Bramki przemieszczenia nici DNA pochodzące z plazmidu do realizacji sieci reakcji chemicznych
25 listopada 2015
Ten protokół opisuje metodę wyprowadzania bramek przemieszczenia nici DNA z plazmidów i testowania ich za pomocą pomiarów kinetyki fluorescencji. Bramki można modułowo komponować w systemy wieloskładnikowe w celu przybliżenia zachowania formalnych sieci reakcji chemicznych (CRN), demonstrując nowe zastosowanie CRN jako molekularnego języka programowania.
Ogólnym celem tej procedury jest wyprowadzenie bramek przemieszczenia nici DNA z plazmidów bakteryjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje plazmid bakteryjny jako wysoce czyste źródło do generowania solidnych bramek DNA. Demonstrując tę procedurę, moi koledzy Sam Dip i ja, aby rozpocząć masową produkcję, a następnie izolować bramki zawierające DNA, używając zestawów do izolacji DNA, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym i zgodnie z instrukcjami producenta zgodnie z instrukcjami ellucian.
Zmierz stężenie plazmidowego DNA przy użyciu standardowych technik. Następnie trawi DNA, dodając cztery jednostki enzymu restrykcyjnego PV U2 HF na każdy miligram plazmidu. Następnie dodać do próbki dwie równoważne objętości lodowatego etanolu absolutnego.
Inkubować mieszaninę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę, aby wytrącić DNA. Następnie osadzać wytrącone DNA, odwirowując próbkę w temperaturze od 10 000 do 14 000 razy G i zero stopni Celsjusza przez 30 minut. Usunąć SNAT i dodać do próbki 1000 mikrolitrów 95% etanolu o temperaturze pokojowej.
Następnie odwrócić próbkę 10 do 15 razy, następnie odwirować próbkę w temperaturze od 10 000 do 14 000 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Po zakończeniu usuń supernatant i wysusz DNA na powietrzu na stole przez 10 do 20 minut. Podczas usuwania supernatantu z wytrąconego DNA należy uważać, aby nie naruszyć osadu, w przeciwnym razie wydajność zostanie znacznie zmniejszona.
Po wyschnięciu ponownie zawiesić osad DNA w ilości do 200 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz i wirować do wymieszania. Dodanie więcej niż 200 mikrolitrów wody na ogół sprawi, że próbka zostanie rozcieńczona do użycia. W eksperymentach kinetycznych, należy zmierzyć zawieszone DNA za pomocą spektrofotometru zgodnie z instrukcjami producenta.
Następnie dodać cztery jednostki enzymu nacinającego M-B-B-S-R-D po jednej na jeden mikrogram plazmidu i dodać odpowiedni bufor enzymatyczny. Inkubować próbkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez jedną godzinę w celu wytrawienia wspólnych bramek. Następnie trawić bramki wideł, dodając osiem jednostek enzymu nacinającego NT BST mb po jednej na jeden mikrogram plazmidu i odpowiedni bufor enzymatyczny.
Inkubować próbkę w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Aby przygotować reporterki fluorescencyjne, najpierw należy zawiesić i oznaczyć ilościowo próbki zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie wymieszaj 10 mikrolitrów dolnej nici reporterów z 13 mikrolitrami górnej nici wygaszającej w buforze EDTA z octanu trisu z 12,5 milimolem magnezu.
Aby upewnić się, że cała flora, cztery oznakowane pasma są ugaszone, należy dodać 30% nadwyżki pasma oznaczonego jako hartowniczego. Następnie anil kompleks reporterowy C za pomocą termocyklera. Schłodzić próbkę z 95 stopni Celsjusza do 20 stopni Celsjusza z szybkością jednego stopnia Celsjusza na minutę.
Po zakończeniu przechowuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza po kalibracji. Pomiary fluorescencji należy rozpocząć od ustawienia regulatora temperatury na 25 stopni Celsjusza, podczas gdy temperatura się ustabilizuje. Ustaw odpowiednie parametry dla pomiarów kinetycznych w oprogramowaniu do akwizycji danych.
Po otwarciu oprogramowania fluorymetru spektralnego ustaw szerokość poślizgu na 2,73 nanometra zarówno dla wzbudzenia, jak i emisji monochromatycznej. Następnie ustaw czas integracji na 10 sekund dla każdego 62. punktu czasowego i ustaw całkowity czas pomiaru na 24 godziny. Na koniec ustaw długości fal wzbudzenia i emisji tak, aby pasowały do lasu flory użytego w eksperymencie.
Następnie dodaj 410,2 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz i 52,8 mikrolitrów 10 dodatkowych octanowych EDTA zawierających 125 milimoli magnezu do syntetycznego ogniwa kwarcowego. Dodaj również dwa mikrolitry 300-milimolowych nici poli T, a następnie wiruj syntetyczne ogniwo kwarcowe przez 10 do 15 sekund. Następnie po dziewięciu mikrolitrach nici reporterowych o średnicy 10 mikromolów i sześciu mikrolitrach każdej nici pomocniczej o średnicy 10 mikromolów.
Następnie przy 45 mikrolitrach zarówno jointa, jak i widelca przy jednym mikromolu i delikatnie wymieszać roztwór, pipetując go w górę iw dół co najmniej 20 razy. Na koniec, w dziewięciu mikrolitrach 10% sodu do siarczanu przewodowego, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,15% SDS, delikatnie wymieszaj reakcję, pipetując w górę iw dół co najmniej 20 razy, natychmiast umieść syntetyczne komórki kwarcowe w komorze flutera widm i rozpocznij pomiar kinetyczny. Po pięciu minutach pomiaru dodaj trzy mikrolitry pasm wejściowych.
Dodaj 10 mikromolowców do syntetycznej komórki kwarcowej. Gdy program do akwizycji danych jest wstrzymany, delikatnie wymieszaj reakcję, pipetując ją w górę iw dół co najmniej 20 razy, a następnie zamknij osłonę lampy i kontynuuj rejestrowanie kinetyki reakcji, aż osiągnie stabilną wartość. Dane kinetyki stanu dla bramek pochodzących z plazmy i zsyntetyzowanych bramek są pokazane tutaj w eksperymentach.
Stężenie nici sygnałowej A jest stałe, podczas gdy ilość sygnału katalitycznego B jest zmienna. Sygnał C służy do odczytywania przebiegu reakcji bez przerywania. Obrót w cyklu katalitycznym definiuje się jako ilość sygnału C wytwarzanego dla każdego katalizatora B w danym momencie.
W przypadku idealnego układu katalitycznego ta liczba obrotu powinna rosnąć liniowo w czasie i być niezależna od ilości katalizatora, o ile substrat nie jest ograniczony. W tym miejscu zaobserwowano, że zsyntetyzowany układ odbiega od idealnego liniowego wzrostu obrotu znacznie wcześniej niż układ pochodzący z plazmy, co wskazuje na sekwestrację katalizatora w wyniku niepożądanej reakcji ubocznej. Porównano tutaj wyciek obwodu zarówno bramek pochodzących z plazmy, jak i zsyntetyzowanych i zaobserwowano, że stosunek sygnału wycieku przy użyciu bramek pochodzących z plazmy jest o około 8% mniejszy niż przy użyciu zsyntetyzowanych bramek po 10 godzinach reakcji.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować solidne bramki DNA z plazmidu bakteryjnego i testować bramki za pomocą pomiarów kinetyki fluorescencji.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę otrzymywania bramek wypierania nici DNA z plazmidów bakteryjnych oraz ich testowania za pomocą pomiarów kinetyki fluorescencji. Podejście to umożliwia modularne składanie bramek w systemy wieloskładnikowe, symulujące zachowanie formalnych sieci reakcji chemicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biotechnologia
- Biologia molekularna
- Biologia systemowa
Wstęp
- Bramki oparte na wypieraniu nici DNA są niezbędne dla programowania molekularnego.
- Plasmidy bakteryjne służą jako czyste źródło do generowania stabilnych bramek DNA.
- Pomiary kinetyki fluorescencji dostarczają informacji o wydajności bramek.
- Zrozumienie zachowania tych bramek może usprawnić projektowanie obwodów molekularnych.
Cel badania
- W celu wyprowadzenia bramek przemieszczania nici DNA z plazmidów bakteryjnych.
- W celu zademonstrowania wykorzystania kinetyki fluorescencji w testowaniu tych bramek.
- W celu porównania wydajności bramek pochodnych z plazmidów z bramkami syntetyzowanymi.
Zastosowane metody
- Izolacja i ilościowe oznaczenie plazmidowego DNA.
- Trawienie DNA przy użyciu enzymów restrykcyjnych.
- Przygotowanie fluorescencyjnych reporterów oraz ich kompleksów.
- Pomiary kinetyki fluorescencji w celu analizy wydajności bramki.
Główne wyniki
- Bramki pochodne plazmidów wykazały mniejszy prąd upływu obwodu w porównaniu do bramek syntetyzowanych.
- Turnover cyklu katalitycznego był bardziej stabilny w systemach pochodnych plazmidów.
- Pomiary fluorescencji wskazały na różnice w wydajności między typami bramek.
- Wytrzymałość bramek DNA została potwierdzona poprzez powtórne testy.
Wnioski
- Protokół umożliwia pomyślne generowanie i testowanie bramek DNA z plazmidów.
- Bramki pochodzące z plazmidów wykazują lepsze parametry wydajności.
- Metoda ta może przyczynić się do rozwoju programowania molekularnego i biologii syntetycznej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bramki wypierania nici DNA pochodzące z plazmidów umożliwiają skalowalną, wysokowierną produkcję programowalnych komponentów DNA dla obliczeń molekularnych i biologii syntetycznej. Podejście to odpowiada na potrzebę stosowania trwałych i powtarzalnych materiałów DNA w konstrukcji sieci reakcji chemicznych (CRNs) oraz urządzeń molekularnych. Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną i niezawodność operacyjną na styku biologii odkrywczej i inżynierii molekularnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę logiki molekularnej i ścieżek reakcji z wykorzystaniem programowalnych bramek DNA.
- Pozwala na minimalizację ryzyka biologicznego poprzez dostarczanie wysokiej czystości, spójnych komponentów DNA do badań mechanistycznych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w projektowaniu sieci molekularnych i walidacji funkcjonalnej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy bramek DNA do dalszych analiz kinetycznych i funkcjonalnych.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację analiz dzięki wykorzystaniu plazmidów jako źródła DNA.
- Umożliwia ilościowe odczyty fluorescencyjne w celu wiarygodnej oceny wydajności.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z inicjatywami biologii syntetycznej w zakresie programowalnych terapeutyków i diagnostyki molekularnej.
- Zapewnia ciągłość od projektowania molekularnego po walidację przedkliniczną systemów opartych na DNA.
- Wspiera rozwój programowalnych platform molekularnych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, dostarczając stabilne bramki DNA do testowania hipotez, opracowywania testów oraz inżynierii sieci molekularnych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie sieci reakcji chemicznych i molekularnych obwodów logicznych w oparciu o postawione hipotezy.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki fluorescencji do analizy porównawczej wydajności bramek DNA.
- Analityka: Dostarcza pomiarów kinetycznych i kwantyfikacji przecieków w celu optymalizacji decyzji projektowych.
- Badania translacyjne: Wspiera opracowywanie programowalnych systemów DNA o potencjalnych zastosowaniach translacyjnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia skalowalny, oparty na plazmidach przepływ pracy dla powtarzalnej produkcji bramek DNA w ramach różnych projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w konstrukcji sieci molekularnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje produkcję bramek DNA w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową w badaniach i rozwoju (R&D) biologii syntetycznej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programowalnych platform molekularnych z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu biologii molekularnej, przetwarzania enzymatycznego oraz kinetyki fluorescencji.
- Konieczny jest dostęp do zestawów do przygotowywania plazmidów, enzymów restrykcyjnych i nacinających oraz infrastruktury do spektrometrii fluorescencyjnej.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów przygotowania bramek DNA i pomiarów kinetycznych pomiędzy zespołami.
- Można potrzebować adaptacji dla różnych sekwencji DNA lub projektów sieci reakcyjnych.
- Potencjalne ograniczenia obejmują specyficzność enzymów oraz optymalizację warunków reakcji dla różnorodnych zastosowań.
