Przekrój optyczny i wizualizacja krążka międzykręgowego od rozwoju embrionalnego do zwyrodnienia
July 8th, 2021
Prezentujemy metodę badania przestrzennej organizacji chondrocytów w pierścieniu włóknistym krążka międzykręgowego za pomocą metody optycznego przekroju.
Zwyrodnienie krążka międzykręgowego prowadzi do wysokiego stopnia upośledzenia i bólu. Nasz protokół pozwala nam badać morfologicznie rozwój dysku i jego zmiany w zwyrodnieniu. Gęsta sieć kolagenu typu pierwszego sprawia, że analiza krążka międzykręgowego za pomocą mikroskopii jest zwykle trudna.
Dzięki sekcji optycznej możemy zbadać trójwymiarowe ułożenie chondrocytów w różnych tkankach. Rozpocznij od umieszczenia śródoperacyjnie uzyskanych próbek krążka międzykręgowego lub IVD w DMEM uzupełnionych 2% objętościowo penicyliny-streptomycyny i 1,2% objętościowo amfoterycyny B, natychmiast po pobraniu przechowywać próbki IVD w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszego przetwarzania. W przypadku zamrożenia ludzkie próbki do diagnostyki in vitro należy rozmrozić w temperaturze pokojowej i określić pochodzenie ludzkiej tkanki do diagnostyki in vitro na podstawie właściwości mikroskopowych, takich jak; zagęszczenie i orientacja uczelni.
Aby pobrać tkankę dysku bydlęcego, weź segment ruchu składający się z IVD z dwoma sąsiednimi kręgami i za pomocą ostrza chirurgicznego nr 15 wypreparuj cały krążek bydlęcy z kości podchrzęstnej, odwróć dysk, aby dotrzeć do wyśrodkowanych obszarów. Po zidentyfikowaniu różnych obszarów chrząstki użyj ostrza chirurgicznego nr 20 lub 22, aby wyciąć obszar zainteresowania z całego dysku. Diagnostyka in vitro z zarodków bydlęcych o długości korony i zadu mniejszej niż 20 centymetrów powinna być przetwarzana bez preparacji.
Przeprowadzono odwapnienie tkanki zgodnie z opisem w manuskrypcie. Potwierdź pomyślne odwapnienie, jeśli igła o rozmiarze 20 wniknie w tkankę dysku lub, jeśli to możliwe, w kręgi bez zauważalnego oporu. Pobrać próbki tkanek w dziesięciokrotnej objętości 4% roztworu formaldehydu w PBS przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnego dnia umieść tkankę w rozpuszczalnym w wodzie podłożu do zatapiania na gałce kriotomowej, tak aby powstała płaszczyzna osiowa lub płaszczyzna, która prostopadle przecina normalnie typ kolagenu. Użyj standardowego kriotomu, aby przeciąć osadzoną tkankę o grubości 70 mikrometrów w próbkach ludzkich i 40 mikrometrów w próbkach bydlęcych. Zebrać skrawki na szkiełku podstawowym przed trzykrotnym przepłukaniem skrawków PBS, dodać odpowiedni barwnik fluorescencyjny, a następnie podłoże montażowe i przykryć sekcje szkiełkiem nakrywkowym.
Umieścić szkiełko z wycinkiem tkanki barwiącej na uchwycie próbki mikroskopu fluorescencyjnego, uruchamiając urządzenie do oświetlania struktury, wykonać obrazowanie pojedynczego pola widzenia z filtrami fluorescencyjnymi i odpowiednim oświetleniem. Korzystając z oprogramowania do optymalizacji obrazu kompatybilnego z mikroskopem fluorescencyjnym, przetwarzaj obrazy, optymalizując intensywność i jasność. Aby zobrazować przekrój jako całość, użyj techniki obrazowania mozaiki, otwierając 60 ustawień akwizycji z panelu paska narzędzi i dostosowując ustawienia mozaiki w rejestrze mozaiki.
W tym celu zdefiniuj liczbę kolumn i rzędów obrazów pola widzenia, które mają być później połączone w jeden obraz ogólny, naciśnij setup i dostosuj korekcję ostrości poszczególnych kafelków. Przetwarzaj zdjęcia po ich wykonaniu, optymalizując ich intensywność i jasność. Aby przeanalizować przestrzenną organizację chondrocytów, użyj funkcji 3D wbudowanej w oprogramowanie, dostosowując ustawienia stosu Z za pomocą przycisku start/stop, zdefiniuj parametry skanowania, takie jak pozycje początkowe i końcowe na osi Z oraz odległość warstwy.
Zidentyfikuj indywidualne wzorce komórkowe i użyj wtyczki do zliczania komórek do analizy ilościowej wzorców komórkowych, oblicz gęstość komórek, dzieląc zliczone komórki według rozmiaru wybranego obszaru zainteresowania. Architekturę IVD z gęstą siecią włókien kolagenowych w pierścieniu i bardziej miękkim jądrze można rozpoznać na obrazach mozaikowych wykonanych w płaszczyźnie osiowej i strzałkowej. W powiększonych obszarach z obrazów mozaikowych różne przestrzenne wzorce organizacyjne chondrocytów, takie jak; Zauważono pojedyncze komórki, pary i sznurki.
Badania nad różnymi etapami rozwoju i dojrzewania zwłóknienia pierścienia bydlęcego wykazały ciągły spadek gęstości komórkowej podczas rozwoju dysku embrionalnego. Z drugiej strony zaobserwowano zwiększoną gęstość komórkową i tworzenie się klastrów w dysku dorosłego człowieka podczas zwyrodnienia. Gęstość komórek we wczesnych stadiach rozwoju IVD w zwłóknieniu pierścienia bydlęcego i jądrze miażdżystym bydła zmniejszała się gwałtownie aż do urodzenia.
Obrazowanie kanałowe IVD za pomocą Epitome pozwoliło na wizualizację architektury 3D wzorców przestrzennych, takich jak cytoplazma i jądro, w nienaruszonym IVD wykryto pojedyncze i pary chondrocytów. Natomiast w zdegenerowanych anulus stwierdzono skupiska komórek. Najtrudniejszą częścią jest przypisanie tkanki do jej źródła i skorygowanie osadzonej do cięcia.
Jest to niezbędne do uzyskania wiarygodnych wyników. Prawidłowe wypreparowanie i wyselekcjonowanie tkanki IVD z różnych stadiów i pochodzenia pozwala nam pogłębić analizę poprzez dalszą analizę biochemiczną i biomechaniczną, taką jak ELISA lub mikroskopia sił atomowych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie bada przestrzenną organizację chondrocytów w obrębie pierścienia włóknistego krążka międzykręgowego (IVD), wykorzystując technikę sekcjonowania optycznego. Metoda ta umożliwia wizualizację 3D architektury chondrocytów na różnych etapach rozwoju i stanów zwyrodnienia.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Organizacja chondrocytów w krążkach międzykręgowych
- Wpływ zwyrodnienia krążka na morfologię komórek
- Biologia rozwojowa krążka międzykręgowego
Tło
- Zwyrodnienie krążka międzykręgowego jest częstą przyczyną bólu i upośledzenia ruchomości.
- Gęsta sieć kolagenu typu I komplikuje analizę za pomocą tradycyjnej mikroskopii.
- Rozumienie ułożeń komórkowych w krążku może przełożyć się na strategie terapeutyczne.
Stosowane metody
- Sekcjonowane optycznie 3D obrazowanie chondrocytów
- Próbki krążków międzykręgowych ludzkich i wołowych
- Mikroskopia fluorescencyjna i techniki mozaiki
Główne wyniki
- Zidentyfikowano różnice w przestrzennej organizacji chondrocytów, w tym pojedyncze komórki, pary i skupiska komórek.
- Zaobserwowano, że gęstość komórek spada podczas rozwoju zarodkowego u wołów, podczas gdy u dorosłych ludzi gęstość i skupienia rosną podczas zwyrodnienia.
- Badanie podkreśla złożoność pracy z tkanką IVD i znaczenie właściwej przygotowania próbki.
Wnioski
- Wyniki podkreślają znaczenie przestrzennych ułożeń chondrocytów w zrozumieniu biologii i zwyrodnienia IVD.
- Ta metodologia zapewnia ramy dla dalszych badań nad biochemicznymi i biomechanicznymi właściwościami krążków międzykręgowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding spatial chondrocyte organization in the intervertebral disc provides mechanistic insights into disc degeneration, a key driver of chronic pain and disability. This optical sectioning approach enables high-resolution 3D visualization of cellular patterns, supporting target validation in musculoskeletal disease research. The method aids in de-risking therapeutic hypotheses by linking cellular architecture to disease progression across developmental and degenerative stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chondrocyte spatial arrangements as a biomarker for disc health and degeneration.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating cellular patterns with tissue maturation and disease states.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by identifying cluster formation as a hallmark of advanced degeneration.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative chondrocyte density and spatial distribution data for assay standardization.
- Operational Value: Produces reproducible, high-resolution imaging outputs suitable for multi-site validation.
- Scalability: Enables preparation of validated biological systems for downstream biochemical and biomechanical analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges developmental biology observations in bovine models to pathological changes in human degenerative discs.
- Disease-Relevant System: Uses human disc tissue from degeneration patients to ensure clinical relevance.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by linking cellular clustering to degenerative progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling spatial analysis from early development through degeneration, informing target selection and validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on chondrocyte organization and its role in disc pathophysiology.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based readouts for assessing cellular density and structural patterns.
- Analytics: Provides Z-stack and mosaic imaging outputs for 3D morphometric analysis and pattern recognition.
- Translational Research: Connects embryonic bovine findings to adult human degeneration, enhancing preclinical validity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying extracellular matrix-cell interactions in connective tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in disc degeneration by visualizing 3D chondrocyte architecture.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized sectioning, staining, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves portfolio decisions by enabling objective assessment of degenerative biomarkers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on spatial cellular phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, decalcification, and cryosectioning of dense collagenous tissues.
- Dependent on fluorescence microscopy with optical sectioning (Apotome) and mosaic imaging capabilities.
- Necessitates cross-team standardization for tissue orientation, region-of-interest selection, and cell counting.
- Adaptation across model systems must account for species-specific differences in disc anatomy and maturation timing.
- Practical limitations include tissue allocation challenges and embedding artifacts affecting section quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Harvest and Preparation of Intervertebral Disc (IVD) Samples
2:11
Tissue Fixation and Histologic Sectioning
3:00
Microscopic Imaging and Processing
4:11
Cellular Pattern Identification and Density Assessment
4:29
Results: Microscopic Analysis of IVDs Through Various Developmental Stages
5:45
Conclusion
