Bramki przemieszczenia nici DNA pochodzące z plazmidu do realizacji sieci reakcji chemicznych

Ogólnym celem tej procedury jest wyprowadzenie bramek przemieszczenia nici DNA z plazmidów bakteryjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje plazmid bakteryjny jako wysoce czyste źródło do generowania solidnych bramek DNA. Demonstrując tę procedurę, moi koledzy Sam Dip i ja, aby rozpocząć masową produkcję, a następnie izolować bramki zawierające DNA, używając zestawów do izolacji DNA, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym i zgodnie z instrukcjami producenta zgodnie z instrukcjami ellucian.

Zmierz stężenie plazmidowego DNA przy użyciu standardowych technik. Następnie trawi DNA, dodając cztery jednostki enzymu restrykcyjnego PV U2 HF na każdy miligram plazmidu. Następnie dodać do próbki dwie równoważne objętości lodowatego etanolu absolutnego.

Inkubować mieszaninę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę, aby wytrącić DNA. Następnie osadzać wytrącone DNA, odwirowując próbkę w temperaturze od 10 000 do 14 000 razy G i zero stopni Celsjusza przez 30 minut. Usunąć SNAT i dodać do próbki 1000 mikrolitrów 95% etanolu o temperaturze pokojowej.

Następnie odwrócić próbkę 10 do 15 razy, następnie odwirować próbkę w temperaturze od 10 000 do 14 000 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Po zakończeniu usuń supernatant i wysusz DNA na powietrzu na stole przez 10 do 20 minut. Podczas usuwania supernatantu z wytrąconego DNA należy uważać, aby nie naruszyć osadu, w przeciwnym razie wydajność zostanie znacznie zmniejszona.

Po wyschnięciu ponownie zawiesić osad DNA w ilości do 200 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz i wirować do wymieszania. Dodanie więcej niż 200 mikrolitrów wody na ogół sprawi, że próbka zostanie rozcieńczona do użycia. W eksperymentach kinetycznych, należy zmierzyć zawieszone DNA za pomocą spektrofotometru zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie dodać cztery jednostki enzymu nacinającego M-B-B-S-R-D po jednej na jeden mikrogram plazmidu i dodać odpowiedni bufor enzymatyczny. Inkubować próbkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez jedną godzinę w celu wytrawienia wspólnych bramek. Następnie trawić bramki wideł, dodając osiem jednostek enzymu nacinającego NT BST mb po jednej na jeden mikrogram plazmidu i odpowiedni bufor enzymatyczny.

Inkubować próbkę w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Aby przygotować reporterki fluorescencyjne, najpierw należy zawiesić i oznaczyć ilościowo próbki zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie wymieszaj 10 mikrolitrów dolnej nici reporterów z 13 mikrolitrami górnej nici wygaszającej w buforze EDTA z octanu trisu z 12,5 milimolem magnezu.

Aby upewnić się, że cała flora, cztery oznakowane pasma są ugaszone, należy dodać 30% nadwyżki pasma oznaczonego jako hartowniczego. Następnie anil kompleks reporterowy C za pomocą termocyklera. Schłodzić próbkę z 95 stopni Celsjusza do 20 stopni Celsjusza z szybkością jednego stopnia Celsjusza na minutę.

Po zakończeniu przechowuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza po kalibracji. Pomiary fluorescencji należy rozpocząć od ustawienia regulatora temperatury na 25 stopni Celsjusza, podczas gdy temperatura się ustabilizuje. Ustaw odpowiednie parametry dla pomiarów kinetycznych w oprogramowaniu do akwizycji danych.

Po otwarciu oprogramowania fluorymetru spektralnego ustaw szerokość poślizgu na 2,73 nanometra zarówno dla wzbudzenia, jak i emisji monochromatycznej. Następnie ustaw czas integracji na 10 sekund dla każdego 62. punktu czasowego i ustaw całkowity czas pomiaru na 24 godziny. Na koniec ustaw długości fal wzbudzenia i emisji tak, aby pasowały do lasu flory użytego w eksperymencie.

Następnie dodaj 410,2 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz i 52,8 mikrolitrów 10 dodatkowych octanowych EDTA zawierających 125 milimoli magnezu do syntetycznego ogniwa kwarcowego. Dodaj również dwa mikrolitry 300-milimolowych nici poli T, a następnie wiruj syntetyczne ogniwo kwarcowe przez 10 do 15 sekund. Następnie po dziewięciu mikrolitrach nici reporterowych o średnicy 10 mikromolów i sześciu mikrolitrach każdej nici pomocniczej o średnicy 10 mikromolów.

Następnie przy 45 mikrolitrach zarówno jointa, jak i widelca przy jednym mikromolu i delikatnie wymieszać roztwór, pipetując go w górę iw dół co najmniej 20 razy. Na koniec, w dziewięciu mikrolitrach 10% sodu do siarczanu przewodowego, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,15% SDS, delikatnie wymieszaj reakcję, pipetując w górę iw dół co najmniej 20 razy, natychmiast umieść syntetyczne komórki kwarcowe w komorze flutera widm i rozpocznij pomiar kinetyczny. Po pięciu minutach pomiaru dodaj trzy mikrolitry pasm wejściowych.

Dodaj 10 mikromolowców do syntetycznej komórki kwarcowej. Gdy program do akwizycji danych jest wstrzymany, delikatnie wymieszaj reakcję, pipetując ją w górę iw dół co najmniej 20 razy, a następnie zamknij osłonę lampy i kontynuuj rejestrowanie kinetyki reakcji, aż osiągnie stabilną wartość. Dane kinetyki stanu dla bramek pochodzących z plazmy i zsyntetyzowanych bramek są pokazane tutaj w eksperymentach.

Stężenie nici sygnałowej A jest stałe, podczas gdy ilość sygnału katalitycznego B jest zmienna. Sygnał C służy do odczytywania przebiegu reakcji bez przerywania. Obrót w cyklu katalitycznym definiuje się jako ilość sygnału C wytwarzanego dla każdego katalizatora B w danym momencie.

W przypadku idealnego układu katalitycznego ta liczba obrotu powinna rosnąć liniowo w czasie i być niezależna od ilości katalizatora, o ile substrat nie jest ograniczony. W tym miejscu zaobserwowano, że zsyntetyzowany układ odbiega od idealnego liniowego wzrostu obrotu znacznie wcześniej niż układ pochodzący z plazmy, co wskazuje na sekwestrację katalizatora w wyniku niepożądanej reakcji ubocznej. Porównano tutaj wyciek obwodu zarówno bramek pochodzących z plazmy, jak i zsyntetyzowanych i zaobserwowano, że stosunek sygnału wycieku przy użyciu bramek pochodzących z plazmy jest o około 8% mniejszy niż przy użyciu zsyntetyzowanych bramek po 10 godzinach reakcji.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować solidne bramki DNA z plazmidu bakteryjnego i testować bramki za pomocą pomiarów kinetyki fluorescencji.