Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zapewnienie prostego i niedrogiego podejścia do zbierania zarodków Drosophilia na średnią skalę. Przygotowanie ekstraktów białkowych, które można wykorzystać w dalszych zastosowaniach proteomicznych, takich jak spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji komórkowej i biologii rozwoju.

Na przykład, jak specyficzne białka, interakcje białkowe przeprowadzają komunikację komórkową podczas rozwoju organizmu. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to łatwa i niedroga metoda generowania lizy zarodka Drosophila. Który może być używany do dalszych zastosowań, takich jak oczyszczanie powinowactwa do białek.

Tradycyjnie, naukowcy zbierali zarodki Drosophila w bardzo dużych klatkach populacyjnych. Przedstawiamy jednak przyjazną dla użytkownika procedurę zbierania zarodków w średniej wielkości klatkach, które można łatwo ustawić w dowolnym laboratorium. Po przygotowaniu pięciolitrowych pojemników i wycięciu kwadratów siatki nylonowej o wymiarach 25 na 25 centymetrów, zgodnie z protokołem tekstowym, umieść siatkę na pojemniku i dociśnij pokrywką.

Upewnij się, że siatka jest szczelna, a pokrywa nie jest przechylona. Klatka jest teraz gotowa do zasiedlenia muchami. Po przygotowaniu jednolitrowych plastikowych słoików i kwadratów z nylonowej siatki o wymiarach 18 na 18 centymetrów, umieść siatkę na górnej krawędzi słoika i przykręć pokrywkę, aby dokręcić.

Upewnij się, że siatka jest szczelna, a pokrywa nie jest przechylona. Amplifikacja transgenicznych linii much przenosi typowane białko będące przedmiotem zainteresowania. I przenoś butelki co dwa dni, aż zgromadzi się od 25 do 30 butelek na każdą linię muchową.

Wzmocnij zapas kontrolny w podobny sposób. Następnie podgrzej talerze z sokiem jabłkowym do temperatury pokojowej. Następnie palcem w rękawiczce rozprowadź mokrą pastę drożdżową na środku talerzy.

Wykonanie około sześciocentymetrowego koła na 15-centymetrową płytę. I czterocentymetrowe koło na 10-centymetrową płytę. Po znieczuleniu much i przeniesieniu ich do przygotowanych klatek siatką skierowaną w dół, przykryj klatki talerzami z sokiem jabłkowym.

Pozwól muchom się obudzić. Następnie odwróć klatki i wysiaduj muchy w temperaturze pokojowej przez dwa do trzech dni. Zmieniaj płytki dwa razy dziennie, odwracając klatkę do góry nogami i trzymając płytkę przy klatce, oderwij taśmę od talerza.

Delikatnie postukaj całą klatką o ławkę i szybko zamień starą płytkę na nową, starając się nie dopuścić do ucieczki much. Pozwól muchom złożyć zarodki na talerzach ze świeżym sokiem jabłkowym przez noc lub przez dowolny inny pożądany czas. Następnego ranka oznacz i zważ siatkowe pojemniki do pobrania zarodków.

Po jednym dla każdej użytej żyłki muchowej. Przygotuj 1x bufor do lizy w 50-mililitrowej probówce, używając wcześniej przygotowanych odczynników, dodając 40 mililitrów wody do 10 mililitrów 5x skoncentrowanego buforu do lizy w 50-mililitrowej probówce. Dodać 50 mikrolitrów jednego molowego DTT przy końcowym stężeniu jednego mili molowego.

Dobrze wymieszaj i podziel roztwór na dwie 50-mililitrowe tubki. Do jednej z probówek dodać jedną tabletkę inhibitora proteazy. I umieść rurkę na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 minut.

Podczas rozpuszczania tabletki należy rozpocząć pobieranie zarodków, oznaczając płytki z sokiem jabłkowym na klatkach, z genotypami użytych linii muchowych. I zamień talerze na świeże. Dodaj tyle wody, aby przykryć każdy talerz soku jabłkowego.

Następnie miękkim pędzlem delikatnie usuń zarodki z płytki. Wlej zarodki do wcześniej zważonego i oznaczonego pojemnika siatkowego i spuść nadmiar wody. Następnie krótko osusz siatkę na ręcznikach papierowych, aby usunąć nadmiar wody.

Aby zdekorionować zarodki, wypełnij do połowy sześciocentymetrową szalkę Petriego 50% wybielaczem. Następnie przygotuj dwie większe szalki Petriego z wodą. Zanurz siatkowy pojemnik z zarodkami w 50% wybielaczu na 90 sekund.

Delikatnie postukaj kilka razy w siatkę podczas inkubacji, aby zawiesić zarodki w roztworze wybielacza. Pod koniec inkubacji użyj wody do umycia pojemnika siatkowego w każdym z dwóch naczyń przez około 10 sekund. Następnie użyj wody o średnicy 18,2 megaoma w butelce ze spryskiwaczem, aby dokładnie wypłukać pojemnik z siatki, w tym boki i na zewnątrz.

Po dokładnym umyciu nie powinien być wyczuwalny zapach wybielacza. Osusz pojemnik siatkowy na ręcznikach papierowych. Następnie zważyć pojemnik siatkowy z zarodkami i odjąć wagę pustego pojemnika.

Zapisać uzyskaną masę zarodków. Aby przygotować ekstrakt z zarodka, dodaj jeden mililitr buforu do lizy z inhibitorami proteazy do homogenizatora Dounce glass i trzymaj go na lodzie. Następnie przenieś zarodki z pojemnika siatkowego do homogenizatora.

Użyj jednego mililitra buforu do lizy, aby zmyć pozostałe zarodki z siatki. I dodaj zarodki i bufor do materiału w homogenizatorze. Następnie pozwól zarodkom osiąść na dnie homogenizatora i ostrożnie odessaj supernatant.

Następnie dodaj Lysis Buffer z inhibitorami proteazy do homogenizatora, dążąc do uzyskania od pięciu do sześciu mililitrów Lysis Buffer na gram zarodków. Następnie włóż luźny tłuczek, aby homogenizować zarodki za pomocą czterech do sześciu pociągnięć. Podczas pierwszych uderzeń pojawi się większy opór.

Staraj się poruszać tłuczkiem w ciągłym ruchu, aby uniknąć rozpryskiwania roztworu. Następnie przełącz się na ciasno dopasowany tłuczek. I homogenizuj zarodki za pomocą ośmiu do 10 uderzeń.

Inkubować homogenid na lodzie przez 20 minut. Następnie przenieś homogenid do mikroprobówek wirówkowych. I odwirować w temperaturze 13 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut.

Unikając osadów w górnej warstwie lipidowej, przenieś supernatanty do świeżych mikroprobówek wirówkowych na lodzie. Po powtórzeniu wirowania użyj jednomililitrowej końcówki, aby ostrożnie zebrać supernatanty. I przenieś je do schłodzonych, 10-mililitrowych strzykawek, z dołączonymi filtrami mikrometrycznymi 045.

Wepchnij cały roztwór do oznaczonych dwóch mililitrowych mikroprobówek wirówkowych na lodzie. Zamroź próbki w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Lub natychmiast użyć do eksperymentów z oczyszczaniem białek.

Korzystając z protokołu opisanego w tym filmie, lizaty przygotowano z zarodków Drosophila wszechobecnych w ekspresji białka EGFP-ERK, pod kontrolą promotora arm-odillo. Ekspresja białka została potwierdzona za pomocą Western Blotting dla całkowitego białka ERK w celu jednoczesnego wykrycia poziomów endogennego i transgenicznego EGFP-ERK, migrujących odpowiednio do 42 kilodaltonów i 69 kilodaltonów. W żółto-białej linii kontrolnej wykryto pojedyncze prążki, odpowiadające nieoznakowanemu endogennemu ERK, co potwierdza udaną ekstrakcję ERK i EGFP-ERK z zarodków.

Aby sprawdzić, czy protokół ekstrakcji jest odpowiedni do późniejszego oczyszczania znakowanego białka, ekstrakty z muchy żółtej białej i arm-EGFP-ERK poddano oczyszczaniu powinowactwa przy użyciu kulek agarozy GFP. Barwienie srebrem próbek przebiegniętych na gradientowym SDS-PAGE, pokazuje udane oczyszczanie białka przynęty EGFP-ERK. Oprócz EGFP-ERK, tor eksperymentalny zawierał dodatkowe prążki, których nie zaobserwowano w próbie kontrolnej, co sugeruje, że oczyszczanie pozwoliło odzyskać potencjalne białka oddziałujące z ERK.

Po opanowaniu, pobieranie zarodków i etapy ekstrakcji można wykonać w ciągu około dwóch godzin. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wykonywaniu etapów ekstrakcji na lodzie. I stosowanie inhibitorów proteazy w celu zminimalizowania degradacji białek.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustawić klatki populacji Drosophila na średnią skalę. I wytwarzaj ekstrakty z całych komórek z zarodków.