Name: Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj metodę FISH do wizualizacji bakterii w tkankach jelitowych gospodarza. Technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ umożliwia lokalizację drobnoustrojów i analizę ich interakcji z błoną śluzową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Kristen Earle za nieoceniony rozwój techniki, Amber Hann za pomoc w rozwiązywaniu problemów, dr Jen Nguyen i Deannie Pepin za krytyczną recenzję manuskryptu, a także dr Heshamowi Solimanowi i laboratorium Rossiego na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej za udostępnienie mikroskopu. Autorzy dziękują za wsparcie ze strony CIHR Team Grant: Canadian Microbiome Initiative 2 (C.T.), Crohn's and Colitis Canada (dla C.T. i K.M.N.), CIFAR (dla C.T. i K.M.N.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (dla CT), Weston Foundation: Weston Family Microbiome Initiative (dla CT), Paul Allen Distinguished Investigator Award (dla CT).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach i pobieranie tkanek opisane w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC) i zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Użyto wolnych od zarazków szwajcarskich myszy Webster. Wszystkie zwierzęta były w wieku 8-10 tygodni, wykorzystano obie płcie, a wszystkie myszy były trzymane razem z co najmniej dwiema myszami w klatce. Zwierzęta zostały poddane eutanazji przy użyciu dwutlenku węgla z wtórnym zwichnięciem szyjki macicy lub nakłuciem serca.
1. Projektowanie eksperymentu z obrazowaniem: rozważania i pobieranie próbek
<ol>
	<li>Konstrukcja sondy FISH
	<ol>
		<li>Jeśli istnieje odpowiednia sonda FISH, wybierz istniejącą wcześniej opublikowaną sondę, która pokazuje silny sygnał w oznaczonych komórkach w porównaniu z tłem.</li>
		<li>Walidacja nowych sond in vitro w celu określenia ich skuteczności wiązania z ustalonymi próbkami bakterii docelowych i wiązania poza celem z innymi bakteriami.</li>
		<li>Należy sprawdzić wszystkie sondy 16S FISH, które mają być używane w odniesieniu do sekwencji 16S z organizmu docelowego lub z sekwencjonowania 16S rRNA z próbek, które mają być analizowane, aby upewnić się, że występuje oczekiwany odsetek dodatnich dopasowań i że sondy nie będą wiązać się niespecyficznie z innymi członkami mikrobioty.
		<ol>
			<li>Dopasuj sondy FISH do sekwencji o pełnej długości lub wariantów sekwencji amplikonów za pomocą narzędzia, takiego jak Clustal Omega13, aby ocenić potencjalne wiązanie sond i ich celów.</li>
			<li>Oprócz testów in silico, przetestuj dokładność i poziom barwienia FISH niezatwierdzonych sond na czystych kulturach8,14.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
UWAGA: Podczas barwienia wielu członków społeczności, sondy mogą być używane kombinacyjnie (np. kombinacja sondy specyficznej dla rodziny i sondy specyficznej dla rodzaju), jeśli użyte fluorofory nie nakładają się na siebie w widmach wzbudzenia i emisji (chyba że obrazowanie odbywa się w systemie z możliwością wykonywania liniowego rozmieszania). Dodatkowo, specyficzność można wykazać poprzez włączenie kontroli specyficzności/sond kodowanych lub poprzez konkurencję z sondami niefluorescencyjnymi.
<ol>
	<li>Rodzaje próbek i pobieranie tkanek
	<ol>
		<li>Za pomocą ostrych i czystych narzędzi wytnij segmenty jelit gnotobiotycznych szwajcarskich myszy Webster do obrazowania. Zminimalizuj zakłócanie próbki tak bardzo, jak to możliwe, i trzymaj sekcje za ich krawędzie, aby uniknąć wpływu na obszar obrazowania. Utrwalić próbkę tak szybko, jak to możliwe po rozbiorze, aby zapobiec degradacji. 
		UWAGA: W przypadku badań na zwierzętach preferowane są nienaruszone, niezapłukane odcinki jelita; Membrana pomoże utrzymać nienaruszoną organizację światła i błony śluzowej.</li>
		<li>Wyczyść narzędzia, przecierając je 70% etanolem między próbkami i miejscami. Należy uzyskać co najmniej trzy powtórzenia biologiczne na wycinek jelita/lokalizację biopsji, zwracając uwagę na pobieranie próbek z różnych lokalizacji jelit, ponieważ śluz i architektura jelit, a także mikrobiota zmieniają się znacząco w różnych miejscach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Utrwalanie i infiltracja próbki tkanki
<ol>
	<li>Utrwalenie
	<ol>
		<li>Przygotuj świeży metakarn w kompatybilnym pojemniku o następujących proporcjach: 60% metanolu bezwzględnego, 30% chloroformu i 10% lodowatego kwasu octowego. Dozuj każdą z tych substancji chemicznych do dygestorium. Wybierz pojemnik, który można odpowietrzyć, otwierając pokrywę. Ponieważ metakarn nie jest kompatybilny z polistyrenem, należy go przygotować w pojemniku polietylenowym, używając szklanych cylindrów z podziałką/pipet serologicznych do chloroformu i lodowatego kwasu octowego. 
		UWAGA: Podczas mieszania wytwarzają się opary, które mogą powodować wzrost ciśnienia wewnątrz pojemnika. Zaleca się, aby pojemnik był stosunkowo szczelnie zamknięty po wyjęciu z dygestorium, jeśli próbki nie są aktywnie dodawane. Chloroform jest toksyczny; Nie wdychać, nie połykać ani nie wchłaniać przez skórę. Metanol jest toksyczny i wysoce łatwopalny; Nie wdychać, nie połykać ani nie wchłaniać przez skórę. Lodowaty kwas octowy jest łatwopalny i silnie dla skóry i oczu.</li>
		<li>Po dozowaniu zamknij pojemnik, zamieszaj, aby wymieszać, a następnie odpowietrzyć; powtarzaj tę czynność, aż ustanie odgazowywanie (a ciśnienie pod pokrywką nie wzrośnie już znacząco). 
		UWAGA: Nie wyrzucaj metakarnu do kanalizacji; Zbieraj i utylizuj jako niebezpieczne odpady chemiczne zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Użyj ołówka do oznaczania kaset histologicznych, ponieważ wiele atramentów do pióra odpadnie w roztworze metakarnu.</li>
		<li>Umieść skrawki jelita w kasetach histologicznych, delikatnie przytrzymując krawędź tkanki pęsetą. Zamknij kasetę i całkowicie zanurz ją w świeżym roztworze metakarnu. Upewnij się, że roztwór nie jest starszy niż kilka godzin po zanurzeniu kaset.</li>
		<li>W przypadku próbek klinicznych, które będą pobierane w pomieszczeniu klinicznym bez dostępu do dygestorium, należy użyć polietylenowego pojemnika do przechowywania z klapką wyciętą w pokrywie, która umożliwi przejście kaset histologicznych. Zaklej tę klapkę taśmą, gdy nie przepuszcza próbek, aby zapobiec wydostawaniu się toksycznych oparów. 
		UWAGA: Ważne jest, aby używać taśmy maskującej, aby uniknąć rozpuszczenia kleju na pojemniku - niektóre rodzaje taśm (np. plastikowa taśma pakowa) mogą nie wytrzymywać dobrze oparów metakarnu.</li>
		<li>Próbki należy utrwalać na minimum 3 godziny, a maksymalnie na dwa tygodnie. 
		UWAGA: Grubsze próbki mogą wymagać czasu utrwalania dłuższego niż 3 godziny. Czas wiązania może być wybrany tak, aby umożliwić jednoczesne przetwarzanie infiltracji parafiny w przypadku kaset utrwalonych w różnych roztworach metakarny (np. w celu jednoczesnego przeprowadzenia infiltracji parafiny na grupach próbek pobranych i utrwalonych w ciągu dwóch tygodni).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Infiltracja i zatapianie parafiny
	<ol>
		<li>Umieść parafinę w żaroodpornym pojemniku i rozpuść ją w piekarniku w temperaturze 60 °C przez noc. Ponieważ granulki parafiny zajmują więcej miejsca przed stopieniem, upewnij się, że stopiono wystarczającą ilość parafiny, aby pokryć wszystkie kasety. 
		UWAGA: Temperatura nie powinna być wyższa niż 60 °C, ponieważ może to spowodować powstawanie artefaktów.</li>
		<li>Umyj chusteczkę, wylewając płyn do odpowiedniego pojemnika na odpady i natychmiast zastępując go następującymi chemikaliami.
		<ol>
			<li>Inkubować w metanolu absolutnym przez 30 minut. Powtórzyć raz.</li>
			<li>Inkubować w absolutnym etanolu przez 20 minut. Powtórzyć raz.</li>
			<li>Inkubować w ksylenach przez 15 minut. Powtórzyć raz.</li>
			<li>Szybko wymieniaj prania, uważając, aby kasety nie wyschły. Upewnij się, że każde mycie całkowicie zakrywa kasety w zlewce lub pojemniku. 
			UWAGA: Ksyleny są łatwopalne, a w przypadku wdychania opary mogą działać negatywnie na ośrodkowy układ nerwowy z potencjalnymi długoterminowymi konsekwencjami neurologicznymi po narażeniu na wysokie stężenia (>200 ppm). Z ksylenami należy obchodzić się tylko w obrębie dygestorium. Ponieważ ksyleny są niebezpieczne, należy zachować minimalną ilość niezbędną do pokrycia kaset histologicznych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podczas osadzania zorientuj segmenty jelita równolegle do długości kasety (w przeciwieństwie do pionowej) za pomocą pęsety, aby zapewnić podłużne, poprzeczne przekroje zamiast pączków o przekroju poprzecznym, aby zapewnić większą potencjalną powierzchnię próbki do obrazowania ilościowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B).</li>
		<li>Lekko otwórz kasety (~ 1-2 cm lub 0,5 cala), aby umożliwić wejście parafiny bez utraty segmentów tkanki. Do tego kroku użyj podwójnych rękawiczek lub pęsety, aby zapobiec przegrzaniu lub lekkiemu poparzeniu palców. Zanurzyć i zamknąć kasety w pojemniku z roztopioną parafiną, umieszczając pojemnik z powrotem w piecu o temperaturze 60 °C. Upewnij się, że kasety są wypełnione parafiną i nie pozostały żadne duże pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Po inkubacji przez 2 godziny w temperaturze 60 °C wyjąć pojemnik z suszarki. Za pomocą kleszczy ostrożnie wyjmij kasety i połóż je pojedynczo na kawałku folii aluminiowej, aby ostygły. Przechowuj je w temperaturze pokojowej, aż będą gotowe do osadzenia i pokrojenia.</li>
		<li>Skrawki parafiny należy podzielić na sekcje za pomocą mikrotomu, wciskając je na tyle głęboko, aby odsłonić zawartość światła, umożliwiając wykonanie podłużnego przekroju kosmków i/lub krypt oprócz zawartości światła i śluzu. Uważaj, aby wymienić ostrza, ponieważ materiał kałowy szybko ostrze w porównaniu z tkanką. Przytnij sekcje o grubości 4 μm, aby uzyskać optymalną ostrość obrazów. Przenieś sekcje na zwykłe niepowlekane szkiełka.</li>
		<li>W przypadku barwienia RYB należy zabarwić odcinki jelita tak szybko, jak to możliwe (tj. w ciągu kilku tygodni od cięcia), aby uzyskać silny sygnał FISH. W przypadku pominięcia barwienia FISH, barwienie lektyną + DAPI można przeprowadzić na mniej świeżych (tj. miesięcznych) próbkach bez znacznej utraty sygnału.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Barwienie bakterii i cech gospodarza
<ol>
	<li>preparat
	<ol>
		<li>Rozgrzej piekarnik do 60 °C. Podgrzej pusty słoik z koplinu i objętość wystarczającą do dwukrotnego przykrycia szkiełek w słoiku ksylenami w szklanej butelce, uważając, aby wokół pokrywki pokryć parafilm, aby zapobiec parowaniu ksylenów. Pozwól, aby temperatura ksylenów osiągnęła 60 °C. 
		UWAGA: Standardowy słoik Coplin mieści 8 szkiełek, a szkiełka można zalać około 50 ml płynu (może się różnić od 40 do 60 ml w zależności od marki). Substytuty ksylenu są mniej toksyczne i są z powodzeniem stosowane przez inne grupy na etapie dewoskowania (krok 3.2)8,9.</li>
		<li>Jeśli dostępny jest oddzielny piekarnik, należy go wstępnie rozgrzać do temperatury 50 °C. W przeciwnym razie krok ten można wykonać w tym samym piecu, który został użyty do pieczenia szkiełka po kroku 3.2.3.</li>
		<li>Przygotuj roztwór hybrydyzacyjny FISH: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0,9 M NaCl; 0,01%26 - 0,1%9 (w/v) dodecylosiarczan sodu (SDS) w wodzie wolnej od nukleaz. W razie potrzeby dodać 5-50% (v/v) formamidu. Podczas deparafinowania roztwór hybrydyzacyjny należy wstępnie ogrzać w temperaturze 50 °C. 
		UWAGA: Formamid jest amidem, który działa jako teratogen; Z formamidem należy obchodzić się w rękawiczkach i okularach ochronnych. W małych dawkach i po ekspozycji na oczy, skórę lub błony śluzowe działa drażniąco. W dużych ilościach opary formamidu mogą wymagać interwencji medycznej. Formamid może być przechowywany w 100% w zamrażarce w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie szkiełek do barwienia: deparafinizacja
	<ol>
		<li>Umieść szkiełka w słoiku Coplin, upewniając się, że sekcje nie stykają się z innymi szkiełkami lub słoikiem, a następnie piecz szkiełka w temperaturze 60 °C przez 10 minut.</li>
		<li>W dygestoriach napełnij słoik Coplin wstępnie podgrzanymi ksylenami z pieca, uważając, aby nie wylać ich bezpośrednio na próbki i nie spowodować przemieszczenia tkanek. Umieść słoik Coplin z powrotem w piekarniku o temperaturze 60 °C. Pozostaw butelkę z pozostałymi ksylenami w dygestorium.</li>
		<li>Wlej zużyte ksyleny do odpowiedniego pojemnika na odpady do utylizacji, uważając, aby nie naruszyć skrawków tkanek na szkiełkach i używając kleszczy, aby szkiełka nie wypadły ze słoika Coplin. Uzupełnij słoik Coplin pozostałymi ksylenami i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej w dygestorium.</li>
		<li>Inkubować sekcje w 99,5% etanolu przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po tym etapie inkubacji wyjmij szkiełka ze słoika Coplin, wytrzyj tylną część szkiełek chusteczką laboratoryjną lub ręcznikiem papierowym i krótko wysusz na powietrzu, aż znikną kropelki etanolu. 
		UWAGA: Wycieranie tylnej części szkiełek umożliwia lepszą wizualizację postępu suszenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie bakteryjne za pomocą FISH
	<ol>
		<li>Użyj blokera płynu lub wstrzykiwacza PAP, aby ograniczyć obszar rozszerzania się płynu, okrążając obszar każdego odcinka tkanki. Upewnij się, że atrament nie styka się z samą sekcją. Utwórz okrąg jak najbliżej każdej sekcji tkanki bez kontaktu z tkanką, aby zminimalizować powierzchnię, która musi zostać pokryta roztworem hybrydyzacyjnym.</li>
		<li>Przygotuj roztwór do hybrydyzacji: na każde 50 μl wstępnie podgrzanego roztworu do hybrydyzacji dodaj 0,5 μg sondy (np. 0,5 μl z 1 μg/μL sondy). Odpipetować roztwór hybrydyzacyjny na sekcje na szkiełku (~20 μl/sekcję, w zależności od wielkości przekroju/koła). Od tego momentu należy chronić roztwór do hybrydyzacji i szkiełka przed światłem podczas etapów inkubacji i przechowywania.</li>
		<li>Upewnij się, że objętość użytego płynu pokrywa całą sekcję po nałożeniu elastycznego plastikowego szkiełka nakrywkowego. Inkubować szkiełko w wilgotnej komorze, aby zmniejszyć parowanie. Stwórz wilgotną komorę z pudełkiem na końcówki do pipet z chusteczkami lub ręcznikami papierowymi na dnie, które zostały nasączone nadmiarem roztworu hybrydyzacyjnego lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby zapewnić wilgotność. Inkubować sekcje w temperaturze 45-50 °C, w zależności od zestawu sond, przez >3 godziny.</li>
		<li>W okresie inkubacji rozgrzać bufor do płukania FISH: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0,9 M NaCl do 50 °C. Przygotuj wystarczającą ilość buforu do mycia, aby przykryć szkiełka w słoiku Coplin.</li>
		<li>Usunąć plastikowe szkiełka nakrywkowe; inkubować szkiełka w buforze do mycia FISH w słoiku z kopliny, oba wstępnie podgrzane do 50 °C. Włożyć słoik Coplin z powrotem do piekarnika o temperaturze 50 °C na 10-20 minut. W przypadku grubych próbek usuń szkiełka nakrywkowe ze słoika Coplin, dodając bufor i delikatnie usuwając szkiełka nakrywkowe, aby uniknąć rozmazania plasterka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie śluzu i cech gospodarza
	<ol>
		<li>Przygotować ogólny barwnik przeciwbarwny DNA/śluzu w PBS: końcowe 10 μg/ml DAPI + 40 μg/ml barwienie śluzu UEA-1. Przygotuj wystarczającą ilość barwnika, aby pokryć plamy w przypadku braku szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć uszkodzenia tkanki dodatkowymi szkiełkami nakrywkowymi. 
		UWAGA: Pokrycie plam w przypadku braku szkiełka nakrywkowego będzie wymagało większych objętości niż 20 μl użyte w ppkt 3.3.2. W przypadku odcinków średniej wielkości (średnica ~10 mm) 200 μL wystarcza na pokrycie jednego miejsca; Przetestuj tę objętość wcześniej na atrapie szkiełka.</li>
		<li>Wyjmij bufor do mycia FISH i zastąp go PBS w słoiku Coplin. Natychmiast po napełnieniu słoika Coplin PBS, zdekantuj PBS.</li>
		<li>Wyjmij szkiełka ze słoika i odpipetuj przeciwplamę na górze sekcji, uważając, aby nie dotknąć chusteczki końcówką pipety. Przykryj całą sekcję bańką. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 45 minut w ciemności.</li>
		<li>Szybko zmyj plamy 3 razy świeżym PBS: przytrzymując szkiełka na miejscu za pomocą pęsety, wylej PBS do zlewu i natychmiast napełnij świeżym PBS.</li>
		<li>Wycierając tylną część szkiełek o chusteczkę lub ręcznik papierowy, pozwól, aby większość PBS odparowała z sekcji, wspomagana przez przewód podciśnieniowy podłączony do końcówki pipety. Również w tym przypadku należy unikać dotykania sekcji końcówką pipety.</li>
		<li>Zamontuj sekcje za pomocą medium montażowego (bez DAPI) i pozwól mu zastygnąć w temperaturze pokojowej przykryte szklanymi szkiełkami nakrywkowymi, upewniając się, że szkiełka nakrywkowe są płaskie i nie ma pęcherzyków powietrza w medium montażowym.</li>
		<li>Przymocuj szkiełka nakrywkowe do szkiełka podstawowego, malując wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci, uważając, aby trzymać się z dala od krawędzi szkiełka, aby upewnić się, że szkiełko będzie leżeć poziomo w uchwycie szkiełka mikroskopowego podczas obrazowania.</li>
		<li>Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez kilka tygodni, zanim fluorescencja zostanie wyczerpana.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie i analiza obrazu
<ol>
	<li>Wizualizacja plam
	<ol>
		<li>Wybierz obszar tkanki, który zawiera zarówno tkankę, jak i światło, aby zobrazować granicę między mikrobiotą a gospodarzem. Do ilościowego obrazowania grubości śluzu i biogeografii światła należy wybrać pola widzenia, w których wycinki kosmków nabłonka i/lub krypt są podłużne, a nie przekrojowe. Unikaj obszarów z dużymi przerwami między śluzem a nabłonkiem, aby uniknąć cięcia artefaktów.</li>
		<li>Zlokalizuj tkankę i skoryguj płaszczyznę ogniskowej, wykorzystując sygnał DAPI do lokalizacji i ustawiania ostrości, aby uniknąć fotowybielania sygnału fluorescencji FISH.</li>
		<li>Dostosuj ustawienia obrazowania. Aby uwidocznić bakteryjne barwienie DAPI, zwiększ moc lasera i wzmocnienie do punktu, w którym sygnał DAPI z komórek nabłonka jest przesycony lub "wydmuchiwany". 
		UWAGA: Nie należy nadmiernie nasycać, ponieważ doprowadzi to do fotowybielania i artefaktów wizualnych w jądrach, których nie można odzyskać.</li>
		<li>W przypadku wszystkich innych kanałów należy używać minimalnej mocy lasera, która zapewni wyraźny sygnał ponad tłem, i uważać, aby nie przesycić. 
		UWAGA: Jest to szczególnie ważne podczas wykonywania skanowania kafelków, ponieważ fotowybielanie będzie problematyczne, gdy obrazowane jest nakładanie się płytek.</li>
		<li>Użyj 40-krotnego lub większego powiększenia, aby zobrazować poszczególne bakterie.</li>
		<li>Zdobądź obrazy.
		<ol>
			<li>Pozyskaj skany płytek, aby uzyskać dane ilościowe na temat grubości śluzu i przestrzennego rozmieszczenia drobnoustrojów w świetle słonecznym. Upewnij się, że kafelki zachodzą na siebie w 15% i sprawdź, czy nie ma winietowania/nierównomiernego oświetlenia, które może się pogorszyć przy <1-krotnym powiększeniu. Podczas konfigurowania skanowania kafelków należy zwrócić szczególną uwagę na to, czy tkanka jest wyostrzona na wszystkich kafelkach, ponieważ nie można analizować rozmytych/nieostrych obrazów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B).</li>
			<li>Jeśli to możliwe, zminimalizuj liczbę kafelków potrzebnych do zobrazowania danej długości nabłonka, obracając obszar skanowania tak, aby warstwa nabłonka i śluzu były równoległe do płytki, a nie pod kątem. W przeciwnym razie znajdź odcinek nabłonka, który jest równoległy lub prostopadły do obszaru obrazowania, aby uzyskać podobny efekt.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tropini, C., Earle, K. A., Huang, K. C., Sonnenburg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiome%3A+connecting+spatial+organization+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">The gut microbiome: connecting spatial organization to function.</a> Cell Host and Microbe. 21 (4), 433-442 (2017).</li>
<li>Hansson, G. C., Johansson, M. E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+of+the+two+Muc2+mucin-dependent+mucus+layers+in+colon+is+devoid+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria.</a> Gut Microbes. 1 (1), 51-54 (2010).</li>
<li>Johansson, M. E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+host+intestinal+mucus+layers+requires+long-term+microbial+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Normalization of host intestinal mucus layers requires long-term microbial colonization.</a> Cell Host and Microbe. 18 (5), 582-592 (2015).</li>
<li>Jakobsson, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+the+gut+microbiota+shapes+the+colon+mucus+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">The composition of the gut microbiota shapes the colon mucus barrier.</a> EMBO Reports. 16 (2), 164-177 (2015).</li>
<li>Tropini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+osmotic+perturbation+causes+long-term+alteration+to+the+aut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transient osmotic perturbation causes long-term alteration to the aut microbiota.</a> Cell. 173 (7), 1742-1754 (2018).</li>
<li>Desai, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dietary+fiber-deprived+gut+microbiota+degrades+the+colonic+mucus+barrier+and+enhances+pathogen+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A dietary fiber-deprived gut microbiota degrades the colonic mucus barrier and enhances pathogen susceptibility.</a> Cell. 167 (5), 1339-1353 (2016).</li>
<li>Ng, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+the+gut+microbiota+after+antibiotics+depends+on+host+diet%2C+community+context%2C+and+environmental+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Recovery of the gut microbiota after antibiotics depends on host diet, community context, and environmental reservoirs.</a> Cell Host and Microbe. 26 (5), 650-665 (2019).</li>
<li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+spatial+mapping+of+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities.</a> Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).</li>
<li>Johansson, M. E. V., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+mucus+in+histological+sections%2C+immunostaining+of+mucins+in+fixed+tissue%2C+and+localization+of+bacteria+with+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH.</a> Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).</li>
<li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProbeBase-an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers%3A+New+features+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ProbeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: New features 2016.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 586-589 (2016).</li>
<li>Quast, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SILVA+ribosomal+RNA+gene+database+project%3A+Improved+data+processing+and+web-based+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), 590-596 (2013).</li>
<li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OligoMiner+provides+a+rapid%2C+flexible+environment+for+the+design+of+genome-scale+oligonucleotide+in+situ+hybridization+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">OligoMiner provides a rapid, flexible environment for the design of genome-scale oligonucleotide in situ hybridization probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2183-2192 (2018).</li>
<li>Madeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EMBL-EBI+search+and+sequence+analysis+tools+APIs+in+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 636-641 (2019).</li>
<li>Welch, J. L. M., Hasegawa, Y., McNulty, N. P., Gordon, J. I., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+a+model+15-member+human+gut+microbiota+established+in+gnotobiotic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of a model 15-member human gut microbiota established in gnotobiotic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (43), 9105-9114 (2017).</li>
<li>Lagkouvardos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+and+cultivation+study+of+Muribaculaceae+reveals+novel+species%2C+host+preference%2C+and+functional+potential+of+this+yet+undescribed+family%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Sequence and cultivation study of Muribaculaceae reveals novel species, host preference, and functional potential of this yet undescribed family.</a> Microbiome. 7 (1), 28(2019).</li>
<li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUPACK%3A+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).</li>
<li>Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MathFISH%2C+a+web+tool+that+uses+thermodynamics-based+mathematical+models+for+in+silico+evaluation+of+oligonucleotide+probes+for+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">MathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (3), 1118-1122 (2011).</li>
<li>Huber, D., Voith von Voithenberg, L., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%3A+History%2C+limitations+and+what+to+expect+from+micro-scale+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+and+Nano+Engineering%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH.</a> Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+metagenomic+analysis+of+intact+mucosa-associated+microbial+communities+of+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and metagenomic analysis of intact mucosa-associated microbial communities of human colon.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (6), 1333-1342 (2010).</li>
<li>Geva-Zatorsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+tracking+of+host%26ndash%3Bmicrobiota+interactions+via+metabolic+labeling+of+gut+anaerobic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and tracking of host&ndash;microbiota interactions via metabolic labeling of gut anaerobic bacteria.</a> Nature medicine. 21 (9), 1091-1100 (2015).</li>
<li>Jemielita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+features+of+the+growth+of+a+bacterial+species+colonizing+the+zebrafish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal features of the growth of a bacterial species colonizing the zebrafish gut.</a> mBio. 5 (6), 01751(2014).</li>
<li>Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+three-dimensional+spatial+structure+in+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome.</a> PLoS ONE. 12 (11), 0188257(2017).</li>
<li>Zhanmu, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+fluorescence+during+paraffin+embedding+of+fluorescent+protein-labeled+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Maintenance of fluorescence during paraffin embedding of fluorescent protein-labeled specimens.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 752(2019).</li>
<li>Bergstrom, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximal+colon-derived+O-glycosylated+mucus+encapsulates+and+modulates+the+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota.</a> Science. 370 (6515), 467-472 (2020).</li>
<li>Jones, M. V., Calabresi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-gelatin+for+embedding+tissues+prior+to+paraffin+processing%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing.</a> BioTechniques. 42 (5), 569-570 (2007).</li>
<li>Earle, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+gut+microbiota+spatial+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of gut microbiota spatial organization.</a> Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).</li>
<li>Jeckel, H., Drescher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+opportunities+in+image+analysis+of+bacterial+cells+and+communities%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Advances and opportunities in image analysis of bacterial cells and communities.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Opisany powyżej protokół zapewnia powtarzalną metodę wizualizacji interfejsu gospodarz-mikrobiota. Testy te znacznie skorzystały na opracowaniu protokołu, począwszy od optymalizacji znakowania FISH18 po zachowanie śluzu i obrazowanie9. Utrwalanie i osadzanie zapewniają również użyteczne przechowywanie próbek; Co więcej, kasety z naciekami parafiny mogą być wysyłane bez żadnych ograniczeń, ponieważ próbki są całkowicie utrwalone i obojętne.
Znaczenie i metody alternatywne Połączenie barwienia FISH i śluzu umożliwia analizę składu mikrobioty w określonych lokalizacjach tkanek oraz interakcji między poszczególnymi bakteriami a gospodarzem. Alternatywne techniki, które obejmują analizę określonych miejsc w obrębie mikrobioty, zwykle nie są w stanie zbadać jednokomórkowego charakteru tych interakcji, tak jak w przypadku mikrodysekcji wychwytywania laserowego w połączeniu z sekwencjonowaniem19. Techniki oparte na sekwencjonowaniu mają jednak tę zaletę, że są w stanie uchwycić skład genetyczny mikrobioty na dokładniejszym poziomie i szerzej niż sondy 16S rRNA.
Pułapką przedstawionego protokołu jest to, że zapewnia on jednorazowy obraz mikrobioty w odniesieniu do gospodarza. Do obrazowania w czasie rzeczywistym u żywych zwierząt wymagane są specjalne techniki obrazowania, które ułatwiają uzyskanie sygnału fluorescencyjnego w głębokich tkankach (np. Mikroskopia dwufotonowa przyżyteczna i mikroskopia fluorescencyjna z arkuszami świetlnymi20,21). W tych metodach organizm modelowy jest albo kolonizowany przez bakterie, które są barwione cząsteczkami, które wiążą się z ich otoczką20, albo genetycznie zmodyfikowanymi bakteriami, które zawierają białka fluorescencyjne21. W tym drugim przypadku dojrzewanie białek fluorescencyjnych jest kluczową kwestią, ponieważ większość standardowych białek fluorescencyjnych wymaga tlenu do emitowania światła. W związku z tym wymagane są organizmy modelowe, które mają co najmniej środowisko natlenowe (nanomolowe stężenie tlenu), takie jak tlenowe jelito danio pręgowanego21.
W tym protokole metanol-Carnoy jest używany jako utrwalacz zamiast paraformaldehydu lub formaliny, ponieważ nie zawiera wody. Zapobiega to nawodnieniu, odwodnieniu i zapadaniu się warstwy śluzu podczas przetwarzania i ułatwia dokładne pomiary grubości śluzu. Podczas gdy utrwalanie metakarny i zatapianie parafiny stało się standardem w tej dziedzinie, badano różne utrwalacze i techniki zatapiania w celu optymalizacji zachowania śluzu 9,22, przy czym niektóre badania wskazują, że żywice mogą być lepsze od osadzania parafiny22. Innym ważnym ograniczeniem w zatapianiu parafiny i wiązaniu metakarny jest utrata fluorescencji białek fluorescencyjnych, której można uniknąć, stosując alternatywne utrwalacze (np. formalinę lub paraformaldehyd (PFA)) lub zmodyfikowane techniki zatapiania23. Każdy utrwalacz ma zalety i wady, a wybór utrwalacza zależy od priorytetów obrazowania. Metody obrazowania można łączyć, jeśli kontrpróby biologiczne są utrwalone w PFA i metakarnie, a obrazy uzyskuje się z obu próbek.
FISH połączono z immunofluorescencją w izolowanych przypadkach ze specyficznymi przeciwciałami poliklonalnymi królika anty-Muc2C3 9,24. Wyniki te nie zostały szeroko powtórzone z innymi przeciwciałami Muc2, co wskazuje, że wybór przeciwciał może mieć kluczowe znaczenie dla powodzenia kombinacji FISH-immunofluorescencyj. Warunki pomyślnego barwienia przeciwciał dla danego przeciwciała mogą nie pozwalać na utrzymanie barwienia FISH.
Rozwiązywanie problemów W tym protokole pobieranie, cięcie i barwienie próbek stanowią krytyczne kroki zapobiegające tworzeniu się artefaktów obrazowania. Na przykład uciskanie tkanki po pobraniu i przed osadzeniem może prowadzić do nieprawidłowej lokalizacji mikrobioty i wpływać na jakość śluzu. Inną ważną kwestią jest unikanie łączenia segmentów o bardzo różnej grubości w jednej kasecie, takiej jak stosunkowo pusty kawałek jelita cienkiego i osad w dalszej części okrężnicy. Różne grubości prowadzą do trudności w obrazowaniu: po osadzeniu przekrój poprzeczny na określonej głębokości dla jednego segmentu może być na niewłaściwej głębokości dla obrazowania dla drugiego (np. światło będzie na różnych głębokościach dla każdej tkanki) (ryc. 1B, C i ryc. 3A). Ponadto, w celu obrazowania osadów kału z modelu zwierzęcego, mogą one być owinięte błoną otrzewnową24. W tej technice niewielka część świeżo wyizolowanej otrzewnej jest delikatnie zawijana wokół stolca i zachowuje strukturę osadu podczas etapów mycia opisanych w protokole.
W przeciwieństwie do przetwarzania tkanek zwierzęcych z zawartością, obrazowanie próbek jelit ludzkich wiąże się z pewnymi wyzwaniami. W szczególności zawartość światła i wyściółka błony śluzowej zostaną prawdopodobnie zakłócone przez kolonoskopowe przygotowanie jelita, zwykle wykonywane przed biopsjami jelit lub zabiegami resekcji. Dodatkowo, podczas pobierania biopsji, pomocne jest zwrócenie uwagi na orientację tkanki, aby pomóc w identyfikacji określonych cech (np. światła świetlnego vs. błony podśluzowej) przy braku treści jelitowej. Wstępne zatapianie 3% mieszanin agaru i/lub agaru: żelatyna może być przydatne w utrzymaniu polarności tkanek25; Istnieją jednak problemy z odwodnieniem i sekcją agaru, jak opisano w literaturze, a czas przetwarzania może wymagać zmiany.
Kluczowym aspektem dla uzyskania dobrego barwienia FISH jest dostosowanie stężenia formamidu dla określonych sond FISH. Formamid będzie kontrolował rygorystyczność hybrydyzacji sond FISH w stosunku do ich celów. Ważne jest, aby upewnić się, że a) do barwienia danej społeczności wybrano odpowiednie stężenie formamidu oraz b) że odpowiednie stężenie formamidu jest w ogóle możliwe dla używanej kombinacji sond - może to wpłynąć na optymalny wybór sondy w przypadku korzystania z wielu sond. Strony internetowe takie jak mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) mogą pomóc w obliczeniu prawidłowych stężeń formamidu dla danej sondy. W przypadku braku informacji o odpowiednich stężeniach formamidu, protokół ten może być testowany z 0% i 10% formamidem.
Cięcie osadzonych próbek wymaga przycięcia bloku do wystarczającej głębokości, aby uzyskać przekroje luminalne, ponieważ zbyt płytkie przecięcie w bloku spowoduje przekrój poprzeczny kosmków/krypt bez zawartości światła (ryc. 3A). Wybarwić próbki wkrótce po przekrojeniu, aby uzyskać optymalny sygnał FISH, i użyć świeżego DAPI (lub DAPI przechowywanego w temperaturze -20 °C), aby rozwiązać problemy z tłem (rysunek 3C). Barwienie RYB na odcinkach, które mają więcej niż miesiąc, może skutkować gorszym/niespójnym zabarwieniem.
Jeśli tkanka lub szkiełko nakrywkowe nie jest idealnie płaskie w stosunku do szkiełka, próbka może nie być ostra w każdej pozycji na skanie kafelkowym (ryc. 3B), co prowadzi do zmarnowanego wysiłku i potencjalnego fotowybielania. Można to rozwiązać, wykonując mniejsze skany płytek, w których wszystkie pozycje zostały zweryfikowane jako ostre. Cięcie z ostrzami może również prowadzić do oderwania śluzu i zawartości światła, które podczas obrazowania pojawiają się jako duże ciemne obszary. Wreszcie, odparowanie roztworu lub pęcherzyków podczas etapu hybrydyzacji może prowadzić do nierównomiernego zabarwienia sond FISH w tkance.
Kolejnym krytycznym parametrem, który wpływa na skuteczność wiązania sondy FISH, jest konkurencja między różnymi sondami. Przydatnym sprawdzeniem, czy sonda FISH znakuje bakterie, jest zbadanie kolokalizacji sygnału z sondy FISH z DAPI (rysunek 2C,D). W próbkach, które wymagają użycia wielu sond rRNA, dostosowanie parametrów, takich jak temperatura hybrydyzacji, stężenie sondy i formamid, staje się krytyczne, aby zapewnić, że sondy skutecznie wiążą się z właściwymi gatunkami18.
Uwagi dotyczące obrazowania Bakterie barwione rybami najlepiej uwidocznić za pomocą mikroskopu konfokalnego i obiektywu o co najmniej 40-krotnym powiększeniu. Podczas gdy 63-krotne powiększenie jest preferowane do obrazowania bakterii na poziomie pojedynczej komórki, 40-krotne powiększenie może być również używane poprzez maksymalizację zoomu cyfrowego lub zastosowanie systemu super rozdzielczości. Systemy wyposażone w funkcje superrozdzielczości mogą również zapewniać subkomórkową rozdzielczość pojedynczych komórek bakteryjnych. Obiektywy o mniejszym powiększeniu mogą być wykorzystane, aby uzyskać ogólne poczucie lokalizacji bakterii i grubości śluzu.
Pozyskiwanie obrazów 16-bitowych zamiast 8-bitowych jest również wysoce zalecane, ponieważ wyższy zakres dynamiki pomoże uchwycić szeroki zakres sygnału DAPI z bardzo jasnych jąder nabłonka i stosunkowo słaby sygnał bakterii luminalnych. Oprócz korzystania z opisanej powyżej konfiguracji obrazowania, ważną kwestią do rozważenia jest wybór fluoroforów. Aby uzyskać najlepszą separację między typami bakterii, należy upewnić się, że użyte fluorofory nie nakładają się na widma wzbudzenia i emisji (chyba że obrazowanie odbywa się w systemie z możliwością liniowego rozmieszania). Dodatkowo, sondy mogą być używane w połączeniu (np. połączenie sondy specyficznej dla rodziny i sondy specyficznej dla rodzaju) w celu identyfikacji dodatkowych członków społeczności. W przypadku korzystania z sond do rozdzielania liniowego lub niezwalidowanych, konieczne jest przetestowanie dokładności i poziomu barwienia FISH na czystych kulturach 8,14.
Po zebraniu obrazów dostępnych jest wiele narzędzi do analizy ilościowej interfejsu gospodarz-mikrobiota, takich jak BacSpace26, HiPR-FISH8 i inne narzędzia do segmentacji27. BacSpace to oprogramowanie firmy MATLAB, które umożliwia segmentację składników tkankowych i świetlnych oraz usuwanie materiału roślinnego z obrazów26. Program zapewnia również analizę grubości śluzu w 2D oraz kwantyfikację rozkładu przestrzennego na podstawie odległości pikseli w różnych kanałach26. I odwrotnie, oprogramowanie do analizy obrazu HiPR-FISH umożliwia segmentację komórek barwionych FISH8. Wreszcie, inne narzędzia do segmentacji bakterii, które zostały zoptymalizowane pod kątem eksperymentów in vitro 27 , mogą być również dostosowane do tego zastosowania.
Konkluzja 
Obrazowanie in situ umożliwia analizę ilościową poszczególnych taksonów drobnoustrojów w kontekście innych członków społeczności i różnych mikrośrodowisk tworzonych przez dietę, śluz i krypty nabłonka gospodarza. Interakcja między organizmami dyktuje biologię systemów mikrobiologicznych związanych z gospodarzem i zapewnia niezbędną analizę zmian w tych strukturach podczas perturbacji, które mają wpływ na zdrowie. Warto zauważyć, że możliwość obrazowania mikrobioty in situ za pomocą opisanego powyżej protokołu zapewnia niesamowite okno na biogeografię mikrobioty w odniesieniu do zwierzęcego gospodarza.

Techniki wizualizacji mikrobiologicznej mają początki tak stare jak sama mikrobiologia, kiedy Antonie Van Leeuwenhoek używał swojego mikroskopu do obserwacji bakterii (które nazwał "animalcules") z płytki nazębnej i stolca w XVIIwieku. Od tego czasu opracowano wiele technik wizualizacji organizacji przestrzennej konsorcjum bakterii, grzybów i wirusów, które żyją w powiązaniu z gospodarzem - mikrobiota1. Wyjaśnienie lokalizacji tych drobnoustrojów jest niezbędne do określenia ich funkcji w organizmie gospodarza. Biogeografia bakterii jest ważna zarówno w taksonach komensalnych, jak i patogennych, ponieważ bliskość określonych lokalizacji (np. nabłonka), substratów odżywczych i określonych drobnoustrojów może dyktować produkcję przez bakterie metabolitów leżących u podstaw interakcji międzygatunkowych i międzykrólestwowych.
Kluczową strukturą oddzielającą bakterie od tkanek gospodarza w kilku różnych miejscach ciała, takich jak jama ustna, jelito lub płuco, jest śluz - warstwa wytwarzana przez gospodarza, która zarówno zapobiega translokacji drobnoustrojów na komórki nabłonka gospodarza, jak i służy jako źródło odżywcze dla mikrobioty2,3,4. Scharakteryzowanie przełamań i zmian w tej barierze ma kluczowe znaczenie, prowadząc do mechanistycznego wglądu w interakcje między gospodarzem a mikrobiotą, którego nie uzyskano by za pomocą samego sekwencjonowania5,6,7. Na przykład obrazowanie umożliwiło odkrycie, że ekspozycja na antybiotyki może zakłócić warstwę śluzową i organizację mikrobioty7,8, oraz że środki przeczyszczające mogą zubożać śluz, co koreluje z dużymi zmianami parametrów immunologicznych5.
Ten protokół nakreśla ogólne ramy utrwalania, barwienia i obrazowania mikrobioty i tkanki gospodarza (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), zbudowane na podstawie pracy Johanssona i Hanssona9. Chociaż protokół ten jest modelowany w kontekście odcinków jelitowych, można go łatwo dostosować do innych typów tkanek. Protokół ten umożliwia przetwarzanie próbek klinicznych pobranych od zwierząt doświadczalnych lub ludzi; Dołączono uwagi dotyczące przetwarzania obu typów próbek. W przedstawionym przykładzie nabłonek gospodarza i bakterie luminalne zostały jednocześnie znakowane barwieniem 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI), śluzem lektyną sprzężoną z fluoresceiną (FITC), aglutyniną Ulex europaeus I (UEA-1) oraz specyficznym taksonem bakteryjnym za pomocą FISH. Sondy FISH są zwykle projektowane w oparciu o geny 16S rRNA taksonu, aby zapewnić wysoki sygnał z wiązania transkryptu o dużej liczbie kopii.
W tym przykładzie sonda celuje w 16S rRNA z rodziny bakterii Muribaculaceae (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Jednak barwienia są łatwo zastępowane różnymi sondami FISH i/lub lektynami, aby dostosować się do odpowiedniego pytania biologicznego. Wcześniej zwalidowane sondy FISH można znaleźć w ProbeBase10, internetowym zasobie sond oligonukleotydowych ukierunkowanych na rRNA, lub w SILVA11, bazie danych rybosomalnego RNA. W celu zaprojektowania nowych sond czytelnik może odwołać się do nowych rurociągów, takich jak HiPR-FISH8 lub Oligominer12. Korzystając z tego protokołu, można zaobserwować ścisłe upakowanie bakterii w świetle jelita i różne cechy śluzu jelitowego w całym przewodzie pokarmowym. Opisany tutaj przebieg pracy umożliwia ilościową analizę mikrobioty w kontekście przestrzennym środowiska gospodarza.

<table><tbody><tr><td>Folia</td><td></td><td></td><td></td>aluminiowa</tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>C298-500</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>słoik z kopliny</td><td>Fisher</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe, 22 & razy; 22 mm, nie #1</td><td>VWR</td><td>CA48366-227-1</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Zawieszony do 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Puste pudełko(a)</td><td></td><td></td> <td>na końcówki do pipetDo topienia parafiny</td></tr><tr><td>Etanol, bezwodny, klasy molekularnej</td> <td>--</td><td>--</td><td></td></tr> <tr><td>Sondy FISH Roztwór</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hybrydyzacyjny FISH</td> <td>--</td><td>--</td> <td>20 mM Tris&ndash; HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl, 0,01% (w/v) SDS w wodzie wolnej od nukleaz. Opcjonalne dodanie 5&ndash; 50% (v/v) formamid</td></tr><tr><td>bufor do płukania ryb</td> <td>--</td><td>-- 20</td> <td>mM Tris&ndash; HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl</td></tr><tr><td>Znakowana fluorescencyjnie lektyna Ulex Europaeus Agglutynina (UEA-1)</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1061 (znakowana fluoresceiną) lub RL-1062-2 (znakowana rodaminą)</td> <td>UEA-1 znakuje fukozylowane glikany, więc nie jest odpowiednia dla myszy wolnych od zarazków lub dla próbek od gospodarzy z niedoborem fukozylotransferazy 2 (FUT2).</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Fumehood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Fisher</td><td>A38-212</td><td>i łatwopalne</td></tr><tr><td>elastyczne szkiełka nakrywkowe z tworzywa sztucznego HybriSlip, 22 x 22 mm i razy 0,25 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GBL722222</td><td>do etapów hybrydyzacji FISH, może zastąpić szklane szkiełka nakrywkowe</td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrofobowa bariera PAP Pen</td><td>Pen Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412</td><td>Toksyczny i łatwopalny</td></tr><tr><td>mikrotom</td><td></td><td></td><td>do cięcia</td></tr><tr><td>Uniwersalne pojemniki do przechowywania próbek, 473 ml</td><td>Fisher</td><td>14-955-117A</td><td>Można zastąpić wybranym pojemnikiem szklanym lub polietylenowym. Metakarna nie jest kompatybilna ze styropianem ani metalem.</td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72180</td><td>Każdy lakier do paznokci powinien działać</td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td></td><td></td><td>Niezbędny zakres: 45-60 &deg; C</td></tr><tr><td>Parafina: Leica Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x roztwór)</td><td>Fisher</td><td>BP3991</td><td>Rozcieńczyć do 1x dla protokołu</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS), 20% roztwór, bez RNaz</td><td>Invitrogen</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Loc HistoScreen Kasety</td><td>Thermo Scientific</td><td>CA83009-999</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorowodorku Trizma, 1M Tris-HCl, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2663-1L</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Woda, bez nukleaz</td><td>Fisher</td><td>BP2484100</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher</td><td>X3P-1GAL</td><td>Toksyczny i łatwopalny</td></tr></tbody></table>

wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Pomiar lokalizacji mikrobów w kontekście in vivo jest niezbędnym krokiem w odkrywaniu funkcjonalnych relacji między mikrobiotą a jelitami kręgowców. Krajobraz przestrzenny mikrobioty jelitowej jest ściśle kontrolowany przez cechy fizyczne – śluz jelitowy, krypty i fałdy – i wpływają na niego właściwości kontrolowane przez gospodarza, takie jak pH, dostępność tlenu i czynniki odpornościowe. Właściwości te ograniczają zdolność drobnoustrojów komensalnych i patogenów do stabilnej kolonizacji jelit. W skali mikronowej organizacja mikrobiologiczna określa interakcje bliskiego zasięgu między różnymi drobnoustrojami, a także interakcje między drobnoustrojami a ich gospodarzem. Interakcje te wpływają następnie na funkcjonowanie narządów na dużą skalę i zdrowie gospodarza.
Ten protokół umożliwia wizualizację przestrzennej organizacji mikrobioty jelitowej od odległości między komórkami do skali obejmującej całe narządy. Metoda opiera się na utrwalaniu tkanek jelitowych przy jednoczesnym zachowaniu struktury jelit i właściwości śluzu. Utrwalone próbki są następnie osadzane, dzielone na sekcje i barwione w celu uwydatnienia określonych gatunków bakterii poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH). Cechy gospodarza, takie jak śluz i składniki komórek gospodarza, są znakowane fluorescencyjnie znakowanymi lektynami. Na koniec zabarwione sekcje są obrazowane za pomocą mikroskopu konfokalnego wykorzystującego obrazowanie skanowania płytek w dużym powiększeniu, aby połączyć skale długości mikronów i centymetrów. Ten rodzaj obrazowania można zastosować do wycinków jelit z modeli zwierzęcych i biopsji tkanek ludzkich w celu określenia biogeografii mikrobioty w jelitach w zdrowiu i chorobie.

W celu zbadania lokalizacji specyficznych komensalnych bakterii jelitowych w jelitach myszy, w badaniu tym wykorzystano wolne od drobnoustrojów (germ-free) myszy rasy Swiss Webster, które zostały skolonizowane poszczególnymi izolatami bakteryjnymi. W tym doświadczeniu znakowano następujące gatunki bakterii: i) ludzki izolat z rodziny Muribaculaceae5, Muribaculum intestinale, należący do licznej i powszechnej rodziny bakterii w mikrobiocie myszy15, oraz ii) Bacteroides thetaiotaomicron, genetycznie podatną i pospolitą bakterię jelitową. Po dwóch tygodniach aklimatyzacji myszy zostały uśpione, a fragment okrężnicy zawierający pellet kałowy został wycięty i utrwalony w świeżo przygotowanym methacarnie. Po dwóch dniach utrwalania preparaty odwodniono poprzez przetwarzanie w metanolu, etanolu i ksylenach, zinfiltrowano parafiną, zablokowano i następnie pocięto na plastry o grubości 4 µm w poprzek światła jelita. Próbki te zabarwiono następnie sondą FISH (oznaczoną Cy3 na końcu 3'), specyficzną dla izolatu Muribaculum, zaprojektowaną za pomocą oprogramowania Oligominer12 i sprawdzoną pod kątem struktury wtórnej i trzeciorzędowej oraz minimalnego wiązania niespecyficznego przy użyciu NuPACK i mathFISH16,17. Próbki poddano również barwieniu kontrastowemu przy użyciu lektyny UEA-1 związanej z rodaminą (która barwi glikany fukozylowane w śluzie) oraz DAPI. Zabarwione przekroje obrazowano przy użyciu obiektywu olejowego 40x oraz modułu nadrozdzielczego.
<img alt="Schemat przetwarzania tkanek; fiksacja, zatapianie, krojenie, barwienie, wizualizacja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62646/62646fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat wizualizacji interfejsu mikrobiota-gospodarz w jelicie. (A) Ilustracja przebiegu procedury. (B) Dwie płaszczyzny krojenia pozwolą na uzyskanie przekrojów poprzecznych (preferowanych w tej procedurze) lub przekrojów w formie „pączków”. (C) Zatapianie tkanek o bardzo różnych grubościach może skutkować uzyskaniem plastrów optymalnych tylko dla jednej z tych tkanek. Skróty: FISH = fluorescencyjna hybrydyzacja in situ; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenyloindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62646/62646fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający znakowanie tkanki w kanałach czerwonym, zielonym i niebieskim, warstwy komórkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62646/62646fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2Obrazowanie jelita grubego pozwala na określenie lokalizacji Muribaculum intestinale w odniesieniu do śluzu w gnotobiotycznym modelu mysim. Przekroje barwiono DAPI (kolor niebieski), Muribaculaceae sonda FISH (czerwona) oraz UEA-1 (zielona). (A) Dalsza część okrężnicy myszy monokolonizowanej za pomocą *Muribaculum intestinale* i (B) dystalna część okrężnicy myszy podwójnie kolonizowanej przez Muribaculum intestinale i Bacteroides thetaiotaomicronPasek skali = 20 µm. (C i D) kanały Cy3-FISH (lewo), DAPI (środek) oraz połączone kanały Cy3-FISH + DAPI dla fragmentów wstawek luminalnych (A) i (B), odpowiednio. Pasek skali = 5 µmW (A) i (C), wszystkie sygnały DAPI o kształcie i wielkości bakterii są znakowane Cy3 (pojedyncze groty strzałek), a w (B) i (D), poza tymi komórkami podwójnie dodatnimi dla Cy3 i DAPI (pojedyncze groty strzałek), występują barwione DAPI komórki bakteryjne, które są negatywne dla Cy3 (podwójne groty strzałek), co jest spodziewane w stanach monokolonizacji i bikolonizacji. Z wyjątkiem dłuższych bakterii nitkowatych, większe (&gt;4 µm długości) struktury wybarwione DAPI (tępe strzałki) to materiał roślinny lub jądra komórkowe komórek gospodarza. Skróty: FISH = fluorescencyjna$\$hyph$en\$situ hybridization (hybrydyzacja in situ wspomagana fluorescencją) in situ hybrydyzacja; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenyloindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62646/62646fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna; struktura tkanki; rozkład komórkowy; zielony i niebieski; analiza naukowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62646/62646fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Typowe problemy. (A>) Płytkie cięcie nie zapewni przekrojów przez światło jelita. (Lewo) Odcinek jelita przecięty na głębokości umożliwiającej wgląd w światło jelita oraz widok podłużny nabłonka. (Prawo) Odcinek jelita przecięty zbyt płytko, ukazujący jedynie przekroje poprzeczne krypt, bez stałej warstwy śluzu lub bakterii. (B>) Nierównomierne przyleganie tkanki do szkiełka nakrywki może skutkować rozmytymi i nierównomiernie oświetlonymi skanami kafelkowymi. Skan kafelkowy został ustawiony z pozycjami będącymi poza ogniskowaniem (prawy górny róg). (C>) Przykład normalnego tła (lewo) oraz wysokiego tła (prawo). W tym przykładzie, w przypadku sygnału DAPI – zwróć uwagę na sygnał pochodzący z nabłonka, poza jądrami komórkowymi. Wszystkie paski skali = 20 µm. Skrót: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62646/62646fig03large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

Ten uproszczony protokół szczegółowo opisuje proces wykrywania i obrazowania bakterii w złożonych próbkach tkanek, od utrwalania tkanki po barwienie mikrobów za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Mikroorganizmy, które są związane z gospodarzem, tworzą ten bardzo złożony ekosystem, który naprawdę wymaga obrazowania, aby mógł być zrozumiany. Za pomocą tej cząsteczki pokażemy Ci, jak przejść przez proces barwienia i uzyskać wizualizację interfejsu mikrobiomu gospodarza. Zrozumienie biologii bakterii związanych z gospodarzem wymaga zrozumienia ich lokalizacji w mikrośrodowiskach.Technika ta umożliwi nam wizualizację poszczególnych taksonów w środowisku gospodarza, a także w kontekście innych bakterii. Dzięki tej technice możliwe będzie określenie, które bakterie mogły przeniknąć przez tkankę gospodarza, a także określenie, czy kluczowe cechy, takie jak śluz gospodarza, mogą być wyczerpane. Przygotuj świeżą metakarnę w kompatybilnym pojemniku z 60% bezwzględnym metanolem, 30% chloroformem i 10% lodowatym kwasem octowym.Za pomocą ostrych i czystych narzędzi odetnij segmenty jelit myszy do obrazowania. Zminimalizuj zakłócanie próbki tak bardzo, jak to możliwe i obchodź się z sekcjami za ich grzbiety, aby uniknąć wpływu na obszar obrazowania. Utrwalić próbkę tak szybko, jak to możliwe po rozbiorze, aby zapobiec degradacji.Umieść skrawki jelita w kasetach histologicznych, delikatnie przytrzymując krawędź tkanki pęsetą. Zamknij kasetę i całkowicie zanurz ją w świeżym roztworze metakarnu, upewniając się, że roztwór nie jest starszy niż kilka godzin po zanurzeniu kaset. W przypadku próbek klinicznych, które będą pobierane w pomieszczeniu klinicznym bez dostępu do dygestorium, należy użyć polietylenowego pojemnika do przechowywania z klapką wyciętą w pokrywie, która umożliwi przejście kaset histologicznych.Zaklej tę klapkę taśmą, gdy nie przepuszcza próbek, aby zapobiec wydostawaniu się toksycznych oparów. Umieść parafinę w żaroodpornym pojemniku i rozpuść w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez noc. Przemyć tkankę, wylewając płyn do odpowiedniego pojemnika na odpady i inkubując ją kolejno w bezwzględnym metanolu, absolutnym etanolu i ksylenie, jak opisano w manuskrypcie tekstowym.Lekko otwórz kasety, aby parafina mogła dostać się bez utraty segmentów tkanki za pomocą podwójnych rękawiczek lub pęsety. Zanurz i zamknij kasety w pojemniku ze stopioną parafiną. Umieść pojemnik z powrotem w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza, upewniając się, że kasety są wypełnione parafiną i nie pozostały żadne duże pęcherzyki powietrza.Po inkubacji przez dwie godziny wyjmij pojemnik z piekarnika. Za pomocą kleszczy ostrożnie wyjmij kasety. Rozgrzej piekarnik do 60 stopni Celsjusza i podgrzej słoik z koplinu.Dodaj wystarczającą ilość ksylenu do szklanej butelki, aby dwukrotnie przykryć szklane szkiełka w słoiku i umieść parafilm wokół pokrywki, aby zapobiec parowaniu ksylenów. Pozwól, aby temperatura ksylenów osiągnęła 60 stopni Celsjusza. Przygotuj roztwór do hybrydyzacji FISH, jak wspomniano w manuskrypcie tekstowym.Umieść szkiełka w słoiku Coplin, upewniając się, że sekcje nie stykają się z innymi szkiełkami lub słoikiem i piecz szkiełka w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 10 minut. W dygestorium napełnij słoik Coplin wstępnie podgrzanymi ksylenami z pieca, uważając, aby nie wylać ich bezpośrednio na próbki i nie spowodować przemieszczenia tkanek. Umieść słoik Coplin z powrotem w piekarniku o temperaturze 60 stopni.Wlej zużyte ksyleny do odpowiedniego pojemnika na odpady, uważając, aby nie naruszyć skrawków tkanek na szkiełkach i używając kleszczy, aby szkiełka nie wypadły ze słoika Coplin. Uzupełnij słoik Coplin pozostałymi ksylenami i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej w dygestorium. Inkubować skrawki w 99,5% etanolu przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po inkubacji wyjmij szkiełka ze słoika Coplin. Wytrzyj tylną część szkiełek chusteczką laboratoryjną lub ręcznikiem papierowym i krótko wysusz na powietrzu, aż kropelki etanolu znikną. Twórz bardzo bliskie okręgi wokół każdej sekcji tkanki za pomocą blokera płynu lub pisaka PAP, aby ograniczyć obszar ekspansji potrzebny do pokrycia roztworem hybrydyzacyjnym, unikając kontaktu atramentu z sekcją.Przygotuj roztwór hybrydyzacyjny i dodaj 0,5 mikrograma sondy na każde 50 mikrolitrów użytego roztworu. Odpipetować roztwór na sekcje na szkiełku. Przykryj sekcję elastycznymi plastikowymi szkiełkami nakrywkowymi, upewniając się, że objętość użytego płynu pokrywa całą sekcję.Stwórz wilgotną komorę z pudełkiem na końcówki do pipet z chusteczkami lub ręcznikami papierowymi, które zostały nasączone nadmiarem roztworu hybrydyzacyjnego lub PBS, aby zapewnić wilgotność. Inkubować szkiełko w wilgotnej komorze w temperaturze od 45 do 50 stopni Celsjusza przez co najmniej trzy godziny, w zależności od sondy ustawionej w celu zmniejszenia parowania. Usuń plastikowe szkiełka nakrywkowe i inkubuj szkiełka w buforze do mycia FISH w słoiku Coplin podgrzanym do 50 stopni Celsjusza.Włóż słoik Coplin z powrotem do piekarnika o temperaturze 50 stopni Celsjusza na 10 do 20 minut. Wyjmij bufor do mycia FISH i zastąp go PBS w słoiku Coplin. Natychmiast po napełnieniu słoika Coplin PBS, zdekantuj PBS.Wyjmij szkiełka ze słoika i odpipetuj przeciwplamę na całej sekcji, uważając, aby nie dotknąć chusteczki końcówką pipety. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 45 minut. Szybko zmyj plamy trzy razy świeżym PBS.Przetrzyj tylną część szkiełek chusteczką lub ręcznikiem papierowym i pozwól, aby większość PBS odparowała z sekcji wspomaganych przez przewód podciśnieniowy podłączony do końcówki pipety. Zamontuj sekcje za pomocą medium montażowego. Przymocuj szkiełka nakrywkowe do szkiełka, malując wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci, uważając, aby trzymać się z dala od krawędzi szkiełka.Pozwól mu zastygnąć w temperaturze pokojowej. Pokazano tutaj obrazy dystalnej części jelita grubego myszy mono-skolonizowanej Muribaculum intestinale i tej dwuskolonizowanej Muribaculum intestinale i Bacteroides thetaiotaomicron . Próbki barwiono sondą FISH, trzema pierwszymi cyjaninami-3, oznaczonymi jako specyficzne dla izolatu Muribaculum, a także barwionymi przeciwstawnie lektyną związaną z rodaminą, UEA-1 i DAPI.Obrazy odcinków barwionych cyjaniną-3 FISH, DAPI i połączonymi kanałami cyjaniny-3 FISH i DAPI pokazują lokalizację Muribaculum intestinale. Wszystkie sygnały DAPI w kształcie bakterii i wielkości bakterii są znakowane cyjaniną-3 w stanie monokolonizacji. W stanie podwójnej kolonizacji, oprócz tych podwójnie dodatnich komórek cyjaniny-3 i DAPI, istnieją komórki bakteryjne barwione DAPI, które zgodnie z oczekiwaniami są cyjaniny-3 ujemne.Z wyjątkiem dłuższych bakterii nitkowatych, większe struktury DAPI-dodatnie to materiał roślinny lub jądra z komórek gospodarza. Odcinek jelita, który został przecięty na głębokość, która zapewnia widok światła, a także podłużne widoki nabłonka i płytki odcinek odcinka odsłaniający tylko przekroje poprzeczne krypt i brak stałej warstwy śluzu lub bakterii, dowodzi, że płytkie cięcie nie zapewni luminalnych wycinków jelita. Nierównomierne pokrycie tkanki lub szkiełka nakrywkowego powoduje rozmyte i nierównomiernie oświetlone skany płytek.Pokazano tu również przykład normalnego tła i wysokiego tła. W miarę jak dowiadujemy się więcej o mikrobiocie, staje się oczywiste, że masowe testy, takie jak sekwencjonowanie, nie wystarczą, aby naprawdę określić, co dzieje się między różnymi gatunkami drobnoustrojów i jak wchodzą ze sobą w interakcje. A do tego naprawdę potrzebujemy obrazowania.Tego typu technika pozwoliła na kilka naprawdę ważnych odkryć, na przykład, że pozbawienie błonnika z diety powoduje ścieńczenie warstwy śluzu i potencjalne zakażenie patogenami, takie jak badania z grupy Martinsa, a także badania nad skutkami biegunki osmotycznej i tym, jak zubożenie warstwy śluzu naprawdę wpływa zarówno na gospodarza, jak i na mikrobiotę. A były to badania przeprowadzone przez grupę Sonnenberga, jak również przez naszą grupę.

visualization-gut-microbiota-host-interactions-via-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Aby zbadać mutualizm między bakteriami Xenorhabdus a nicieniami Steinernema, opracowano metody monitorowania obecności i lokalizacji bakterii wewnątrz nicieni. Podejście eksperymentalne, które można zastosować w innych systemach, polega na zmodyfikowaniu bakterii w celu ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego oraz wizualizacji bakterii wewnątrz przezroczystego nicienia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Wizualizacja bakterii w nicieniach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Źródło: Ng, K. M., Tropini, C. Wizualizacja interakcji mikrobioty jelitowej z gospodarzem za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ , barwienia lektynowego oraz obrazowania. J. Vis. Exp. (2021).Ten film demonstruje procedurę hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH) w celu barwienia mikrobioty jelitowej w tkance jelitowej myszy poprzez hybrydyzację fluorescencyjnych sond do bakteryjnego rRNA (rybosomalnego kwasu rybonukleinowego) oraz przeciwbarwienie struktur gospodarza do analizy...

Fluorescencja in situ Hybrydyzacja bakterii jelitowych w przekrojach jelit myszy

Source: Zhang, L., et al. Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates the preparation of gut tissue from a plant virus–infected insect vector for fluorescence imaging. Fixed guts were washed, permeabilized, and incubated with two fluorescent antibodies in a blocking solution—one targeting a viral antigen in vesicles, the other a vesicle-associated membrane protein. The tissue was counterstained for actin...

Immunostaining to Visualize Viral Antigen and Host Protein Colocalization in the Insect Gut

Ten film pokazuje wizualizację bakterii w odparafinowanej tkance pęcherza moczowego od pacjenta zakażonego drogami moczowymi. Znakowana fluorescencyjnie sonda zhybrydyzowana z bakteryjnymi 16-sowymi rybosomalnymi RNA ujawnia bakterie związane z tkankami i ich rozmieszczenie, dostarczając cennych informacji przestrzennych na temat ich gęstości w próbce.

Wizualizacja bakterii w skrawkach biopsji pęcherza moczowego za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Opisujemy protokół in vitro do wspólnej hodowli mikrobiomu jelitowego i kosmków jelitowych przez dłuższy okres przy użyciu ludzkiego systemu mikrofizjologicznego typu gut-on-a-chip.

Współhodowla żywego mikrobiomu z mikroinżynieryjnymi kosmkami jelitowymi człowieka w urządzeniu mikroprzepływowym typu gut-on-a-chip

Tutaj prezentujemy protokół do przestrzennej i czasowej oceny obecności żywotnej mikroflory w jelitach kleszczy przy użyciu zmodyfikowanego podejścia do hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja mikrobioty w jelitach kleszczy poprzez hybrydyzację in situ w całości

Ten artykuł przedstawia unikalną metodę analizy interakcji gospodarz-mikrobiom przy użyciu nowatorskiego systemu hodowli narządów jelitowych do eksperymentów ex vivo.

System hodowli jelit i narządów do analizy interakcji między gospodarzem a mikrobiotą

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy procedurę, która umożliwia wykrywanie bakterii chorobotwórczych w całym narządzie podczas infekcji i ilościowe określanie aktywności fluorescencyjnego reportera.

Trójwymiarowa tomografia całego narządu o wysokiej rozdzielczości zakażeń bakteryjnych

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący optyczną fototermiczną hybrydyzację in situ z fluorescencją podczerwieni (OPTIR-FISH), znaną również jako fototermiczna RYBA w średniej podczerwieni (MIP-FISH), do identyfikacji pojedynczych komórek i zrozumienia ich metabolizmu. Metodologia ta może być szeroko stosowana do różnych zastosowań, w tym do mapowania metabolizmu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Optyczna fototermiczna hybrydyzacja in situ z fluorescencją w podczerwieni (OPTIR-FISH)

Poznaj metodę FISH do wizualizacji bakterii w tkankach jelitowych gospodarza. Technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ umożliwia lokalizację drobnoustrojów i analizę ich interakcji z błoną śluzową.

Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie

Przeglądaj więcej filmów