Name: Sortowanie spermatyd myszy według cytometrii przepływowej w zależności od kroku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Poznaj strategię sortowania spermatyd myszy za pomocą cytometrii przepływowej, umożliwiającą uzyskanie czterech czystych populacji komórek. Ta metoda wspiera badania molekularne spermiogenezy bez zanieczyszczeń krzyżowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować dr Leonidowi Volkovowi i Éricowi Bouchardowi za ich techniczne porady dotyczące mikroskopii epifluorescencyjnej.
Wsparcie finansowe 
Ufundowane przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (grant #MOP-93781) dla G.B.

Opieka nad zwierzętami była zgodna z komitetem ds. opieki i użytkowania zwierząt Université de Sherbrooke.

1. Przygotowanie probówki
<ol>
	<li>Dzień przed sortowaniem komórek dodać 1-2 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 5 ml polipropylenowych probówek z okrągłym dnem oraz do 15 ml i 50 ml polipropylenowych probówek stożkowych. 
	Krok krytyczny: Upewnij się, że każda rurka używana w protokole jest powlekana. 
	Uwaga: Powłoka FBS zapobiega przywieraniu komórek rozrodczych do ścianek rurki.</li>
	<li>Powoli mieszać O/N przez odwrócenie w temperaturze 4 °C, aby równomiernie pokryć probówki za pomocą rotatora.</li>
	<li>Następnego dnia usuń FBS z powlekanych tub przez dekantację.
	<ol>
		<li>*Krok krytyczny: Upewnij się, że probówki z okrągłym dnem z polipropylenu o pojemności 5 ml oraz probówki o pojemności 15 i 50 ml używane do przygotowania komórek (kroki protokołu od 2.1 do 2.11) są całkowicie opróżnione z FBS, aby zapobiec wachlowaniu (tj. nieprecyzyjnemu odchyleniu strumieni bocznych). Użyj pipety P200, aby usunąć FBS. 
		Uwaga: Resztki FBS w probówkach przed sortowaniem mogą prowadzić do utraty komórek lub zanieczyszczenia innych probówek używanych podczas sortowania komórek, </li>
		<li>Pozostawić niewielką pozostałą objętość FBS (około 100-200 μl) w probówkach o pojemności 5 ml z okrągłym dnem z polipropylenu używanych do zbierania oczyszczonych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Uśmiercić jednego samca myszy pod narkozą za pomocąO2/izofluranu (indukcja na poziomie 5%, a następnie utrzymywana na poziomie 2%), a następnie uduszenieCO2.</li>
	<li>Wyciąć i usunąć kapsułkę z obu jąder i zmielić małymi nożyczkami w 500 μl buforu sortującego do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wypłukać komórki rozrodcze z kanalików nasiennych za pomocą delikatnego pipetowania w górę i w dół w probówce o pojemności 1,5 ml, najpierw za pomocą ściętej końcówki o pojemności 100-1000 μl, a następnie za pomocą nienaruszonej końcówki o pojemności 100-1000 μl.</li>
	<li>Usunąć zanieczyszczenia i grudki w jednym etapie filtracji za pomocą sitka komórkowego 40 μm i zebrać filtrat do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, uprzednio pokrytej FBS w kroku 1.</li>
	<li>Przemyć filtr raz buforem sortującym do całkowitej objętości 3 ml i przenieść filtrat do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, uprzednio pokrytej w kroku 1.</li>
	<li>Dodać 16 μl 50 mM EDTA pH 8 na mililitr zawiesiny komórek (48 μl na 3 ml), aby uzyskać końcowe stężenie 0,8 mM EDTA.</li>
	<li>Aby utrwalić komórki rozrodcze, powoli dodaj 3 objętości lodowatego 100% etanolu za pomocą pipety o pojemności 10 ml z delikatnym mieszaniem (wir na niskiej prędkości), co spowoduje powstanie mlecznej zawiesiny. 
	Krok krytyczny: Powolne dodawanie etanolu ma kluczowe i ważne znaczenie dla zachowania integralności preparatu komórkowego. Zauważyliśmy, że szybkie dodanie etanolu powoduje lizę komórek, co skutkuje znacznym spadkiem wydajności sortowania. W przypadku 3 ml zawiesiny komórkowej należy dodać 9 ml etanolu w ciągu około 1 minuty.</li>
	<li>Inkubować komórki na lodzie przez 15 minut, od czasu do czasu mieszając przez odwrócenie.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek o sile 800 x g przez 5 minut i usunąć klarowny supernatant.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić utrwalone komórki rozrodcze w 2 ml buforu sortującego.</li>
	<li>Dodać 4 μl barwnika DNA SYTO16 (1 mM roztwór w DMSO) i inkubować przez co najmniej 30 minut (chronić przed światłem). 
	Uwaga: Najlepsze wyniki sortowania uzyskuje się przy użyciu SYTO16, ponieważ jest to przepuszczalny barwnik DNA, który łatwo wbudowuje się w wysoce zbite jądra spermatydów.</li>
</ol>
3. Konfiguracja sortera komórek
Uwaga: Tutaj używany jest 4-laserowy (405 nm - fioletowy, 488 nm - niebieski, 561 nm - żółto-zielony, 633 nm - czerwony) 20-parametrowy sorter komórek BDFACSAria III. Oprogramowanie BD FACSDiva 6.1.3 służy do wizualizacji i analizy danych. Ustawienia mogą się różnić w zależności od typu używanego sortera.
<ol>
	<li>Wysterylizuj sortownik FACS, uruchamiając 70% etanolu jako płyn osłonowy podczas procedury wyłączania fluidics (menu "Cytometr" w oprogramowaniu) przed sortowaniem. Wybierz "Cytometr" na pasku narzędzi oprogramowania i wybierz "Wyłączenie płynowe". Postępuj zgodnie z krokami wymienionymi przez procesy.</li>
	<li>Przygotuj i przefiltruj 1x PBS z filtrem 0,22 μm, aby wyeliminować wszelkie kryształy i zanieczyszczenia. Napełnij zbiornik osłony do górnej linii spawania po wewnętrznej stronie zbiornika.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie i zaloguj się. Uruchom sortownik FACS, aby rozgrzać lasery przez co najmniej 30 minut przed sortowaniem. Uruchom dwa procesy uruchamiania fluidycznego, aby wypłukać etanol z fluidyki. Wybierz "Cytometr" na pasku narzędzi oprogramowania i wybierz "Uruchamianie Fluidic". Postępuj zgodnie z krokami wymienionymi przez procesy. 
	Uwaga: To przywraca płyny z normalnym płynem osłonkowym (1x PBS).</li>
	<li>Wyczyść blok sortujący i płytki odchylające wodą destylowaną i dokładnie je wysusz. Sonikować dyszę 100 μm umieszczoną w probówce z wodą destylowaną na 2 minuty w kąpieli sonikacyjnej. Dokładnie wytrzyj dyszę.</li>
	<li>Włóż dyszę 100 μm do komory przepływowej i przekręć dźwignię blokującą dyszę zgodnie z ruchem wskazówek zegara do pozycji 12 godzin. Ustaw ciśnienie w osłonie na 20 psi.</li>
	<li>Włącz strumień i dostosuj amplitudę, aby uzyskać docelowe wartości częstotliwości (około 30), Drop 1 (około 150) i Gap (około 12) oraz aby ustalić stabilny wzór zrywania kropli (kilka zrzutów satelitów). Wyłącz tłumienie.</li>
	<li>Upewnij się, że strumień jest prosty i uderza w środek aspiratora odpadów, zmieniając kąt bloku sortowania. Uwaga: Przetestowano również dyszę 130 μm przy ciśnieniu 10 psi i nie znaleziono żadnej oczywistej różnicy.</li>
	<li>Ustaw opóźnienie lasera na 0 dla lasera niebieskiego, -77,39 dla czerwonego, 37,33 dla fioletowego i -39,85 dla żółto-zielonego.</li>
	<li>Ustaw skalowanie obszarów na 1,14 dla niebieskiego, 1,0 dla czerwonego, 0,75 dla fioletowego i 0,96 dla żółto-zielonego lasera.</li>
	<li>Korzystając z sortowania testowego (w oknie "Strumień boczny" oprogramowania), upewnij się, że strumienie boczne nie są wachlowane. W oknie "Strumień boczny" wyreguluj suwaki napięcia każdego strumienia bocznego tak, aby uderzały w środek probówki do pobierania testów. Jeśli strumień środkowy nie jest ciasny, dostosuj ustawienia 2., 3. i 4. kropli, aby ograniczyć strumień środkowy.</li>
	<li>Uruchom aplikację Cytometer Setup and Tracking (CS&T) w oprogramowaniu (menu "Cytometr").</li>
	<li>Użyj konfiguracji cytometru i kulek śledzących w ilości 1 kropli na 350 μl, aby zautomatyzować charakterystykę i śledzenie działania cytometru zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Zamknij aplikację CS&T. Zastosuj ustawienie CS&T, upewnij się, że parametry strumienia nadal pozwalają na stabilny wzór odrywania kropli i włącz przycisk Sweet Spot zgodnie z instrukcją producenta (w "Oknie przerwania").</li>
	<li>Zoptymalizuj wartość opóźnienia upuszczania za pomocą koralików fluorescencyjnych (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Zamontuj probówki zbiorcze w uchwycie. Otwórz drzwi bloku sortowania. W oknie "Strumień boczny" włącz napięcie, a następnie wybierz "Sortowanie testowe" i kliknij przycisk Szuflada aspiratora, aby otworzyć szufladę i uzyskać dostęp do probówek zbiorczych.</li>
		<li>Zoptymalizuj strumienie boczne tak, aby wchodziły do środka rury. Dostosuj wartości i suwaki zgodnie z potrzebami.</li>
		<li>Zamknij drzwiczki bloku sortowania i upewnij się, że wyregulowałeś pokrętło mikrometru, aby uzyskać najjaśniejsze miejsce koralika pośrodku. Odznacz szufladę na odpady, przetestuj sortowanie i napięcie. Wyjmij probówki zbiorcze.</li>
		<li>Zoptymalizuj opóźnienie upuszczenia zgodnie z instrukcjami producenta.
		<ol>
			<li>Krótko wstrząsnąć energicznie fiolką z kulkami i rozcieńczyć 1 kroplę kulek w 0,5 ml PBS.</li>
			<li>Korzystając z instrukcji producenta, ustaw opóźnienie upuszczenia, korzystając z szablonu eksperymentu Drop Delay dostępnego w oprogramowaniu. Alternatywnie użyj funkcji Auto Drop Delay, aby ustawić opóźnienie upuszczania.</li>
			<li>Załaduj rurkę z koralikami fluorescencyjnymi i dostosuj natężenie przepływu, aż szybkość progowa wyniesie ~ 3,000 do 4,000 zdarzeń / sekundę. Ustaw dokładność sortowania na "Początkową", a na końcu na "Dostosuj dostosowanie" w oknie "Sortuj układ". Wybierz filtr optyczny i posortuj koraliki. Dostosuj opóźnienie upuszczania, aż ~100% zostanie posortowane po lewej stronie. 
			Uwaga: Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby upewnić się, że interesujące komórki są sortowane w strumieniu bocznym. Kulki i filtr optyczny służą do uzyskania blisko 100% odchylenia kropli. </li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść filtr FSC 1.5 ND (o neutralnej gęstości) na lewym końcu bloku detektora FSC. Ustaw rozszerzenie okna na 2,00 μs i skalowanie obszaru FSC na 1,00 (w zakładce "Laser" w oknie "Cytometr").</li>
	<li>Przed załadowaniem probówki z próbką należy umieścić przewód filtra do próbki o długości 50 μm na końcu linii próbkowania, aby uniknąć zbrylania. Aby to zrobić, wybierz "Zmień filtr próbki" w menu "Cytometr".</li>
	<li>Zbadać skład płynu w próbce, aby uzyskać dobrą separację bez wachlowania między strumieniami bocznymi i zapobiec przywieraniu komórek do rurek polipropylenowych.
	<ol>
		<li>Załaduj probówkę z próbką, włącz płytki odchylające i wybierz "Sortowanie testowe" przy zamkniętej szufladzie. Spójrz na strumienie boczne, jeśli separacja następuje bez zbyt dużego wentylatora. 
		Uwaga: Wachlowanie jest prawdopodobnie spowodowane wysokim stężeniem białka w buforze próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj probówkę z próbką do przyrządu FACS. Wybrać mieszanie próbki 300 obr./min i temperaturę próbki 4 °C. Wybierz opcję "Acquire Data" (Pobieranie danych) w menu "Acquisition Dashboard" (Pulpit nawigacyjny akwizycji).</li>
	<li>W razie potrzeby rozcieńczyć próbkę, aby osiągnąć odpowiednią szybkość zdarzeń do maksymalnej liczby 5 000 zdarzeń/s (przy maksymalnym natężeniu przepływu 3,0). Należy ściśle przestrzegać tych limitów, aby zachować czystość sortowanych komórek.</li>
	<li>Aby przeanalizować i posortować komórki, zoptymalizuj wartość progową FSC, aby wyeliminować zanieczyszczenia bez ingerencji w badaną populację. W skali logarytmicznej wyreguluj napięcie detektora fotopowielacza (PMT) z filtrem 530/30, aby upewnić się, że sygnał fluorescencji całej populacji mieści się w skali i bramce na populacji dodatniej (Rysunek 1, Bramka 1).</li>
	<li>Utwórz wykres obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A)/obszaru rozproszenia bocznego (SSC-A) populacji dodatniej SYTO16 i dostosuj FSC-A do około 110 V w skali liniowej, a SSC-A do około 150 V w skali logarytmicznej, aby zobrazować wszystkie zdarzenia, wykluczając bardzo duże komórki i agregaty komórek.</li>
	<li>W oknie "Układ sortowania" ustaw "Tryb precyzji sortowania" na "Czystość 4-kierunkowa" (Maska wydajności: 0, Maska czystości: 32, Maska fazy: 0). Wybierz "Ciągłe" z menu "Zdarzenia docelowe", aby sortować ciągło.</li>
	<li>Dodaj populacje do sortowania w polu odpowiadającym rurom (w oknie "Sortuj układ"). Populacje o wyższych częstotliwościach należy umieszczać pośrodku, a populacje o niższych częstotliwościach na końcach. Ustaw tabliczki napięcia na 2 500 V. Podczas sortowania probówki do pobierania próbek należy przechowywać na lodzie. </li>
</ol>
4. Sortowanie komórek
<ol>
	<li>Bezpośrednio przed sortowaniem przefiltrować komórki za pomocą filtra 50 μm w uprzednio powlekanej probówce z okrągłym dnem o pojemności 5 ml z polipropylenu.</li>
	<li>Dokładnie umyć filtr 1-2 ml buforu sortującego.</li>
	<li>Sortuj utrwalone komórki rozrodcze za pomocą sortera komórek wyposażonego w laser 488 nm zgodnie ze schematem bramkowania opisanym na rysunku 1. Oczyszczone frakcje zebrać w 5 ml polipropylenowych probówkach z okrągłym dnem, uprzednio pokrytych lodem w sekcji 1.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że 100-200 μl FBS jest przechowywane w probówkach zbiorczych, aby uniknąć przywierania posortowanych komórek do ścianki probówki.</li>
		<li>Upewnij się, że stężenie SYTO16 jest nasycone, aby uniknąć wahań fluorescencji w okresie sortowania. SYTO16 nasyca się, gdy nie ma dalszych zmian intensywności barwienia komórek przy parametrze Alexa Fluor 488 (barwienie DNA) na grafice sortowania. W razie potrzeby dodać 1 μl SYTO16 do probówki sortującej, aby osiągnąć nasycenie.</li>
		<li>Wyświetl łączną liczbę zdarzeń na grafice wyświetlającej następujące parametry: liczba zdarzeń w porównaniu z Alexa Fluor 488-A.</li>
		<li>Wybierz dodatnie komórki barwiące DNA za pomocą bramki 1, jak pokazano na rysunku 1.
		<ol>
			<li>Wyświetlanie komórek od bramki 1 na grafice przy użyciu parametrów SSC-A vs FSC-A
			<ol>
				<li>Wybierz komórki z bramką 2, jak pokazano na rysunku 1.</li>
				<li>Wyświetlaj komórki od bramki 2 na grafice, używając FSC-A vs Alexa Fluor 488-A jako parametrów.</li>
				<li>Wybierz komórki z bramką 5 i bramką 6 na grafice bramki 2, jak pokazano na rysunku 1.</li>
				<li>Wyświetlaj oddzielnie bramkę 5 i bramkę 6 na grafice, używając parametrów Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A.</li>
				<li>Wybierz kroki spermiogenezy 1-9 spermatydy na grafice bramki 5 i kroki spermiogenezy 10-12 spermiogenezy na grafice bramki 6, jak pokazano na rysunku 1.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Wyświetlanie komórek od bramki 1 na grafice przy użyciu parametrów FSC-A vs Alexa Fluor 488-A
			<ol>
				<li>Wybierz komórki z bramką 3 i bramką 4, jak pokazano na rysunku 1.</li>
				<li>Wyświetlaj oddzielnie bramkę 3 i bramkę 4 na grafice, używając parametrów Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A.</li>
				<li>Wybierz kroki spermiogenezy 13-14 spermatydy na grafice bramki 3 i kroki spermiogenezy 15-16 spermiogenezy na grafice bramki 4, jak pokazano na rysunku 1. </li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+production+of+fertile+sperm+from+murine+spermatogonial+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines.</a> Nat. Commun. 2, 472(2011).</li>
<li>Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+actin+and+myosin+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">The role of actin and myosin during spermatogenesis.</a> Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).</li>
<li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+junction+dynamics+in+the+testis%3A+Sertoli-germ+cell+interactions+and+male+contraceptive+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development.</a> Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).</li>
<li>Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+the+murine+testis+during+the+first+wave+of+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li>
<li>Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+during+chromatin+remodeling+in+elongating+spermatids+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice.</a> Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).</li>
<li>Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+transition+nuclear+proteins+in+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis.</a> Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).</li>
<li>Grégoire, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-driven+de+novo+mutations+in+haploid+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Male-driven de novo mutations in haploid germ cells.</a> Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).</li>
<li>Simard, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+trinucleotidic+repeats+during+chromatin+remodeling+in+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids.</a> Hum. Mutat. , (2014).</li>
<li>Wykes, S. M., Krawetz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+spermatogenic+cells+from+adult+transgenic+mouse+testes+using+unit-gravity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation.</a> Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).</li>
<li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).</li>
<li>Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+throughout+the+first+wave+of+spermatogenesis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat.</a> Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).</li>
<li>Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+specific+stages+of+spermatids+from+vitamin+A-synchronized+rat+testes+for+assessment+of+nucleoprotein+changes+during+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis.</a> Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).</li>
<li>van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+the+seminiferous+epithelium+after+vitamin+A+replacement+in+vitamin+A-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice.</a> Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).</li>
<li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Kovtun, I. V., McMurray, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+expansion+in+haploid+germ+cells+by+gap+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair.</a> Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).</li>
<li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).</li>
<li>Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+method+to+isolate+round+spermatids+from+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis.</a> Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Badanie komórek plemnikotwórczych zawsze stanowiło wyzwanie ze względu na złożoność nabłonka nasiennego, a także ograniczony sukces hodowli in vitro . Z biegiem lat opracowano wiele podejść do oczyszczania komórek rozrodczych różnych gatunków. Techniki sedymentacji wykorzystujące oczyszczanie grawitacyjne za pomocą gradientów albuminy Percoll lub surowicy bydlęcej zwykle zapewniają dobrą wydajność nienaruszonych komórek rozrodczych, ale brakuje odpowiedniej definicji między niektórymi typami komórek, takimi jak ...

Haploidalne okrągłe spermatydy różnicują się w plemniki w procesie zwanym spermiogenezą. Obejmuje to wiele różnych etapów, w tym nabycie wici, przebudowę chromatyny i cytoszkieletu, kondensację jądra, a także utratę większości cytoplazmy. Te unikalne zdarzenia komórkowe muszą być precyzyjnie regulowane, aby wytworzyć dojrzałą funkcjonalną gametę z nienaruszonym genomem nadającym się do zapłodnienia. Spermiogenezę trudno jest badać in vitro, ponieważ do tej pory żaden niezawodny system hodowli komórkowej nie był w stanie wspierać postępu na różnych etapach procesu. Co więcej, rzeczywiste techniki in vitro prowadzą do niskiej wydajności1,2. In vivo prawidłowe przejścia przez różne etapy spermiogenezy mają kluczowe znaczenie dla naturalnej integralności funkcjonalnej męskiej gamety. Skuteczne oczyszczanie plemników zgodnie z ich etapami różnicowania nigdy nie zostało osiągnięte przy poziomie wzbogacenia wystarczającym do molekularnej charakterystyki spermiogenezy. Na przykład oczyszczanie kluczowych etapów różnicowania plemników byłoby szczególnie przydatne do badania rozwijającego się akrosomu, tworzenia części środkowej3, dynamiki połączeń komórkowych4, dynamiki RNA5, procesu przebudowy chromatyny6,7 lub stabilności genomu8. Oczyszczanie plemników jest utrudnione przez ich postępującą transformację morfologiczną, brak znanych biomarkerów zewnętrznych specyficznych dla danego stadium oraz ich specyficzny kształt i rozmiar. 
Chociaż większość męskich komórek rozrodczych wykazuje bezpośredni związek między barwieniem DNA a ploidalnością (zawartością DNA), zauważyliśmy, że taka pozytywna korelacja nie ma już zastosowania do spermatyd. Wynika to z naszej wczesnej obserwacji, że odcinki kanalików nasiennych wykazują różną intensywność barwienia DNA na różnych etapach spermiogenezy. Chociaż barwienie DNA jest zgodne z ich haploidalnym zestawem chromosomów z etapów spermiogenezy od 1 do 7 (okrągłe spermatydy), zaobserwowaliśmy gwałtowny wzrost intensywności fluorescencji z DAPI lub SYTO 16 na początku reorganizacji jądrowej i przebudowy chromatyny (etap spermiogenezy 8) osiągając szczyt na początku kondensacji jądrowej (kroki spermiogenezy 11-12). Po kondensacji jądra intensywność barwienia DNA zmniejsza się aż do spermiogenezy (etap spermiogenezy 16). Przypuszczaliśmy, że jest to prawdopodobnie związane z powstaniem ich osobliwego przejścia struktury chromatyny, w którym histony są zastępowane protaminami. W związku z tym opracowaliśmy niezawodną metodę cytometrii przepływowej, która umożliwia separację spermatyd przy użyciu zmienności intensywności DNA spermatyd jako głównego parametru selekcyjnego.
Opisano proste podejście cytometrii przepływowej do rozdzielania mysich spermatyd o wysokiej czystości (95-100%) na podstawie ich pozornej zawartości DNA (barwienie SYTO16), wielkości i ziarnistości. Spermatydy są podzielone na cztery populacje; Etapy spermiogenezy 1-9, 10-12, 13-14 i 15-16. Oczyszczone spermatydy nadają się do analizy genetycznej/genomicznej, a także do zastosowań proteomicznych, jak opisano w niedawnej publikacji naszej grupy9.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>ABBOT</td><td>05260-05</td><td>Do znieczulenia myszy przed eutanazją</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Żubr</td><td>90150</td><td>Do powlekania probówki</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT</td><td>Do sortowania preparatu buforowego</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H</td><td>Do sortowania preparatu buforowego</td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Les alcools de commerce</td><td>092-09-11N</td><td>Do utrwalania komórek</td></tr><tr><td>SYTO 16</td><td>Life Technologies</td><td>S7578</td><td>Barwienie DNA</td></tr><tr><td>5 ml polipropylenowe probówki z okrągłym dnem</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td>Kolekcja sortowanych komórek</td></tr><tr><td>15 ml polipropylenowe stożkowe probówki z dnem</td><td>PROgene</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polipropylenowe stożkowe probówki z dnem</td><td>PROgene</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator anestezjologiczny TEC4</td><td>Ohmeda</td><td>1160526</td><td>Do eutanazji myszy</td></tr><tr><td>Zbiornik gazu CO2</td><td>Praxair</td><td>C799117902</td><td>Do eutanazji</td></tr><tr><td>myszy Zbiornik gazu O2</td><td>Praxair</td><td>O254130501</td><td>Do eutanazji myszy</td></tr><tr><td>Domowa komora</td><td></td><td></td> gazowa myszy <td>Do eutanazji myszy</td></tr><tr><td>40 &mikro; m Sitko do komórek Falcon</td><td>Corning Incorporated</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; m Filtry linii próbkowania</td><td>BD Biosciences</td><td>649049</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik Vortex</td><td>Labnet international, inc.</td><td>S0200</td><td>Do utrwalania komórek</td></tr><tr><td>Wirówka Dynac</td><td>Clay Adams</td><td>101</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50 &micro; m filtry</td><td></td><td>Partec 04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>488 nm laserowy sortownik komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria III</td><td></td></tr><tr><td>Accudop Koraliki fluorescencyjne</td><td>BD Biosciences</td><td>345249</td><td></td></tr><tr><td>Bufor sortujący: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8,0, 25 mM HEPES pH 7,0, 1% FBS</td><td></td><td></td><td>FBS jest inaktywowany termicznie. Przygotuj świeży roztwór, 0,22 &mu; m przefiltrowane i przechowywać w temperaturze 4& st. C.</td></tr></tbody></table>

sortowanie spermatyd myszy według cytometrii przepływowej w zależności od kroku

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Różnicowanie mysich plemników jest jednym z kluczowych procesów dla produkcji funkcjonalnej męskiej gamety z nienaruszonym genomem, która ma być przekazywana następnemu pokoleniu. Dotychczasowe badania molekularne tego przejścia morfologicznego były utrudnione ze względu na brak metody pozwalającej na odpowiednie rozdzielenie tych ważnych etapów różnicowania spermatyd do kolejnych analiz. Wcześniejsze próby prawidłowego bramkowania tych komórek za pomocą cytometrii przepływowej mogły być utrudnione ze względu na swoisty wzrost fluorescencji DNA u spermatyd poddawanych przebudowie chromatyny. Opierając się na tej obserwacji, przedstawiamy szczegóły prostego schematu cytometrii przepływowej, umożliwiającego powtarzalne oczyszczanie czterech populacji mysich spermatyd związanych etanolem, z których każda reprezentuje inny stan w procesie przebudowy jądrowej. Wzbogacenie populacji potwierdza się za pomocą markerów specyficznych dla danego kroku i kryteriów morfologicznych. Oczyszczone spermatydy mogą być wykorzystywane do analiz genomicznych i proteomicznych.

Strategia bramkowania zastosowana w cytometrii przepływowej
Rysunek 1 przedstawia strategię bramkowania zastosowaną w cytometrii przepływowej w celu sortowania czterech wysoce czystych populacji spermatyd. W skrócie, komórki z pozytywnym barwieniem DNA (Alexa Fluor 488-A) są najpierw wyselekcjonowane za pomocą Bramy 1 (Gate 1). Spermatydy z etapów 1–12 spermiogenezy są wybierane (Brama 2) na wykresie kropkowym p...

Opisujemy strategię sortowania plemników myszy za pomocą cytometrii przepływowej. Spermatydy są podzielone na cztery wysoce czyste populacje, w tym okrągłe (etapy spermiogenezy 1-9), wczesne wydłużające się (etapy spermiogenezy 10-12), późne wydłużające się (etapy spermiogenezy 13-14) i wydłużone spermioidy (etapy spermiogenezy 15-16). Barwienie DNA, wielkość i ziarnistość są wykorzystywane jako parametry selekcji.

Sortowanie spermatyd myszy według cytometrii przepływowej w zależności od kroku

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rozdzielenie spermatyd mysich na cztery odrębne populacje, co umożliwia badanie molekularne spermiogenezy. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie reprodukcji, takie jak wpływ remodelowania chromatyny na integralność genomu. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie separacji plemników na czyste populacje komórek bez zanieczyszczeń krzyżowych.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zaobserwowaliśmy istotne różnice w intensywności barwienia DNA podczas przebudowy chromatyny w parametrach haplo w dniu poprzedzającym sortowanie komórek. Należy dodać od 1 do 2 ml dezaktywowanego termicznie FBS do 5 ml polipropilenowych probówek z okrągłym dnem oraz do 15 i 50 ml polipropilenowych probówek stożkowych. Następnie probówki należy powoli pokryć warstwą białka, pozostawiając je na noc w temperaturze 4 °C na rotatorze.Ostrożnie odlej FBS za pomocą pipety P 200, aby usunąć pozostałości FBS z probówek 15 i 50 ml, pozostawiając niewielką objętość resztkową od 100 do 200 µl FBS w probówkach 5 ml w celu zebrania oczyszczonych komórek w dniu sortowania komórek. Posiekaj enkapsulowane fragmenty testowe w 500 µl buforu do sortowania. Następnie przenieś fragmenty tkanki do probówki 1,5 ml, używając uciętego końcówki mikropipety.Wypłucz komórki zarodkowe z kanalików nasiennych, delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół, a następnie przepłucz je, używając nienaruszonej końcówki. Następnie użyj sitka komórkowego o oczkach 40 micron, aby usunąć zanieczyszczenia i agregaty, zbierając filtrat do probówki stożkowej o pojemności 50 milliliter pokrytej FBS. Przepłucz filtr raz buforem do sortowania, aż do uzyskania całkowitej objętości trzech milliliters, a następnie przenieś filtrat do probówki stożkowej o pojemności 15 milliliter pokrytej FBS.Następnie do komórek należy dodać 16 µL EDTA na każdy mililitr zawiesiny komórkowej i za pomocą pipety 10 mL powoli utrwalić komórki w ciągu jednej minuty, dodając trzy objętości lodowatego, 100% etanolu przy jednoczesnym mieszaniu na wirówce typu vortex z niskimi obrotami; po utrwaleniu zawiesina stanie się mętna. Komórki należy inkubować w lodzie przez 15 minut, sporadycznie odwracając probówkę. Następnie zawiesinę komórkową należy odwirować, osad zawiesić w 2 mL buforu do sortowania i bezpośrednio przed sortowaniem zbarwić komórki rozrodcze za pomocą 4 µL cyto 16 DNAD.Przefiltruj komórki przez filtr o rozmiarze oczek 50 µm do probówki fax powlekanej FBS i dokładnie wypłucz filtr jednym do dwóch mililitrów buforu do sortowania. Załaduj utrwalone komórki zarodkowe do sortera komórek wyposażonego w laser 488 nm. Następnie wyświetl całkowitą liczbę zdarzeń na histogramie przedstawiającym liczbę zdarzeń w zależności od pola Alexa Fluor 488 i wyznacz bramkę dla komórek z pozytywnym barwieniem DNA.Następnie wyświetl komórki z tej bramki na wykresie powierzchniowego rozproszenia bocznego (side scatter area) względem powierzchniowego rozproszenia przedniego (forward scatter area) i wyznacz bramkę. Dla wskazanych komórek wyświetl te bramkowane komórki na wykresie powierzchniowego rozproszenia przedniego względem obszaru Alexa Fluor 488, a następnie wyznacz bramkę. Ponownie wyświetl komórki z tych bramek na osobnych wykresach szerokości sygnału Alexa Fluor 488 względem powierzchni sygnału Alexa Fluor 488.Etapy spermiogenezy od pierwszego do dziewiątego oraz od dziesiątego do dwunastego. Następnie spermatydy mogą zostać poddane bramkowaniu w celu sortowania, aby zebrać etapy od trzynastego do czternastego oraz od piętnastego do szesnastego. Spermatydy wyświetlają komórki z pierwszej bramki w obszarze rozproszenia przedniego względem wykresu i bramki obszaru EXOR 4 88.Populacje komórek zgodnie z oznaczeniami. Następnie wyświetl te bramki na oddzielnych wykresach Alexa Fluor 488 width względem Alexa Fluor 488 area i wyznacz bramki.Kroki od 13 do 14 oraz od 15 do 16 opisują sortowanie plemników. Na koniec należy zebrać oczyszczone frakcje w 100 do 200 µL FBS w osobnych probówkach o okrągłym dnie o pojemności 5 ml, powlekanych FBS, w warunkach chłodzenia na lodzie. Na tych obrazach przedstawiono barwienie DAPI posortowanych w przepływie populacji plemników.Spermatydy w etapach spermiogenezy od pierwszego do dziewiątego zazwyczaj wykazują okrągłe jądra, które w trakcie spermiogenezy przyjmują kształt owalny. Spermatydy w etapie dziewiątym oraz te obserwowane w etapach od dziesiątego do dwunastego przyjmują formę wydłużonych haczyków. Spermatydy w etapach spermiogenezy od trzynastego do czternastego oraz od piętnastego do szesnastego wykazują jądra o podobnym kształcie, lecz z nieco różną intensywnością barwienia DNA, co pozwala na zidentyfikowanie tych odrębnych populacji spermatyd podczas ich sortowania za pomocą cytometrii przepływowej.Stosując zaprezentowany protokół, oczekiwana czystość poszczególnych populacji badanego S powinna wynosić od 95 do 100%. Całą technikę można przeprowadzić w ciągu od sześciu do ośmiu godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania każdego etapu. Należy pamiętać, aby przez cały czas trwania procedury utrzymywać komórki w lodzie. Dzięki zastosowaniu tej metody można uzyskać odrębne populacje plemników, zapewniając wystarczającą ilość materiału do analiz molekularnych, takich jak charakterystyka gwałtownego procesu przebudowy chromatyny czy badanie wpływu genetycznego tego przejścia.

step-specific-sorting-of-mouse-spermatids-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano wydajną metodę otrzymywania wysokiej czystości żywych frakcji meiotycznych z jądra myszy, która łączy udoskonalony protokół dysocjacji komórek z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS). Metoda ta wykorzystuje różnice w zawartości DNA oraz gęstości jąder poszczególnych frakcji meiotycznych.

Oczyszczanie komórek meiotycznych myszy metodą cytometrii przepływowej

Opisano nowy protokół mechanicznego przygotowania zawiesin komórek jąder z materiału gryzoni, unikając enzymów i detergentów. Metoda jest bardzo prosta, szybka, powtarzalna i pozwala uzyskać dobrej jakości zawiesiny komórek, które nadają się do sortowania przepływowego i ekstrakcji RNA.

Prosta i skuteczna technika przygotowania zawiesin komórek jąder

Metoda STA-PUT pozwala na rozdzielanie różnych populacji komórek spermatogennych na podstawie wielkości i gęstości.

Separacja typów komórek spermatogennych za pomocą sedymentacji prędkości STA-PUT

Mejoza to proces rozwojowy, w którym gamety są formowane przez pojedynczą rundę replikacji DNA i dwie kolejne rundy segregacji chromosomów. Mejozę ssaków można zbadać, wykorzystując technikę przygotowania mejotycznych rozsiewów chromosomów. W tym miejscu przedstawiono metodę przygotowania jąder rozsianych powierzchniowo ze spermatocytów myszy.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów myszy

Ta praca opisuje standaryzację metody uzyskiwania oczyszczonych populacji komórek rozrodczych z tkanki jąder różnych gatunków ssaków. Jest to prosty protokół, który łączy mechaniczną dysocjację jąder, barwienie za pomocą Hoechst-33342 i jodku propidyny oraz sortowanie FACS, z szerokim zastosowaniem w badaniach porównawczych biologii rozrodu mężczyzn.

Ustandaryzowane podejście do wielogatunkowego oczyszczania męskich komórek rozrodczych ssaków za pomocą mechanicznej dysocjacji tkanek i cytometrii przepływowej

Celem tej techniki zgniatania kanalików jest szybka ocena cech cytologicznych rozwijających się mysich spermatocytów przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórkowej. Metoda ta pozwala na badanie wszystkich etapów spermatogenezy i może być łatwo stosowana wraz z innymi biochemicznymi i molekularnymi podejściami biologicznymi do badania mejozy myszy.

Technika squasha kanalików nasiennych do cytologicznej analizy spermatogenezy z wykorzystaniem modelu mysiego

Prezentowany tutaj jest protokół wzbogacania spermatocytów pachytenowych, okrągłych spermatyd i wydłużania spermatyd z jąder dorosłych myszy za pomocą nieciągłego gradientu gęstości albuminy surowicy bydlęcej za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Wzbogacanie spermatocytów pachytenowych i spermatydów z jąder myszy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną metodę izolowania żywych mejotycznych i postmejotycznych komórek rozrodczych od jąder dorosłych myszy. Korzystając z barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, wzbudzonego fioletem i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, można wyizolować wysoce wzbogacone populacje komórek spermatogennych do wielu dalszych zastosowań.

Izolacja mysich komórek spermatogennych za pomocą fioletowo-wzbudzonego, przepuszczalnego dla komórek barwnika wiążącego DNA

Ten artykuł opisuje in-vivo hamowanie CENP-E poprzez operację jamy brzusznej i wstrzyknięcie do jąder GSK923295, cenny model męskiego podziału mejotycznego. Korzystając z testów immunofluorescencji, cytometrii przepływowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej, pokazujemy, że hamowanie CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów i niestabilność genomu w spermatocytach myszy.

Ocena funkcjonalna kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach za pomocą inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej

Tutaj wprowadzamy metodę wykonywania okrągłych wstrzyknięć spermatyd (ROSI) u myszy, technikę o obiecujących zastosowaniach klinicznych i użyteczność do badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju embrionalnego.

Wstrzyknięcie okrągłego plemnika myszy

Poznaj strategię sortowania spermatyd myszy za pomocą cytometrii przepływowej, umożliwiającą uzyskanie czterech czystych populacji komórek. Ta metoda wspiera badania molekularne spermiogenezy bez zanieczyszczeń krzyżowych.

Sortowanie spermatyd myszy według cytometrii przepływowej w zależności od kroku

Przeglądaj więcej filmów