Ulepszony protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy pod względem czasu i pracy

Pierwotne hepatocyty myszy są ważne w badaniach wątroby. Zwłaszcza do metabolizmu glukozy i testowania leków w wątrobie. Biorąc pod uwagę czas, proces izolacji może być czasochłonny, a energia kosztowna.

Protokół ten może zapewnić skuteczny sposób izolowania pierwotnych hepatocytów myszy. Jest przyjazny dla czasu i pracy. Wymaga to bardzo niewielu kroków, ponieważ wszystkie regiony są dostępne na rynku.

Zacznij od użycia pompy perystaltycznej, aby rozpocząć pompowanie podgrzanej podwójnie destylowanej wody z prędkością 4 ml na minutę przez pięć minut. Następnie zmień rurkę pompującą z wody na podgrzane medium perfuzyjne. Monitorowanie pęcherzyków powietrza między wodą a medium perfuzyjnym.

Pomoże śledzić przepływ medium perfuzyjnego przez system. Następnie zdezynfekuj brzuch znieczulonej ośmiotygodniowej czarnej samicy myszy C57 6J za pomocą 70% etanolu. I za pomocą nożyczek rozetnij brzuch, aby odsłonić wątrobę, żyłę wrotną i żyłę główną dolną.

Następnie zatrzymaj pompę perystaltyczną. Po upewnieniu się, że rurka pompująca zawiera medium perfuzyjne, a nie wodę. Wprowadzić cewnik o rozmiarze 24 do żyły głównej dolnej.

Ponownie włącz pompę i otwórz żyłę wrotną. Podczas pompowania pożywki perfuzyjnej należy co minutę naciskać żyłę wrotną, aby płyn dotarł do każdego zakątka wątroby. Kontynuuj pompowanie przez około trzy do pięciu minut lub do momentu, gdy wypłukany płyn będzie klarowny.

Następnie zmienić rurkę pompującą z pożywki perfuzyjnej na pożywkę do dyspazy kolagenazy. I naciskaj żyłę wrotną co minutę, aby płyn dotarł do każdego zakątka wątroby. Kontynuować pompowanie, aż wszystkie 25 ml pożywki do dyspazy kolagenazy zostanie wyczerpane.

Następnie odizoluj całą wątrobę bez pęcherzyka żółciowego. I umieścił go w 30 ml pożywki myjącej na szalce Petriego na lodzie. Za pomocą kleszczy rozerwij wątrobę na kawałki, aby uwolnić pierwotne hepatocyty do roztworu.

Na tym etapie pożywka płucząca zamienia się w mętny roztwór zawierający uwolnione pierwotne hepatocyty i małe kawałki wątroby. Przefiltruj ten mętny roztwór przez sitko o wielkości 70 mikronów, do 20 ml 1X na połączenie HBSS w probówce o pojemności 50 ml na lód. I wymieszaj roztwór, odwracając rurkę 20 razy.

Następnie odwirować roztwór. Następnie w kapturze do hodowli tkankowej odessać supernatant. I umyj granulkę 30 ml zimnego środka do mycia.

Ponownie zagnieździć komórki za pomocą wirowania. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 25 ml pożywki hodowlanej. Policz komórki i umieść je na żądanych płytkach hodowlanych.

Zgodnie z projektem eksperymentalnym. Po posianiu izolowane hepatocyty pierwotne były mocno połączone przez godzinę i w pełni rozprężone po 12 godzinach. W izolowanych hepatocytach poziomy mRNA markerów hepatocytów, takich jak transtyretyna, CD95, ASGR1 i ASGR2, były znacznie zwiększone w porównaniu z całą wątrobą.

Natomiast obecność komórek odpornościowych, gwiaździstych i komórek śródbłonka była niższa. Świadczy o tym gwałtowny spadek poziomu mRNA CD45, kolagenu typu 1 alfa 1 i kinazy 2 komórek śródbłonka. Sugeruje to, że ten protokół może znacznie zmniejszyć zakłócenia ze strony innych komórek wątroby.

Po posianiu poziomy ASGR1 i ASGR2 zmniejszały się z czasem, ale pozostają porównywalne dla całej wątroby do 12-godzinnego punktu czasowego. Specjalnie dla ASGR1. Poziom ekspresji CD81 związanego z błoną był stały przez okres do 48 godzin.

Dla porównania, ekspresja receptora toll-podobnego 4 ogólnie wzrosła i stała się wyższa niż w przypadku in vivo po 48 godzinach. Testy wrażliwości na insulinę wykazały, że insulina znacząco sprzyjała fosforylacji obu AKT przy serynie 473. I pudełko widełkowe 01 przy serynie 256, w hepatocytach.

Wskazując na wrażliwość hepatocytów pierwotnych na insulinę. Poziom białka karboksykinazy fosfoenolopirogronianu znacznie wzrósł po leczeniu glukagonem. Sugeruje to, że szlak produkcji glukozy został aktywowany.

Aktywacja ta została dodatkowo potwierdzona zwiększoną produkcją glukozy. Oraz z innymi stymulatorami produkcji glukozy, takimi jak Forskolina + IBMX. Protokół ten może zaoszczędzić zarówno czas, jak i energię na badania z wykorzystaniem pierwotnych hepatocytów myszy.

Zgodnie z tym protokołem można przeprowadzić powiązane eksperymenty, takie jak hipotetyczny metabolizm glukozy i testy biomarkerów farmaceutycznych.