Wstrzyknięcie okrągłego plemnika myszy

Wstrzyknięcie okrągłego plemnika może rozwiązać problem reprodukcji u niektórych pacjentów z azoospermią nieobturacyjną, ale jego skuteczność jest bardzo niska. W naszym badaniu wykorzystaliśmy myszy jako modele do poszukiwania metod poprawy efektywności rozwoju embrionalnego ROSI u myszy. Niepełne statystyki wskazują, że na całym świecie urodziło się mniej niż 200 ludzkich płodów poczętych w wyniku ROSI.

Punkt zwrotny w zrozumieniu potencjału technologii ROSI nastąpił w 2015 roku, kiedy Tanaka i współpracownicy poinformowali o udanych narodzinach 14 płodów dzięki technologii ROSI, wzbudzając ponowne zaufanie do jej klinicznego zastosowania i wykonalności. Obecnie badania ROSI koncentrują się na nieprawidłowościach w modyfikacjach epigenetycznych i nieprawidłowej aktywacji wspomaganej oocytami, podczas gdy dokładna identyfikacja okrągłych danych plemników jest również wyzwaniem. Efektywność rozwoju zarodków ROSI u myszy jest już bardzo wysoka w naszym laboratorium, które jest podobne do innych laboratoriów.

Jednak efektywność rozwoju zwierząt innych niż gryzonie, takich jak ludzie, jest wciąż bardzo nowa. W przyszłości skupimy się na poprawie efektywności rozwoju zwierząt niebędących gryzoniami. Na początek wstrzyknij dootrzewnowo sześcio- do ośmiotygodniowej samicy myszy po 7,5 jednostki międzynarodowe gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy o godzinie 17:00 i ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej 48 godzin później.

Upewnij się, że po wstrzyknięciu nie ma kontaktu z samcami myszy. Po eutanazji myszy otwórz jej jamę brzuszną. Za pomocą nożyczek przeciąć jajowody w pobliżu obu jajników i umieścić je w buforze M2 podgrzanym do 37 stopni Celsjusza.

Pod obiektywem 10X mikroskopu pionowego zlokalizuj przezroczystą, powiększoną część jajowodu. Następnie za pomocą jednomililitrowej strzykawki zabezpiecz jajowód, odetnij powiększoną część i zbierz kompleksy wzgórków koronalnych oocytów. Aby usunąć komórki ziarniste, umieść kompleks oocytów w podgrzanym roztworze operacyjnym M2 zawierającym 0,1% hialuronidazy i delikatnie przedmuchaj przez pipetę doustną.

Przenieś oocyt szeregowo do kropelek KSOMaa w celu trzykrotnego spłukania i umieść w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Na początek zdobądź poddaną eutanazji ośmio- lub 10-tygodniowego samca myszy C57BL/6. Otwórz jamę brzuszną i delikatnie wytnij nożyczkami najądrze w pobliżu jądra.

Umieść naczynie zawierające najądrza w podłożu M2 pod 10-krotnym obiektywem mikroskopu pionowego. I za pomocą jednomililitrowej strzykawki delikatnie wytnij najądrza, aby plemniki mogły wypłynąć. Zasysać przepływające plemniki w zawiesinie na dno probówki zawierającej 0,5 mililitra buforu M2.

W celu wyizolowania okrągłych spermatyd przenieś wypreparowane jądro do bufora M2. Za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra delikatnie przeciąć białą membranę pod mikroskopem, a następnie wycisnąć i wyciąć pofałdowane kanaliki nasienne. Po ekstrakcji zawiesiny przefiltrować za pomocą sita o oczkach 400 i odwirować przefiltrowane komórki.

Odrzucić supernatant i inkubować komórki z 200 mikrolitrami Hoechst 33342 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Umieść rurkę cytometryczną zawierającą barwione komórki w cytometrze przepływowym. Po dostosowaniu napięcia wybierz populację komórek na podstawie rozproszenia do przodu i bocznego.

Następnie usuń zrosty komórek zgodnie z rozproszeniem do przodu i szerokością impulsu wyzwalającego. Używając dwóch kanałów detekcyjnych pod laserem o długości fali 355 nanometrów, posortuj okrągłe spermatydy i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod mikroskopem okrągłe spermatydy myszy miały około 10 mikrometrów średnicy i wykazywały strukturę jąderka przypominającą wystające jądro pośrodku.

Na początek pobierz oocyty i okrągłe spermatydy od myszy. Następnie należy przygotować igły przytrzymujące i iniekcyjne o odpowiedniej średnicy. Umieść oocyty w 10 mikrolitrowych kropelkach M2 z cytochalazyną B lub bez niej w celu zmiękczenia i przechowywania gamet.

Następnie umieść okrągłe kropelki M2 spermatyd i zamontuj naczynie operacyjne na mikroskopijnym stole operacyjnym. Skorygować położenie wstrzyknięcia i zamocować igłę. Za pomocą poliwinylopirolidonu lub PVP zwilżyć i oczyścić igłę do wstrzykiwań.

Następnie należy pobrać okrągły spermatyd do igły iniekcyjnej. Obróć oocyt za pomocą igły przytrzymującej, aby ustawić ciało polarne oocytów w pozycji godziny 12. Następnie ostrożnie umieścić igłę do wstrzykiwań w pozycji godziny trzeciej na oocycie.

Za pomocą urządzenia PiezoXpert utwórz otwór w osłonie przejrzystej oocytów. Następnie delikatnie wsunąć igłę do iniekcji w poziomie do oocytu i rozerwać błonę oocytu. Stopniowo wstrzykiwać okrągły spermatyd do cytoplazmy oocytu.

Wyjąć igłę do wstrzykiwań i odessać niewielką ilość błony oocytów w pobliżu otworu, aby ją uszczelnić. W celu docytoplazmatycznego wstrzyknięcia plemnika umieść na pasie startowym PVP. Odessać plemniki z ogona i umieścić ich szyjkę u wylotu igły do wstrzykiwań.

Zastosuj piezo, aby oddzielić głowę plemnika od ogona. Następnie wstrzyknij plemniki do oocytu, jak pokazano wcześniej, za pomocą igły do wstrzykiwania o średnicy od 9 do 10 mikrometrów. W celu wspomaganej aktywacji oocytów umieść oocyty w 20 mikrolitrowych kropelkach bezwapniowo-magnezowej pożywki CZB zawierającej sześciowodny chlorek strontu.

Następnie przenieś je do pożywki hodowlanej KSOMaa w celu uprawy. Jednocześnie należy ustalić grupę aktywacji partenogenezy bez wstrzykiwania okrągłych plemników lub plemników do badań embriologicznych. Po aktywacji przenieść do pożywki hodowlanej KSOMaa do uprawy.

Okrągłe zarodki, którym wstrzyknięto plemniki, wykazywały zmniejszoną wydajność rozwojową w porównaniu z zarodkami, którym wstrzyknięto plemniki do cytoplazmatyki.