TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie zaangażowanego w translację RNA w komórce typowanej w specyficzny sposób w zarodkach drosophila. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie zarodków z transgenicznej linii muchowej, co pozwala na specyficzną ekspresję podjednostki rybosomalnej znakowanej GFP w docelowym typie komórek, w tym przypadku w zgarbionych komórkach mięśniowych. Drugim krokiem jest wytworzenie lizatu w celu otrzymania preparatu polisomowego zawierającego mieszaninę znakowanych i nieznakowanych rybosomów.

Następnie szacuje się stężenie białka w lizacie i przeprowadza się oczyszczanie powinowactwa za pomocą kulek sprzężonych z przeciwciałami GFP w celu wychwycenia kompleksów rybosomów RNA z interesującego typu komórki. Ostatni etap poświęcony jest triolowi, RNA, ekstrakcji i oczyszczaniu. Ostatecznie oceny jakości i swoistości przeprowadza się odpowiednio za pomocą bioanalizatora i R-T-Q-P-C-R.

RNA można następnie wykorzystać do globalnej analizy ilościowej za pomocą sekwencjonowania RNA lub mikromacierzy. Główną zaletą tej techniki naszej istniejącej metody, takiej jak sortowanie VX, jest to, że nie wymaga ona etapu dysocjacji komórek w labo. Można go wykonać na ławce.

Jest szybki i umożliwia bezpośrednią identyfikację translowanego RNA w bardzo małej populacji komórek, co jest miarą korzyści dla zrozumienia nabywania właściwości komórek. Nawet jeśli ta metoda może dostarczyć informacji na temat miogenezy w zarodku Josephine, może być również zastosowana do innych tkanek lub współczesnych organizmów, takich jak roślina, zebra, ryba lub mysz, a także może pomóc w śledzeniu wpływu leczenia na syntezę białek w przypadku patologii. Procedurę zademonstruje Benjamin, doktorant z mojego laboratorium Po inżynierii, obie linie transgeniczne zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołu i krzyżowanie w celu stworzenia podwójnej krzyżowej linii transgenicznej, wzmacniają linię, najpierw przygotowując osiem dużych cylindrycznych klatek populacyjnych zawierających około 40 gramów młodych much w klatce, co odpowiada około 180 000 much w klatce.

Przygotuj szalki Petriego o średnicy 11 centymetrów zawierające mieszaninę zestalonego agaru i soku winogronowego, z jedną trzecią powierzchni pokrytą świeżo przygotowaną pastą drożdżową i pozwól muchom złożyć jaja na tych talerzach przez godzinę. Powtórz ten proces na dwóch kolejnych zestawach talerzy ze świeżym sokiem winogronowym, aby muchy mogły całkowicie opróżnić swoje pojemniki. Pożądane podwójne zarodki transgeniczne z krzyżówki zostaną złożone na czwartej płytce.

Wyjąć z klatek płytki zawierające pożądane zarodki i pozostawić je do inkubacji do pożądanego stadium rozwojowego w temperaturze pokojowej. Stosuje się tutaj 13-godzinną inkubację. Następnie ponownie zanurz zawartość płytki w około 50 mililitrach wody za pomocą pędzla.

Oddziel zarodki od martwych muszek, przepuszczając płyn przez trzy sita o średnicach 700, 355 i 112 mikronów. Zebrane zarodki przepłukać na sitku o najmniejszej średnicy wodą jonizowaną. Pokryj zarodki w 4,5% wybielaczu w zjonizowanej wodzie przez dwie minuty, a następnie dokładnie spłucz zjonizowaną wodą przez 30 do 60 sekund.

Inkubować zarodki w PBS 0,01% T od 20 do 100 mikrogramów na mililitr. Cyklo heide przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Po wysuszeniu zarodków na celulozowych arkuszach chłonnych przenieś je do probówek do mikrowirówek, następnie zważ probówki i flashuj, zamroź zarodki przez zanurzenie w ciekłym azocie.

Na tym etapie wysuszone zarodki mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Trend przenieś 1,5 grama wysuszonych zarodków do wstępnie schłodzonych 15-mililitrowych probówek, zawierających cztery mililitry ekstrakcji polisomów, buforu i homogenizacji. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 mililitrów.

Następnie rozłóż homogenizowane zarodki w dwóch wstępnie schładzonych, dwumililitrowych probówkach i zmiel zarodki w wielokierunkowym, szybkim młynku do kulek. Ustaw uruchamianie dwa razy przez 10 sekund przy 5 000 obr./min z 15-sekundową przerwą między każdym cyklem. Po 10 minutach wirowania w temperaturze 2000 G przenieść lizat do świeżej, wstępnie schłodzonej mikroprobówki wirówkowej na lodzie.

Dodać 10% non P 40 do supernatantu S do końcowego stężenia 0,1% i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę. Dodać 300 mikromoli DHPC do końcowego stężenia 30 milimolowych i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę. Inkubować mieszaninę na lodzie przez pięć minut, mieszając kilkakrotnie przez odwrócenie podczas inkubacji.

Po inkubacji w lodzie. Przygotować supinat po mitochondriach przez odwirowanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut w temperaturze 20 000 G. Po zmierzeniu stężenia białka metodą Bradforda i uzyskaniu stężenia białka między 60 a 80 miligramów na mililitr, przenieś SNAT do świeżej, wstępnie schłodzonej mikroprobówki wirówkowej i natychmiast przejdź do etapu wstępnej absorpcji. Ponownie zawiesić kulki magnetyczne za pomocą delikatnego mieszania, a następnie przenieść 30 mikrolitrów kulek na każdy mililitr lizatu do mikroprobówki wirówkowej.

Zbierz kulki na magnesie, odpipetuj od ślimaka i ponownie zawieś kulki oraz 500 mikrolitrów buforu do ekstrakcji polisomów. Następnie zbierz koraliki na magnesie. Ponownie dodaj zarodek, lizat i inkubuj przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze.

Usuń kulki i umieść środek leżący na lodzie do momentu etapu oczyszczania immunologicznego. Rezerwując 100 mikrolitrów supinatu jako globalną próbkę RNA do porównania z próbką pobraną po oczyszczeniu immunologicznym w celu immunooczyszczania próbki, dodaj jeden mililitr wstępnie wchłoniętego lizatu do probówki wolnej od RNA zawierającej 90 mikrolitrów zablokowanych kulek sprzężonych z przeciwciałem GFP. Inkubować próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny lub przez noc, delikatnie mieszając koniec po końcu w rotatorze probówkowym po inkubacji.

Umyj koraliki, najpierw odkręcając pozostałe kulki w mini wirówce. Następnie zebrać na magnesie, ponownie zawiesić w 500 mikrolitrach prania, buforować i inkubować w kółko. Zakończ mieszanie na 10 minut w chłodni i ponownie zbierz koraliki na magnesie.

Przenieś kulki do świeżej probówki wolnej od RNA R i umyj jeszcze dwukrotnie. Na koniec, po zebraniu kulek na magnesie, przystąp do ekstrakcji RNA, dodając jeden mililitr TRIOL do kulek i wykonując ekstrakcję zgodnie z instrukcjami producenta. Postępuj zgodnie z tym przez oczyszczanie RNA, używając zestawu RNEZ micro zgodnie z instrukcjami producenta.

Aby przetestować specyficzność uwięzionego RNA, należy przeprowadzić odwrotną transkrypcję na trzech nanogramach oczyszczonego immunologicznie i wejściowego RNA zgodnie ze standardowymi procedurami. Następnie użyj CDNA uzyskanego do QPCR z zestawami starterów specyficznych dla genu. Ten konfokalny obraz zarodka w stadium 16 pokazuje ekspresję RPL 10 A-E-G-F-P, szczególnie w sześciu garbatych komórkach mięśniowych w każdym segmencie HEMI obserwuje się kolokalizację RPL 10 A-E-G-F-P z ogólnym markerem mięśniowym beta trzy tubuliny.

Uwięzione RNA przeprowadzono na bioanalizatorze w celu kontroli jakości. Zwróć uwagę na doskonałą integralność jednego rybosomalnego RNA ósemki i dwóch ósemek. Rysunek ten przedstawia wyniki analizy RT QPCR na trzech replikach biologicznych zarodków w stadium 16 i pokazuje wysoką specyficzność mRNA izolowanego w pułapce.

Zmiana FO została obliczona w porównaniu z danymi wejściowymi i znormalizowana w stosunku do metamfetaminy genu RPL 32. Dwa transkrypty obecne we wszystkich liniach mięśniowych są 2,3-krotnie wzbogacone w porównaniu z danymi wejściowymi, podczas gdy bardziej ograniczone transkrypty garbienia są 5,6-krotnie wzbogacone komórki nerwowe wyrażające prospero i skarpety oraz geny i geny są wyczerpane odpowiednio 2,2 razy i 5,5 razy po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom, szczególnie w dziedzinie biologii rozwojowej, do zbadania zaangażowania w samopomoc i nabywania właściwości komórek podczas różnicowania zarodków door.