Oparta na obrazowaniu i cytometrii przepływowej analiza położenia komórki i cyklu komórkowego w sferoidach czerniaka 3D
28 grudnia 2015
Opisujemy dwie uzupełniające się metody wykorzystujące wskaźnik cyklu komórkowego ubikwitynacji fluorescencji (FUCCI) oraz analizę obrazu lub cytometrię przepływową do identyfikacji i izolacji komórek w wewnętrznych obszarach zatrzymanych G1 i zewnętrznych proliferujących sferoidach 3D.
Ogólnym celem tej metody jest identyfikacja, charakterystyka i izolacja komórek z wielokomórkowego steroidu w odniesieniu do ich stanu w cyklu komórkowym oraz pozycji w obrębie steroidu w porównaniu z dwuwymiarową (2D) hodowlą komórkową. Trójwymiarowy (3D) model OID odtwarza biologię raka in vivo, ponieważ naśladuje architekturę guza oraz jego mikrośrodowisko. Dzięki połączeniu sferoidów z cytometrią przepływową i technikami obrazowania, metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie onkologii, takie jak wpływ mikrośrodowiska guza na zmianę wrażliwości na leki, ruchliwość komórek oraz ich proliferację.
Główną zaletą tej metody jest to, że umożliwia ona wizualizację cyklu komórkowego w czasie rzeczywistym oraz pozwala na oczyszczanie żywych komórek z konkretnego regionu steroidowego. Procedurę przeprowadzi A sharp, asystent badawczy z naszego laboratorium. Przygotowanie do tworzenia 3D steroidów rozpoczyna się od podgrzania w kuchence mikrofalowej 1,5% aros w 100 mililitrach zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS). Przez trzy do pięciu minut należy okresowo zakręcać kolbą, aby upewnić się, że aros został całkowicie rozpuszczony. Następnie należy niezwłocznie pipetować 100 µL roztworu aros do każdego dołka płaskodنnej 96-dołkowej płytki hodowlanej. Płytkę należy inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby umożliwić stężenie aros.
Następnie wyjmij z inkubatora hodowlę komórek czerniaka wykazujących konfluencję 80%, w których ekspresowane są konstrukty FCI. Przemyj komórki 10 milliliters HBSS. Dodaj 1.5 milliliters 0.05% EDTA, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 degrees Celsius przez około dwie minuty.
Po odczepieniu komórek zawiesić je w 10 ml pożywki do hodowli komórkowych. Ręcznie policzyć komórki za pomocą hemocytometru i mikroskopu odwróconego, a następnie rozcieńczyć je w pożywce do stężenia 25 000 komórek na ml. Następnie nanieść pipetą 200 µL zawiesiny komórkowej na każdą studzienkę płytki 96-dołkowej.
Inkubuj płytkę w temperaturze 37°C i 5% carbon dioxide przez około trzy dni, aby utworzyły się sferoidy komórkowe. Po inkubacji wykonaj obrazowanie sferoidów za pomocą mikroskopu odwróconego, używając obiektywu Forex i filtra kontrastu fazowego. Sferoidy powinny wyglądać jak zwarte, w przybliżeniu sferyczne agregaty komórkowe, aby przygotować sferoid komórkowy do sekcjonowania i obrazowania.
Użyj pipety o objętości 1 ml, aby przenieść je do probówki typu Falcon. Następnie pozwól steroidom osiąść na dnie stożka. Kolejnym krokiem jest usunięcie medium za pomocą ssaka, a następnie utrwalenie sferoidów poprzez inkubację w 10% neutralnie buforowanej formalinie przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej.
SP można następnie przechowywać w HBSS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka dni po wykonaniu przekrojów i obrazowaniu komórki. Następnie należy otworzyć oprogramowanie do analizy obrazu i wybrać konfigurację służącą wyłącznie do kwantyfikacji. Potem należy utworzyć nową bibliotekę i zaimportować plik obrazu konfokalnego sferoidu, przeciągając plik z surowymi danymi do biblioteki.
Następnie przejdź do karty pomiarów, aby stworzyć protokół analizy obrazu, przeciągając i upuszczając polecenia w odpowiedniej kolejności w oknie protokołu. Aby znaleźć obiekty w kanale zielonym, przeciągnij i upuść polecenie find objects z sekcji finding do okna protokołu, a następnie wybierz odpowiedni kanał. Dodaj polecenie open znajdujące się w sekcji processing, a następnie dodaj oddzielne polecenie touching objects, aby rozdzielić komórki.
Na koniec, w sekcji filtrowania, dodaj i wyklucz obiekty według rozmiaru. Ustaw polecenie dla obiektów mniejszych niż 50 µm, aby wykluczyć małe obiekty niekomórkowe. Następnie przeciągnij i upuść nową komendę „find objects” do okna protokołu.
Postępując zgodnie z tymi samymi krokami, należy wybrać kanał czerwony i zastosować wszystkie kolejne polecenia. Po wykryciu obiektów należy użyć poleceń ukryj kanał (hide channel) lub pokaż kanał (show channel), aby wizualnie upewnić się, że obiekty czerwone i zielone odpowiadają czerwonym i zielonym jądrom. W razie potrzeby należy kliknąć pomiary (measurements), a następnie opcje informacji zwrotnej (feedback options), aby zmodyfikować wygląd masek obiektów.
Aby znaleźć żółte obiekty odpowiadające komórkom wczesnej fazy S, należy użyć polecenia intersect w sekcji combining i wybrać opcję intersect red objects with green objects. Ponownie należy wykluczyć obiekty o rozmiarze mniejszym niż 50 micrometers. W celu identyfikacji komórek w fazie G1 należy użyć polecenia subtract w sekcji combining i wybrać opcję subtract yellow object from red objects, aby wyodrębnić wyłącznie czerwone obiekty.
Analogicznie, należy odjąć obiekty żółte od obiektów zielonych, aby zidentyfikować wyłącznie obiekty zielone, które odpowiadają SG dwa oraz komórkom w fazie MPH, zarówno dla obiektów wyłącznie czerwonych, jak i wyłącznie zielonych. W razie potrzeby należy usunąć obiekty niekomórkowe, stosując polecenie filter population z sekcji filtrowania z parametrem shape factor większym niż 0,25. Następnie należy wyznaczyć obrys sferoidu S.
Użyj polecenia find objects z sekcji finding w kanale zielonym lub czerwonym. Skorzystaj z polecenia closed z sekcji processing, aby połączyć poszczególne komórki w jeden obiekt. Następnie dodaj polecenie fill holes in objects, aby wypełnić otwory w sferze.
Następnie użyj filtru drobnego (fine filter), aby usunąć szum z obiektu Sphero. Zakończ wyznaczanie obrysu sferoidy, wybierając opcję wykluczania obiektów według rozmiaru (exclude objects by size), aby usunąć obiekty mniejsze niż 30 000 µm. Po zdefiniowaniu wszystkich obiektów dodaj funkcję pomiaru odległości (measure distances) z odpowiedniej sekcji, aby określić odległość każdego OID od krawędzi obrysu sferoidy S.
Wykonaj tę czynność w każdej z populacji: żółtej, wyłącznie czerwonej oraz wyłącznie zielonej. Aby zwizualizować minimalne odległości od komórki do najbliższej krawędzi sferoidu S, otwórz kartę pomiarów, wybierz opcje sprzężenia zwrotnego, a następnie relacje. Następnie wybierz opcję pokaż odległości.
Na koniec zapisz protokół, aby zachować dane przez niego utworzone. W sekcji pomiarów wybierz element wykonaj pomiar (make measurement). Następnie, aby zinterpretować dane, wybierz element pomiaru, przejdź do karty analiza w sekcji pomiarów i wybierz Analizuj (Analyze) w menu analizy, aby zliczyć komórki znajdujące się w określonej odległości od krawędzi steroidu.
Utwórz filtr, wybierając opcję filter z karty analysis. Na przykład wyświetl tylko dane, w których odległość od krawędzi sfery jest mniejsza niż 100 microns. Aby wyeksportować surowe dane, wybierz opcję export z karty file, a następnie zapisz dane jako tekst rozdzielany przecinkami lub tabulatorami.
Te dane można otworzyć w programie do arkuszy kalkulacyjnych w celu przeprowadzenia dalszej analizy. Sferoidy komórkowe wygenerowane z C 8 1 16 1. Ludzkie komórki czerniaka, które zostały transdukowane za pomocą systemu Fuji, utrwalono i poddano sekcjonowaniu.
Wykonano obrazowanie konfokalne z użyciem barwnika AZA green, który znakuje komórki w fazie S i M cyklu komórkowego, oraz Berra orange, który znakuje komórki w fazie G1. Po nałożeniu tych obrazów na siebie można zaobserwować oczekiwane kluczowe cechy, takie jak rdzeń nekrotyczny. Komórki w fazie G1 (kolor czerwony) przeważają w pobliżu tego rdzenia nekrotycznego, natomiast liczba proliferujących komórek czerwonych i zielonych wzrasta gradientowo w kierunku zewnętrznej krawędzi sferoidu, gdzie dostęp do tlenu i składników odżywczych jest największy.
Po półautomatycznej analizie obrazu można zdefiniować maski komórek fucci oraz obrys sferoidu S. Oprogramowanie do obrazowania zostało wykorzystane do ilościowego oznaczenia komórek czerwonych i zielonych w regionie wewnętrznym lub zewnętrznym sferoidu S. Analiza ta wykazała, że komórki zablokowane w fazie G1 są wzbogacone w regionie wewnętrznym, natomiast komórki proliferujące przeważają bliżej krawędzi sferoidu.
Po opanowaniu tej techniki, proces można przeprowadzić w ciągu jednego do dwóch tygodni; ramy czasowe te obejmują hodowlę sferoidu, obrazowanie oraz analizę. Po wykonaniu tych procedur sferoidy mogą zostać zaimplantowane w matrycy kolagenowej, a następnie obrazowane za pomocą mikroskopii TimeLapse. Następnie mogą one zostać poddane analizie białek lub RNA, co może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania dotyczące tego, czy położenie w sferoidzie oraz dostęp do tlenu i składników odżywczych mogą zmieniać fenotypy komórek nowotworowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia dwie komplementarne metody wykorzystujące fluorescencyjny wskaźnik cyklu komórkowego ubikwitynacji (FUCCI) wraz z analizą obrazu i cytometrią przepływową. Techniki te zostały zaprojektowane w celu identyfikacji i izolacji komórek na podstawie ich fazy cyklu komórkowego w obrębie sferoidów 3D.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Badania nad rakiem
- Trójwymiarowa hodowla komórek
Wstęp
- Sferoidy 3D naśladują architekturę i mikrośrodowisko guza.
- Zrozumienie statusu cyklu komórkowego jest kluczowe dla badań nad rakiem.
- Tradycyjne hodowle 2D nie oddają precyzyjnie warunków in vivo.
- Cytometria przepływowa i techniki obrazowania zwiększają możliwości analityczne.
Cel badania
- Identyfikacja i charakterystyka komórek w różnych fazach cyklu komórkowego.
- Izolacja specyficznych populacji komórek z sferoidów 3D.
- Badanie wpływu mikrośrodowiska nowotworowego na zachowanie komórek.
Zastosowane metody
- Fluorescencyjny wskaźnik ubikwitynacji cyklu komórkowego (FUCCI) do wizualizacji.
- Analiza obrazu w celu oceny stanu cyklu komórkowego.
- Cytometria przepływowa do izolacji komórek.
- Przygotowanie sferoidów 3D z wykorzystaniem kropli w płytkach do hodowli tkankowej.
Główne wyniki
- Pomyślna identyfikacja wewnętrznych komórek zatrzymanych w fazie G1 oraz zewnętrznych komórek proliferujących.
- Osiągnięto wizualizację dynamiki cyklu komórkowego w czasie rzeczywistym.
- Wykazano możliwość izolacji żywych komórek z określonych obszarów sferoidów.
- Wnioski dotyczące wpływu mikrośrodowiska guza na wrażliwość na leki i proliferację.
Wnioski
- Opisane metody stanowią solidne podejście do badania biologii nowotworów.
- Analiza w czasie rzeczywistym pogłębia zrozumienie zachowania komórek w modelach 3D.
- Techniki te mogą dostarczyć cennych informacji dla strategii terapeutycznych w leczeniu raka.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie heterogeniczności przestrzennej w sferoidach nowotworowych umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w walidacji celu poprzez powiązanie stanu cyklu komórkowego z sygnałami z mikrośrodowiska. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną modeli przedklinicznych dzięki kwantyfikacji gradientów proliferacji oraz nisz spoczynkowych, które mają znaczenie dla penetracji leków i oporności. Pozwala ono również na selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację subpopulacji najskłonniejszych do wywoływania nawrotów lub ucieczki terapeutycznej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G1 oraz proliferacji w obrębie regionów sferoidu, co wyjaśnia zależności szlaków sygnałowych w strefach hipoksycznych w porównaniu ze strefami bogatymi w składniki odżywcze.
- Wartość operacyjna: Umożliwia izolację żywych komórek z określonych stref do dalszych analiz funkcjonalnych, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad oddziakiwaniem z celem molekularnym.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne z mierzalnymi odczytami cyklu komórkowego do przesiewania związków, zapewniając istotność testu w odniesieniu do architektury 3D.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje wyniki przestrzenne i fenotypowe za pomocą analizy obrazu, co poprawia powtarzalność w ramach kampanii przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zgodność z układami istotnymi dla przebiegu chorób poprzez modelowanie gradientów nekrozy, stanu spoczynku i proliferacji obserwowanych in vivo.
- Wartość operacyjna: Wsparcie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez powiązanie fenotypów zależnych od położenia ze stresorami mikrośrodowiskowymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z biologią odkrywczą, umożliwiając testowanie hipotez dotyczących wpływu mikrośrodowiska na cykl komórkowy, przechodzi do etapu przesiewowego poprzez standaryzowane testy oparte na sferoidach oraz wspiera badania translacyjne dzięki dopasowaniu biomarkerów w rozdzielczości przestrzennej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez korelację pozycji komórek z fazami cyklu komórkowego w celu wyjaśnienia mechanizmów odpowiedzi na leki.
- Screening: Zapewnia gotowość do analizy dzięki mierzalnym stosunkom komórek czerwonych do zielonych w wewnętrznych i zewnętrznych regionach sferoidów, co umożliwia śledzenie efektów działania związków.
- Analityka: Dostarcza pomiary odległości od krawędzi oraz maski specyficzne dla poszczególnych faz jako dane ilościowe do porównywania różnych warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie gradientów tlenu i składników odżywczych, które wpływają na fenotypy komórek nowotworowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do podłużnego śledzenia żywotności komórek, ekspresji genów lub odpowiedzi na leki w wielu generacjach sferoidów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna dzięki rozdzielczości przestrzennej proliferacji i stanu spoczynku, co redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich w walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i skalowalność dzięki półautomatycznej analizie obrazów oraz izolacji metodą cytometrii przepływowej.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go dzięki ograniczaniu ryzyka związanego z celami na podstawie ich responsywności na mikrośrodowisko.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja związków z uwzględnieniem ryzyka, które przenikają do nisz spoczynkowych lub celują w komórki w cyklu komórkowym.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w transdukcji FUCCI, hodowli sferoidów oraz obrazowaniu konfokalnym.
- Zależne od mikroskopii fluorescencyjnej i oprogramowania do analizy obrazu umożliwiającego segmentację kanałów i filtrowanie morfometryczne.
- Wymaga standaryzacji linii komórkowych i warunków macierzy w celu zapewnienia powtarzalnego tworzenia sferoidów.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metod przy zastosowaniu w systemach niebędących czerniakiem lub w ko-kulturach ze stromalem.
- Ograniczone przez głębokość cięcia i penetrację sygnału w większych sferoidach, co wpływa na rozdzielczość obszaru rdzenia.
![Ilościowa analiza [18F]-Naf-PET-MRI do oceny dynamicznego obrotu kostnego u pacjenta z facetogenetycznym bólem krzyża](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F58491.jpg%3Fv%3D2026-07-04T05%253A56%253A06.000Z&w=384&q=75)