Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie

Mikroorganizmy, które są związane z gospodarzem, tworzą ten bardzo złożony ekosystem, który naprawdę wymaga obrazowania, aby mógł być zrozumiany. Za pomocą tej cząsteczki pokażemy Ci, jak przejść przez proces barwienia i uzyskać wizualizację interfejsu mikrobiomu gospodarza. Zrozumienie biologii bakterii związanych z gospodarzem wymaga zrozumienia ich lokalizacji w mikrośrodowiskach.

Technika ta umożliwi nam wizualizację poszczególnych taksonów w środowisku gospodarza, a także w kontekście innych bakterii. Dzięki tej technice możliwe będzie określenie, które bakterie mogły przeniknąć przez tkankę gospodarza, a także określenie, czy kluczowe cechy, takie jak śluz gospodarza, mogą być wyczerpane. Przygotuj świeżą metakarnę w kompatybilnym pojemniku z 60% bezwzględnym metanolem, 30% chloroformem i 10% lodowatym kwasem octowym.

Za pomocą ostrych i czystych narzędzi odetnij segmenty jelit myszy do obrazowania. Zminimalizuj zakłócanie próbki tak bardzo, jak to możliwe i obchodź się z sekcjami za ich grzbiety, aby uniknąć wpływu na obszar obrazowania. Utrwalić próbkę tak szybko, jak to możliwe po rozbiorze, aby zapobiec degradacji.

Umieść skrawki jelita w kasetach histologicznych, delikatnie przytrzymując krawędź tkanki pęsetą. Zamknij kasetę i całkowicie zanurz ją w świeżym roztworze metakarnu, upewniając się, że roztwór nie jest starszy niż kilka godzin po zanurzeniu kaset. W przypadku próbek klinicznych, które będą pobierane w pomieszczeniu klinicznym bez dostępu do dygestorium, należy użyć polietylenowego pojemnika do przechowywania z klapką wyciętą w pokrywie, która umożliwi przejście kaset histologicznych.

Zaklej tę klapkę taśmą, gdy nie przepuszcza próbek, aby zapobiec wydostawaniu się toksycznych oparów. Umieść parafinę w żaroodpornym pojemniku i rozpuść w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez noc. Przemyć tkankę, wylewając płyn do odpowiedniego pojemnika na odpady i inkubując ją kolejno w bezwzględnym metanolu, absolutnym etanolu i ksylenie, jak opisano w manuskrypcie tekstowym.

Lekko otwórz kasety, aby parafina mogła dostać się bez utraty segmentów tkanki za pomocą podwójnych rękawiczek lub pęsety. Zanurz i zamknij kasety w pojemniku ze stopioną parafiną. Umieść pojemnik z powrotem w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza, upewniając się, że kasety są wypełnione parafiną i nie pozostały żadne duże pęcherzyki powietrza.

Po inkubacji przez dwie godziny wyjmij pojemnik z piekarnika. Za pomocą kleszczy ostrożnie wyjmij kasety. Rozgrzej piekarnik do 60 stopni Celsjusza i podgrzej słoik z koplinu.

Dodaj wystarczającą ilość ksylenu do szklanej butelki, aby dwukrotnie przykryć szklane szkiełka w słoiku i umieść parafilm wokół pokrywki, aby zapobiec parowaniu ksylenów. Pozwól, aby temperatura ksylenów osiągnęła 60 stopni Celsjusza. Przygotuj roztwór do hybrydyzacji FISH, jak wspomniano w manuskrypcie tekstowym.

Umieść szkiełka w słoiku Coplin, upewniając się, że sekcje nie stykają się z innymi szkiełkami lub słoikiem i piecz szkiełka w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 10 minut. W dygestorium napełnij słoik Coplin wstępnie podgrzanymi ksylenami z pieca, uważając, aby nie wylać ich bezpośrednio na próbki i nie spowodować przemieszczenia tkanek. Umieść słoik Coplin z powrotem w piekarniku o temperaturze 60 stopni.

Wlej zużyte ksyleny do odpowiedniego pojemnika na odpady, uważając, aby nie naruszyć skrawków tkanek na szkiełkach i używając kleszczy, aby szkiełka nie wypadły ze słoika Coplin. Uzupełnij słoik Coplin pozostałymi ksylenami i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej w dygestorium. Inkubować skrawki w 99,5% etanolu przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji wyjmij szkiełka ze słoika Coplin. Wytrzyj tylną część szkiełek chusteczką laboratoryjną lub ręcznikiem papierowym i krótko wysusz na powietrzu, aż kropelki etanolu znikną. Twórz bardzo bliskie okręgi wokół każdej sekcji tkanki za pomocą blokera płynu lub pisaka PAP, aby ograniczyć obszar ekspansji potrzebny do pokrycia roztworem hybrydyzacyjnym, unikając kontaktu atramentu z sekcją.

Przygotuj roztwór hybrydyzacyjny i dodaj 0,5 mikrograma sondy na każde 50 mikrolitrów użytego roztworu. Odpipetować roztwór na sekcje na szkiełku. Przykryj sekcję elastycznymi plastikowymi szkiełkami nakrywkowymi, upewniając się, że objętość użytego płynu pokrywa całą sekcję.

Stwórz wilgotną komorę z pudełkiem na końcówki do pipet z chusteczkami lub ręcznikami papierowymi, które zostały nasączone nadmiarem roztworu hybrydyzacyjnego lub PBS, aby zapewnić wilgotność. Inkubować szkiełko w wilgotnej komorze w temperaturze od 45 do 50 stopni Celsjusza przez co najmniej trzy godziny, w zależności od sondy ustawionej w celu zmniejszenia parowania. Usuń plastikowe szkiełka nakrywkowe i inkubuj szkiełka w buforze do mycia FISH w słoiku Coplin podgrzanym do 50 stopni Celsjusza.

Włóż słoik Coplin z powrotem do piekarnika o temperaturze 50 stopni Celsjusza na 10 do 20 minut. Wyjmij bufor do mycia FISH i zastąp go PBS w słoiku Coplin. Natychmiast po napełnieniu słoika Coplin PBS, zdekantuj PBS.

Wyjmij szkiełka ze słoika i odpipetuj przeciwplamę na całej sekcji, uważając, aby nie dotknąć chusteczki końcówką pipety. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 45 minut. Szybko zmyj plamy trzy razy świeżym PBS.

Przetrzyj tylną część szkiełek chusteczką lub ręcznikiem papierowym i pozwól, aby większość PBS odparowała z sekcji wspomaganych przez przewód podciśnieniowy podłączony do końcówki pipety. Zamontuj sekcje za pomocą medium montażowego. Przymocuj szkiełka nakrywkowe do szkiełka, malując wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci, uważając, aby trzymać się z dala od krawędzi szkiełka.

Pozwól mu zastygnąć w temperaturze pokojowej. Pokazano tutaj obrazy dystalnej części jelita grubego myszy mono-skolonizowanej Muribaculum intestinale i tej dwuskolonizowanej Muribaculum intestinale i Bacteroides thetaiotaomicron . Próbki barwiono sondą FISH, trzema pierwszymi cyjaninami-3, oznaczonymi jako specyficzne dla izolatu Muribaculum, a także barwionymi przeciwstawnie lektyną związaną z rodaminą, UEA-1 i DAPI.

Obrazy odcinków barwionych cyjaniną-3 FISH, DAPI i połączonymi kanałami cyjaniny-3 FISH i DAPI pokazują lokalizację Muribaculum intestinale. Wszystkie sygnały DAPI w kształcie bakterii i wielkości bakterii są znakowane cyjaniną-3 w stanie monokolonizacji. W stanie podwójnej kolonizacji, oprócz tych podwójnie dodatnich komórek cyjaniny-3 i DAPI, istnieją komórki bakteryjne barwione DAPI, które zgodnie z oczekiwaniami są cyjaniny-3 ujemne.

Z wyjątkiem dłuższych bakterii nitkowatych, większe struktury DAPI-dodatnie to materiał roślinny lub jądra z komórek gospodarza. Odcinek jelita, który został przecięty na głębokość, która zapewnia widok światła, a także podłużne widoki nabłonka i płytki odcinek odcinka odsłaniający tylko przekroje poprzeczne krypt i brak stałej warstwy śluzu lub bakterii, dowodzi, że płytkie cięcie nie zapewni luminalnych wycinków jelita. Nierównomierne pokrycie tkanki lub szkiełka nakrywkowego powoduje rozmyte i nierównomiernie oświetlone skany płytek.

Pokazano tu również przykład normalnego tła i wysokiego tła. W miarę jak dowiadujemy się więcej o mikrobiocie, staje się oczywiste, że masowe testy, takie jak sekwencjonowanie, nie wystarczą, aby naprawdę określić, co dzieje się między różnymi gatunkami drobnoustrojów i jak wchodzą ze sobą w interakcje. A do tego naprawdę potrzebujemy obrazowania.

Tego typu technika pozwoliła na kilka naprawdę ważnych odkryć, na przykład, że pozbawienie błonnika z diety powoduje ścieńczenie warstwy śluzu i potencjalne zakażenie patogenami, takie jak badania z grupy Martinsa, a także badania nad skutkami biegunki osmotycznej i tym, jak zubożenie warstwy śluzu naprawdę wpływa zarówno na gospodarza, jak i na mikrobiotę. A były to badania przeprowadzone przez grupę Sonnenberga, jak również przez naszą grupę.