Ulepszony protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy pod względem czasu i pracy
25 października 2021
Pierwotne hepatocyty są cennym narzędziem do badania reakcji wątroby i metabolizmu in vitro. Wykorzystując dostępne na rynku odczynniki, opracowano ulepszony, efektywny czasowo i pracochłonnie protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy.
Pierwotne hepatocyty myszy są ważne w badaniach wątroby. Zwłaszcza do metabolizmu glukozy i testowania leków w wątrobie. Biorąc pod uwagę czas, proces izolacji może być czasochłonny, a energia kosztowna.
Protokół ten może zapewnić skuteczny sposób izolowania pierwotnych hepatocytów myszy. Jest przyjazny dla czasu i pracy. Wymaga to bardzo niewielu kroków, ponieważ wszystkie regiony są dostępne na rynku.
Zacznij od użycia pompy perystaltycznej, aby rozpocząć pompowanie podgrzanej podwójnie destylowanej wody z prędkością 4 ml na minutę przez pięć minut. Następnie zmień rurkę pompującą z wody na podgrzane medium perfuzyjne. Monitorowanie pęcherzyków powietrza między wodą a medium perfuzyjnym.
Pomoże śledzić przepływ medium perfuzyjnego przez system. Następnie zdezynfekuj brzuch znieczulonej ośmiotygodniowej czarnej samicy myszy C57 6J za pomocą 70% etanolu. I za pomocą nożyczek rozetnij brzuch, aby odsłonić wątrobę, żyłę wrotną i żyłę główną dolną.
Następnie zatrzymaj pompę perystaltyczną. Po upewnieniu się, że rurka pompująca zawiera medium perfuzyjne, a nie wodę. Wprowadzić cewnik o rozmiarze 24 do żyły głównej dolnej.
Ponownie włącz pompę i otwórz żyłę wrotną. Podczas pompowania pożywki perfuzyjnej należy co minutę naciskać żyłę wrotną, aby płyn dotarł do każdego zakątka wątroby. Kontynuuj pompowanie przez około trzy do pięciu minut lub do momentu, gdy wypłukany płyn będzie klarowny.
Następnie zmienić rurkę pompującą z pożywki perfuzyjnej na pożywkę do dyspazy kolagenazy. I naciskaj żyłę wrotną co minutę, aby płyn dotarł do każdego zakątka wątroby. Kontynuować pompowanie, aż wszystkie 25 ml pożywki do dyspazy kolagenazy zostanie wyczerpane.
Następnie odizoluj całą wątrobę bez pęcherzyka żółciowego. I umieścił go w 30 ml pożywki myjącej na szalce Petriego na lodzie. Za pomocą kleszczy rozerwij wątrobę na kawałki, aby uwolnić pierwotne hepatocyty do roztworu.
Na tym etapie pożywka płucząca zamienia się w mętny roztwór zawierający uwolnione pierwotne hepatocyty i małe kawałki wątroby. Przefiltruj ten mętny roztwór przez sitko o wielkości 70 mikronów, do 20 ml 1X na połączenie HBSS w probówce o pojemności 50 ml na lód. I wymieszaj roztwór, odwracając rurkę 20 razy.
Następnie odwirować roztwór. Następnie w kapturze do hodowli tkankowej odessać supernatant. I umyj granulkę 30 ml zimnego środka do mycia.
Ponownie zagnieździć komórki za pomocą wirowania. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 25 ml pożywki hodowlanej. Policz komórki i umieść je na żądanych płytkach hodowlanych.
Zgodnie z projektem eksperymentalnym. Po posianiu izolowane hepatocyty pierwotne były mocno połączone przez godzinę i w pełni rozprężone po 12 godzinach. W izolowanych hepatocytach poziomy mRNA markerów hepatocytów, takich jak transtyretyna, CD95, ASGR1 i ASGR2, były znacznie zwiększone w porównaniu z całą wątrobą.
Natomiast obecność komórek odpornościowych, gwiaździstych i komórek śródbłonka była niższa. Świadczy o tym gwałtowny spadek poziomu mRNA CD45, kolagenu typu 1 alfa 1 i kinazy 2 komórek śródbłonka. Sugeruje to, że ten protokół może znacznie zmniejszyć zakłócenia ze strony innych komórek wątroby.
Po posianiu poziomy ASGR1 i ASGR2 zmniejszały się z czasem, ale pozostają porównywalne dla całej wątroby do 12-godzinnego punktu czasowego. Specjalnie dla ASGR1. Poziom ekspresji CD81 związanego z błoną był stały przez okres do 48 godzin.
Dla porównania, ekspresja receptora toll-podobnego 4 ogólnie wzrosła i stała się wyższa niż w przypadku in vivo po 48 godzinach. Testy wrażliwości na insulinę wykazały, że insulina znacząco sprzyjała fosforylacji obu AKT przy serynie 473. I pudełko widełkowe 01 przy serynie 256, w hepatocytach.
Wskazując na wrażliwość hepatocytów pierwotnych na insulinę. Poziom białka karboksykinazy fosfoenolopirogronianu znacznie wzrósł po leczeniu glukagonem. Sugeruje to, że szlak produkcji glukozy został aktywowany.
Aktywacja ta została dodatkowo potwierdzona zwiększoną produkcją glukozy. Oraz z innymi stymulatorami produkcji glukozy, takimi jak Forskolina + IBMX. Protokół ten może zaoszczędzić zarówno czas, jak i energię na badania z wykorzystaniem pierwotnych hepatocytów myszy.
Zgodnie z tym protokołem można przeprowadzić powiązane eksperymenty, takie jak hipotetyczny metabolizm glukozy i testy biomarkerów farmaceutycznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia protokół izolacji komórek hepatozytów myszy, który jest efektywny pod względem nakładu pracy i czasu, a jest kluczowy dla badań nad funkcją i metabolizmem wątroby. Metoda wykorzystuje dostępne komercyjnie odczynniki w celu zwiększenia wydajności i zminimalizowania zakłóceń spowodowanych przez nieparenchymalne komórki.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Metabolizm wątrobowy
- Metabolizm glukozy
- Testowanie leków
Wprowadzenie
- Komórki hepatozytów myszy są niezbędne do badania biologii wątroby.
- Tradycyjne metody izolacji są często czasochłonne i pracochłonne.
- Skrócenie czasu izolacji może ułatwić bardziej efektywne eksperymenty biologiczne.
Wykorzystane metody
- Protokół izolacji z wykorzystaniem pompy perystaltycznej i medium kolagenazy dispazy.
- Model myszy: samice C57BL/6J.
- Techniki hodowli komórek i pomiaru ekspresji genów.
Główne wyniki
- Zwiększone poziomy mRNA markerów hepatozytów w porównaniu z całą wątrobą.
- Zmniejszona obecność komórek odpornościowych i śródbłonka po izolacji.
- Wykazano wrażliwość na insulinę i aktywowane szlaki produkcji glukozy.
Wnioski
- Niniejszy protokół znacznie poprawia wydajność izolacji komórek hepatozytów.
- Wzbogacone zrozumienie metabolizmu glukozy i odpowiedzi na leki w badaniach wątrobowych.
Najczęściej zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of primary hepatocytes is critical for liver metabolism and drug testing studies, where time and labor constraints impact throughput in discovery workflows. This protocol reduces isolation time to ~35 minutes while maintaining hepatocyte yield and purity, supporting rapid hypothesis testing in preclinical models. The method enables scalable preparation of disease-relevant systems for mechanistic de-risking in target validation and lead identification pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Provides purified hepatocytes for interrogating therapeutic hypotheses in glucose metabolism and hepatic drug response pathways.
- Operational Value: Reduces time and labor burden, enabling higher throughput in target validation assays.
- Predictive Value: Yields hepatocytes with demonstrated insulin sensitivity and gluconeogenesis activation, supporting mechanistic de-risking of liver targets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers hepatocytes with low non-parenchymal cell interference, improving assay specificity for compound screening.
- Operational Value: Uses commercially available reagents and standardized steps, enhancing reproducibility across screening campaigns.
- Scalability: Enables preparation of validated biological systems suitable for high-content or phenotypic screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems for preclinical validation of liver-targeted compounds.
- Risk-Adjusted Advancement: Generates hepatocytes with validated glucose production and insulin response, informing go/no-go decisions.
- Biomarker Alignment: Maintains hepatocyte marker expression (ASGR1, ASGR2, CD81) for up to 12 hours, enabling biomarker-assay compatibility.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical studies, providing a reliable source of primary hepatocytes for liver metabolism assays.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of hepatic pathways by delivering hepatocytes with confirmed marker expression and functional responses.
- Screening: Produces hepatocytes suitable for compound evaluation due to reduced stromal cell contamination and consistent insulin sensitivity.
- Analytics: Supports quantitative readouts such as glucose production, phosphorylation assays, and mRNA expression of hepatocyte markers.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work by providing hepatocytes that maintain key metabolic functions for up to 48 hours.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation capability that standardizes hepatocyte preparation across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in liver metabolism studies through reduced cellular interference and functional validation.
- Operational Value: Streamlines workflow with minimal steps and commercially available reagents, improving lab efficiency.
- Strategic Value: Accelerates discovery timelines by reducing isolation time from hours to ~35 minutes, increasing assay frequency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of liver targets by providing reliable preclinical models for mechanism validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse surgery and perfusion techniques.
- Depends on access to a peristaltic pump and sterile tissue culture environment.
- Necessitates standardized reagent preparation (perfusion medium, collagenase dispase, wash and culture media).
- Involves adaptation considerations for different mouse strains or ages beyond the C57BL/6J female model used.
- Limited by the need for immediate use of isolated hepatocytes to maintain functional integrity, as marker expression declines after 12 hours.
