Name: Bramki przemieszczenia nici DNA pochodzące z plazmidu do realizacji sieci reakcji chemicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Poznaj metodę izolacji bramek przemieszczenia nici DNA z plazmidów bakteryjnych i ich testowania za pomocą pomiarów kinetyki fluorescencji. Technika ta umożliwia tworzenie stabilnych układów molekularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rysunki 1, 2, 3, 4, 6, 8 i tabele 2, 3, 10, 15, 16 są zmodyfikowane z Ref29. Prace te były wspierane przez National Science Foundation (grant NSF-CCF 1117143 i NSF-CCF 1162141 dla G.S.). Y.-J. C. był wspierany przez Taiwanese Government Fellowships. S.D.R był wspierany przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP).

<ol><li>Zhang, D. Y., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+nanotechnology+using+strand-displacement+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions.</a> Nat. Chem. 3, 103-113 (2011).</li>
<li>Krishnan, Y., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+based+molecular+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid based molecular devices.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50, 3124-3156 (2011).</li>
<li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+DNA+strand+displacement+kinetics+using+toehold+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Control of DNA strand displacement kinetics using toehold exchange.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 17303-17314 (2009).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475, 368-372 (2011).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+up+digital+circuit+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Scaling up digital circuit computation with DNA strand displacement cascades.</a> Science. 332, 1196-1201 (2011).</li>
<li>Zadegan, R. M., Jepsen, M. D., Hildebrandt, L. L., Birkedal, V., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+fuzzy+and+boolean+logic+gates+based+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Construction of a fuzzy and boolean logic gates based on DNA.</a> Small. 11, 1811-1817 (2015).</li>
<li>Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-free+nucleic+acid+logic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzyme-free nucleic acid logic circuits.</a> Science. 314, 1585-1588 (2006).</li>
<li>Zadegan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+4+zeptoliters+switchable+3D+DNA+box+origami%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Construction of a 4 zeptoliters switchable 3D DNA box origami.</a> ACS Nano. 6, 10050-10053 (2012).</li>
<li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459, 73-76 (2009).</li>
<li>Zhang, D. Y., Hariadi, R. F., Choi, H. M., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+DNA+strand-displacement+circuitry+with+DNA+tile+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Integrating DNA strand-displacement circuitry with DNA tile self-assembly.</a> Nat. Commun. 4, (1965).</li>
<li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406, 605-608 (2000).</li>
<li>Green, S. J., Lubrich, D., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+hairpins%3A+fuel+for+autonomous+DNA+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">DNA hairpins: fuel for autonomous DNA devices.</a> Biophys. J. 91, 2966-2975 (2006).</li>
<li>Venkataraman, S., Dirks, R. M., Rothemund, P. W., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autonomous+polymerization+motor+powered+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">An autonomous polymerization motor powered by DNA hybridization.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 490-494 (2007).</li>
<li>Green, S. J., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+chemomechanical+cycles%3A+a+mechanism+for+autonomous+molecular+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Coordinated chemomechanical cycles: a mechanism for autonomous molecular motion.</a> Phys. Rev. Lett. 101, 238101(2008).</li>
<li>Omabegho, T., Sha, R., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bipedal+DNA+Brownian+motor+with+coordinated+legs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bipedal DNA Brownian motor with coordinated legs.</a> Science. 324, 67-71 (2009).</li>
<li>Turberfield, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fuel+for+free-running+nanomachines%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">DNA fuel for free-running nanomachines.</a> Phys. Rev. Lett. 90, 118102(2003).</li>
<li>Dirks, R. M., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+amplification+by+hybridization+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Triggered amplification by hybridization chain reaction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 15275-15278 (2004).</li>
<li>Seelig, G., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalyzed+relaxation+of+a+metastable+DNA+fuel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalyzed relaxation of a metastable DNA fuel.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 12211-12220 (2006).</li>
<li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318, 1121-1125 (2007).</li>
<li>Yin, P., Choi, H. M., Calvert, C. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+biomolecular+self-assembly+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming biomolecular self-assembly pathways.</a> Nature. 451, 318-322 (2008).</li>
<li>Chen, X., Briggs, N., McLain, J. R., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stacking+nonenzymatic+circuits+for+high+signal+gain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Stacking nonenzymatic circuits for high signal gain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 5386-5391 (2013).</li>
<li>Phillips, A., Cardelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programming+language+for+composable+DNA+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">A programming language for composable DNA circuits.</a> J. R. Soc. Interface. 6, Suppl 4. S419-S436 (2009).</li>
<li>Lakin, M. R., Youssef, S., Polo, F., Emmott, S., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+DSD%3A+a+design+and+analysis+tool+for+DNA+strand+displacement+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Visual DSD: a design and analysis tool for DNA strand displacement systems.</a> Bioinformatics. 27, 3211-3213 (2011).</li>
<li>Lakin, M. R., Youssef, S., Cardelli, L., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abstractions+for+DNA+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Abstractions for DNA circuit design.</a> J. R. Soc. Interface. 9, 470-486 (2012).</li>
<li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+and+modularity+properties+of+a+non-covalent+DNA+catalytic+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Robustness and modularity properties of a non-covalent DNA catalytic reaction.</a> Nucleic Acids Res. 38, 4182-4197 (2010).</li>
<li>Ducani, C., Kaul, C., Moche, M., Shih, W. M., Hogberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+production+of+%27monoclonal+stoichiometric%27+single-stranded+DNA+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic production of 'monoclonal stoichiometric' single-stranded DNA oligonucleotides.</a> Nat. Methods. 10, 647-652 (2013).</li>
<li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cloning+of+artificial+DNA+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo cloning of artificial DNA nanostructures.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 17626-17631 (2008).</li>
<li>Bhatia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icosahedral+DNA+nanocapsules+by+modular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Icosahedral DNA nanocapsules by modular assembly.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 4134-4137 (2009).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+chemical+controllers+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Programmable chemical controllers made from DNA.</a> Nat. Nanotechnol. 8, 755-762 (2013).</li>
<li>Arkin, A., Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+functions+in+biochemical+reaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Computational functions in biochemical reaction networks.</a> Biophys. J. 67, 560-578 (1994).</li>
<li>Érdi, P., Tóth, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3a%C3%89rdi%2C+P+%22Mathematical+models+of+chemical+reactions%3A+theory+and+applications+of+deterministic+and+stochastic+models%22">Mathematical models of chemical reactions: theory and applications of deterministic and stochastic models</a>. , Manchester University Press. (1989).</li>
<li>Magnasco, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+kinetics+is+Turing+universal%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Chemical kinetics is Turing universal.</a> Phys. Rev. Lett. 78, 1190(1997).</li>
<li>Oishi, K., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+implementation+of+linear+I%2FO+systems%5BTitle%5D)+AND+%22IET+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biomolecular implementation of linear I/O systems.</a> IET Syst. Biol. 5, 252-260 (2011).</li>
<li>Senum, P., Riedel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate-independent+constructs+for+chemical+computation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rate-independent constructs for chemical computation.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Soloveichik, D., Cook, M., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computation+with+finite+stochastic+chemical+reaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Computing%22%5BJournal%5D)">Computation with finite stochastic chemical reaction networks.</a> Natural Computing. 7, 615-633 (2008).</li>
<li>Soloveichik, D., Seelig, G., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+as+a+universal+substrate+for+chemical+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DNA as a universal substrate for chemical kinetics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 5393-5398 (2010).</li>
<li>Tyson, J. J., Chen, K. C., Novak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sniffers%2C+buzzers%2C+toggles+and+blinkers%3A+dynamics+of+regulatory+and+signaling+pathways+in+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sniffers, buzzers, toggles and blinkers: dynamics of regulatory and signaling pathways in the cell.</a> Curr. Opin. Cell. Biol. 15, 221-231 (2003).</li>
<li>Cardelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-domain+DNA+strand+displacement%5BTitle%5D)+AND+%22Math.+Struct.+Comput.+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-domain DNA strand displacement.</a> Math. Struct. Comput. Sci. 23, 247-271 (2013).</li>
<li>Angluin, D., Aspnes, J., Eisenstat, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+population+protocol+for+fast+robust+approximate+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Distrib.+Comput%22%5BJournal%5D)">A simple population protocol for fast robust approximate majority.</a> Distrib. Comput. 21, 87-102 (2008).</li>
<li>Cardelli, L., Csikasz-Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+switch+computes+approximate+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">The cell cycle switch computes approximate majority.</a> Sci. Rep. 2, 656(2012).</li>
<li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUPACK%3A+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Chem%22%5BJournal%5D)">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> J. Comput. Chem. 32, 170-173 (2011).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J. Vis. Exp. , e253(2007).</li>
<li>Lessard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+E.+coli+via+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of E. coli via electroporation.</a> Methods Enzymol. 529, 321-327 (2013).</li>
<li>Nasri, M., Thomas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+the+specificity+of+PvuII+restriction+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Alteration of the specificity of PvuII restriction endonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 15, 7677-7687 (1987).</li>
<li>Dalchau, N., Seelig, G., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+design+of+reaction-diffusion+patterns+using+DNA-based+chemical+reaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Computing+and+Molecular+Programming%22%5BJournal%5D)">Computational design of reaction-diffusion patterns using DNA-based chemical reaction networks.</a> DNA Computing and Molecular Programming. , 84-99 (2014).</li>
<li>Scalise, D., Schulman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+modular+reaction-diffusion+programs+for+complex+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Designing modular reaction-diffusion programs for complex pattern formation.</a> Technology. 2, 55-66 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

W artykule opisano metodę wyprowadzania bramek ndsDNA z wysoce czystego plazmidowego DNA. Ponadto przedstawiono protokół charakteryzujący wydajność bramki za pomocą testu kinetyki fluorescencji. Dane eksperymentalne pokazują, że system pochodzący z plazmidu przewyższa swój syntetyczny odpowiednik, nawet jeśli system syntetyczny jest złożony z pasm oczyszczonych za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Prawdopodobnie poprawa wydajności bramek pochodzących z plazmidu wynika przede wszystkim z bardzo wysokiej czystości biologicznego DNA. Syntetyczne DNA zawiera wiele błędów, w szczególności delecje, które skutkują oligonukleotydami o długości n-1, a takie produkty uboczne zazwyczaj nie są całkowicie usuwane w procedurach oczyszczania PAGE lub wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Podobne ulepszenia do tych opisanych tutaj zaobserwowano również w poprzednim badaniu katalizowanego wzmacniacza spinki do włosów, który wykorzystywał DNA pochodzące ze źródeł biologicznych21.
Jednak nawet zastosowanie bramek pochodzących z plazmidu nie może całkowicie wyeliminować błędów w działaniu bramki, dla których istnieją co najmniej dwa powody: po pierwsze, nadmierne trawienie lub brak precyzji cięcia może prowadzić do bramek ze zbyt dużą liczbą nacięć lub nacięć w niewłaściwych pozycjach. W obu przypadkach bramki są bardziej skłonne do udziału w niepożądanych reakcjach. Problemy te można złagodzić poprzez optymalizację ilości stosowanego enzymu (patrz rysunek 4). Po drugie, w tych eksperymentach większość danych wejściowych i nici pomocniczych była syntetycznym DNA, a zatem zawierała delecje i mutacje. Zasadniczo wszystkie jednoniciowe nici wejściowe i pomocnicze można również uzyskać z DNA fagi poprzez trawienie enzymem nacinającym wstępnie zakodowanego genomu wirusa m1326. Być może wydajność obwodu można jeszcze bardziej poprawić za pomocą ssDNA pochodzącego z genomu bakteryjnego.
Podczas gdy stwierdzono, że zastosowanie bramek pochodzących z plazmidów poprawia wydajność obwodu, analiza kosztów i czasu przetwarzania wykazała, że chociaż produkcja bramek pochodzących z plazmidów jest nieco tańsza (Tabela 15), zajmuje 2-3 razy dłuższy czas przetwarzania w porównaniu do montażu i oczyszczania bramek z komercyjnie zsyntetyzowanych oligonukleukleotydów (Tabela 16). Głównymi kosztami bramek pochodzących z plazmidu są synteza genów i stosowanie enzymów restrykcyjnych. W przypadku 300 pmol bramek (wystarcza na 15 reakcji przy 30 nM) szacowany koszt bramek Join wynosi około 170 USD i 200 USD w przypadku bramek Fork, przy czym różnica w kosztach wynika z zastosowania różnych enzymów nacinania. W przeciwieństwie do tego, synteza chemiczna nici dla tej samej bramki kosztuje około 260 USD, w tym opłatę za oczyszczanie PAGE. Podstawowym kosztem czasu dla bramek pochodzących z plazmidu jest procedura klonowania, która, podobnie jak synteza DNA, może być zlecona firmie zajmującej się syntezą genów. Jednak po złożeniu bramki pochodzące z plazmidów mają tę zaletę, że plazmidy gospodarza mogą być łatwo replikowane i mogą być przechowywane w postaci bakteryjnych zapasów glicerolu. Dzięki temu możliwe jest wielokrotne wykorzystanie bram.
Patrząc w przyszłość, ulepszona wydajność bramek pochodzących z plazmidu może umożliwić znacznie szerszy zakres zachowań dynamicznych niż dotychczas eksperymentalnie wykazane w przypadku DNA CRN. Na przykład niedawne prace teoretyczne47,48 sugerują, że samoorganizujące się wzorce przestrzenne w skali makro mogą być realizowane za pomocą DNA CRN poprzez mechanizm dyfuzji reakcji. Przedstawiona tutaj metoda zapewnia realną ścieżkę do konstruowania podstawowych składników molekularnych dla takich samokształtnych materiałów DNA. Opracowanie morfologii w skali makro w programowalny sposób, choć jest to wyzwanie, miałoby znaczące implikacje w różnych dziedzinach, od badań nad biomateriałami po medycynę regeneracyjną.

Przewidywalność parowania zasad Watsona-Cricka pozwoliła na pojawienie się dynamicznej nanotechnologii DNA jako programowalnego sposobu projektowania urządzeń molekularnych o dynamicznych właściwościach1,2. W szczególności przemieszczenie nici DNA – programowalna, konkurencyjna reakcja hybrydyzacji – okazała się potężnym mechanizmem inżynierii dynamicznych systemów DNA. W reakcji przemieszczenia nici DNA nadchodzący oligonukleotyd wypiera wcześniej związaną nić "wyjściową" z komplementarnego partnera wiążącego. Wiele takich reakcji można łączyć w wieloetapowe kaskady reakcyjne z wysokim stopniem kontroli nad kolejnością i czasem poszczególnych etapów reakcji3. Kaskady przemieszczeń nici DNA zostały wykorzystane do stworzenia cyfrowych i analogowych obwodów molekularnych4-7, przełączalnych nanostruktur8-10, autonomicznych silników molekularnych11-15 oraz niekowalencyjnych wzmacniaczy katalitycznych13,16-21. Co więcej, urządzenia DNA wykorzystujące reakcje przemieszczenia nici mogą być symulowane i projektowane do różnych zastosowań za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo22-24.
Obecnie, chemicznie syntetyzowane DNA służy jako główny materiał dla nanotechnologii DNA. Uważa się jednak, że błędy w procesie syntezy DNA i wynikające z nich niedoskonałe oligonukleotydy ograniczają działanie dynamicznych urządzeń DNA, powodując błędne reakcje uboczne. Na przykład reakcje "wycieku" mogą prowadzić do uwolnienia wyjściowego oligonukleotydu nawet przy braku wyzwalacza reakcji. Takie efekty są najbardziej widoczne w kaskadach reakcji autokatalitycznych, gdzie nawet minimalna ilość początkowego wycieku ostatecznie doprowadzi do pełnej aktywacji kaskady19,20. I odwrotnie, reakcje często nie osiągają oczekiwanego poziomu aktywacji, ponieważ niektóre składniki nie wyzwalają się nawet w obecności zamierzonego wejścia7,25. Aby wydajność nanourządzeń opartych na DNA była porównywalna z ich odpowiednikami opartymi na białkach biologicznych, takie tryby błędów muszą zostać radykalnie zredukowane.
Plazmidy bakteryjne lub inne biologiczne DNA mogą służyć jako stosunkowo tanie źródło wysoce czystego DNA do zastosowań nanotechnologicznych. Duże ilości DNA mogą być generowane przez replikację w bakteriach, a wewnętrzne zdolności korekty żywych systemów zapewniają czystość powstałego DNA. W rzeczywistości kilka ostatnich prac uznało potencjalną użyteczność biologicznego DNA w zastosowaniach nanotechnologii21,26-28. Jednak w pełni dwuniciowy charakter plazmidowego DNA do tej pory uniemożliwiał jego stosowanie jako materiału do tworzenia dynamicznych urządzeń DNA, które zazwyczaj składają się z wielu oligonukleotydów i zawierają zarówno domeny dwuniciowe, jak i jednoniciowe. W niedawnym artykule29 poruszono tę kwestię i przedstawiono nową architekturę bramek DNA, która składa się głównie z naciętego dwuniciowego DNA (ndsDNA).
Co ważne, systemy bramek ndsDNA mogą być zaprojektowane tak, aby realizowały dynamikę określoną przez dowolną formalną sieć reakcji chemicznych (CRN)29. Bramki ndsDNA mogą być zatem w zasadzie używane do tworzenia dynamicznych systemów, które wykazują oscylacje i chaos, bistabilność i pamięć, logikę Boole'a lub zachowania algorytmiczne30-38. Na przykład, Ref. 29 zademonstrował trzyreakcyjny CRN, który zapewnił molekularną implementację protokołu "konsensusu", rodzaju rozproszonego algorytmu obliczeniowego29,39,40. Praca ta po raz pierwszy zademonstrowała nowatorskie zastosowanie formalizmu CRN jako "języka programowania" do szybkiej syntezy funkcjonalnych układów molekularnych (Rysunek 1A).
Tutaj znajduje się szczegółowy protokół wyprowadzania bramek ndsDNA z plazmidowego DNA. Pierwszym z nich jest przegląd procesu projektowania sekwencji. Następnie następuje wyjaśnienie, w jaki sposób syntetyczne oligonukleotydy zawierające sekwencje bramek są klonowane do plazmidów, a sekwencja jest weryfikowana i amplifikowana za pomocą hodowli bakteryjnej. Następnie pokazano, w jaki sposób bramki ndsDNA mogą być uzyskane z plazmidów poprzez przetwarzanie enzymatyczne (patrz ryc. 2). Na koniec przedstawiono metodę testowania zachowania bramki za pomocą testów kinetyki fluorescencji.
Mechanizm reakcji 
Na przykład protokół koncentruje się na katalitycznej reakcji chemicznej A+B->B+C. Gatunki A, B i C ("sygnały", ryc. 1B) odpowiadają innej jednoniciowej cząsteczce DNA. Sekwencje tych cząsteczek są całkowicie niezależne, a nici nie reagują ze sobą bezpośrednio. Sekwencje wszystkich sygnałów mają dwie różne domeny funkcjonalne, tj. podsekwencje, które działają razem w reakcjach przemieszczenia nici: 1) domena krótkiego palca u nogi (etykiety ta, tb, tc), która jest używana do inicjacji reakcji przemieszczenia nici, oraz 2) domena długa (etykiety a, b, c), która określa tożsamość sygnału.
Interakcje między niciami sygnałowymi są pośredniczone przez kompleksy bramek z dwuniciowym DNA (ndsDNA) (zwane JoinAB i ForkBC) oraz pomocnicze gatunki jednoniciowe (<tr r>, , <c tb> i ). Formalna reakcja A + B->B + C jest przeprowadzana przez szereg etapów reakcji przemieszczenia nici, gdzie każdy krok reakcji odsłania punkt zaczepienia dla kolejnej reakcji (rysunek 1B). W tym przykładzie sygnały A i B są początkowo wolne w roztworze, podczas gdy sygnał C jest powiązany z bramką widełkową. Pod koniec reakcji B i C znajdują się w roztworze. Mówiąc bardziej ogólnie, sygnały związane z bramką są nieaktywne, podczas gdy sygnały, które są wolne w roztworze, są aktywne, to znaczy mogą uczestniczyć w reakcji przemieszczenia nici jako dane wejściowe. Przebieg reakcji w czasie jest śledzony za pomocą strategii fluorescencyjnego reportera (ryc. 1C). W poprzednich pracach29 wykazano, że ten mechanizm reakcji nie tylko realizuje prawidłową stechiometrię, ale także kinetykę docelowej reakcji.

<table><tbody><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HF</td><td>NEB</td><td>M0531S</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>NEB</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>PstI-HF</td><td>NEB</td><td>R3140S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Wspaniały bulion, zmodyfikowany</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0918-250G</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw QIAGEN Hispeed Maxi-prep</td><td>QIAGEN</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>Nb.BsrDI</td><td>NEB</td><td>R0648L</td><td></td></tr><tr><td>Nt.BstNBI</td><td>NEB</td><td>R0607L</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwuniciowe bloki genomowe</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorolog-3 Fluorymetr</td>Syntetyczne ogniwa kwarcowe <td>Horiba/Jobin Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Starna</td><td>23-5.45-S0G-5</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAGEN</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Szkielet plazmidu</td><td>BioBrick</td><td>E0240-pSB1A2</td><td>Plazmid o wysokiej liczbie kopii z opornością na ampicylinę. Sekwencję można znaleźć pod adresem http://parts.igem.org</td></tr></tbody></table>

bramki przemieszczenia nici dna pochodzące z plazmidu do realizacji sieci reakcji chemicznych

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

Nanotechnologia DNA wymaga dużych ilości wysoce czystego DNA jako materiału inżynieryjnego. Plazmidowe DNA może zaspokoić tę potrzebę, ponieważ jest replikowane z wysoką wiernością, jest łatwo amplifikowane przez hodowlę bakteryjną i może być przechowywane w nieskończoność w postaci bakteryjnych zapasów glicerolu. Jednak dwuniciowy charakter plazmidowego DNA do tej pory utrudniał jego efektywne wykorzystanie do budowy nanostruktur DNA lub urządzeń, które zazwyczaj zawierają domeny jednoniciowe lub rozgałęzione. W ostatnich pracach stwierdzono, że bramki przemieszczenia nici dwuniciowego DNA (ndsDNA) mogą pochodzić z plazmidowego DNA. Poniżej znajduje się protokół, który szczegółowo opisuje, w jaki sposób te bramki ndsDNA mogą być skutecznie kodowane w plazmidach i mogą być uzyskiwane z plazmidów poprzez niewielką liczbę etapów przetwarzania enzymatycznego. Podano również protokół testowania bramek ndsDNA za pomocą pomiarów kinetyki fluorescencji. Bramki NdsDNA mogą być wykorzystywane do implementacji dowolnych sieci reakcji chemicznych (CRN), a tym samym zapewniają drogę do wykorzystania formalizmu CRN jako normatywnego języka programowania molekularnego. Aby zademonstrować tę technologię, skonstruowano wieloetapową kaskadę reakcji z kinetyką katalityczną. Ponadto wykazano, że składniki pochodzące z plazmidu działają lepiej niż identyczne składniki złożone z syntetycznego DNA.

Ten protokół opisuje metodę wyprowadzania bramek przemieszczenia nici DNA z plazmidów i testowania ich za pomocą pomiarów kinetyki fluorescencji. Bramki można modułowo komponować w systemy wieloskładnikowe w celu przybliżenia zachowania formalnych sieci reakcji chemicznych (CRN), demonstrując nowe zastosowanie CRN jako molekularnego języka programowania.

Bramki przemieszczenia nici DNA pochodzące z plazmidu do realizacji sieci reakcji chemicznych

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyprowadzenie bramek przemieszczenia nici DNA z plazmidów bakteryjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje plazmid bakteryjny jako wysoce czyste źródło do generowania solidnych bramek DNA. Demonstrując tę procedurę, moi koledzy Sam Dip i ja, aby rozpocząć masową produkcję, a następnie izolować bramki zawierające DNA, używając zestawów do izolacji DNA, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym i zgodnie z instrukcjami producenta zgodnie z instrukcjami ellucian.Zmierz stężenie plazmidowego DNA przy użyciu standardowych technik. Następnie trawi DNA, dodając cztery jednostki enzymu restrykcyjnego PV U2 HF na każdy miligram plazmidu. Następnie dodać do próbki dwie równoważne objętości lodowatego etanolu absolutnego.Inkubować mieszaninę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę, aby wytrącić DNA. Następnie osadzać wytrącone DNA, odwirowując próbkę w temperaturze od 10 000 do 14 000 razy G i zero stopni Celsjusza przez 30 minut. Usunąć SNAT i dodać do próbki 1000 mikrolitrów 95% etanolu o temperaturze pokojowej.Następnie odwrócić próbkę 10 do 15 razy, następnie odwirować próbkę w temperaturze od 10 000 do 14 000 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Po zakończeniu usuń supernatant i wysusz DNA na powietrzu na stole przez 10 do 20 minut. Podczas usuwania supernatantu z wytrąconego DNA należy uważać, aby nie naruszyć osadu, w przeciwnym razie wydajność zostanie znacznie zmniejszona.Po wyschnięciu ponownie zawiesić osad DNA w ilości do 200 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz i wirować do wymieszania. Dodanie więcej niż 200 mikrolitrów wody na ogół sprawi, że próbka zostanie rozcieńczona do użycia. W eksperymentach kinetycznych, należy zmierzyć zawieszone DNA za pomocą spektrofotometru zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie dodać cztery jednostki enzymu nacinającego M-B-B-S-R-D po jednej na jeden mikrogram plazmidu i dodać odpowiedni bufor enzymatyczny. Inkubować próbkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez jedną godzinę w celu wytrawienia wspólnych bramek. Następnie trawić bramki wideł, dodając osiem jednostek enzymu nacinającego NT BST mb po jednej na jeden mikrogram plazmidu i odpowiedni bufor enzymatyczny.Inkubować próbkę w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Aby przygotować reporterki fluorescencyjne, najpierw należy zawiesić i oznaczyć ilościowo próbki zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie wymieszaj 10 mikrolitrów dolnej nici reporterów z 13 mikrolitrami górnej nici wygaszającej w buforze EDTA z octanu trisu z 12,5 milimolem magnezu.Aby upewnić się, że cała flora, cztery oznakowane pasma są ugaszone, należy dodać 30% nadwyżki pasma oznaczonego jako hartowniczego. Następnie anil kompleks reporterowy C za pomocą termocyklera. Schłodzić próbkę z 95 stopni Celsjusza do 20 stopni Celsjusza z szybkością jednego stopnia Celsjusza na minutę.Po zakończeniu przechowuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza po kalibracji. Pomiary fluorescencji należy rozpocząć od ustawienia regulatora temperatury na 25 stopni Celsjusza, podczas gdy temperatura się ustabilizuje. Ustaw odpowiednie parametry dla pomiarów kinetycznych w oprogramowaniu do akwizycji danych.Po otwarciu oprogramowania fluorymetru spektralnego ustaw szerokość poślizgu na 2,73 nanometra zarówno dla wzbudzenia, jak i emisji monochromatycznej. Następnie ustaw czas integracji na 10 sekund dla każdego 62. punktu czasowego i ustaw całkowity czas pomiaru na 24 godziny. Na koniec ustaw długości fal wzbudzenia i emisji tak, aby pasowały do lasu flory użytego w eksperymencie.Następnie dodaj 410,2 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz i 52,8 mikrolitrów 10 dodatkowych octanowych EDTA zawierających 125 milimoli magnezu do syntetycznego ogniwa kwarcowego. Dodaj również dwa mikrolitry 300-milimolowych nici poli T, a następnie wiruj syntetyczne ogniwo kwarcowe przez 10 do 15 sekund. Następnie po dziewięciu mikrolitrach nici reporterowych o średnicy 10 mikromolów i sześciu mikrolitrach każdej nici pomocniczej o średnicy 10 mikromolów.Następnie przy 45 mikrolitrach zarówno jointa, jak i widelca przy jednym mikromolu i delikatnie wymieszać roztwór, pipetując go w górę iw dół co najmniej 20 razy. Na koniec, w dziewięciu mikrolitrach 10% sodu do siarczanu przewodowego, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,15% SDS, delikatnie wymieszaj reakcję, pipetując w górę iw dół co najmniej 20 razy, natychmiast umieść syntetyczne komórki kwarcowe w komorze flutera widm i rozpocznij pomiar kinetyczny. Po pięciu minutach pomiaru dodaj trzy mikrolitry pasm wejściowych.Dodaj 10 mikromolowców do syntetycznej komórki kwarcowej. Gdy program do akwizycji danych jest wstrzymany, delikatnie wymieszaj reakcję, pipetując ją w górę iw dół co najmniej 20 razy, a następnie zamknij osłonę lampy i kontynuuj rejestrowanie kinetyki reakcji, aż osiągnie stabilną wartość. Dane kinetyki stanu dla bramek pochodzących z plazmy i zsyntetyzowanych bramek są pokazane tutaj w eksperymentach.Stężenie nici sygnałowej A jest stałe, podczas gdy ilość sygnału katalitycznego B jest zmienna. Sygnał C służy do odczytywania przebiegu reakcji bez przerywania. Obrót w cyklu katalitycznym definiuje się jako ilość sygnału C wytwarzanego dla każdego katalizatora B w danym momencie.W przypadku idealnego układu katalitycznego ta liczba obrotu powinna rosnąć liniowo w czasie i być niezależna od ilości katalizatora, o ile substrat nie jest ograniczony. W tym miejscu zaobserwowano, że zsyntetyzowany układ odbiega od idealnego liniowego wzrostu obrotu znacznie wcześniej niż układ pochodzący z plazmy, co wskazuje na sekwestrację katalizatora w wyniku niepożądanej reakcji ubocznej. Porównano tutaj wyciek obwodu zarówno bramek pochodzących z plazmy, jak i zsyntetyzowanych i zaobserwowano, że stosunek sygnału wycieku przy użyciu bramek pochodzących z plazmy jest o około 8% mniejszy niż przy użyciu zsyntetyzowanych bramek po 10 godzinach reakcji.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować solidne bramki DNA z plazmidu bakteryjnego i testować bramki za pomocą pomiarów kinetyki fluorescencji.

plasmid-derived-dna-strand-displacement-gates-for-implementing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Origami DNA to potężna metoda wytwarzania precyzyjnych obiektów w nanoskali poprzez programowanie samoorganizacji cząsteczek DNA. Tutaj opisujemy, w jaki sposób origami DNA można wykorzystać do zaprojektowania robota zdolnego do wyczuwania sygnałów biologicznych i reagowania poprzez zmianę kształtu, a następnie przekazywanego do pożądanego efektu.

Projektowanie bioresponsywnego robota z DNA Origami

Synteza niestandardowych plazmidów jest pracochłonna i czasochłonna. Protokół ten opisuje zastosowanie klonowania zespołu Gibsona w celu zmniejszenia pracy i czasu trwania niestandardowej procedury klonowania DNA. Opisany protokół pozwala również na uzyskanie wiarygodnych znakowanych konstruktów białkowych do ekspresji ssaków przy podobnych kosztach jak w przypadku tradycyjnego klonowania DNA metodą "wytnij i wklej".

Generowanie wektorów plazmidowych eksprymujących białka znakowane FLAG pod regulacją promotora ludzkiego czynnika wydłużenia-1α przy użyciu zespołu Gibsona

Tutaj prezentowany jest zautomatyzowany przepływ pracy do wykonywania modułowego montażu "urządzenia" DNA przy użyciu modułowej metody klonowania DNA na robotach obsługujących ciecze. Protokół wykorzystuje intuicyjne narzędzie programowe do generowania list wyboru osób zajmujących się cieczami do kombinatorycznego generowania biblioteki urządzeń DNA, które demonstrujemy za pomocą dwóch platform do obsługi cieczy.

Zautomatyzowany zrobotyzowany montaż modułowych urządzeń DNA do obsługi cieczy

Ten artykuł przedstawia serię protokołów do rozwoju inżynieryjnych komórek i funkcjonalizowanych powierzchni, które umożliwiają syntetycznie modyfikowanym E. coli kontrolowanie i manipulowanie programowalnymi powierzchniami materiałów.

Wykorzystanie biologii syntetycznej do inżynierii żywych komórek, które łączą się z programowalnymi materiałami

Opisujemy szczegółowy protokół projektowania, symulacji, eksperymentów w laboratorium mokrym i analizy dla rekonfigurowalnego stojaka harmonijkowego DNA o oczkach 6 na 6.

Projekt i synteza rekonfigurowalnego stojaka na akordeon DNA

Opisujemy prostą procedurę litograficzną do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchni, która może być użyta do przeprowadzenia eksperymentów z ekspresją genów na biochipach bez komórek.

Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak i) złożyć samoreplikujący się wektor za pomocą modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate, ii) wprowadzić wektor do sinicowego gospodarza przez koniugację, oraz iii) scharakteryzować transgeniczne szczepy sinic za pomocą czytnika płytek lub cytometrii przepływowej.

Modyfikacja genetyczna cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Opisujemy inżynierię nowatorskiej polimerazy T7 RNA na uwięzi DNA do regulacji reakcji transkrypcji in vitro. Omawiamy etapy syntezy i charakterystyki białek, walidujemy regulację transkrypcji typu proof-of-concept i omawiamy jej zastosowania w obliczeniach molekularnych, diagnostyce i przetwarzaniu informacji molekularnych.

Polimeraza RNA na uwięzi DNA do programowalnej transkrypcji in vitro i obliczeń molekularnych

Systemy CRISPR-Cas i białka anty-CRISPR zostały zintegrowane ze schematem bramek Boole'a u Saccharomyces cerevisiae. Nowe małe obwody logiczne wykazały się dobrą wydajnością i pogłębiły wiedzę zarówno na temat czynników transkrypcyjnych opartych na dCas9/dCas12a, jak i właściwości białek anty-CRISPR.

Genowe obwody cyfrowe oparte na systemach CRISPR-Cas i białkach anty-CRISPR

Montaż in vivo to metoda klonowania niezależna od ligacji, która opiera się na wewnętrznych enzymach naprawy DNA u bakterii w celu złożenia fragmentów DNA przez rekombinację homologiczną. Protokół ten jest zarówno czasochłonny, jak i opłacalny, ponieważ wymagana jest niewielka liczba odczynników, a skuteczność klonowania może sięgać nawet 99%.

Zastosowanie montażu in vivo do wysokowydajnej budowy plazmidu

Poznaj metodę izolacji bramek przemieszczenia nici DNA z plazmidów bakteryjnych i ich testowania za pomocą pomiarów kinetyki fluorescencji. Technika ta umożliwia tworzenie stabilnych układów molekularnych.

Bramki przemieszczenia nici DNA pochodzące z plazmidu do realizacji sieci reakcji chemicznych

Przeglądaj więcej filmów