Wzbogacanie spermatocytów pachytenowych i spermatydów z jąder myszy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego

Prosta i niedroga metoda, którą nazywamy MDR, pozwala wyizolować wzbogacone populacje spermatocytów pachytenowych, plemników okrągłych i plemników wydłużających się z jąder myszy. Główną zaletą metody MDR jest jej prostota. Potrzebny jest tylko standardowy sprzęt laboratoryjny, który jest dostępny w większości laboratoriów badań biomedycznych.

Protokół MDR jest świetny dla naukowców prowadzących badania funkcjonalne na męskich komórkach rozrodczych. Na przykład grupy, które badają spermatogenezę, czynniki wpływające na męską płodność, a także ojcowskie dziedziczenie epigenetyczne. Do metody MDR wymagany jest minimalny materiał wyjściowy

W rzeczywistości rutynowo uzyskujemy dużą ilość komórek za pomocą tylko jednego dorosłego samca myszy. Zacznij od skonfigurowania niezbędnego sprzętu i odczynników. Ustaw łaźnię wodną na 37 stopni Celsjusza, a inkubator do hodowli komórkowych na 34 stopnie Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności.

Umieść rotator rurkowy wewnątrz inkubatora. Przygotuj i oznacz odpowiednią ilość szkiełek mikroskopowych, a następnie narysuj pierścień o średnicy około jednego centymetra za pomocą pisaka do smaru i pozostaw tłuszcz do wyschnięcia. Gdy zwierzę będzie gotowe do sekcji, spryskaj brzuszny brzuch myszy 70% etanolem i użyj nożyczek, aby zrobić otwór w kształcie litery V w jamie brzusznej miednicy.

Pociągnij kleszcze za poduszeczkę tłuszczową najądrza, zlokalizuj jądra i usuń je nożyczkami, uważając, aby nie naruszyć osłonki białawej. Umieść jądra na sześciocentymetrowej szalce Petriego zawierającej 1X KREBS. Zdekapsuluj jądra i wyrzuć osłonkę białawą, a następnie lekko rozproszyj kanaliki nasienne, delikatnie rozsuwając je kleszczami.

Przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów zawierającej dwa mililitry świeżo przygotowanego roztworu kolagenazy. Inkubuj kanaliki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty, delikatnie je mieszając przez kołysanie. Następnie dodaj co najmniej 40 mililitrów ciepłego 1X KREBS i pozwól kanalikom osiąść w temperaturze pokojowej.

Usunąć supernatant i powtórzyć pranie jeszcze raz. Dodaj 25 mililitrów świeżo przygotowanego roztworu trypsyny. Umieść probówkę na rotatorze wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych i pozostaw ją tam na 15 do 20 minut, obracając się z prędkością około 15 obr./min.

Sporadycznie sprawdzaj kanaliki. Gdy roztwór stanie się mętny i pozostaną tylko małe kawałki kanalików, umieść probówkę na lodzie i przejdź do następnego kroku. Przefiltruj roztwór przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do nowej 50-mililitrowej stożkowej rurki na lodzie.

Następnie odwiruj go w temperaturze 600 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby granulować komórki. Ostrożnie wylej supernatant i postukaj w osad komórek, aby ponownie zawiesić ogniwa w pozostałej części 1X KREBS. Dodaj co najmniej 40 mililitrów zimnego 1X KREBS do zawieszonych komórek i powtórz wirowanie.

Zawieś ponownie komórki, stukając w rurkę. Następnie zamontuj końcówkę pipety na pipecie o pojemności jednego mililitra i przytnij ją tak, aby otwór miał średnicę około trzech milimetrów. Dodaj do trzech mililitrów 0,5% BSA w KREBS.

Ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów i natychmiast przystąp do ładowania komórek na gradient BSA. Musisz uzyskać jednorodną zawiesinę pojedynczej komórki przed załadowaniem komórek na gradient.

Zbite komórki będą się szybciej osadzać, zaburzając gradient i zanieczyszczając frakcje. Ustaw rurkę o pojemności 50 mililitrów pionowo na lodzie, upewniając się, że można zobaczyć jedną stronę tuby. Następnie odetnij około pięciu do dziesięciu milimetrów od końcówki dziesięciomililitrowej pipety serologicznej i zamontuj ją na kontrolerze pipety.

Odpipetować pięć mililitrów 5% roztworu BSA na dno 50-mililitrowej probówki. Delikatnie dotknąć powierzchni 5% roztworu odciętą końcówką pipety i powoli nałożyć pięć mililitrów 4% roztworu BSA na wierzch 5% roztworu. Powtórz tę procedurę z innymi roztworami BSA, aby uzyskać gradient od 5% do 1% BSA.

Między warstwami powinna być widoczna wyraźna linia. Następnie ostrożnie załaduj zawiesinę jednokomórkową na górę gradientu, nie naruszając jej. Pozwól komórkom przechodzić przez gradient przez półtorej godziny.

Za pomocą wyciętej końcówki pipety ostrożnie zbierz frakcje mililitra do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 mililitra i przechowuj je na lodzie, upewniając się, że probówki zostały ponumerowane w kolejności, w jakiej zostały zebrane. Odwirować frakcje komórek rozrodczych w temperaturze 600 x g przez dziesięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie, uważając, aby nie naruszyć osadu, wyrzuć większość supernatantu i ponownie zawieś komórki, przesuwając probówkę.

Dodaj jeden mililitr lodowatego buforu 1X KREBS do każdej probówki i powtórz wirowanie. Wyrzuć większość supernatantu, pozostawiając około 100 mikrolitrów i ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy. Aby przeanalizować frakcje komórek, zacznij od odpipetowania 20 mikrolitrów 4% paraformaldehydu wewnątrz każdego pierścienia smarowego na numerowanym szkiełku mikroskopowym.

Natychmiast dodać dwa mikrolitry zawieszonych komórek z odpowiedniej frakcji. Następnie suszyć szkiełka w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę. Raz przepłucz szkiełka za pomocą PBS i użyj podłoża montażowego z DAPI do zamontowania szkiełek.

Przeanalizuj każde szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby oszacować, który konkretny typ komórek rozrodczych jest wzbogacony w każdą frakcję. Po pobraniu próbki z każdej frakcji do mikroskopii, dodaj jeden mililitr lodowatego 1X KREBS do każdej frakcji i odwiruj komórki w temperaturze od 600 do 13000 x g przez dziesięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć i wyrzucić supernatant i kontynuować preferowaną analizę w dalszej kolejności.

Protokół ten sprawdza się szczególnie dobrze w przypadku wzbogacania okrągłych spermatyd. Wzbogacenie powyżej 90% osiągnięto we frakcjach drugiej, trzeciej i czterech. Wydłużające się plemniki mają tendencję do pozostawania na szczycie gradientu i zostały zebrane z pierwszą frakcją.

Ze względu na swoje duże rozmiary, spermatocyty pachytenowe szybciej się osadzają i są pobierane jako ostatnie. Wzbogacenie wynosiło około 75% we frakcjach 14 i 15. Całkowite RNA uzyskane z większości frakcji wahało się od 0,5 do 2,5 mikrograma, co wystarczało do dalszych analiz RNA.

Ilość białka uzyskanego z każdej frakcji zazwyczaj wahała się od 20 do 140 mikrogramów, co jest wystarczające dla kilku zachodnich plam. W tym protokole 10% lizatów białkowych pochodzących z pojedynczych frakcji było wystarczające do wyraźnego wykrycia białek DDX4, PIWIL1 i PIWIL2 na standardowym Western blot. Ilość białka w jednej frakcji była również wystarczająca do immunoprecypitacji z użyciem przeciwciała przeciwko PIWIL1, a także do wykrycia koimmunoprecypitacji PIWIL2.

Nawet dla nowicjusza ten protokół działa bardzo dobrze, o ile upewnisz się, że wstępna obróbka komórek jest dobra i nic nie zakłóca gradientu podczas sedymentacji. Z jednej myszy uzyskuje się wysoce wzbogacone komórki, które można wykorzystać do różnych dalszych analiz, takich jak RT-PCR, sekwencjonowanie RNA, immunoprecypitacja i Western blot. Chociaż MDR nie jest jedyną metodą wzbogacania męskich komórek rozrodczych, jest to bardzo wygodne narzędzie, ponieważ nie wymaga żadnego specjalistycznego sprzętu ani intensywnego szkolenia.