Przekrój optyczny i wizualizacja krążka międzykręgowego od rozwoju embrionalnego do zwyrodnienia

Zwyrodnienie krążka międzykręgowego prowadzi do wysokiego stopnia upośledzenia i bólu. Nasz protokół pozwala nam badać morfologicznie rozwój dysku i jego zmiany w zwyrodnieniu. Gęsta sieć kolagenu typu pierwszego sprawia, że analiza krążka międzykręgowego za pomocą mikroskopii jest zwykle trudna.

Dzięki sekcji optycznej możemy zbadać trójwymiarowe ułożenie chondrocytów w różnych tkankach. Rozpocznij od umieszczenia śródoperacyjnie uzyskanych próbek krążka międzykręgowego lub IVD w DMEM uzupełnionych 2% objętościowo penicyliny-streptomycyny i 1,2% objętościowo amfoterycyny B, natychmiast po pobraniu przechowywać próbki IVD w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszego przetwarzania. W przypadku zamrożenia ludzkie próbki do diagnostyki in vitro należy rozmrozić w temperaturze pokojowej i określić pochodzenie ludzkiej tkanki do diagnostyki in vitro na podstawie właściwości mikroskopowych, takich jak; zagęszczenie i orientacja uczelni.

Aby pobrać tkankę dysku bydlęcego, weź segment ruchu składający się z IVD z dwoma sąsiednimi kręgami i za pomocą ostrza chirurgicznego nr 15 wypreparuj cały krążek bydlęcy z kości podchrzęstnej, odwróć dysk, aby dotrzeć do wyśrodkowanych obszarów. Po zidentyfikowaniu różnych obszarów chrząstki użyj ostrza chirurgicznego nr 20 lub 22, aby wyciąć obszar zainteresowania z całego dysku. Diagnostyka in vitro z zarodków bydlęcych o długości korony i zadu mniejszej niż 20 centymetrów powinna być przetwarzana bez preparacji.

Przeprowadzono odwapnienie tkanki zgodnie z opisem w manuskrypcie. Potwierdź pomyślne odwapnienie, jeśli igła o rozmiarze 20 wniknie w tkankę dysku lub, jeśli to możliwe, w kręgi bez zauważalnego oporu. Pobrać próbki tkanek w dziesięciokrotnej objętości 4% roztworu formaldehydu w PBS przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia umieść tkankę w rozpuszczalnym w wodzie podłożu do zatapiania na gałce kriotomowej, tak aby powstała płaszczyzna osiowa lub płaszczyzna, która prostopadle przecina normalnie typ kolagenu. Użyj standardowego kriotomu, aby przeciąć osadzoną tkankę o grubości 70 mikrometrów w próbkach ludzkich i 40 mikrometrów w próbkach bydlęcych. Zebrać skrawki na szkiełku podstawowym przed trzykrotnym przepłukaniem skrawków PBS, dodać odpowiedni barwnik fluorescencyjny, a następnie podłoże montażowe i przykryć sekcje szkiełkiem nakrywkowym.

Umieścić szkiełko z wycinkiem tkanki barwiącej na uchwycie próbki mikroskopu fluorescencyjnego, uruchamiając urządzenie do oświetlania struktury, wykonać obrazowanie pojedynczego pola widzenia z filtrami fluorescencyjnymi i odpowiednim oświetleniem. Korzystając z oprogramowania do optymalizacji obrazu kompatybilnego z mikroskopem fluorescencyjnym, przetwarzaj obrazy, optymalizując intensywność i jasność. Aby zobrazować przekrój jako całość, użyj techniki obrazowania mozaiki, otwierając 60 ustawień akwizycji z panelu paska narzędzi i dostosowując ustawienia mozaiki w rejestrze mozaiki.

W tym celu zdefiniuj liczbę kolumn i rzędów obrazów pola widzenia, które mają być później połączone w jeden obraz ogólny, naciśnij setup i dostosuj korekcję ostrości poszczególnych kafelków. Przetwarzaj zdjęcia po ich wykonaniu, optymalizując ich intensywność i jasność. Aby przeanalizować przestrzenną organizację chondrocytów, użyj funkcji 3D wbudowanej w oprogramowanie, dostosowując ustawienia stosu Z za pomocą przycisku start/stop, zdefiniuj parametry skanowania, takie jak pozycje początkowe i końcowe na osi Z oraz odległość warstwy.

Zidentyfikuj indywidualne wzorce komórkowe i użyj wtyczki do zliczania komórek do analizy ilościowej wzorców komórkowych, oblicz gęstość komórek, dzieląc zliczone komórki według rozmiaru wybranego obszaru zainteresowania. Architekturę IVD z gęstą siecią włókien kolagenowych w pierścieniu i bardziej miękkim jądrze można rozpoznać na obrazach mozaikowych wykonanych w płaszczyźnie osiowej i strzałkowej. W powiększonych obszarach z obrazów mozaikowych różne przestrzenne wzorce organizacyjne chondrocytów, takie jak; Zauważono pojedyncze komórki, pary i sznurki.

Badania nad różnymi etapami rozwoju i dojrzewania zwłóknienia pierścienia bydlęcego wykazały ciągły spadek gęstości komórkowej podczas rozwoju dysku embrionalnego. Z drugiej strony zaobserwowano zwiększoną gęstość komórkową i tworzenie się klastrów w dysku dorosłego człowieka podczas zwyrodnienia. Gęstość komórek we wczesnych stadiach rozwoju IVD w zwłóknieniu pierścienia bydlęcego i jądrze miażdżystym bydła zmniejszała się gwałtownie aż do urodzenia.

Obrazowanie kanałowe IVD za pomocą Epitome pozwoliło na wizualizację architektury 3D wzorców przestrzennych, takich jak cytoplazma i jądro, w nienaruszonym IVD wykryto pojedyncze i pary chondrocytów. Natomiast w zdegenerowanych anulus stwierdzono skupiska komórek. Najtrudniejszą częścią jest przypisanie tkanki do jej źródła i skorygowanie osadzonej do cięcia.

Jest to niezbędne do uzyskania wiarygodnych wyników. Prawidłowe wypreparowanie i wyselekcjonowanie tkanki IVD z różnych stadiów i pochodzenia pozwala nam pogłębić analizę poprzez dalszą analizę biochemiczną i biomechaniczną, taką jak ELISA lub mikroskopia sił atomowych.