Sortowanie spermatyd myszy według cytometrii przepływowej w zależności od kroku

Ogólnym celem tej procedury jest rozdzielenie mysich spermatyd na cztery odrębne populacje, co pozwoli na molekularne badanie spermiogenezy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie reprodukcji lustrzanej, takie jak wpływ modelowania chromatycznego na integralność genomu. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona separację plemników na czystą populację komórek bez zanieczyszczenia krzyżowego.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zaobserwowaliśmy istotne zmiany w intensywności barwienia DN podczas przebudowy chromatyny w parametrach haplo w dniu poprzedzającym sortowanie komórek. Dodaj od jednego do dwóch mililitrów inaktywowanego termicznie FBS do pięciomililitrowych polipropylenowych okrągłych dna oraz 15 i 50 mililitrowych polipropylenowych rurek stożkowych. Następnie powoli pokryj rurki przez nocną inwersję w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze następnego dnia.

Ostrożnie zdekantować FBS za pomocą pipety P 200 w celu usunięcia wszelkich pozostałości FBS z probówek o pojemności 15 i 50 mililitrów i pozostawiając niewielką pozostałą objętość od 100 do 200 mikrolitrów FBS w pięciomililitrowych probówkach do zbierania oczyszczonych komórek w dniu komórki. Sortując, zmielić zamknięte w kapsułkach próbki do badań w 500 mikrolitrach buforu sortującego. Następnie przenieś fragmenty tkanek do 1,5 mililitrowej rurki za pomocą ściętej końcówki mikropipety.

Wypłukać komórki rozrodcze z kanalików nasiennych za pomocą delikatnego pipetowania w górę i w dół, a następnie przepłukać nienaruszoną końcówką. Następnie użyj sitka komórkowego o średnicy 40 mikronów, aby usunąć zanieczyszczenia i grudki zbierające filtrat w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów pokrytej FBS. Raz umyć filtr buforem sortującym do całkowitej objętości trzech mililitrów i przenieść filtrat do 15-mililitrowej stożkowej rurki pokrytej FBS.

Następnie dodaj 16 mikrolitrów EDTA na mililitr zawiesiny komórek do komórek i użyj 10-mililitrowej pipety, aby powoli utrwalić komórki w ciągu jednej minuty za pomocą trzech objętości lodowatego, 100% etanolu podczas wirowania z niską prędkością, zawiesina stanie się mleczna po utrwaleniu. Inkubować komórki na lodzie przez 15 minut, od czasu do czasu odwracając. Następnie odwirować zawiesinę komórkową, ponownie zawiesić paletę w dwóch mililitrach buforu sortującego i zabarwić komórki rozrodcze czterema mikrolitrami cyto 16 DNAD bezpośrednio przed sortowaniem.

Przefiltruj komórki przez filtr o grubości 50 mikronów do rurki faksowej z powłoką FBS i dokładnie umyj filtr jednym do dwóch mililitrów buforu sortującego. Załaduj utrwalone komórki rozrodcze do sortera komórek wyposażonego w laser o długości fali 488 nanometrów. Następnie wyświetl łączną liczbę zdarzeń z histogramem reprezentującym liczbę zdarzeń w obszarze piętra Alexa 4 88 i bramkują komórki barwiące dodatnie DNA.

Następnie wyświetl komórki z tej bramki w bocznym obszarze rozproszenia na tle wykresu i bramki obszaru punktowego do przodu. Komórki, jak wskazano, wyświetlają te bramkowane komórki w obszarze rozproszenia do przodu na tle obszaru podłogi Alexa 4 88, wykresu i bramy. Komórki ponownie wyświetlają te bramki na oddzielnych wykresach o szerokości piętra Alexa 4 88 względem piętra Alexa 4 88.

Spermiogeneza przechodzi od pierwszego do dziewiątego i od 10 do dwunastego. Plemniki można następnie bramkować w celu sortowania w celu zebrania kroków od 13 do 14 i od 15 do 16. Spermatydy wyświetlają komórki od pierwszej bramki do obszaru rozproszenia do przodu na wykresie i bramce EXOR 4 88.

Populacje komórek, jak wskazano. Następnie wyświetl te bramki w indywidualnej Alexie. Piętro 4 88 szerokość względem Alexa piętro 4 88 powierzchnia działek i bramy.

Kroki od 13 do 14 i od 15 do 16 plemniki do sortowania. Na koniec zbierz oczyszczone frakcje w 100 do 200 mikrolitrach FBS w pojedynczych pięciomililitrowych rurkach z okrągłym dnem pokrytych FBS na lodzie. Na tych obrazach pokazane jest delikatne zabarwienie posortowanych przepływowo porażonych populacji.

Etapy spermiogenezy od pierwszego do dziewięciu plemników zazwyczaj mają okrągłe jądra, które w spermiogenezie wydają się owalne. Krok dziewiąty plemniki, które są obserwowane jako wydłużone haczyki w krokach od 10 do 12. Spermiogeneza Etapy spermiogenezy od 13 do 14 i od 15 do 16 Spermatydy wykazują jądra o podobnym kształcie, ale o nieco innej intensywności barwienia DNA, co pozwala na identyfikację tych odrębnych populacji sper podczas ich sortowania za pomocą cytometrii przepływowej.

Zgodnie z zademonstrowanym protokołem, można oczekiwać, że czystość poszczególnych eksperymentalnych populacji S wyniesie od 95 do 100%Ta technika może być wykonana w ciągu sześciu do ośmiu godzin. Jeśli każdy krok zostanie wykonany prawidłowo. Należy pamiętać, aby zawsze utrzymywać komórki na lodzie przez cały czas trwania procedury, postępując zgodnie z tą procedurą, ponieważ można uzyskać odrębne populacje plemników, zapewniając wystarczającą ilość materiału do analizy molekularnej, takiej jak scharakteryzowanie dramatycznego procesu przebudowy lub zbadanie genetycznego wpływu tego przejścia.