Name: Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Naucz się przygotowywać ekstrakty białkowe z zarodków Drosophila w skali średniej do badań proteomicznych. Ta prosta metoda umożliwia analizę interakcji białkowych w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują członkom laboratorium Veraksa za pomocne komentarze na temat manuskryptu i sugestie dotyczące ulepszeń protokołu. A.V. było wspierane przez granty NIH GM105813, a NS096402. L.Y. było wspierane przez University of Massachusetts Boston Sanofi Genzyme Doctoral Fellowship.

1. Przygotowanie 5 L Fly Cages (pasujących do płyt 15 cm)
<ol>
	<li>Zdobądź potrzebne materiały: 5-litrowy (4,7-litrowy) pojemnik z pokrywką (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A), nylonową siatkę i żyletkę.</li>
	<li>Zaznacz okrąg o średnicy 12 cm i wytnij otwór w dnie pojemnika za pomocą żyletki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Wytnij otwór o średnicy 15 cm w pokrywie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Pokrój nylonową siatkę na kwadraty o wymiarach 25 x 25 cm.</li>
	<li>Umieść siatkę na górnej krawędzi pojemnika i dociśnij pokrywką (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1C). Upewnij się, że siatka jest szczelna, a pokrywa nie jest przechylona. Klatka jest gotowa do zasiedlenia muchami (patrz krok 5.3).</li>
</ol>
2. Przygotowanie 1 L Fly Cages (pasujących do 10 cm talerzy)
<ol>
	<li>Zaopatrz się w potrzebne materiały: wiertarkę elektryczną, 3-calowe (76 mm) narzędzie tnące (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E i <silna klasa="xfig">Rysunek 1F), prosty plastikowy słoik o pojemności 1 l z pokrywką, nylonową siatkę, żyletkę, papier ścierny, okulary ochronne i rękawice robocze.</li>
	<li>Wytnij 3-calowe (76 mm) otwory w dnie i pokrywce plastikowego słoika (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1G), z pokrywką mocno przykręconą do pojemnika podczas wiercenia. Umieść narzędzie tnące na środku koła, gdy zaczynasz robić otwór. 
	Ostrzeżenie: Podczas tego kroku należy nosić okulary ochronne i rękawice robocze.</li>
	<li>Wygładź krawędzie otworów żyletką i papierem ściernym.</li>
	<li>Pokrój nylonową siatkę na kwadraty o wymiarach 18 x 18 cm.</li>
	<li>Umieść siatkę na górnej krawędzi słoika i dokręć, przykręcając pokrywkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G). Upewnij się, że siatka jest szczelna, a pokrywa nie jest przechylona. Klatka jest gotowa do zasiedlenia muchami (patrz krok 5.3).</li>
</ol>
3. Przygotowanie talerzy z sokiem jabłkowym (AJ)
<ol>
	<li>Dodać 19 g agaru i 1 l wody o pojemności 18,2 MΩ·cm do kolby o pojemności 2 l. Dodaj mieszadło i krótko wymieszaj.</li>
	<li>Autoklaw przez 30 min. W międzyczasie rozmrozić 100% koncentrat soku jabłkowego z zamrożonego wywaru i przygotować 10 ml 10% (wagowo/objętościowo) roztworu 4-hydroksybenzoesanu metylu w etanolu.</li>
	<li>Po autoklawowaniu należy rozpocząć mieszanie agaru na płytce mieszającej i dodać do kolby 80 ml 100% koncentratu soku jabłkowego i 10 ml 10% (wagowo/objętościowo) roztworu 4-hydroksybenzoesanu metylu. Ostudzić w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu.</li>
	<li>Wlać 15 cm szalki Petriego (dla klatek 5 l) lub 10 cm szalki Petriego (dla klatek 1 l) tak, aby poziom agaru w każdym naczyniu miał grubość około 5 mm. Pozostawić do zestalenia w temperaturze pokojowej i zawinąć w plastikowe torby. Płytki AJ można przechowywać w temperaturze 4 °C przez dwa tygodnie. 
	Uwaga: szalki Petriego można myć i używać ponownie.</li>
	<li>Przygotuj mokrą pastę drożdżową: wlej trochę aktywnych suchych drożdży do pojemnika o pojemności 100 ml z pokrywką, która umożliwi łatwe mieszanie, i dodaj wodę w małych ilościach, mieszając, aby uzyskać gęstą, ale dokładnie wymieszaną pastę. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
</ol>
4. Przygotowanie odczynników do lizy
<ol>
	<li>Przygotuj 5x bufor do lizy: 250 mM Tris pH 7,5, 25% glicerol, 1% oktylofenoksy poli(etylenoksy)etanol (IGEPAL CA-630), 7,5 mM MgCl2, 625 mM NaCl, 125 mM NaF, 5 mM Na3VO4.
	<ol>
		<li>Aby przygotować 200 ml: całkowicie rozpuść 1 g proszku NaF i 184 mg proszku Na3VO4 w 71 ml wody, ciągle mieszając. Dodać 50 ml 1 M Tris pH 7,5, 2 ml 100% IGEPAL, 1,5 ml 1 M MgCl2 i 25 ml 5 M NaCl. Następnie dodaj 50 ml glicerolu (dodaj na końcu) i kontynuuj mieszanie przez 1 godzinę.</li>
		<li>Sterylizacja filtra za pomocą jednostek filtrujących o pojemności 250 ml. Ten krok może być powolny, ale filtrowanie roztworu jest ważne, aby usunąć nierozpuszczalne cząstki. Porcję 10 ml rozlać do probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 1 M roztwór ditiotreitolu (DTT) w wodzie. Przechowywać w temperaturze -20 °C w 1 ml porcji.</li>
	<li>Zaopatrz się w tabletki koktajlowe inhibitorów proteazy z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zaopatrzyć się w strzykawki o pojemności 10 ml i filtry strzykawkowe: membrana z octanu celulozy (SFCA) o średnicy 26 mm, wielkość porów 0,45 μm.</li>
</ol>
5. Kolekcja zarodków much
<ol>
	<li>Amplifikuj transgeniczne linie muchowe przenoszące oznaczone białko będące przedmiotem zainteresowania w butelkach (około 100 much na butelkę) i przenoś butelki co 2 dni, aż zgromadzi się 25-30 butelek na każdą linię muchową. W podobny sposób należy wzmocnić zapas kontrolny (np. linię y w).</li>
	<li>Podgrzej talerze AJ do temperatury pokojowej (około 1-2 h, można to zrobić przez noc). Za pomocą palca w rękawiczce rozprowadź mokrą pastę drożdżową na środku talerzy AJ, aby uzyskać ok. 6-centymetrowe kółko na talerz 15 cm i kółko 4 cm na talerz 10 cm.</li>
	<li>Znieczulenie muszek strumieniem dwutlenku węgla za pomocą standardowego zestawu Drosophila i przeniesienie do klatek (ok. 15 dobrze wyrośniętych butelek much na klatkę 5 L, 5 butelek na klatkę 1 L).
	<ol>
		<li>Przykryj dno klatki przygotowanymi płytkami AJ z kroku 5.2 i przyklej płytkę AJ do klatki za pomocą dwóch pasków taśmy (rysunki 1D i 1H). Przydatne jest zagięcie końcówek taśmy, które przechodzą przez płytkę, aby ułatwić obieranie podczas wymiany płytek.</li>
		<li>Po tym, jak muchy wyzdrowieją ze znieczulenia, trzymaj klatki z płytkami na dole i siatką na górze. 
		Uwaga: Ważne jest, aby poczekać, aż muchy w pełni się zregenerują, ponieważ w przeciwnym razie przykleją się do talerza AJ i pasty drożdżowej.</li>
		<li>Pod koniec eksperymentu, aby przygotować klatkę do czyszczenia, umieść klatkę w zamrażarce na kilka godzin. Moczenie siatki w wodzie przez kilka godzin ułatwi czyszczenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubuj klatki z muchami w temperaturze pokojowej przez 2-3 dni i zmieniaj płytki AJ dwa razy dziennie. Aby zmienić talerze, odwróć klatkę do góry nogami, oderwij taśmę od płyty, ale przytrzymaj płytkę do klatki, delikatnie postukaj całą klatką o ławkę i szybko zamień starą płytkę na nową, starając się nie dopuścić do ucieczki much. 
	Uwaga: Muchy muszą przyzwyczaić się do klatki i najlepiej leżą od 3 dnia. Będą nadal leżeć na najwyższym poziomie przez około 4-5 dni. Dwie klatki o pojemności 5 l przy maksymalnej zdolności nieśności mogą wyprodukować do 1 g zarodków w ciągu jednej nocy. Używaj klatek o pojemności 1 l do eksperymentów na mniejszą skalę.</li>
	<li>Pozwól muszkom złożyć zarodki na świeżych płytkach AJ przez noc (ok. 16 godzin) lub przez dowolny inny pożądany okres czasu.</li>
	<li>Następnego ranka oznacz i zważ pojemniki siatkowe do pobrania zarodków, po jednym na każdą użytą żyłkę muchową.</li>
	<li>Przygotować 1x bufor do lizy, używając odczynników z sekcji 4 (Uwaga: gotowy do użycia 1x bufor do lizy musi być przygotowany tuż przed ekstrakcją): dodać 40 ml wody do 10 ml 5x stężonego buforu do lizy (przechowywanego w temperaturze -80 °C) w probówce o pojemności 50 ml.
	<ol>
		<li>Dodać 50 μl 1 M DTT do końcowego stężenia 1 mM, dobrze wymieszać i rozdzielić na dwie probówki o pojemności 50 ml, po 25 ml w każdej. Do jednej z probówek dodać jedną tabletkę inhibitora proteazy i obracać w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Podczas rozpuszczania tabletki należy pobrać i usunąć zarodki z zarodków (etapy od 5.8 do 6.6). Sprawdź, czy tabletka całkowicie się rozpuściła i utrzymuj bufor na lodzie. 
		Uwaga: Druga tuba bufora 1x z naziemną telewizją cyfrową może być przechowywana w temperaturze -80 °C i będzie wymagała jedynie dodania tabletki przed następnym eksperymentem. 25 ml buforu do lizy wystarcza na maksymalnie 2 próbki, biorąc pod uwagę kolejne płukania podczas etapów oczyszczania białka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznacz płytki AJ na klatkach genotypami użytych linek muchowych i zamień płytki na świeże. 
	Uwaga: Na tym etapie nadmiar pasty drożdżowej można zeskrobać z talerza. Zarodki mogą być leżakowane na płytkach w temperaturze 25 °C lub pokojowej, aby uzyskać pożądane okno rozwoju.</li>
	<li>Dodaj tyle wody, aby przykryć każdą płytkę AJ. Delikatnie usuń zarodki z płytki miękkim pędzlem (płaska główka o szerokości ok. 10 mm dobrze sprawdza się w przypadku dużych płytek). Wlej zarodki do wcześniej zważonego i oznaczonego pojemnika siatkowego i spuść nadmiar wody.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby wykonaj drugie płukanie i szczotkowanie płytki, aby usunąć wszystkie zarodki. Połączyć zarodki z dodatkowej płytki (płytek) dla tej samej żyłki muchowej do tego samego pojemnika siatkowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krótko osusz siatkę na ręcznikach papierowych, aby usunąć nadmiar wody.</li>
</ol>
6. Dechorionacja zarodka
<ol>
	<li>Napełnij do połowy 6 cm szalkę Petriego 50% wybielaczem (roztwór obj. w wodzie). 
	Uwaga: Zobacz ważny komentarz na temat marki wybielacza w Tabeli materiałów i odczynników. 
	Uwaga: Noś rękawiczki i unikaj wybielania ubrań.</li>
	<li>Przygotuj 2 większe szalki Petriego z wodą.</li>
	<li>Zanurz siatkowy pojemnik z zarodkami w 50% wybielaczu na 90 s. Podczas inkubacji delikatnie postukaj w siatkę, aby zawiesić zarodki w roztworze wybielacza.</li>
	<li>Pod koniec inkubacji 90 s myj pojemnik siatkowy w każdym z 2 naczyń wodą przez około 10 s.</li>
	<li>Dokładnie wypłucz pojemnik siatkowy wodą o mocy 18,2 MΩ·cm za pomocą butelki ze spryskiwaczem. Umyj również boki i zewnętrzną stronę pojemnika siatkowego. 
	Uwaga: Po dokładnym praniu nie powinien być wyczuwalny zapach wybielacza.</li>
	<li>Osusz pojemnik siatkowy na ręcznikach papierowych. Zważyć pojemnik siatkowy z zarodkami i odjąć wagę pustego pojemnika otrzymaną w kroku 5.6. Zapisać uzyskaną masę zarodków. Dobra ilość zarodków, do których należy dążyć, to 0,5 - 1 g.</li>
</ol>
7. Przygotowanie ekstraktu z zarodka
<ol>
	<li>Dodać 1 ml buforu do lizy z inhibitorami proteazy (z kroku 5.7) do homogenizatora ze szkła odbijanego i trzymać na lodzie. Przenieść zarodki z pojemnika siatkowego do homogenizatora. 
	Uwaga: Zarodki można pobrać płaskim końcem metalowej szpatułki lub szczoteczki i przenieść bezpośrednio do bufora. Wykonaj wszystkie czynności opisane w tej sekcji na lodzie.</li>
	<li>Pozostałe zarodki na siatce zmyć dodatkowym 1 ml buforu do lizy i dodać do materiału w homogenizatorze. Pozwól zarodkom osiądnąć na dnie homogenizatora i ostrożnie odessać supernatant.</li>
	<li>Dodać bufor do lizy z inhibitorami proteazy (z kroku 5.7) do homogenizatora, dążąc do uzyskania 5-6 ml buforu do lizy na gram zarodków.</li>
	<li>Homogenizować zarodki przez 4-6 pociągnięć luźnym tłuczkiem. 
	Uwaga: Podczas pierwszych pociągnięć będzie większy opór. Staraj się przesuwać tłuczek w ciągłym ruchu, aby uniknąć rozpryskiwania roztworu.</li>
	<li>Homogenizuj zarodki przez 8-10 uderzeń ciasno dopasowanym tłuczkiem.</li>
	<li>Inkubować homogenat na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Przenieść homogenat do probówek do mikrowirówek i wirować w temperaturze 4 °C przez 15 minut z maksymalną prędkością (ok. 13 000 x g).</li>
	<li>Unikając osadów i wierzchniej warstwy lipidowej, przenieść supernatanty do świeżych probówek do mikrowirówek i wirować w temperaturze 4 °C przez 15 minut z maksymalną prędkością (ok. 13 000 x g).</li>
	<li>Ostrożnie zassać supernatanty końcówką o pojemności 1 ml i załadować do schłodzonych strzykawek o pojemności 10 ml z dołączonymi filtrami 0,45 μm (połączyć podwielokrotności tej samej próbki w jednej strzykawce). Wciśnij cały roztwór do oznaczonej 15 ml probówki na lodzie. Ekstrakt może być natychmiast wykorzystany do kolejnych eksperymentów z oczyszczaniem białka lub zamrożony w ciekłym azocie i przechowywany w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. 
	Uwaga: Lepiej jest zamrozić ekstrakty niż zarodki, ponieważ podczas późniejszego rozmrażania zarodków proteazy mogą się aktywować i prowadzić do degradacji białek.</li>
</ol>

<ol><li>Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+developmental+processes%3A+insights+from+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).</li>
<li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction%3A+mass+spectrometry-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).</li>
<li>Arbeitman, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+during+the+life+cycle+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster.</a> Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).</li>
<li>Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transcription+of+the+Drosophila+engrailed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene.</a> Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).</li>
<li>Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soluble+nuclear+fraction%2C+a+highly+efficient+transcription+extract+from+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos.</a> Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).</li>
<li>Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+affinity+purification+in+Drosophila%3A+The+advantages+of+the+GS-TAP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system.</a> Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).</li>
<li>Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raising+large+quantities+of+Drosophila+for+biochemical+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments.</a> Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).</li>
<li>Sisson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+large+populations+of+Drosophila+for+protein+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Caravaca, J. M., Lei, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+a+Drosophila+melanogaster+Population+Cage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minibrain+and+Wings+apart+control+organ+growth+and+tissue+patterning+through+down-regulation+of+Capicua%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).</li>
<li>Neumuller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stringent+analysis+of+gene+function+and+protein-protein+interactions+using+fluorescently+tagged+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes.</a> Genetics. 190 (3), 931-940 (2012).</li>
<li>Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+complexes+in+Drosophila+with+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).</li>
<li>Mukherjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Notch+signalling+by+non-visual+beta-arrestin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin.</a> Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).</li>
<li>Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Screen+for+Conditional+Growth+Suppressor+Genes+Identifies+the+Drosophila+Homolog+of+HD-PTP+as+a+Regulator+of+the+Oncoprotein+Yorkie%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie.</a> Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).</li>
<li>Anjum, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Toll+Signaling+and+Inflammation+by+beta-Arrestin+and+the+SUMO+Protease+Ulp1%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1.</a> Genetics. 195 (4), 1307-1317 (2013).</li>
<li>Degoutin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riquiqui+and+minibrain+are+regulators+of+the+hippo+pathway+downstream+of+Dachsous%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous.</a> Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecdysone+receptor+coactivator+Taiman+links+Yorkie+to+transcriptional+control+of+germline+stem+cell+factors+in+somatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue.</a> Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).</li>
<li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+by+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell signaling by receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li>
<li>Vincent, J. P., Girdham, C. H., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-autonomous%2C+ubiquitous+marker+for+the+analysis+of+Drosophila+genetic+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics.</a> Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).</li>
<li>Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+Drosophila+melanogaster+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos.</a> J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).</li>
<li>Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+to+isolate+ubiquitin+conjugates+reveals+wide+role+for+ubiquitination+during+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).</li>
<li>Ramirez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+the+Ubiquitin+Landscape+in+the+Drosophila+Embryonic+Nervous+System+and+the+Adult+Photoreceptor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells.</a> PLoS One. 10 (10), 0139083(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół jest prostą i ogólną procedurą tworzenia klatek dla populacji Drosophila na średnią skalę i wytwarzania ekstraktów białkowych z całych komórek z zarodków. Uzyskane ekstrakty mogą być wykorzystywane w różnych dalszych zastosowaniach, takich jak oczyszczanie kompleksów białkowych na żywicach o powinowactwie. Bardzo ważne jest, aby przeprowadzić etapy ekstrakcji na lodzie i zastosować silne hamowanie proteazy, aby zminimalizować degradację białek. Zgodnie z opisem, protokół jest odpowie...

Badania genetyczne, a ostatnio także podejścia genomiczne zrewolucjonizowały badania nad funkcjami biologicznymi. Jednak ważne informacje komórkowe są kodowane w białkach i ich zespole oddziałujących partnerów. Podczas gdy tradycyjne badania przesiewowe modyfikatorów genetycznych mogą identyfikować składniki szlaku ograniczające szybkość i odzyskiwać interakcje pośrednie, siła podejść proteomicznych polega na ich zdolności do identyfikacji kompletnych sieci natychmiastowych interakcji białek będących przedmiotem zainteresowania. Proteomika jest zatem cenną ortogonalną metodą badania systemów biologicznych i uzupełnia genomikę, transkryptomikę i tradycyjne genetyczne badania przesiewowe. Spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS) okazała się skutecznym podejściem do badania interakcji białko-białko (PPI) w ich naturalnym środowisku w komórkach i tkankach1,2. Metoda ta pozwala na identyfikację bezpośrednich lub pośrednich interakcji na określonych etapach rozwoju lub w kontekstach tkankowych i została z powodzeniem wykorzystana do identyfikacji wielu nowych IPP w różnych ścieżkach rozwojowych (recenzja w reference1). Pomimo niekwestionowanego sukcesu badań IPP, większość z nich przeprowadzono w hodowanych komórkach, w których interesujące nas białka "przynęty" wykazywały nadekspresję. Istnieją dwa problemy związane z badaniem IPP w hodowli komórkowej: po pierwsze, określona linia komórkowa może nie zapewniać pełnego zestawu interakcji z powodu braku ekspresji niektórych białek. Po drugie, wysoka nadekspresja zwykle stosowana w takich analizach może prowadzić do artefaktów, takich jak nieprawidłowe fałdowanie białek lub identyfikacja interakcji fałszywie dodatnich.
Oba te ograniczenia można przezwyciężyć poprzez analizę IPP in vivo. Ograniczeniem w takich eksperymentach jest dostępność materiału wyjściowego do oczyszczania kompleksów białkowych. Drosophila melanogaster od dawna jest wykorzystywana jako model do analizy funkcjonalnej, a ostatnio wykazano również, że jest doskonałym systemem do badania IPP in vivo. Embriogeneza Drosophila stanowi szczególnie atrakcyjny typ tkanki do badania IPP, ponieważ zarodki mogą być łatwo pobierane w dużych ilościach, a także dlatego, że większość genów (>88%) ulega ekspresji w trakcie embriogenezy, zapewniając w ten sposób bogate środowisko in vivo do wykrywania odpowiednich IPP3.
Tradycyjnie, badania biochemiczne na muszkach wykorzystywały bardzo duże zbiory zarodków (100-150 g), takie jak te niezbędne do oczyszczania funkcjonalnych lizatów transkrypcyjnych4,5. Poprzednie badania AP-MS na Drosophila również wymagały dużych ilości zarodków (5-10 g), ponieważ opierały się na dwuetapowym podejściu do oczyszczania, takim jak tandemowe oczyszczanie powinowactwa (TAP), z towarzyszącą utratą materiału na każdym etapie6. Duże ilości materiału wyjściowego wymagały założenia kolekcji zarodków w klatkach dla dużych populacji, co może być zarówno kosztowne (przy zakupie komercyjnym), jak i czasochłonne w utrzymaniu i czyszczeniu7,8,9.
Ostatnie postępy w rozwoju jednoetapowych metod oczyszczania powinowactwa, jak również rosnąca czułość spektrometrów masowych, zredukowały niezbędną ilość materiału wyjściowego o rząd wielkości. Korzystając z tagów, takich jak peptyd wiążący streptawidynę (SBP) lub białko zielonej fluorescencji (GFP) i zaczynając od mniej niż 1 g zarodków, możliwe jest wyizolowanie ilości białka przynęty i oddziałujących składników, które byłyby wystarczające do identyfikacji za pomocą spektrometrii mas10,11.
Celem przedstawionego tutaj protokołu jest pomoc naukowcom w pokonaniu postrzeganej bariery dla biochemicznej analizy IPP in vivo. W tym celu zapewniamy prostą i niedrogą procedurę pobierania zarodków Drosophila w średniej skali (0,5-1 g), a następnie jednoetapowe przygotowanie ekstraktów białkowych z całych komórek, które nadają się do późniejszej analizy za pomocą AP-MS lub innych metod. Nasza metoda opiera się na wykorzystaniu niestandardowych klatek populacyjnych o pojemności 1 l lub 5 l, które mogą być łatwo wyprodukowane przez każde laboratorium. Co więcej, przedstawione tutaj warunki ekstrakcji zostały zweryfikowane w kilku badaniach, zarówno w hodowanych komórkach, jak i in vivo10,12,13,14,15,16,17.

<table><tbody><tr><td>Leaktite 5-Qt. Naturalny pojemnik Multi Mix (zestaw 3 szt)</td><td>Home Depot</td><td>209330</td><td>Do produkcji klatek 5-L.</td></tr><tr><td>Leaktite 5-Qt. Naturalna pokrywa Multi Mix (zestaw 3 sztuk)</td><td>Home Depot</td><td>209320</td><td>Średnica 8.37 cala Pokrywy do klatek 5 L.</td></tr><tr><td>Szalki Petriego Fisherbrand z przezroczystą pokrywką, 100 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Materiał: polistyren. Do stosowania z klatkami o pojemności 1 l.</td></tr><tr><td>Szalki Petriego Fisherbrand z przezroczystą pokrywką, 150 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td>Materiał: polistyren. Do stosowania z klatkami 5-L.</td></tr><tr><td>Szalki Petriego Fisherbrand z przezroczystą pokrywką, 60 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td>Materiał: polistyren. Stosowany podczas dechorionacji zarodka.</td></tr><tr><td>Siatka nylonowa Sefar NITEX</td><td>Sefar</td><td>03-180/44</td><td>180 mikronów, 44% otwarta przestrzeń, stosowana do klatek na muchy.</td></tr><tr><td>Milwaukee 3 w. Otwornica spycharka Otwornica z trzpieniem</td><td>Home Depot</td><td>49-56-9670</td><td>3-calowe narzędzie tnące do wykonywania klatek 1-L.</td></tr><tr><td>Nalgene Słoiki PMP z szerokimi ustami i białym polipropylenowym zamknięciem</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-823-33</td><td>Do produkcji klatek 1-L. Kot Thermo Scientific # 21171000. Można zastosować alternatywne pojemniki o pojemności 1 l.</td></tr><tr><td>Aktywne suche drożdże Red Star, woreczek 2 funty</td><td>Red Star&nbsp;</td><td></td><td>można kupić od Amazon.com lub od innych dostawców.</td></tr><tr><td>Mrożony 100% koncentrat soku jabłkowego&nbsp;</td><td></td><td></td><td>można kupić w sklepie spożywczym. Na puszce musi być napisane "100% sok jabłkowy".</td></tr><tr><td>4-hydroksybenzoesan metylu</td><td>Acros Organics</td><td>AC126965000</td><td>znany również jako methylparaben lub Tegosept. Stosowany jako środek konserwujący w płytkach AJ.</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 do biologii molekularnej, 100 ml</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>służy do przygotowania buforu do lizy.</td></tr><tr><td>Sterylne jednorazowe jednostki filtrujące Nalgene o szybkim przepływie z membraną CN&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-2A</td><td>0.2 &mu; m wielkość porów. Służy do filtrowania 5x buforu do lizy. Kot Thermo Scientific # 1260020.</td></tr><tr><td>CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma</td><td>11697498001</td><td>fiolka z 20 tabletkami. Służy do hamowania proteazy w buforze do lizy.</td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe Corning SFCA&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-21</td><td>Membrana SFCA, średnica 26 mm, wielkość porów 0,45 &mu;m. Służy do filtrowania końcowych próbek ekstraktu.</td></tr><tr><td>BD&nbsp; Jednorazowe strzykawki Luer-Lok bez igieł</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2A</td><td>do filtrowania końcowych próbek ekstraktu. BD kot # 309604.</td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td>Clorox</td><td></td><td>stosowany do dechorionacji zarodków w stężeniu 50% (vol/vol) w wodzie, można kupić w każdym supermarkecie. Ważne jest, aby używać marki Clorox, ponieważ inne marki mogą powodować niepełną dechorionację lub mogą być toksyczne dla zarodków.</td></tr><tr><td>Corning Costar Netwell Plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-213</td><td>pojemniki siatkowe do pobierania zarodków. 74 &mu; m rozmiar oczek, 6-dołkowy.</td></tr><tr><td>Młynki do tkanek Wheaton Dounce, pojemność 15 ml</td> Homogenizator do zarodków <td>Fisher Scientific</td><td>06-435B</td><td>, z luźnymi i szczelnymi tłuczkami. Kot Wheaton # 357544.</td></tr></tbody></table>

przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków drosophila do eksperymentów proteomicznych

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analiza interakcji białko-białko (PPI) stała się nieodzownym podejściem do badania procesów biologicznych i mechanizmów, takich jak sygnalizacja komórkowa, rozwój organizmu i choroby. Często pożądane jest uzyskanie informacji o IPP przy użyciu materiału in vivo, aby uzyskać najbardziej naturalny i bezstronny obraz sieci interakcji. Muszka owocowa Drosophila melanogaster jest doskonałą platformą do badania IPP in vivo i nadaje się do prostego podejścia do izolowania materiału do eksperymentów biochemicznych. W szczególności zarodki muszek owocowych stanowią dogodny rodzaj tkanki do badania IPP, ze względu na łatwość pobierania zwierząt na tym etapie rozwoju oraz fakt, że większość białek ulega ekspresji w embriogenezie, zapewniając w ten sposób odpowiednie środowisko do ujawnienia większości IPP. Poniżej przedstawiamy protokół pobierania zarodków Drosophila w średniej skali (0,5-1 g), który jest idealną ilością do szerokiego zakresu zastosowań proteomicznych, w tym do analizy IPP metodą spektrometrii mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS). Opisujemy nasze projekty klatek o pojemności 1 l i 5 l do pobierania zarodków, które można łatwo i niedrogo ustawić w dowolnym laboratorium. Zapewniamy również ogólny protokół pobierania zarodków i ekstrakcji białek w celu wytworzenia lizatów, które mogą być bezpośrednio wykorzystane w dalszych zastosowaniach, takich jak AP-MS. Naszym celem jest zapewnienie wszystkim badaczom dostępnych środków do przeprowadzania analiz IPP in vivo.

Aby zilustrować zastosowanie niniejszego protokołu w eksperymencie oczyszczania kompleksu białkowego, wygenerowano homozygotyczną, żywotną linię much arm-EGFP-ERK, wykazującą ekspresję z oznakowanej EGFP kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym Drosophila (ERK, kodowanej przez gen rolled) pod kontrolą powszechnie eksprimowanego promotora armadillo (arm)18,19. Promotor arm...

Celem tego protokołu jest zapewnienie prostego i taniego podejścia do zbierania zarodków Drosophila na średnią skalę (0,5-1 g) i przygotowywania ekstraktów białkowych, które mogą być używane w dalszych zastosowaniach proteomicznych, takich jak spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS).

Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest przedstawienie prostego i niedrogiego podejścia do pozyskiwania zarodków Drosophila w średniej skali oraz przygotowywania ekstraktów białkowych, które mogą być wykorzystane w dalszych analizach proteomicznych, takich jak spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach sygnalizacji komórkowej i biologii rozwoju.Na przykład, w jaki sposób konkretne białka oraz oddziaływania białko-białko realizują komunikację komórkową podczas rozwoju organizmu. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to łatwa i niedroga metoda przygotowania lizatu embrionów Drosophila, który może być wykorzystany w dalszych zastosowaniach, takich jak oczyszczanie białek metodą powinowactwa.Tradycyjnie badacze zbierali zarodki Drosophila w bardzo dużych klatkach populacyjnych. Przedstawiamy jednak przyjazną dla użytkownika procedurę zbierania zarodków w klatkach średniej wielkości, które można łatwo przygotować w każdym laboratorium. Po przygotowaniu pięciolitrowych pojemników i wycięciu kwadratów z nylonowej siatki o wymiarach 25 na 25 centymetrów, zgodnie z protokołem tekstowym, należy położyć siatkę na pojemniku i docisnąć ją pokrywką.Upewnij się, że siatka jest napięta, a pokrywka nie jest przechylona. Klatka jest teraz gotowa do zasiedlenia przez muchy. Po przygotowaniu plastikowych słoików o pojemności jednego litra i nylonowych kwadratów z siatki o wymiarach 18 na 18 centymetrów, nałóż siatkę na górną krawędź słoika i zakręć pokrywką, aby ją mocno przymocować.Upewnij się, że siatka jest ściśnięta, a pokrywka nie jest przechylona. Namnóż linie much transgenicznych niosących badane białko. Przenoś muchy do nowych butelek co dwa dni, aż do momentu zgromadzenia od 25 do 30 butelek dla każdej linii.Namnóż zapas kontrolny w podobny sposób. Następnie ogrzej płytki z sokiem jabłkowym do temperatury pokojowej. Potem, używając palca w rękawiczce, nanieś niewielką ilość wilgotnej pasty drożdżowej na środek płytek.Przygotowanie koła o średnicy około 6 cm dla płytki o średnicy 15 cm oraz koła o średnicy 4 cm dla płytki o średnicy 10 cm. Po znieczuleniu much i przeniesieniu ich do przygotowanych klatek z siatką skierowaną w dół, należy przykryć klatki płytkami z soku jabłkowym.Pozostaw muchy do czasu ich wybudzenia. Następnie odwróć klatki i inkubuj muchy w temperaturze pokojowej przez dwa do trzech dni. Wymieniaj podłoża dwa razy dziennie: odwróć klatkę do góry dnem i, przytrzymując płytkę przy klatce, odklej taśmę od płytki.Delikatnie opukaj całą klatkę o blat i szybko zamień starą płytkę na nową, starając się nie dopuścić do ucieczki much. Pozostaw muchy na noc lub na inny wybrany czas, aby złożyły embriony na świeżych płytkach z sokiem jabłkowym. Następnego dnia rano oznakuj i zważ pojemniki z siatką służące do zbierania embrionów.Jedna probówka dla każdej użytej linii much. Przygotować 1x bufor do lizy w probówce o pojemności 50 ml, korzystając z wcześniej przygotowanych odczynników, poprzez dodanie 40 ml wody do 10 ml 5x stężonego buforu do lizy w probówce o pojemności 50 ml. Dodać 50 µL 1 M DTT do stężenia końcowego 1 mM.Dobrze wymieszać i podzielić roztwór pomiędzy dwie probówki o pojemności 50 ml. Do jednej z probówek dodać jedną tabletkę inhibitora proteaz. Następnie umieścić probówkę w rotatorze w temperaturze 4°C na 30 minut.Podczas rozpuszczania tabletki należy rozpocząć zbieranie embrionów, oznakując płytki z sokiem jabłkowym w klatkach zgodnie z genotypami użytych linii muszek. Następnie należy wymienić płytki na nowe i dolać odpowiednią ilość wody, aby pokryła każdą płytkę z sokiem jabłkowym.Następnie za pomocą miękkiego pędzla delikatnie oddziel zarodki od płytki. Przelej zarodki do wcześniej zważonego i oznakowanego pojemnika z siatką i odlej nadmiar wody. Następnie krótko osusz siatkę ręcznikami papierowymi, aby usunąć pozostałą wodę.Aby zdechorionować embriony, napełnij do połowy szalkę Petriego o średnicy sześciu centymetrów 50% wybielaczem. Następnie przygotuj dwie większe szalki Petriego z wodą. Zanurz pojemnik z siatką z embrionami w 50% wybielaczu na 90 sekund.Podczas inkubacji delikatnie kilkukrotnie stuknij w siatkę, aby zawiesić embriony w roztworze wybielacza. Po zakończeniu inkubacji opłucz wodą pojemnik z siatką w obu naczyniach przez około 10 s. Następnie, używając butelki z atomizerem z wodą o oporności 18,2 megohm cm, dokładnie wypłucz pojemnik z siatką, wliczając w to boki i zewnętrzną stronę.Po dokładnym przemyciu nie powinno być wyczuwalnego zapachu wybielacza. Osusz pojemnik z siatką za pomocą ręczników papierowych. Następnie zważ pojemnik z siatką wraz z embrionami i odejmij wagę pustego pojemnika.Zanotuj uzyskaną wagę embrionów. Aby przygotować ekstrakt z embrionów, dodaj 1 ml buforu lizującego z inhibitorami proteaz do szklanego homogenizatora Dounce'a i przechowuj go na lodzie. Następnie przenieś embriony z pojemnika z siatką do homogenizatora.Użyj 1 mL Buforu do Lizy, aby wypłukać pozostałe embriony z siatki. Następnie przenieś embriony wraz z buforem do homogenizatora. Pozostaw embriony do czasu, aż opadną na dno homogenizatora, a następnie ostrożnie odessij nadsącz.Następnie do homogenizatora należy dodać bufor do lizy z inhibitorami proteaz, dążąc do uzyskania od pięciu do sześciu mililitrów buforu do lizy na gram zarodków. Następnie należy włożyć luźno dopasowany tłuczek, aby zhomogenizować zarodki za pomocą czterech do sześciu ruchów. Podczas pierwszych ruchów opór będzie większy.Staraj się poruszać tłuczkiem w sposób ciągły, aby uniknąć rozpryskiwania roztworu. Następnie zmień tłuczek na taki, który ściśle dopasowuje się do naczynia. Homogenizuj zarodki, wykonując od ośmiu do 10 ruchów.Inkubuj homogenizat na lodzie przez 20 minut. Następnie przenieś homogenizat do probówek do mikrowirówki i wiruj przy 13 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.Unikając osadów znajdujących się w najwyższej warstwie lipidowej, przenieś nadsączniki do nowych probówek do mikrowirówki w lodzie. Po powtórzeniu wirowania użyj końcówki o pojemności 1 ml, aby ostrożnie zebrać nadsączniki. Następnie przenieś je do schłodzonych strzykawek o pojemności 10 ml z dołączonymi filtrami 0,45 µm.Przenieś cały roztwór do opisanych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL umieszczonych w lodzie. Przenieś próbki w stan gwałtownego zamrożenia w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C. Alternatywnie wykorzystaj je niezwłocznie do eksperymentów z oczyszczania białek.Zgodnie z protokołem opisanym w tym filmie, przygotowano lizaty z embrionów Drosophila powszechnie eksponujących białko EGFP-ERK pod kontrolą promotora arm-odillo. Ekspresję białka potwierdzono za pomocą metody Western Blotting dla całkowitego białka ERK, aby jednocześnie wykryć poziomy endogennego i transgenicznego EGFP-ERK, które migrują odpowiednio przy 42 kilodaltonach i 69 kilodaltonach. W linii kontrolnej yellow white wykryto pojedynczy prążek odpowiadający nieoznaczonemu endogenicznemu ERK, co potwierdziło skuteczną ekstrakcję ERK i EGFP-ERK z embrionów.Aby sprawdzić, czy protokół ekstrakcji nadaje się do późniejszego oczyszczania białka z etykietą, ekstrakty z much yellow white oraz arm-EGFP-ERK poddano oczyszczaniu powinowactwa przy użyciu kulek GFP Agarose. Barwienie srebrem próbek rozdzielonych w gradientowym SDS-PAGE wykazało skuteczne oczyszczenie białka przynęty EGFP-ERK. Oprócz EGFP-ERK w ścieżce eksperymentalnej pojawiły się dodatkowe prążki, których nie zaobserwowano w próbce kontrolnej, co sugeruje, że proces oczyszczania pozwolił na odzyskanie potencjalnych białek oddziałujących z ERK.Po opanowaniu techniki, etapy pobierania embrionów i ekstrakcji można przeprowadzić w ciągu około dwóch godzin. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby etapy ekstrakcji przeprowadzać w lodzie oraz stosować inhibitory proteaz w celu zminimalizowania degradacji białek.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować klatki dla populacji Drosophila w średniej skali oraz jak przygotować ekstrakty białek całokomórkowych z embrionów.

medium-scale-preparation-drosophila-embryo-extracts-for-proteomic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy proces utrwalania, zatapiania, krojenia i obrazowania późnych stadiów embrionów Drosophila do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu badania embrionalnej rurki serca. Technika ta umożliwia wizualizację światła rurki serca, a także błony podstawnej wyścielającej światło serca.

Przygotowanie embrionów do mikroskopii elektronowej rurki serca embrionów Drosophila

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Wieloskładnikowe kompleksy białkowe odgrywają kluczową rolę podczas funkcjonowania i rozwoju komórek. W tym miejscu opisujemy metodę stosowaną do izolowania natywnych kompleksów białkowych z zarodków Drosophila po sieciowaniu in vivo, a następnie oczyszczeniu usieciowanych kompleksów w celu późniejszej analizy strukturalno-funkcjonalnej.<br...

Sieciowanie in vivo w celu wyizolowania kompleksów białkowych z zarodków Drosophila

Wprowadzenie małych cząsteczek do rozwijającego się zarodka Drosophila daje ogromne możliwości do charakteryzowania aktywności biologicznej nowych związków, leków i toksyn, a także do badania podstawowych ścieżek rozwojowych. Opisane tu metody nakreślają kroki, które pokonują naturalne bariery dla tego podejścia, rozszerzając użyteczność modelu zarodka Drosophila.

Metoda przenikania zarodków Drosophila do oznaczania aktywności drobnocząsteczkowej

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić specyficzną dla typu komórki translację mRNA. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony izolacji mRNA w rzadkich populacjach komórek zarodków Drosophila.

TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Tutaj opisujemy protokół wykrywania i lokalizacji białka zarodka Drosophila i RNA od pobrania do wstępnego osadzenia i osadzenia, barwienia immunologicznego i hybrydyzacji mRNA in situ.

Protokół immunohistochemii i dystrybucji RNA in-situ we wczesnym zarodku Drosophila

Tutaj przedstawiono protokół implementacji mikroskopii ekspansywnej we wczesnych zarodkach Drosophila w celu uzyskania obrazowania w superrozdzielczości przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Naucz się przygotowywać ekstrakty białkowe z zarodków Drosophila w skali średniej do badań proteomicznych. Ta prosta metoda umożliwia analizę interakcji białkowych w biologii rozwoju.

Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych

Przeglądaj więcej filmów