Name: TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj metodę TRAP do izolacji mRNA z rzadkich populacji komórek w zarodkach Drosophila. Technika ta umożliwia badanie translacji w specyficznych typach komórek mięśniowych bez konieczności ich rozdzielania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Nicolasowi Allegre, Maud Peyny i Jean-Philippe'owi Da Ponte za doskonałą pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), grant startowy INSERM, grant ANR ID-CELL-SPE, Equipe FRM oraz grant AFM 15845.

1. Generowanie linii muchowej 
<ol>
	<li>Wygeneruj dwie różne konstrukcje. W pierwszym konstrukcie cDNA RpL10A (podjednostka białka rybosomalnego L10a) jest klonowane za GFP do plazmidu pUASP-PL-GFP-Nter (zmodyfikowana wersja z32). Zastosowanie promotora linii zarodkowej pozwala na bardziej wielowartościowe wykorzystanie linii transgenicznej. 
	UWAGA: Uzyskaj drugi konstrukt poprzez sklonowanie sekwencji regulatorowej napędzającej specyficzną tkankowo ekspresję genu garbu przed GAL4 (TF) przy użyciu plazmidu pPTGAL4.</li>
	<li>Wstrzyknąć plazmidy oddzielnie do muszek w1118 i wprowadzić konstrukty do genomu muchy przez insercję elementu P (zgodnie ze standardową procedurą)33.</li>
	<li>Wybierz transformanty, aby odzyskać linie muchowe z konstruktami na dwóch różnych chromosomach. Ostateczna linia TRAP jest tworzona przez połączenie tych dwóch linii (krzyżówek genetycznych) w celu uzyskania jednej podwójnej stabilnej linii transgenicznej. F0: w-; Cyo, UAS EGFP::RpL10A; MKRS/TM6B x w-; Cyo/SCU; Garbaty Gal4/TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP::RpL10A; Garbaty Gal4/TM6B. Znacznie wzmocnij tę linię i zbierz pożądane zarodki w stadium.</li>
</ol>
2. Pobieranie zarodków
<ol>
	<li>Przygotuj 8 dużych cylindrycznych klatek populacyjnych zawierających około 40 g młodych much w klatce (około 180 000 much w klatce).</li>
	<li>Kontynuuj tak zwane pre-lays, które pozwalają muchom usunąć rozwijające się zarodki z ich jajowodów. W tym celu połóż muchy na 1 godzinę na dwóch szalkach Petriego o średnicy 11 cm, zawierających mieszaninę zestalonego agaru i soku winogronowego i przykryj 1/3 powierzchni świeżo przygotowaną pastą drożdżową. Po 3 wymianach talerzy z sokiem winogronowym zbierz prawdziwe zarodki na podobnych świeżo przygotowanych talerzach. 
	UWAGA: Czas inkubacji będzie się różnił w zależności od badanego okna rozwojowego.</li>
	<li>Wyjąć płytki z klatek i pozostawić je w tej samej temperaturze przez czas potrzebny do uzyskania prawidłowego stadium rozwojowego (np. 3 godziny składania jaj + 10 godzin dodatkowej inkubacji dają zarodki w stadium 10-13 godzin po złożeniu jaj (AEL)). Zawiesić zawartość płytki (zarodki, pasta drożdżowa, martwe muchy) w 50 ml wody za pomocą pędzla.</li>
	<li>Przejść przez szereg sit (700 μm, 355 μm, 112 μm) w celu oddzielenia zarodków od martwych much i pozostałych części ciała i zebrać zarodki zatrzymane na sicie o mniejszej średnicy, a następnie krótko umyć w wodzie dejonizowanej. Nie używaj więcej niż 18 płytek na kolekcję, ponieważ może to zatkać sita.</li>
	<li>Dechorionate zarodki w 4,5% wybielaczu w dejonizowanej wodzie przez 2 minuty i dokładnie płukać wodą dejonizowaną przez 30-60 sekund. Inkubować zarodki w PBS 0,01% Tween 20, 100 μg/ml cykloheksymidu, przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej pod mieszaniem.</li>
	<li>Wysuszyć zarodki na celulozowych arkuszach chłonnych i przenieść je do probówek do mikrowirówek. Zważyć probówki i błyskawicznie zamrozić zarodki przez zanurzenie w ciekłym azocie. Na tym etapie wysuszone zarodki mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałem GFP
<ol>
	<li>Dokładnie wymieszaj kulki magnetyczne Protein G w oryginalnej butelce przez delikatne mieszanie.</li>
	<li>Przenieś 90 μl kulek do probówki wolnej od RNaz i zbierz je na magnesie (30–60 sekund). Do przeprowadzenia immunoprecypitacji (IP) z użyciem 1 ml lizatu zawierającego 60-80 mg/ml białek niezbędne jest 90 μl kulek. Przestrzegaj proporcji, aby zapobiec nasyceniu ściegów. Użyj kilku probówek w zależności od ilości białka.</li>
	<li>Umyj koraliki za pomocą 1× PBS 0,01% Tween 20 (500 μl) i zbierz koraliki na magnesie, aby usunąć supernatant. Dodać 30 μg przeciwciała GFP w 350 μl PBS 0,01% Tween 20 do kulek i inkubować z powolnym mieszaniem koniec nad końcem przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zebrać kulki na magnesie (30-60 sek), wyrzucić supernatant i spłukać w 500 μl buforu do ekstrakcji polisomów (Hepes 10 mM, KCl 150 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM, Triton 1%, cykloheksymid 100 μg/ml, inhibitor proteazy 1×, inhibitor RNazy 100 U).</li>
	<li>Zbierz kulki na magnesie i dodaj 500 μl buforu blokującego (BSA 0,1 μg/μl, tRNA drożdży 0,1 μg/μl, glikogen 0,1 μg/μl w buforze do ekstrakcji polisomów).</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej i powtórzyć ten krok raz ze świeżym buforem blokującym.</li>
	<li>Zebrać kulki na magnesie i spłukać w 500 μl buforu do ekstrakcji polisomów, a następnie zebrać kulki i natychmiast przejść do etapu oczyszczania immunologicznego (sekcja 6).</li>
</ol>
4. Przygotowanie lizatu
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem ustaw program na wielokierunkowej szlifierce do kulek szybkoobrotowych: 2×10 s przy 5,000 obr./min, 15 sec pauza. Przenieść wysuszone zarodki (1,5 g) do 15 ml probówek wstępnie schłodzonych na lodzie zawierających bufor do ekstrakcji polisomów i natychmiast poddać homogenizacji. Homogenizować 1,5 g zarodków w 4 ml buforu do ekstrakcji polisomów.</li>
	<li>Rozłóż homogenizowane zarodki w dwóch wstępnie schłodzonych probówkach o pojemności 2 ml i zmiel zarodki, uruchamiając program homogenizatora. Przenieść lizat do świeżych, wstępnie schłodzonych probówek mikrowirówek na lodzie i przygotować postjądrowy supernatant przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przez 10 minut w temperaturze 2 000 g.</li>
	<li>Przenieść supernatant do świeżej, wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówki na lodzie, dodać 1/100 objętości próbki 10% Nonidetu P-40 do supernatantu (stężenie końcowe = 0,1%) i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę.</li>
	<li>Odwirować pulsacyjnie próbkę w minifuge, aby zebrać ciecz na dnie probówki, dodać 1/9 objętości próbki 300 mM 1,2-Diheptanoilo-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DHPC) (stężenie końcowe = 30 mM), delikatnie wymieszać przez odwrócenie probówki i inkubować mieszaninę na lodzie przez 5 minut (mieszać przez kilkakrotne odwrócenie podczas inkubacji).</li>
	<li>Przygotować supernatant pomitochondrialny przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przez 10 minut w temperaturze 20 000 g. Zmierz stężenie białka metodą Bradforda: stężenie w lizacie powinno wynosić 60-80 mg/ml. Przenieść supernatant do nowej, świeżo schłodzonej probówki mikrowirówki i natychmiast przejść do etapu wstępnej absorpcji (sekcja 5).</li>
</ol>
5. Wstępna absorpcja
<ol>
	<li>Dokładnie zawiesić kulki magnetyczne przez delikatne mieszanie i przenieść 30 μl kulek do probówki mikrowirówkowej w temperaturze pokojowej (30 μl kulek/1 ml lizatu embrionalnego).</li>
	<li>Zebrać kulki na magnesie, odpipetować supernatant i ponownie zawiesić kulki w buforze do ekstrakcji polisomów (500 μl). Zebrać koraliki na magnesie, dodać lizat embrionalny i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C na rotatorze.
	<ol>
		<li>Usuń kulki i trzymaj supernatant na lodzie do etapu oczyszczania immunologicznego. Przed immunooczyszczaniem należy zachować 100 μl supernatantu (wejście), aby porównać globalną próbkę RNA z próbką RNA pobraną po oczyszczeniu immunologicznym, na przykład metodą RT-qPCR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Oczyszczanie immunologiczne
<ol>
	<li>Dodać 1 ml (co odpowiada 60-80 mg/ml białka) wstępnie wchłoniętego lizatu do probówki wolnej od RNaz zawierającej 90 μl zablokowanych kulek sprzężonych z przeciwciałem GFP. Inkubować próbki w temperaturze 4 °C przez 2 godziny, delikatnie mieszając od końca do końca w rotatorze probówkowym. Alternatywnie przeprowadzić inkubację O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po inkubacji zbierz koraliki na magnesie. Za pomocą minifuge odwiruj kulki, a następnie zawieś je ponownie w 500 μl buforu do płukania (Hepes 10mM, KCl 350mM, MgCl2 5mM, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 mM, cykloheksymid 100 μg/ml, inhibitor RNazy 100 U) i zbierz je na magnesie. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Wymień koraliki na nową, wstępnie schłodzoną probówkę wolną od RNaz i umyj dwukrotnie. Zbierz kulki na magnesie i przystąp do ekstrakcji RNA, dodając 1 ml TRiZol bezpośrednio do kulek i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
7. Oczyszczanie RNA i ocena jakości
<ol>
	<li>Użyj zestawu RNeasy Micro Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Po zakończeniu eluuj RNA wodą wolną od (x) μl RNazy. Ogrzewać przez 2 minuty w temperaturze 60 °C i przechowywać zamrożone próbki w temperaturze -80 °C. Sprawdź jakość RNA za pomocą bioanalizatora (postępuj zgodnie z instrukcjami producenta).</li>
	<li>Aby przetestować swoistość RNA TRAPed, należy przeprowadzić odwrotną transkrypcję na 3 ng oczyszczonego RNA (wejście i IP) zgodnie z instrukcjami producenta (indeks górny III). Użyj cDNA uzyskanego do qPCR przy użyciu zestawów starterów specyficznych dla genu.</li>
</ol>

<ol><li>Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).</li>
<li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (1038).</li>
<li>Junion, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+view+of+cell+fate+specification%3A+ladybird+acts+at+multiple+levels+during+diversification+of+muscle+and+heart+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors.</a> Genes. 21, 3163-3180 (2007).</li>
<li>Jakobsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+ChIP-on-chip+reveals+Biniou+as+a+universal+regulator+of+the+visceral+muscle+transcriptional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network.</a> Genes. 21, 2448-2460 (2007).</li>
<li>Cunha, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+binding+leads+to+diverse+regulatory+responses%3A+Lmd+is+a+tissue-specific+modulator+of+Mef2+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity.</a> PLoS genetics. 6, e1001014(2010).</li>
<li>Sandmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+transcriptional+network+for+early+mesoderm+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+%26+development%22%5BJournal%5D)">A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster.</a> Genes, & development. 21, 436-449 (2007).</li>
<li>Kvon, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+functional+characterization+of+Drosophila+developmental+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo.</a> Nature. 512, 91-95 (2014).</li>
<li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).</li>
<li>Gallo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REDfly+v3.0%3A+toward+a+comprehensive+database+of+transcriptional+regulatory+elements+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila.</a> Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).</li>
<li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li>
<li>Doyle, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+translational+profiling+approach+for+the+comparative+analysis+of+CNS+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types.</a> Cell. 135, 749-762 (2008).</li>
<li>Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+approaches+to+RNA+profiling+data+for+the+identification+of+genes+enriched+in+specific+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells.</a> Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).</li>
<li>Fomchenko, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+cells+can+become+transformed+and+overtake+PDGF-induced+murine+gliomas+in+vivo+during+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression.</a> PloS one. 6, e20605(2011).</li>
<li>Helmy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+global+alteration+of+translational+regulation+glioma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo.</a> PloS one. 7, e46965(2012).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li>
<li>Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+mouse+line+for+collecting+ribosome-bound+mRNA+using+the+tetracycline+transactivator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+molecular+neuroscience%22%5BJournal%5D)">A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82(2014).</li>
<li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li>
<li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+translational+profiling+in+the+Xenopus+laevis+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1%2FStat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).</li>
<li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li>
<li>Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+analysis+of+translating+RNAs+in+developing+flowers+reveals+new+levels+of+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control.</a> Molecular systems biology. 6, 419(2010).</li>
<li>Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+method+for+cell-specific+profiling+of+translated+mRNAs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila.</a> PloS one. 7, e40276(2012).</li>
<li>Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Larval+and+Adult+Drosophila+Astrocytes+Reveals+Stage-Specific+Gene+Expression+Profiles%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles.</a> G3. , (2015).</li>
<li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genome Res. 22, 766-777 (2012).</li>
<li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).</li>
<li>Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+analysis+of+muscle+founder+cells+implicates+the+chromatin+regulator+Sin3A+in+muscle+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity.</a> Cell reports. 8, 858-870 (2014).</li>
<li>Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+cell+sorting+from+Drosophila+embryos%3A+application+to+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis.</a> Fly. 5, 261-265 (2011).</li>
<li>Busser, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+underlying+the+regulatory+specificity+of+a+Drosophila+homeodomain+protein+that+specifies+myoblast+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity.</a> Development. 139, 1164-1174 (2012).</li>
<li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gal4+in+the+Drosophila+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">Gal4 in the Drosophila female germline.</a> Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).</li>
<li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218, 348-353 (1982).</li>
<li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule opisano zmodyfikowany protokół oczyszczania powinowactwa rybosomów (nazwany "TRAP-rc") przeznaczony do badania rzadkich populacji komórek w zarodkach Drosophila . Podano informacje na temat kluczowych etapów pomyślnej izolacji specyficznego RNA z wydajnością odpowiednią do analizy mikromacierz lub sekwencji RNA , tj. 1) wymaganej ilości materiału biologicznego i zoptymalizowanej procedury lizy zarodków i ekstrakcji polisomów; 2) Proporcje kulek/przeciwciał do lizatu dla optymalnej immunoprecypitacji; 3) kroki pozwalające na redukcję tła, w tym skład bufora myjącego, tak aby prowadzić eksperymenty TRAP-rc z wysoką swoistością i czułością.
Protokół ten zapewnia powtarzalne dane, dzięki czemu można go łatwo zastosować do innych typów komórek. Technika ta umożliwia analizę zróżnicowanej ekspresji genów na poziomie aktywnie translującego mRNA, a tym samym toruje drogę do zrozumienia ekspresji białek w określonym typie komórki w określonym oknie czasowym. Należy jednak pamiętać, że obfitość białka będzie zależeć od szybkości procesów translacji i degradacji. Głównym ograniczeniem metody TRAP jest jej niemożność dokładnego pomiaru zawartości białka ani wykrycia modyfikacji potranslacyjnej. Poprawa kwantyfikacji poprzez pomiar gęstości rybosomów wzdłuż ciała mRNA, a tym samym w sposób specyficzny dla typu komórki, może sprawić, że TRAP w połączeniu ze śladami rybosomów stanie się bardzo potężnym narzędziem. W niedawnym artykule34 ta kombinacja została przeprowadzona na ludzkich embrionalnych komórkach nerki 293. Autorzy przeprowadzili ślad nukleazy, a następnie oczyścili powinowactwo indukowalnej biotynylowanej formy RpL10A za pomocą kulek streptawidyny. Jest to dowód na słuszność zasady, że możliwe jest wykonanie śladu rybosomu w całym organizmie przy jednoczesnym ukierunkowaniu na określony typ komórki, przy czym ograniczeniem jest ilość materiału biologicznego wymaganego do tego celu.
Przeprowadzanie eksperymentów TRAP równolegle z globalnymi analizami transkryptomicznymi umożliwi śledzenie proporcji między nowo transkrybowanym a aktywnie translującym RNA. Będzie to bardzo pouczające na temat potencjalnych mechanizmów potranskrypcyjnych zachodzących w określonych kontekstach rozwojowych lub określonych populacjach komórek – na przykład przez mikroRNA.
Podsumowując, TRAP jest wysoce wydajną, specyficzną i czułą metodą identyfikacji RNA związanych z rybosomami ulegającymi aktywnej translacji w sposób specyficzny dla komórki. Metoda ta może być stosowana w wielu różnych organizmach i typach tkanek. Opisany tutaj nowy protokół TRAP-rc został zoptymalizowany pod kątem rzadkich populacji komórek (mniej niż 1% całkowitej liczby komórek) oraz ilości materiału końcowego wystarczającej do kolejnych analiz na poziomie całego genomu.
Możliwym ograniczeniem tej metody jest wymóg silnego czynnika napędzającego do wytwarzania znakowanych rybosomów w ilości wystarczającej do konkurowania z endogennymi rybosomami nieoznakowanymi w docelowym typie komórki. W niedawnym badaniu25 autorzy oszacowali na 10-30% stosunek rybosomów znakowanych do nieoznakowanych.
Aby rozwiązać ten problem, zwiększenie liczby kopii UAS-RpL10A-EGFP powinno znacznie poprawić tę równowagę. Alternatywnie, dodanie do opisanego tła genetycznego transgenu UAS-GAL4 wzmocni produkcję białka GAL4 i pośrednio zwiększy ekspresję RpL10A-EGFP. Powinno to sprzyjać lepszemu zajęciu znakowanych rybosomów na mRNA.
Należy zauważyć, że to już skuteczne podejście może stać się jeszcze bardziej skuteczne poprzez dostosowanie uzupełniających się metod w celu wprowadzenia bardziej ilościowego aspektu lub odkrycia i rozwikłania mechanizmów molekularnych, które są niezbędne do kontroli ekspresji genów.

Zrozumienie, w jaki sposób komórki nabywają określone właściwości podczas rozwoju, jest kluczowe, aby docenić złożoność organów i ich potencjalną ewolucję w kierunku stanów patologicznych. Istnieje duży nacisk badawczy na rozszyfrowanie sieci regulacyjnych genów, które leżą u podstaw specyfikacji i różnicowania komórek, poprzez nieujawnianie globalnych profili ekspresji genów, statusu wiązania Pol II, zajętości czynnika transkrypcyjnego w sekwencjach regulatorowych lub potranslacyjnych modyfikacji histonów.
Do oceny ekspresji genów na poziomie globalnym stosuje się mikromacierze i metody sekwencyjne RNA. Mikromacierze pozwalają na wykrycie obfitości mRNA, podczas gdy sekwencjonowanie RNA jest lepiej nastawione na informowanie o różnych typach RNA, w tym kodujących i niekodujących RNA, takich jak mikroRNA, lncRNA lub snRNA. Jednak techniki te nie są w stanie rozróżnienia mRNA w stanie stacjonarnym z aktywną transkrypcją, mRNA z aktywną translacją i mRNA wchodzącego w proces degradacji. Wiadomo, że pomiar poziomów mRNA w stanie stacjonarnym jest słabym oszacowaniem składu proteomu1-3. Wręcz przeciwnie, identyfikacja aktywnie translującego mRNA daje dokładniejszy obraz produkcji białek.
Jednak badania transkryptomiczne były prowadzone głównie na poziomie całego organizmu, porównując przyrost lub utratę funkcji określonego czynnika do stanudzikiego typu 4-7 lub na wypreparowanej tkance, co utrudnia interpretację profili ekspresji genów. Niedawne postępy w narzędziach do celowania w komórki, oczyszczanie powinowactwa i poprawa czułości pozwalają obecnie na przeprowadzanie analiz całego genomu na małych populacjach komórek, a nawet pojedynczych komórkach w żywym organizmie.
U Drosophila, duże zbiory linii transgenicznych umożliwiają specyficzne czasowe i przestrzenne celowanie w różne tkanki i subpopulacje komórek za pomocą systemu GAL4/UAS8-10, co pozwala na dokładniejsze określenie mechanizmów molekularnych wymaganych do funkcjonowania komórki.
Wśród nowo opracowanych metod profilowanie polisomów metodą frakcjonowania zostało opisane jako sposób na wychwytywanie aktywnie translującego RNA11. Ta metoda oparta na wirowaniu w gradiencie sacharozy pozwala na wybór frakcji polisomowej i określenie mRNA translowanego w całym genomie podczas analizy za pomocą mikromacierzy lub głębokiego sekwencjonowania. Izolację polisomów można połączyć z trawieniem nukleazy w celu identyfikacji śladów rybosomalnych odpowiadających fragmentom RNA chronionym przez rybosomy podczas procesu translacji12. Ślad rybosomalny zwiększa dokładność kwantyfikacji translacji RNA i rozdzielczości na poziomie sekwencji RNA oraz pozycjonowania rybosomów, umożliwia pomiar szybkości translacji. Jednak do tej pory nie zastosowano go do specyficznej dla komórki izolacji translatomów, głównie ze względu na silny spadek wydajności RNA uzyskanej pod koniec procesu śladu rybosomowego. Biorąc pod uwagę, że wybór wielkości RNA może generować potencjalne fałszywie dodatnie wyniki z różnych RNP, które mogą również chronić RNA w podobny sposób, potrzebne są dalsze postępy, aby poprawić ślad rybosomalny i dostosować go do podejść specyficznych dla komórki.
Jedna z takich metod, zwana Oczyszczaniem Powinowactwa Rybosomów (TRAP), została opisana w 2008 roku przez Heimana i wsp. i zastosowana do wyizolowania translatomu z podzbioru neuronów u myszy. Poprzez znakowanie epitopowe białka rybosomalnego w sposób specyficzny dla typu komórki, polisomy mogą być selektywnie oczyszczane bez pracochłonnego etapu dysocjacji i sortowania komórek. W tym przypadku białko rybosomalne 60S L10a na powierzchni rybosomu zostało oznaczone eGFP 13. Od 2008 roku w kilku badaniach stosowano tę metodę na różnych gatunkach, od myszyw wieku 14-19 lat po X. laevis20,21, danio pręgowanego22,23 i Arabidopsis thaliana 24. Metoda TRAP została również dostosowana do modelu Drosophila i wykorzystana do oczyszczania mRNA specyficznych dla typu komórki z komórek neuronalnych 25 i astrocytów 26. Wszechstronny binarny system GAL4/UAS został wykorzystany do ekspresji RpL10A znakowanego GFP w sposób specyficzny dla tkanki. Głowy dorosłych muszek zostały wypreparowane w celu przeprowadzenia selekcji polisomów z komórek neuronalnych (celowanych przez pan-neuronalny sterownik Elav-Gal4) i zsekwencjonowano izolowane RNA. Duża liczba genów regulowanych w górę odpowiadała tym, o których wiadomo, że ulegają ekspresji w układzie nerwowym, co wskazuje, że podejście to ma dobrą specyficzność i skłania nas do dostosowania go do rzadkich populacji komórek (mniej niż 1% komórek) obecnych w rozwijających się zarodkach Drosophila.
W modelu Drosophila, stadium embrionalne jest modelem z wyboru do badania procesów rozwojowych, ponieważ aktorzy molekularni i ruchy morfogenetyczne są ewolucyjnie zachowane. Jedyne specyficzne tkankowo podejścia transkryptomiczne przeprowadzone do tej pory w tym modelu zostały przeprowadzone przy użyciu sortowania komórkowego lub jądrowego i były w stanie zbadać tylko transkryptom w stanie ustalonym 27-31, co stworzyło zapotrzebowanie na metody dedykowane profilowaniu translatomu specyficznemu dla tkanki/komórki w zarodku muchy. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony zarodkom Drosophila. Dzięki tej metodzie udało się wyizolować mRNA zaangażowane w translację w bardzo ograniczonej populacji komórek liczącej około 100 komórek mięśniowych na zarodek z zachowaniem wysokiej jakości i swoistości. Binarny system GAL4 / UAS jest używany do sterowania ekspresją RpL10A znakowanego GFP w subpopulacji mięśni bez żadnej toksyczności, bez widocznych fenotypów lub opóźnienia rozwojowego, jak wykazano wcześniej25. Zarodki Drosophila posiadają 30 mięśni na półsegment, które dadzą początek muskulaturze larwy. Wykorzystując region regulatorowy odkryty w pobliżu genu tożsamości garbu, celem jest 6 z 30 mięśni wielojądrowych. W tym teście rybosomy są unieruchamiane na mRNA za pomocą inhibitora wydłużania translacji cykloheksymidu. Ekstrakty cytozolowe są następnie używane do oczyszczania powinowactwa za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałem GFP. Jakość oczyszczonego RNA zweryfikowano za pomocą bioanalizatora. Ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) został wykorzystany do określenia swoistości i czułości izolacji mRNA i wykazał, że nasz zoptymalizowany protokół jest bardzo skuteczny.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diheptanoyl-sn-glicero-3-fosfocholina&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>termo naukowy&nbsp;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony BSA 100X&nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>TRNA drożdży&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Super RNase w&nbsp;</td><td>Przeciwciało Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Klon GFP N86/38</td><td>UC DAVIS / NIH Neuromab Faculty Przeciwciała Włączone</td><td>75-132&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Homogenizacja Lysis&nbsp;</td><td>Technologia</td><td></td><td></td>Bertin</tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads BiałkoG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Applied Biosystem&nbsp;</td><td></td><td></td>AM96406</tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)&nbsp;</td><td>Biosystem stosowany&nbsp;</td><td></td><td></td>AM95306</tr><tr><td>Celuloza waddyna niebielona&nbsp;</td><td>VWR</td><td>115-2597&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sita 112, 355, 710 um&nbsp;</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRiZol&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE HealthCare&nbsp;</td><td></td><td></td>28948964</tr><tr><td>Końcówki filtrów o niskim poziomie wiązania&nbsp;</td><td>ClearLine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubka bez rnazy 1,5 ml&nbsp;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>Animacja 20&nbsp;</td><td>Bioodczynnik Fischera&nbsp;</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Cykloheksymid&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki z inhibitorem proteazy, Mini-Complete, wolne od EDTA&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

trap-rc, translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków drosophila

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Pomiar poziomów mRNA w procesie translacji w poszczególnych komórkach dostarcza informacji o białkach zaangażowanych w funkcje komórkowe w danym momencie. Protokół nazwany Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić ten proces translacji mRNA w sposób specyficzny dla typu komórki. Opierając się na oczyszczaniu powinowactwa polisomów zawierających znakowaną podjednostkę rybosomalną, TRAP może być stosowany do analiz translatomów w poszczególnych komórkach, umożliwiając porównywanie typów komórek w trakcie procesów rozwojowych lub śledzenie postępów w rozwoju choroby i wpływu potencjalnych terapii na poziomie molekularnym. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną wersję protokołu TRAP, zwaną TRAP-rc (rzadkie komórki), poświęconą identyfikacji RNA zaangażowanych w translację z rzadkich populacji komórek. Projekt TRAP-rc poddano walidacji przy użyciu systemu celowania Gal4/UAS w ograniczonej populacji komórek mięśniowych w zarodkach Drosophila. Ten nowatorski protokół umożliwia odzyskiwanie RNA specyficznego dla typu komórki w ilościach wystarczających do globalnej analizy ekspresji genów, takiej jak mikromacierze lub sekwencja RNA. Solidność protokołu i duże zbiory sterowników Gal4 sprawiają, że TRAP-rc jest bardzo wszechstronnym podejściem z potencjalnymi zastosowaniami w badaniach całego genomu specyficznych dla komórek.

Zarodkowy układ mięśni somatycznych Drosophila składa się z 30 mięśni na hemisegment, a każdy mięsień posiada określony zestaw właściwości: kod genów tożsamości, położenie, liczbę zdarzeń fuzji, miejsca przyczepu oraz unerwienie. Identyfikacja przetłumaczonego mRNA w specyficznym podzbiorze mięśni dostarczy informacji o białkach niezbędnych do uformowania tych konkretnych cech mięśniowych. Z zastosowaniem metody opartej na TRAP wyizolowano RNA z subpopulacji mięśni wykazujących ekspresję genu tożsamości slouch (Rycina 1A-B). Główną kwestią w tym podejściu jest jakość i specyficzność wyizolowanego RNA. Zoptymalizowany protokół opisany w niniejszym opracowaniu umożliwił systematyczne odzyskanie wysokiej jakości RNA, ocenione za pomocą analizy bioanalizatorem. Uzyskany profil nie wykazuje degradacji RNA (Rycina 1C).
W innych badaniach opartych na metodzie TRAP pojawiły się wątpliwości dotyczące specyficzności danych. W niniejszej pracy ulepszamy tę metodę w celu zminimalizowania tła związanego z niespecficznym wiązaniem RNA do kulek lub probówek oraz poprzez optymalizację buforu do płukania. Aby ocenić poziom tła oraz efektywność izolacji komórek wykazujących ekspresję genu slouch, przeprowadziliśmy analizy RT-qPCR na trzech powtórzeniach tego samego stadium embrionalnego. Krotność wzbogacenia czterech różnych genów (mef2, slouch, prospero, soxNeuro) obliczono w stosunku do wartości wejściowych i znormalizowano względem RpL32 gen (Rycina 1D). Wyniki te wykazały 2,3-krotne wzbogacenie genów pan-mięśniowych mef2 i5,6-krotne wzbogacenie garbić się genu. W przeciwieństwie do tego, dwa geny wykazujące ekspresję w układzie nerwowym były w mniejszym stopniu obecne w porównaniu z próbką wejściową. Bardzo podobne wartości krotności zmiany (fold change) zaobserwowano w trzech powtórzeniach biologicznych, co dowodzi powtarzalności protokołu. Przy zastosowaniu drivera Slouch-Gal4 i rozpoczęciu procesu od 1,5 g, uzyskano około 1,5×10^6 embrionów zawierających 100 komórek GFP na embrion (łącznie 150×10^6 komórek pozytywnych).
Po przeprowadzeniu eksperymentu TRAP wydajność wynosi około 25–45 ng specyficznego RNA, w zależności od badanego stadium. Taka ilość materiału jest wystarczająca do przeprowadzenia analizy mikromacierzy lub RNA-seq z zastosowaniem protokołu amplifikacji w celu stworzenia biblioteki RNA-seq. Wydajność będzie w dużej mierze zależeć od siły promotora wykorzystanego do ekspresji RpL10A-EGFP.
<img alt="Analiza ekspresji genetycznej, obrazowanie GFP, chromatogram jakości RNA, wykres słupkowy wzbogacenia mRNA." src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Ocena jakości i specyficzności RNA izolowanego metodą TRAP z embrionów Slouch-GAL4&gt;UASRpL10A-EGFP. 
(A-B) Obrazy konfokalne zarodka w stadium 16 wykazujące ekspresję RpL10A-EGFP specyficznie w sześciu komórkach mięśni Slouch na hemisegment (A). Na obrazie scalonym (B) widoczna jest kolokalizacja RpL10A-EGFP z ogólnym markerem mięśni Beta3tubulin. (C) Kontrola jakości RNA wyizolowanego metodą TRAP analizowana za pomocą bioanalizatora, wykazująca pełną integralność rRNA 18S i 28S. (D) Analiza RT-qPCR wykazująca wysoką specyficzność eksperymentów z mRNA izolowanym metodą TRAP na 3 replikach biologicznych zarodków w stadium 16. Krotność zmiany (fold change) obliczono w stosunku do próbki wejściowej (input) i znormalizowano względem genu RpL32. Transkrypty Mef2, obecne we wszystkich liniach mięśniowych, są wzbogacone 2,3-krotnie w porównaniu do próbki wejściowej, natomiast bardziej ograniczone transkrypty slouch są wzbogacone 5,6-krotnie. Komórki neuronalne wykazujące ekspresję genów prospero i soxN są uszczuplone odpowiednio 2,2-krotnie i 5,5-krotnie. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić specyficzną dla typu komórki translację mRNA. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony izolacji mRNA w rzadkich populacjach komórek zarodków Drosophila.

TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja RNA zaangażowanego w translację w sposób specyficzny dla typu komórek w embrionach drosofilowych. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie embrionów z transgenicznej linii much, co pozwala na specyficzną ekspresję podjednostki rybosomalnej znakowanej GFP w docelowym typie komórek, w tym przypadku w komórkach mięśni slouch. Drugim krokiem jest przygotowanie lizatu w celu otrzymania preparatu polisomów zawierającego mieszaninę rybosomów znakowanych i nieznakowanych.Następnie szacuje się stężenie białka w lizacie i przeprowadza oczyszczanie powinowactwem za pomocą kulek sprzężonych z przeciwciałami przeciwko GFP, aby wychwycić kompleksy RNA rybosomalnego z badanego typu komórek. Ostatni etap jest poświęcony ekstrakcji i oczyszczaniu TRIzol RNA. Ostatecznie, za pomocą bioanalizatora i RT-qPCR przeprowadza się odpowiednio ocenę jakości oraz specyficzności.Następnie RNA można wykorzystać do globalnej analizy ilościowej za pomocą sekwencjonowania RNA lub mikromacierzy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z naszą istniejącą metodą, podobnie jak w przypadku sortowania VX, jest to, że nie wymaga ona etapu dysocjacji komórek w laboratorium. Może być ona przeprowadzona przy stole laboratoryjnym.Metoda ta jest szybka i umożliwia bezpośrednią identyfikację translacyjnego RNA w bardzo małej populacji komórek, co stanowi istotną zaletę w zrozumieniu procesu nabywania właściwości komórkowych. Chociaż metoda ta pozwala na zgłębienie procesu miogenezy w embrionie Josephine, może być ona również zastosowana do innych tkanek lub organizmów modelowych, takich jak rośliny, danio pręgowany czy myszy, a także może pomóc w śledzeniu wpływu leczenia na syntezę białek w przypadku patologii. Procedurę zademonstruje Benjamin Berta, doktorant z mojego laboratorium. Po opracowaniu obu linii transgenicznych zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołu oraz ich skrzyżowaniu w celu stworzenia transgenicznej linii podwójnie skrzyżowanej typu trap, należy namnożyć tę linię, przygotowując najpierw osiem dużych cylindrycznych klatek populacyjnych zawierających około 40 g młodych much na klatkę, co odpowiada około 180 000 much na klatkę.Przygotuj szalki Petriego o średnicy 11 cm zawierające mieszaninę zestalonego agaru i soku z winogron, z jedną trzecią powierzchni pokrytą świeżo przygotowaną pastą drożdżową, i pozwól muchom składać jaja na tych szalkach przez jedną godzinę. Powtórz ten proces na dwóch kolejnych zestawach świeżych szalek z sokiem z winogron, aby umożliwić muchom całkowite opróżnienie przewodów jajowych. Pożądane embriony podwójnie transgeniczne z krzyżówki zostaną złożone na czwartej szalce.Wyjmij z klatek płytki zawierające wybrane embriony i pozostaw je do inkubacji w temperaturze pokojowej do osiągnięcia pożądanego stadium rozwoju. W niniejszej procedurze zastosowano 13-godzinną inkubację. Następnie, przy użyciu pędzla, resuspenduj zawartość płytki w około 50 mililitrach wody.Oddziel embriony od martwych much, przepuszczając ciecz przez trzy sita o średnicach oczek 700, 355 i 112 mikronów. Przepłucz zebrane embriony w sicie o najmniejszej średnicy wodą jonizowaną. Poddaj embriony działaniu 4,5% roztworu wybielacza w wodzie jonizowanej przez dwie minuty, a następnie dokładnie przepłucz wodą jonizowaną przez 30 do 60 sekund.Inkubować zarodki w PBS z 0,01% T od 20 do 100 µg/mL cykloheksydyny przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej przy mieszaniu. Po osuszeniu zarodków na arkuszach absorpcyjnych z celulozy przenieść je do probówek do mikrocentryfugi, następnie zważyć probówki i zamrozić zarodki metodą błyskawiczną poprzez zanurzenie w ciekłym azocie.Na tym etapie wysuszone embriony mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze -80 °C. Przenieś 1,5 g wysuszonych embrionów do schłodzonych wcześniej probówek o pojemności 15 ml, zawierających 4 ml buforu do ekstrakcji polizomów, i zhomogenizuj je, używając sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 ml.Następnie rozdziel homogenizowane embriony do dwóch schłodzonych wcześniej probówek o pojemności 2 ml i rozetrzyj je w wielokierunkowym, szybkim homogenizatorze kulkowym. Ustaw urządzenie na dwa cykle po 10 sekund przy 5 000 RPM, z 15-sekundową przerwą między cyklami. Po 10 minutach wirowania przy 2000 G przenieś lizat do nowej, schłodzonej wcześniej probówki do mikrocentryfugi na lodzie.Do supernatantu S dodać NP-40 w stężeniu 10%, aby uzyskać stężenie końcowe 0,1%, i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę. Dodać 300 µM DHPC do stężenia końcowego 30 mM i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę. Mieszaninę inkubować na lodzie przez pięć minut, kilka razy odwracając probówkę w celu wymieszania podczas inkubacji.Po inkubacji w lodzie przygotuj nadsącz pozamitochondrialny poprzez wirowanie w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 20 000 G. Po zmierzeniu stężenia białka metodą Bradforda i uzyskaniu stężenia białka w zakresie od 60 do 80 mg/mL, przenieś SNAT do nowej, schłodzonej probówki do mikrowirowarki i niezwłocznie przejdź do etapu wstępnej absorpcji. Resuspenduj kulki magnetyczne poprzez delikatne mieszanie, a następnie przenieś 30 µL kulek na każdy 1 mL lizatu do probówki do mikrowirowarki.Zgromadź kuleczki na magnesie, odpipetuj nadsącz i resuspenderuj kuleczki w 500 µL buforu do ekstrakcji polisomów. Następnie ponownie zgromadź kuleczki na magnesie. Dodaj lizat embrionalny i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C na rotatorze.Usunąć kuleczki i umieścić nadsącz na lodzie do momentu etapu immunopuryfikacji. Odłożyć 100 µl nadsączu jako globalną próbkę RNA do porównania z próbką pobraną po immunopuryfikacji. Aby przeprowadzić immunopuryfikację próbki, dodać 1 ml uprzednio zaabsorbowanego lizatu do wolnej od RNA probówki zawierającej 90 µl zablokowanych kuleczek sprzężonych z przeciwciałem przeciwko GFP. Inkubować próbkę w temperaturze 4 °C przez dwie godziny lub przez noc, stosując delikatne mieszanie w rotatorze do probówek (obrót wzdłuż osi długiej). Po inkubacjiPrzemyj kuleczki, najpierw wirowując pozostałe kuleczki w miniwirówce. Następnie zgromadź je za pomocą magnesu, zawieś ponownie w 500 µL buforu do mycia i inkubuj. Po wymieszaniu przez 10 minut w pomieszczeniu chłodniczym ponownie zgromadź kuleczki za pomocą magnesu.Przenieś kuleczki do nowej, wolnej od RNaz probówki i przemyj je jeszcze dwukrotnie. Na koniec, po zebraniu kuleczek za pomocą magnesu, przystąp do ekstrakcji RNA, dodając do kuleczek 1 mL TRIOL i przeprowadzając ekstrakcję zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie wykonaj oczyszczanie RNA, używając zestawu RNEZ micro zgodnie z instrukcjami producenta.Aby przetestować swoistość wyizolowanego RNA, przeprowadź transkrypcję odwrotną trzech nanogramów RNA immunopuryfikowanego oraz RNA wejściowego zgodnie ze standardowymi procedurami. Następnie wykorzystaj otrzymane cDNA do reakcji QPCR z zastosowaniem zestawów starterów specyficznych dla genów. Ten obraz konfokalny zarodka w stadium 16 pokazuje ekspresję RPL 10 A-E-G-F-P, konkretnie w sześciu komórkach mięśni przykręgosłupowych w każdym segmencie HEMI; obserwowana jest kolokalizacja RPL 10 A-E-G-F-P z ogólnym markerem mięśniowym beta trzy tubuliną.Wyizolowane RNA poddano analizie bioanalizatorem w celu kontroli jakości. Należy zwrócić uwagę na doskonałą integralność 18S oraz 28S rybosomalnego RNA. Rycina ta przedstawia wyniki analizy RT-qPCR wykonanej na trzech powtórzeniach biologicznych embrionów w stadium 16 i wykazuje wysoką swoistość mRNA wyizolowanego metodą TRAP.Zmianę FO obliczono w porównaniu do próbki wejściowej i znormalizowano względem metylacji genu RPL 32. Dwa transkrypty obecne we wszystkich liniach mięśniowych wykazują 2,3-krotne wzbogacenie w porównaniu do wejścia, podczas gdy bardziej ograniczone transkrypty slouch są wzbogacone 5,6-krotnie; natomiast w komórkach neuronalnych wykazujących ekspresję prospero oraz geny socks są uszczuplone odpowiednio 2,2-krotnie i 5,5-krotnie po ich rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom, szczególnie w dziedzinie biologii rozwoju, do eksploracji zaangażowania self aid oraz nabywania właściwości komórkowych podczas różnicowania embrionów doof.

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Główną przeszkodą w analizach biochemicznych rybosomów zawierających powstające peptydylo-tRNA była obecność innych rybosomów w tych samych próbkach — rybosomów niezaangażowanych w translację konkretnej analizowanej sekwencji mRNA. Opracowaliśmy prostą metodologię pozwalającą na wyłączną puryfikację rybosomów zawierających interesujące nas powstające peptydylo-tRNA.

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

Celem tego protokołu jest zapewnienie prostego i taniego podejścia do zbierania zarodków Drosophila na średnią skalę (0,5-1 g) i przygotowywania ekstraktów białkowych, które mogą być używane w dalszych zastosowaniach proteomicznych, takich jak spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS).

Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych

Prezentujemy podejście do oczyszczania mRNA związanego z rybosomami z komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (EC) bezpośrednio w tkankach mózgu, płuc i serca myszy za pomocą specyficznego dla EC znacznika genetycznego wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) w rybosomach w połączeniu z oczyszczaniem RNA.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) do izolacji RNA z komórek śródbłonka in vivo

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) oferuje możliwość analizowania programów rozwojowych przy minimalnym przetwarzaniu narządów i tkanek. Protokół zapewnia wysokiej jakości RNA z komórek ukierunkowanych na podjednostkę rybosomalną znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Narzędzia do dalszej analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencja RNA, ujawniają profile ekspresji specyficzne dla typu tkanki i komórki.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Tutaj opisujemy immunoprecypitację rybosomów i związanego z nimi RNA z wybranych populacji dorosłych męskich komórek rozrodczych myszy za pomocą systemu RiboTag. Strategiczna hodowla i staranna immunoprecypitacja skutkują czystymi, powtarzalnymi wynikami, które informują o translatomie komórek rozrodczych i dostarczają wglądu w mechanizmy zmutowanych fenotypów.

Immunoprecypitacja RiboTag w komórkach rozrodczych samca myszy

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

Ten protokół ma na celu wyizolowanie specyficznych dla typu komórki translujących rybosomalnych mRNA za pomocą mysiego modelu NuTRAP.

Izolowanie RNA specyficznych dla typu komórki z zatrzaskowo mrożonych próbek tkanek heterogenicznych bez sortowania komórek

Na podstawie mechanizmu składania kompleksu białkowego INAD, w tym protokole, zmodyfikowano strategię oczyszczania powinowactwa i konkurencji w celu oczyszczenia endogennego kanału TRP Drosophila.

Oczyszczanie endogennych kanałów potencjału przejściowego receptora Drosophila

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Protokół opisuje metodę hybrydyzacji in situ z uwzględnieniem polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP-FISH) w celu rozróżnienia transkryptów rybosomalnego RNA pochodzących z locus rybosomalnego DNA chromosomu X lub Y u Drosophila melanogaster.

Wykrywanie rybosomalnego RNA specyficznego dla polimorfizmu pojedynczego nukleotydu FISH u Drosophila melanogaster

Tu dostarczamy szczegółów dotyczących przygotowania lizatów i przeprowadzania in vitro translacji za pomocą Drosophila zarodków.

Wolnokomórkowa in vitro translacja mRNA w Drosophila Lizowaniu

Poznaj metodę TRAP do izolacji mRNA z rzadkich populacji komórek w zarodkach Drosophila. Technika ta umożliwia badanie translacji w specyficznych typach komórek mięśniowych bez konieczności ich rozdzielania.

TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Przeglądaj więcej filmów