Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji roślina-mikroorganizm, takie jak to, w jaki sposób bakterie chorobotwórcze mogą zakłócać optymalny stan komórek roślinnych gospodarza za pomocą białek zwanych efektorami wydzielanych do komórek roślinnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że bakteryjne białko efektorowe ulega ekspresji w komórce bakteryjnej za pomocą ich natywnego systemu ekspresji, a następnie jest dostarczane do komórki roślinnej przez bakteryjny system wydzielania typu III. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj rośliny Nicotiana benthamiana i Arabidopsis thaliana zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie użyj standardowej elektroporacji, aby przekształcić gen przenoszący plazmid i efektorowy połączony ze znacznikiem sfGFP11 w szczep CUCPB5500 pomidorów Pseudomonas syringae pathovar. Optymalny punkt czasowy i poziom ekspresji, czyli rekonstytucja sfGFP, naprawdę zależy od białka efektorowego. Zalecamy optymalizację warunków inokulacji lub obserwacji.

Delikatnie rozprowadź przekształcone komórki bakteryjne na powierzchni płytek King's B Agar. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez dwa dni. Następnie zaszczepij jedną kolonię bakteryjną w płynnym pożywce King's B antybiotykiem odpowiednim dla wektora.

Inkubować przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Następnego dnia dodaj autoklawowany glicerol do zaszczepionej pożywki do końcowego stężenia 50%Przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć, przekształć plazmid w komórki szczepu Agrobacterium tumefaciens GV3101, jak opisano w protokole tekstowym.

Hoduj komórki na uzupełnionym podłożu agarowym LB w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez dwa dni. Używając pojedynczej kolonii z pożywki agarowej LB, zaszczepij 5 mililitrów uzupełnionej płynnej pożywki LB. Następnie hoduj komórki przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza, potrząsając przy 200 obr./min.

Następnie odwirować przy 3000 G przez 10 minut, aby zebrać komórki. Odlej supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze świeżo przygotowanego buforu infiltracyjnego. Za pomocą spektrofotometru określ ilość komórek Agrobacterium, mierząc wartość gęstości optycznej przy absorbancji 600 nanometrów.

Następnie użyj bufora infiltracyjnego, aby dostosować OD 600 komórek bakteryjnych do 0,5. Pozostaw kulturę na delikatnym bujaku w temperaturze pokojowej na jedną do pięciu godzin. Aby nacieknąć liście, użyj końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby zrobić otwór w środku każdego liścia.

Za pomocą bezigłowej strzykawki o pojemności 1 mililitra ostrożnie wstrzyknąć 500 mikrolitrów zawiesiny Agrobacterium w przyosiową stronę liścia. Zetrzyj pozostałą zawiesinę bakteryjną z liści i zaznacz granicę naciekanego obszaru. Utrzymuj naciekane rośliny w komorze wzrostowej w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności 60% przez dwa dni.

Przekształcony szczep Pseudomonas należy przelać z glicerolu na podłoże King's B Agar z odpowiednim antybiotykiem. Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez dwa dni. Zaszczepić pętlę komórek Pseudomonas w płynnym podłożu glutaminianu mannitolu.

Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza, wstrząsając przy 200 obr./min. Następnie odwirować przy 3000 G przez 10 minut, aby zebrać komórki. Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10-milimolowym roztworze chlorku magnezu.

Następnie dostosuj gęstość optyczną do 0,02 dla liści Nicotiana benthamiana i do 0,002 dla liści Arabidopsis. W przypadku liści Nicotiana benthamiana należy naciekać zawiesinę Pseudomonas w tym samym obszarze, w którym Agrobacterium zostało naciekane dwa dni wcześniej. W przypadku transgenicznego rzodkiewnika należy naciekać zawiesinę Pseudomonas do dwóch czterotygodniowych, krótkich, jednodniowych liści.

Na koniec wytnij dysk liściowy na liście zaszczepione przez Pseudomonas. W określonych punktach czasowych po infiltracji Pseudomonas, użyj konfokalnego systemu skanowania laserowego, aby zobrazować dwa, dwa centymetry kwadratowe dyski liściowe z jednej rośliny. Obserwuj komórki z dala od otworu infiltracyjnego, aby uniknąć martwych komórek zabitych przez zranienie.

Translokowane efektory z bakterii są obecne tylko w bardzo małych ilościach. Dlatego możesz zwiększyć moc lasera i uzyskać emisję fluorescencji, aby wykryć sygnał fluorescencyjny. Nie należy jednak przesadnie przejmować siły, aby uniknąć przechwycenia fałszywego sygnału z autofluorescencji z komórek roślinnych.

W tym badaniu zastosowano podejście oparte na białkach fluorescencyjnych do monitorowania efektorów wydzielanych przez bakterie do komórek gospodarza. Konfokalny skan laserowy liścia Nicotiana benthamiana trzy godziny po zakażeniu jest pokazany tutaj. Komórki wyrażające zoptymalizowany sfGFP tylko z AvrB nie wykazują żadnego sygnału fluorescencyjnego.

Jednak sygnały GFP są widoczne z zainfekowanych komórek zawierających AvrB, sfGFP11. Potwierdza to, że kompleks AvrB sfGFP11 jest odtwarzany ze zoptymalizowanym sfGFP w cytozolu, a następnie przemieszcza się do błony plazmatycznej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o utrzymaniu zdrowych materiałów roślinnych i przygotowaniu świeżej kultury bakterii dla aktywnych komórek.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak analiza krwi żywicznej, aby zrozumieć modyfikację fałszywej translacji białek efektorowych bakterii w komórkach roślinnych podczas odpowiedzi immunologicznej roślin. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować dostarczanie efektora typu III w zainfekowanych komórkach roślinnych. Materiały roślinne i kultury bakterii należy utylizować zgodnie z kryteriami laboratorium dotyczącymi odpadów niebezpiecznych biologicznie i nie zapominać o noszeniu środków ochrony osobistej.