować OD600 do 0,02 (1 x 107 jtk/ml) dla liści N. benthamiana i do 0,002 (1 x 106 jtk/ml) dla liści Arabidopsis.</li>
	<li>W przypadku N. benthamiana zawiesinę Pseudomonas należy naciekać w obszar liści, w którym 2 dni wcześniej infiltrowany był konstrukt Agrobacterium przenoszący sfGFP1-10OPT (jak w kroku 3.1.7). W przypadku transgenicznego rzodkiewnika sfGFP1-10OPT należy naciekać zawiesinę Pseudomonas do dwóch 4-tygodniowych, krótkich, jednodniowych liści. 
	Uwaga: Do przeprowadzenia prób eksperymentalnych potrzebne są co najmniej trzy rośliny.</li>
</ol>
5. Obserwacja sygnału sfGFP za pomocą mikroskopii konfokalnej (1 dzień)
<ol>
	<li>Wytnij krążek liściowy z liści zaszczepionych przez Pseudomonas. W określonych punktach czasowych po infiltracji Pseudomonas, zobrazuj dwa2-centymetrowe dyski liściowe o średnicy 2 cm z pojedynczej rośliny za pomocą konfokalnego systemu skanowania laserowego z obiektywem do zanurzenia w wodzie 40X/1,2 NA C-Apochromat lub obiektywem immersyjnym 63X/0,8 NA C-Apochromat olejowym. Aby uniknąć śmierci martwych komórek w wyniku zranienia, obserwuj komórki z dala od otworu infiltracyjnego.</li>
	<li>Rozpocznij obserwację przy niskim ustawieniu mocy lasera argonowego 488 nm. Zwiększ moc lasera, aby wykryć sfGFP. 
	Uwaga: Zwykle używamy 2 - 15% intensywności lasera do wykrywania sygnału fluorescencji. Jednak moc lasera i ustawienie wykrywania należy dostosować w oparciu o system mikroskopowy użytkownika. Tutaj filtry emisji zostały ustawione na 520 - 550 nm. Martwe komórki często emitują autofluorescencję pod wpływem wzbudzenia laserowego 488 nm. Dlatego, jako kontrola ujemna, ten sam efektor bez znacznika sfGFP11 powinien być infiltrowany i obserwowany w tych samych warunkach obserwacji. Ponadto wysokie wzbudzenie lasera może indukować autofluorescencję chlorofilu. Dlatego dostosuj intensywność lasera za pomocą kontrolnych komórek roślinnych, aby nie indukować autofluorescencji chlorofilu.
	<ol>
		<li>W celu barwienia przeciwstawnego ściany komórkowej należy naciekać 20 mM jodku propidyny (PI) do krążka liścia na 5 - 10 minut przed obserwacją.</li>
		<li>W celu zabarwienia jądra zanurz krążki liści w 0,1% paraformaldehydzie na 5 minut, a następnie przemyj wodą. Następnie naciekać 10 mM PI do krążka liścia po 5 - 10 minutach przed obserwacją mikroskopową. Powtórz eksperymenty co najmniej trzy razy. 
		Uwaga: Ten krok nie jest krytyczny, ale pomocny w określeniu lokalizacji efektora na błonie plazmatycznej lub jądrze. Jeśli interesujące efektory wykazały swoją lokalizację w określonej organelli, użyj markera dla danej organelli, aby potwierdzić lokalizację efektora.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+stomata+in+plant+innate+immunity+and+foliar+bacterial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases.</a> Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).</li>
<li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126 (5), 969-980 (2006).</li>
<li>Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-Pathogen+Effectors%3A+Cellular+Probes+Interfering+with+Plant+Defenses+in+Spatial+and+Temporal+Manners%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners.</a> Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).</li>
<li>Buttner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behind+the+lines-actions+of+bacterial+type+III+effector+proteins+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells.</a> FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).</li>
<li>Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Yersinia+type+III+secretion+system%3A+traffic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control.</a> Front Cell Infect Microbiol. 3, 4(2013).</li>
<li>Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+hrpC+and+hrpRS+operons+of+Pseudomonas+syringae+pathovars+syringae%2C+tomato%2C+and+glycinea+and+analysis+of+the+ability+of+hrpF%2C+hrpG%2C+hrcC%2C+hrpT%2C+and+hrpV+mutants+to+elicit+the+hypersensitive+response+and+disease+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants.</a> J Bacteriol. 180 (17), 4523-4531 (1998).</li>
<li>Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+targeting+of+plant+cellular+systems+by+injected+type+III+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (9), 1055-1063 (2009).</li>
<li>Alfano, J. R., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+secretion+system+effector+proteins%3A+double+agents+in+bacterial+disease+and+plant+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense.</a> Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).</li>
<li>Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Localization+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+Effector+Proteins+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants.</a> Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).</li>
<li>Kay, S., Bonas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Xanthomonas+type+III+effectors+manipulate+the+host+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant.</a> Curr Opin Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).</li>
<li>Bassham, D. C., Raikhel, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cells+are+not+just+green+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plant cells are not just green yeast.</a> Plant Physiol. 122 (4), 999-1001 (2000).</li>
<li>Courbot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+quantitative+trait+locus+for+cadmium+tolerance+in+Arabidopsis+halleri+colocalizes+with+HMA4%2C+a+gene+encoding+a+heavy+metal+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase.</a> Plant Physiol. 144 (2), 1052-1065 (2007).</li>
<li>Geisler, M., Murphy, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+of+auxin+transport%3A+the+role+of+p-glycoproteins+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development.</a> FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).</li>
<li>Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+SifA+effector+protein+requires+its+membrane-anchoring+C-terminal+hexapeptide+for+its+biological+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function.</a> J Biol Chem. 278 (16), 14196-14202 (2003).</li>
<li>Reinicke, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Salmonella+typhimurium+effector+protein+SifA+is+modified+by+host+cell+prenylation+and+S-acylation+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery.</a> J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).</li>
<li>Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversification+of+a+Salmonella+virulence+protein+function+by+ubiquitin-dependent+differential+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization.</a> Cell. 137 (2), 283-294 (2009).</li>
<li>Fernandez-Alvarez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+O-mannosylated+virulence+factors+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002563(2012).</li>
<li>Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+themes+in+the+design+and+function+of+bacterial+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Common themes in the design and function of bacterial effectors.</a> Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).</li>
<li>Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, Á <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/242102870_Suspension_protoplasts_as_useful_experimental_tool_to_study_localization_of_GFP-tagged_proteins_in_Arabidopsis_thaliana">Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana.</a> Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52 (1), 59(2008).</li>
<li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).</li>
<li>Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tagging+and+detection+with+engineered+self-assembling+fragments+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).</li>
<li>Cabantous, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protein-protein+interaction+sensor+based+on+tripartite+split-GFP+association%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association.</a> Sci Rep. 3, 2854(2013).</li>
<li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nat Commun. 7, 11046(2016).</li>
<li>Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+type-III+secretion+reveals+dynamics+and+spatial+segregation+of+Salmonella+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors.</a> Nat Methods. 7 (4), 325-330 (2010).</li>
<li>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Monitoring+of+Pseudomonas+syringae+Effectors+via+Type+III+Secretion+Using+Split+Fluorescent+Protein+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments.</a> Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017).</li>
<li>Addgene. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org">https://www.addgene.org</a> (2018).</li>
<li>Arabidopsis Biological Resource Center. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://abrc.osu.edu">https://abrc.osu.edu</a> (2018).</li>
<li>Kvitko, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletions+in+the+repertoire+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+type+III+secretion+effector+genes+reveal+functional+overlap+among+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000388(2009).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Kovach, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+new+derivatives+of+the+broad-host-range+cloning+vector+pBBR1MCS%2C+carrying+different+antibiotic-resistance+cassettes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.</a> Gene. 166 (1), 175-176 (1995).</li>
<li>Upadhyaya, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterial+type+III+secretion+assay+for+delivery+of+fungal+effector+proteins+into+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat.</a> Mol Plant Microbe Interact. 27 (3), 255-264 (2014).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+agrobacterium+using+the+freeze-thaw+method%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method.</a> CSH Protoc. 2006 (7), (2006).</li>
<li>Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana+RPM1+disease+resistance+gene+product+is+a+peripheral+plasma+membrane+protein+that+is+degraded+coincident+with+the+hypersensitive+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).</li>
<li>Nimchuk, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+fatty+acylation+drives+plasma+membrane+targeting+and+enhances+function+of+several+type+III+effector+proteins+from+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae.</a> Cell. 101 (4), 353-363 (2000).</li>
<li>Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+intracellular+innate+immune+receptor+Resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+maculicola+1+%28RPM1%29+is+activated+at%2C+and+functions+on%2C+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).</li>
<li>Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+strategy+for+high-throughput+GFP+tagging+of+endogenous+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).</li>
<li>Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+Agrobacterium-delivered+VirE2+in+recipient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells.</a> Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+approaches+to+investigate+effector+translocation+into+host+cells+in+the+Ustilago+maydis%2Fmaize+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Opisany tutaj protokół służy do monitorowania dokładnej lokalizacji białek efektorowych wstrzykiwanych przez bakteryjną T3SS do komórki rośliny gospodarza po zakażeniu. Wcześniej podzielony system GFP był używany jako narzędzie do badania subkomórkowej lokalizacji białekssaków 23,36, lokalizacji Salmonella T3E i dostarczania Agrobacterium VirE2 przez T4SS do komórek roślinnych37. Aby zastosować ten system w komórkach rośl...

Rośliny to osiadłe organizmy, które napotykają liczne atakujące patogeny, w tym bakterie, grzyby, wirusy, owady i nicienie przez cały swój cykl życia. Wśród fitopatogenów bakterie Gram-ujemne, takie jak Pseudomonas spp. i Ralstonia spp., infekują swoje rośliny żywicielskie, wnikając przez rany lub naturalne otwory, takie jak aparaty szparkowe i hydathode1. Aby skutecznie skolonizować rośliny żywicielskie, patogeny bakteryjne ewoluowały, rozwijając różne czynniki wirulencji2. Kiedy bakterie atakują roślinę żywicielską, wstrzykują szereg białek wirulencji - znanych jako efektory - bezpośrednio do komórek roślinnych, aby promować ich patogenność. Efektory te tłumią lub modulują wrodzoną odporność roślin i manipulują procesami komórkowymi gospodarza, aby doprowadzić do przeżycia bakterii3.
Bakterie chorobotwórcze głównie używają T3SS do dostarczania białek efektorowych bezpośrednio do komórek gospodarza4. T3SS przypomina strzykawkę molekularną z kanałem przypominającym igłę, łączącym strukturę białka rusztowania przez wewnętrzną i zewnętrzną błonę bakteryjną z miejscem wstrzyknięcia komórki gospodarza5. Ten mechanizm wydzielania efektora za pośrednictwem T3SS (T3E) jest dobrze zachowany w różnych patogenach bakteryjnych Gram-ujemnych roślin, a także ludzi. Jeden z reprezentatywnych patogenów roślin, P. syringae pv. pomidor Mutant DC3000 hrcC, który zazwyczaj ma wadliwy T3SS, ma ograniczony wzrost roślin, prawdopodobnie z powodu niezdolności tego mutanta do całkowitego stłumienia odporności roślin (poprzez wstrzyknięcie białek efektorowych)6. Po translokacji do komórek gospodarza, efektory celują w różne białka gospodarza, które są ważne dla układu komórkowego gospodarza, w tym odpowiedzi obronne roślin, transkrypcję genów, śmierć komórki, proteasom, transport pęcherzyków i szlaki hormonalne7,8,9,10. Dlatego śledzenie lokalizacji komórkowej białek efektorowych w komórkach gospodarza jest atrakcyjnym celem dla zrozumienia ich funkcji w odniesieniu do modulacji odporności roślin.
Większość badań lokalizacyjnych T3E wykorzystywała nadekspresję za pośrednictwem Agrobacterium z dużym białkiem fluorescencyjnym w roślinie gospodarza9. Wykazano jednak, że metoda ekspresji heterologicznej dla genów, które są wprowadzane u innych gatunków, jest błędnie zlokalizowana lub czasami niefunkcjonalna11,12,13. Ponadto kilka badań wykazało, że efektory bakteryjne ulegają modyfikacji w celu prawidłowego celowania w komórkach gospodarza14,15,16,17. W związku z tym efektory o przejściowej ekspresji w cytozolu komórek roślinnych mogą nie być funkcjonalnie lub ilościowo identyczne z efektorami, które są dostarczane przez T3SS po zakażeniu patogenem18. Co więcej, fuzja dużych znaczników fluorescencyjnych z białkami efektorowymi może zakłócić prawidłowe dostarczanie i wizualizację efektora18,19. Dlatego te podejścia do oznaczania funkcji T3E mogą nie odzwierciedlać w pełni natywnej lokalizacji efektorów wydzielanych przez T3SS.
Zielone białko fluorescencyjne (GFP) składa się z 11-niciowego β-lufy otaczającej centralną nić, która zawiera chromofor20. Waldo i wsp. opisano nowy system podzielonej dobrej dobrej praktyki laboratoryjnej, który składa się z małego komponentu (GFP β komponent 11); GFP11) i duży fragment komplementarny (GFP β nici 1-10; GFP1-10)21. Fragmenty nie fluoryzują same z siebie, ale fluoryzują po ich skojarzeniu, gdy oba fragmenty znajdują się w bliskiej odległości od siebie. W celu optymalizacji wydajności fałdowania białek, następnie opracowano solidne warianty fałdowania GFP, tj. sfGFP i sfGFPOPT, dla podzielonego systemu GFP20,21,22. Ostatnio wygenerowano warianty sfGFP1-10OPT z mutacją pojedynczych aminokwasów - sfYFP1-10OPT i sfCFP1-10OPT - które mogą odtworzyć się fragmentem sfGFP11 i wykazują odpowiednio żółtą i cyjanową fluorescencję23. Co więcej, sfCherry, pochodna mCherry, może być podzielona na fragmenty sfCherry1-10 i sfCherry11 w taki sam sposób jak sfGFP23.
Ten system został dostosowany do oznaczania i śledzenia efektorów T3SS w komórkach HeLa podczas infekcji za pomocą efektorów z Salmonella24. Jednak wcześniej nie był zoptymalizowany pod kątem systemu patogenów roślina-bakteria żywicielska. Niedawno zoptymalizowaliśmy podzielony system GFP oparty na ulepszonym sfGFP1-10OPT, aby monitorować subkomórkową lokalizację T3E dostarczanych przez P. syringae do komórek roślinnych25. Aby ułatwić badania lokalizacji T3E w różnych subkomórkowych przedziałach w komórkach roślinnych, wygenerowano zestaw transgenicznych roślin Arabidopsis thaliana do ekspresji sfGFP1-10OPT w różnych przedziałach subkomórkowych25. Co więcej, wygenerowano również plazmidy przenoszące różne organelleukierunkowane na sfGFP1-10 OPT dla przejściowej nadekspresji za pośrednictwem Agrobacterium oraz wektory znakowane sfGFP11 dla dostarczania efektorowego opartego na T3SS. Nasiona różnych transgenicznych linii Arabidopsis i plazmidy do ekspresji interesujących nas T3E można uzyskać ze źródeł wymienionych w Tabeli Materiałów26,27.
W poniższym protokole opisujemy zoptymalizowany system do monitorowania dynamiki efektorów dostarczanych przez bakterie w komórkach gospodarza za pomocą podzielonego systemu sfGFP. Zakażenie roślin wykazujących ekspresję sfGFP1-10OPT transgenicznymi Pseudomonas przenoszącymi rekombinowany plazmid sfGFP11 powoduje dostarczenie efektora znakowanego sfGFP11 z Pseudomonas do komórki gospodarza. W związku z tym białka te są odtwarzane i przemieszczają się do określonego przedziału docelowego efektora. Pseudomonas syringae pv. pomidor CUCPB5500 szczep, w którym usunięto 18 efektorów, został użyty, ponieważ szczep ten wykazywał niską lub żadną śmierć komórek zarówno u A. thaliana, jak i N. benthamianas28. Jednak wszystkie opisane tutaj materiały i kroki mogą być zastąpione lub zmodyfikowane w celu dostosowania podzielonego systemu sfGFP do badania innych zagadnień biologicznych lub optymalizacji w danych warunkach laboratoryjnych.

<table><tbody><tr><td><silne>Linie transgeniczne Arabidopsis</td><td></td><td></td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitorowanie czasoprzestrzenne efektorów Pseudomonas syringae poprzez wydzielanie typu III przy użyciu podzielonych fluorescencyjnych fragmentów białka. Komórka roślinna. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td></tr><tr><td>CYTO-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69831</td><td></td></tr><tr><td>NU-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69832</td><td></td></tr><tr><td>PT-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69833</td><td></td></tr><tr><td>MT-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69834</td><td></td></tr><tr><td>PX-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69835</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69836</td><td></td></tr><tr><td>GO-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69837</td><td></td></tr><tr><td>PM-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69838</td><td></td></tr><tr><td><silny>Organelle-ukierunkowany plazmid sfGFP1-10OPT</td><td></td><td></td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitorowanie czasoprzestrzenne efektorów Pseudomonas syringae poprzez wydzielanie typu III przy użyciu podzielonych fluorescencyjnych fragmentów białka. Komórka roślinna. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td></tr><tr><td>CYTO-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97387</td><td></td></tr><tr><td>NU-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97388</td><td></td></tr><tr><td>PT-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97389</td><td></td></tr><tr><td>MT-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97390</td><td></td></tr><tr><td>PX-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97391</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97392</td><td></td></tr><tr><td>GO-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97393</td><td></td></tr><tr><td>PM-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97394</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfCherry1-10</td><td>Addgene</td><td>97403</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfYFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97404</td><td></td></tr><tr><td>CYTO-sfCFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97405</td><td></td></tr><tr><td>sfGFP11-tagged Wektor kompatybilny z bramką dla systemu dostarczania efektorów opartego na T3SS</td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitorowanie czasoprzestrzenne efektorów Pseudomonas syringae poprzez wydzielanie typu III przy użyciu podzielonych fluorescencyjnych fragmentów białka. Komórka roślinna. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pBK-GW-1-2</td><td>Addgene</td><td>98250</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Kanamycynę (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-1-4</td><td>Addgene</td><td>98251</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Kanamycynę (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-2-2</td><td>Addgene</td><td>98252</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Kanamycynę (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-2-4</td><td>Addgene</td><td>98253</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Kanamycynę (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-1-2</td><td>Addgene</td><td>98254</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Gentamycynę (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-1-4</td><td>Addgene</td><td>98255</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Gentamycynę (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-2-2</td><td>Addgene</td><td>98256</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Gentamycynę (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-2-4</td><td>Addgene</td><td>98257</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Gentamycynę (25 ug / ml)</td></tr> <tr><td>< silny> szczepy bakteryjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens GV3101</td><td></td><td></td><td>Csaba Koncz i Jeff Schell, Promotor genu TL-DNA 5 kontroluje specyficzną tkankowo ekspresję genów chimerycznych przenoszonych przez nowy typ wektora binarnego Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Odporny na gentamycynę (50 ug/ml) i ryfampicynę (50 ug/ml)</td></tr><tr><td>Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500</td><td></td><td></td><td>Kvitko, B. H. i wsp. Delecje w repertuarze genów efektorowych wydzielania Pseudomonas syringae pv. DC3000 typu III pomidora ujawniają funkcjonalne nakładanie się efektorów. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Odporny na ryfampicynę (100 ug/ml)</td></tr><tr><td>składniki pożywki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do kiełkowania roślin</td><td></td><td></td><td>Dodać 2,165 g/L Murashige i Proszek Skoog, 10 g/l sacharozy do wody. Dostosuj do pH 5,8 i dodaj 2,2 g/l fitagelu. Automatyczne cielenie.</td></tr><tr><td>Murashige & Pożywka Skoog z witaminami</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>LB podłoże</td><td></td><td></td>Dodaj <td>do wody 10 g/L tryptonu, 5 g/L ekstraktu drożdżowego, 10 g/L NaCl. W przypadku pożywek stałych dodać 15 g/l mikro agaru. Autoklaw.&nbsp; Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury 55 stopni Celsjusza; C i w razie potrzeby dodaj antybiotyk.</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>BD Bioscience</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>BD Bioscience</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0520</td><td></td></tr><tr><td>Mikro agar</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>King's B media</td><td></td><td></td><td>10 g/L proteazy pepton #2, 1,5 g/L bezwodny K2HPO4, 15 g/L agaru do wody. Autoklaw. Schłodzić do 55 stopni C i dodać do podłoża sterylne 15 ml/l glicerolu, 5 ml/l MgSO4. W razie potrzeby dodaj antybiotyki.</td></tr><tr><td>Pepton proteozy</td><td>BD Bioscience</td><td>212120</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551128 USP</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G1345</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Bioscience</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol-glutaminian (MG) płynne podłoże </td><td></td><td></td><td>Dodaj do wody 10 g/l mannitolu, 2 g/l kwasu L-glutaminowego, 0,5 g/l KH2PO4, 0,2 g/L NaCl i 0,2 g/L MgSO4. Dostosuj do pH 7</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0803</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0707</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> infiltracyjny <td>10 mM MES (kwas 2-(N-morfolino)-etanosulfonowy), 10 mM MgCl2, 150 &mikro; M acetosyringon. pH 5,6; Przed użyciem przygotuj świeży bufor.</td></tr><tr><td>MES</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503</td><td>Przygotować 100 mM (pH 5,6) w wodzie. Filtruj sterylizację.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Przygotować 100 mM zapasu w wodzie. Autoklaw.</td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td>Przygotuj 150 mM zapasu w DMSO.</td></tr><tr>Sprzęt/materiały <td></td><td></td><td></td>do <td>mikroskopu konfokalnego</td></tr><tr><td>710 laserowy skaningowy system konfokalny</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio observer Z1 mikroskop odwrócony</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidium jodek</td><td>ThermoFisher</td><td>P1304MP</td><td></td></tr></tbody></table>

split green fluorescent protein system do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bakterie, jeden z najważniejszych czynników wywołujących różne choroby roślin, wydzielają zestaw białek efektorowych do komórki rośliny gospodarza, aby osłabić układ odpornościowy rośliny. Podczas infekcji efektory cytoplazmatyczne są dostarczane do cytozolu gospodarza za pośrednictwem systemu wydzielania typu III (T3SS). Po dostarczeniu do komórki roślinnej efektor (efektory) celuje w określony przedział (przedziały), aby modulować procesy komórek gospodarza w celu przetrwania i replikacji patogenu. Chociaż przeprowadzono pewne badania nad subkomórkową lokalizacją białek efektorowych w komórkach gospodarza, aby zrozumieć ich funkcję w patogenności przy użyciu białek fluorescencyjnych, badanie dynamiki efektorów wstrzykiwanych bezpośrednio z bakterii było trudne ze względu na niekompatybilność między T3SS a białkami fluorescencyjnymi.
Tutaj opisujemy naszą najnowszą metodę zoptymalizowanego systemu zielonego białka fluorescencyjnego (sfGFPOPT) do wizualizacji lokalizacji efektorów dostarczanych przez bakteryjny T3SS w komórce gospodarza. Efektor znakowany sfGFP11 (11. nićβ sfGFP) wydzielany przez T3SS może być połączony ze specyficznymi organellami ukierunkowanymi na sfGFP1-10OPT (1-10th β-nić sfGFP), co prowadzi do emisji fluorescencji w tym miejscu. Protokół ten zapewnia procedurę wizualizacji odtworzonego sygnału fluorescencji sfGFP za pomocą białka efektorowego z Pseudomonas syringae w określonych organellach w roślinach Arabidopsis i Nicotiana benthamiana.

Struktura beczki β białka GFP składa się z jedenastu nici β i może zostać podzielona na dwa fragmenty: 1–10th fragment (GFP1-10OPT) oraz 11th nici (GFP11). Chociaż żaden z dwóch fragmentów nie wykazuje samodzielnie fluorescencji, samomontująca się sfGFP może emitować fluorescencję, gdy oba fragmenty znajdują się w bliskim sąsiedztwie (Rycina 1A). W tym systemie sfGFP1-10OPTwyrażający Arabidopsis lub N. ...

Oparte na białkach fluorescencyjnych podejścia do monitorowania efektorów wydzielanych przez bakterie do komórek gospodarza są wyzwaniem. Wynika to z niezgodności między białkami fluorescencyjnymi a układem wydzielania typu III. W tym przypadku zoptymalizowany system GFP z dzielonym superfolderem służy do wizualizacji efektorów wydzielanych przez bakterie do komórki rośliny gospodarza.

Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji roślina-mikroorganizm, takie jak to, w jaki sposób bakterie chorobotwórcze mogą zakłócać optymalny stan komórek roślinnych gospodarza za pomocą białek zwanych efektorami wydzielanych do komórek roślinnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że bakteryjne białko efektorowe ulega ekspresji w komórce bakteryjnej za pomocą ich natywnego systemu ekspresji, a następnie jest dostarczane do komórki roślinnej przez bakteryjny system wydzielania typu III. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj rośliny Nicotiana benthamiana i Arabidopsis thaliana zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie użyj standardowej elektroporacji, aby przekształcić gen przenoszący plazmid i efektorowy połączony ze znacznikiem sfGFP11 w szczep CUCPB5500 pomidorów Pseudomonas syringae pathovar. Optymalny punkt czasowy i poziom ekspresji, czyli rekonstytucja sfGFP, naprawdę zależy od białka efektorowego. Zalecamy optymalizację warunków inokulacji lub obserwacji.Delikatnie rozprowadź przekształcone komórki bakteryjne na powierzchni płytek King's B Agar. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez dwa dni. Następnie zaszczepij jedną kolonię bakteryjną w płynnym pożywce King's B antybiotykiem odpowiednim dla wektora.Inkubować przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Następnego dnia dodaj autoklawowany glicerol do zaszczepionej pożywki do końcowego stężenia 50%Przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć, przekształć plazmid w komórki szczepu Agrobacterium tumefaciens GV3101, jak opisano w protokole tekstowym.Hoduj komórki na uzupełnionym podłożu agarowym LB w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez dwa dni. Używając pojedynczej kolonii z pożywki agarowej LB, zaszczepij 5 mililitrów uzupełnionej płynnej pożywki LB. Następnie hoduj komórki przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza, potrząsając przy 200 obr./min.Następnie odwirować przy 3000 G przez 10 minut, aby zebrać komórki. Odlej supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze świeżo przygotowanego buforu infiltracyjnego. Za pomocą spektrofotometru określ ilość komórek Agrobacterium, mierząc wartość gęstości optycznej przy absorbancji 600 nanometrów.Następnie użyj bufora infiltracyjnego, aby dostosować OD 600 komórek bakteryjnych do 0,5. Pozostaw kulturę na delikatnym bujaku w temperaturze pokojowej na jedną do pięciu godzin. Aby nacieknąć liście, użyj końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby zrobić otwór w środku każdego liścia.Za pomocą bezigłowej strzykawki o pojemności 1 mililitra ostrożnie wstrzyknąć 500 mikrolitrów zawiesiny Agrobacterium w przyosiową stronę liścia. Zetrzyj pozostałą zawiesinę bakteryjną z liści i zaznacz granicę naciekanego obszaru. Utrzymuj naciekane rośliny w komorze wzrostowej w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności 60% przez dwa dni.Przekształcony szczep Pseudomonas należy przelać z glicerolu na podłoże King's B Agar z odpowiednim antybiotykiem. Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez dwa dni. Zaszczepić pętlę komórek Pseudomonas w płynnym podłożu glutaminianu mannitolu.Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza, wstrząsając przy 200 obr./min. Następnie odwirować przy 3000 G przez 10 minut, aby zebrać komórki. Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10-milimolowym roztworze chlorku magnezu.Następnie dostosuj gęstość optyczną do 0,02 dla liści Nicotiana benthamiana i do 0,002 dla liści Arabidopsis. W przypadku liści Nicotiana benthamiana należy naciekać zawiesinę Pseudomonas w tym samym obszarze, w którym Agrobacterium zostało naciekane dwa dni wcześniej. W przypadku transgenicznego rzodkiewnika należy naciekać zawiesinę Pseudomonas do dwóch czterotygodniowych, krótkich, jednodniowych liści.Na koniec wytnij dysk liściowy na liście zaszczepione przez Pseudomonas. W określonych punktach czasowych po infiltracji Pseudomonas, użyj konfokalnego systemu skanowania laserowego, aby zobrazować dwa, dwa centymetry kwadratowe dyski liściowe z jednej rośliny. Obserwuj komórki z dala od otworu infiltracyjnego, aby uniknąć martwych komórek zabitych przez zranienie.Translokowane efektory z bakterii są obecne tylko w bardzo małych ilościach. Dlatego możesz zwiększyć moc lasera i uzyskać emisję fluorescencji, aby wykryć sygnał fluorescencyjny. Nie należy jednak przesadnie przejmować siły, aby uniknąć przechwycenia fałszywego sygnału z autofluorescencji z komórek roślinnych.W tym badaniu zastosowano podejście oparte na białkach fluorescencyjnych do monitorowania efektorów wydzielanych przez bakterie do komórek gospodarza. Konfokalny skan laserowy liścia Nicotiana benthamiana trzy godziny po zakażeniu jest pokazany tutaj. Komórki wyrażające zoptymalizowany sfGFP tylko z AvrB nie wykazują żadnego sygnału fluorescencyjnego.Jednak sygnały GFP są widoczne z zainfekowanych komórek zawierających AvrB, sfGFP11. Potwierdza to, że kompleks AvrB sfGFP11 jest odtwarzany ze zoptymalizowanym sfGFP w cytozolu, a następnie przemieszcza się do błony plazmatycznej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o utrzymaniu zdrowych materiałów roślinnych i przygotowaniu świeżej kultury bakterii dla aktywnych komórek.Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak analiza krwi żywicznej, aby zrozumieć modyfikację fałszywej translacji białek efektorowych bakterii w komórkach roślinnych podczas odpowiedzi immunologicznej roślin. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować dostarczanie efektora typu III w zainfekowanych komórkach roślinnych. Materiały roślinne i kultury bakterii należy utylizować zgodnie z kryteriami laboratorium dotyczącymi odpadów niebezpiecznych biologicznie i nie zapominać o noszeniu środków ochrony osobistej.

split-green-fluorescent-protein-system-to-visualize-effectors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Lee, H. i wsp., Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia metodę monitorowania infekcji bakteryjnej i dostarczania białek efektorowych w komórkach roślinnych za pomocą komplementacji dzielonego białka fluorescencyjnego (sfGFP) w połączeniu z mikroskopią konfokalną. Podejście to umożliwia precyzyjną wizualizację translokacji efektorowej do cytozolu komórki gospodarza.

Monitorowanie infekcji bakteryjnej i dostarczania białek efektorowych w komórkach roślinnych

Ten artykuł opisuje metody syntezy i fluorescencyjnego znakowania nanocząstek (NP). Nanocząsteczki zastosowano w eksperymentach z pogonią za impulsami w celu oznaczenia układu endolizosomalnego komórek eukariotycznych. Manipulację układu endo-lizosomalnego przez aktywność wewnątrzkomórkowego patogenu Salmonella enterica przeprowadzono następnie za pomocą obrazowania żywych komórek i określono ilościowo.

Zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe

Elektroporacja została użyta do wprowadzenia oczyszczonych bakteryjnych białek efektorowych wirulencji bezpośrednio do żywych komórek eukariotycznych. Lokalizację białek monitorowano za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Metoda ta pozwala na badania nad transportem, funkcją i interakcjami białko-białko przy użyciu aktywnych białek egzogennych, unikając potrzeby heterologicznej ekspresji w komórkach eukariotycznych.

Elektroporacja funkcjonalnych efektorów bakteryjnych w komórkach ssaków

Translokacja efektorowa do komórek gospodarza poprzez system wydzielania typu III jest powszechną strategią wirulencji wśród bakterii Gram-ujemnych. Zastosowano test oparty na fuzji efektorowej beta-laktamazy do ilościowej analizy translokacji. W komórkach zakażonych Yersinia konwersja reportera FRET przez beta-laktamazę jest monitorowana za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej.

Analiza translokacji efektorowej Yersinia enterocolitica do komórek gospodarza za pomocą fuzji efektorów beta-laktamazy

Badanie interakcji między patogenami bakteryjnymi a ich gospodarzami jest ważnym obszarem badań biologicznych. W tym miejscu opisujemy niezbędne techniki pomiaru translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania genu siRNA przy użyciu substratu BlaM.

Zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do zbadania wydajności translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania siRNA

Tutaj prezentujemy protokół oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej myszy przy użyciu wzmocnionej zielonej fluorescencji wyrażającej białko Escherichia coli.

Wykorzystanie Escherichia coli z ekspresją białka zielonej fluorescencji do oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej myszy

Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

Ten artykuł zawiera prosty i przejrzysty protokół oznaczania efektorów wydzielanych przez Salmonellę za pomocą rozszerzenia kodu genetycznego (GCE) specyficznie dla miejsca i obrazowania subkomórkowej lokalizacji wydzielanych białek w komórkach HeLa za pomocą bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (dSTORM)...

Obrazowanie w superrozdzielczości białek wydzielanych przez bakterie za pomocą ekspansji kodu genetycznego

Tutaj opisujemy procedurę, która umożliwia wykrywanie bakterii chorobotwórczych w całym narządzie podczas infekcji i ilościowe określanie aktywności fluorescencyjnego reportera.

Trójwymiarowa tomografia całego narządu o wysokiej rozdzielczości zakażeń bakteryjnych

Poznaj metodę wizualizacji efektorów bakteryjnych w komórkach roślinnych przy użyciu systemu split superfolder GFP. Technika ta umożliwia badanie interakcji roślina-patogen z wykorzystaniem Nicotiana benthamiana i Arabidopsis thaliana.

Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji

Przeglądaj więcej filmów