Name: Oparta na obrazowaniu i cytometrii przepływowej analiza położenia komórki i cyklu komórkowego w sferoidach czerniaka 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj metodę analizy cyklu komórkowego w sferoidach czerniaka 3D z wykorzystaniem FUCCI, obrazowania i cytometrii przepływowej. Technika umożliwia identyfikację i izolację komórek w różnych fazach cyklu w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Pani Danae Sharp i Pani Sheenie Daignault za pomoc techniczną. Dziękujemy dr Atsushi Miyawaki, RIKEN, miasto Wako, Japonia, za dostarczenie konstruktów FUCCI, dr Meenhardowi Herlynowi i Pani Patricii Brafford z Instytutu Wistar, Filadelfia, za dostarczenie linii komórkowych, Zakładowi Obrazowania i Cytometrii Przepływowej w Instytucie Stulecia za wyjątkowe wsparcie techniczne. Dziękujemy Panu Chrisowi Johnsonowi i dr Andrew Barlowowi za wsparcie techniczne oprogramowania Volocity. N.K.H. jest stypendystką Cameron w Instytucie Badań nad Czerniakiem i Rakiem Skóry w Australii. K.A.B. jest członkiem Instytutu Raka w Nowej Południowej Walii (13/ECF/1-39). W.W. jest członkiem Instytutu Raka w Nowej Południowej Walii (11/CDF/3-39). Prace te były wspierane przez granty projektowe RG 09-08 i RG 13-06 (Rada ds. Raka Nowej Południowej Walii), 570778 i 1051996 (Priority-driven Collaborative cancer research scheme/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Foundation), 08/RFG/1-27 (Cancer Institute New South Wales) oraz APP1003637 i APP1084893 (National Health and Medical Research Council).

1. Transdukcja FUCCI i hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Przekładnia FUCCI
	<ol>
		<li>Stwórz linie komórkowe stabilnie eksprymujące konstrukty FUCCI mKO2-hCdt1 (30-120) i mAG-hGem (1-100) 15 za pomocą kotransdukcji lentiwirusa, jak opisano wcześniej 7. 
		Uwaga: System FUCCI jest już dostępny w sprzedaży.</li>
		<li>Generuj podklony z jasną fluorescencją przez sortowanie pojedynczych komórek. Sortuj pojedyncze komórki dodatnie zarówno dla AG, jak i KO (żółty) przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją na 96-dołkowej płytce, jak opisano wcześniej 7,16.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posiewy komórkowe czerniaka
	<ol>
		<li>Hodowla ludzkich komórek czerniaka C8161, jak opisano wcześniej, 7,17.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 3D Formacja sferoidalna (jak wcześniej opisano 3,9)
<ol>
	<li>Przygotowanie płytki agarozowej
	<ol>
		<li>Rozpuść 1,5% agarozy (lub szlachetnego agaru) w 100 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), gotując w kuchence mikrofalowej przez 3-5 minut z wirowaniem. Upewnij się, że agaroza jest całkowicie rozpuszczona.</li>
		<li>Natychmiast dozować 100 μl roztworu agarozy na studzienkę do płaskodennej 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej za pomocą pipety wielokanałowej. 
		Uwaga: Agaroza może zastygnąć w końcówkach po krótkim czasie, aby przezwyciężyć ten problem, końcówki należy wymieniać między płytkami, jeśli robisz więcej niż jedną płytkę agarozową.</li>
		<li>Pozostaw 96-dołkową płytkę na płaskiej powierzchni do stwardnienia agarozy przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek i nakładanie na agarozę
	<ol>
		<li>Hoduj komórki do około 80% zbiegu w kolbie T75. Umyć 10 ml HBSS.</li>
		<li>Odłączyć komórki za pomocą 1,5 ml 0,05% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i ponownie zawiesić w 10 ml normalnej pożywki.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru 18 lub innej automatycznej metody liczenia.</li>
		<li>Zawiesić komórki do końcowego stężenia 25 000 komórek/ml w normalnym podłożu.</li>
		<li>Załóż studzienki agarozowe na 200 μl zawiesiny komórek, aby uzyskać ostateczną liczbę 5 000 komórek na studzienkę.</li>
		<li>Włożyć płytki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych (5% CO2 i 37 °C) w celu utworzenia sferoid przez około 3 dni. 
		Uwaga: Czas potrzebny do uformowania sferoidy różni się w zależności od różnych linii komórkowych. Niektóre linie komórkowe w ogóle nie tworzą sferoid przy użyciu tej metody.</li>
		<li>Obraz morfologii sferoidalnej za pomocą mikroskopu odwróconego przy użyciu obiektywu 4X i filtra kontrastu fazowego. Linia komórkowa, która z powodzeniem tworzy sferoidy, wytwarza zwarte, z grubsza kuliste agregaty komórek, a na studzienkę powinna przypadać tylko jedna sferoida. 
		Uwaga: Opcjonalnie: Po uformowaniu się sferoid można je przesadzić do kolagenu lub innej matrycy w celu dalszej analizy wzrostu i inwazji 3,7,17. Aby usunąć sferoidy z kolagenu, należy potraktować 500 μl kolagenazy 2 mg/ml w temperaturze 37 °C, aż kolagen rozpuści się na tyle, aby sferoidy mogły uwolnić się do podłoża (około 30 min). Delikatnie usuń sferoidy za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
		<li>Do cięcia/obrazowania utrwal sferoidy (wyizolowane z kolagenu lub hodowane przez 3-5 dni na agarozie) w 10% neutralnej buforowanej formalinie (UWAGA: formalinę należy stosować w dygestorium) przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT) lub przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C. Sferoidy mogą być przechowywane w HBSS w temperaturze 4 °C przez kilka dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Sekcja wibratomu sferoidalnego
<ol>
	<li>Rozpuścić 5 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 100 ml HBSS w szklanej butelce o pojemności 500 ml w kuchence mikrofalowej. Użyj średniego ustawienia ognia z wirowaniem. UWAGA: Podczas gotowania roztworu należy trzymać pokrywkę luźną, aby można było zwolnić ciśnienie. Używaj rękawic ochronnych żaroodpornych, aby chronić dłonie przed oparzeniami podczas obchodzenia się z gorącą szklaną butelką.</li>
	<li>Poczekaj, aż agaroza lekko ostygnie – tak, aby można było dotknąć butelki bez poparzenia rąk.</li>
	<li>Wlej około 2 ml agarozy na dno kubka z ladą Coulter lub podobnej plastikowej formy. Natychmiast odessać utrwaloną sferoidę (patrz sekcja 2.2.8) za pomocą pipety o pojemności 1 ml w możliwie najmniejszej objętości płynu. Dodaj sferoidę do agarozy. Na filiżankę można dodać kilka sferoid (do 10).</li>
	<li>Przykryj sferoidy 2 ml więcej agarozy. Zrób to szybko, aby uniknąć stwardnienia agarozy przed dodaniem drugiej warstwy.</li>
	<li>Pozwól agarozie stwardnieć w temperaturze pokojowej w ciemności przez co najmniej 3 godziny. Na tym etapie kubki mogą być przechowywane przez krótki czas w temperaturze 4 °C z nałożonymi 2-3 ml HBSS, aby zapobiec odwodnieniu.</li>
	<li>Usuń agarozę z filiżanki. Przytnij agarozę zawierającą sferoidy tak, aby pasowała do metalowego bloku wibratomu, a sferoidy znajdowały się blisko górnej części agarozy. Sferoidy mogą być widziane jako małe białe obiekty wewnątrz agarozy. Super przyklej agarozę do bloku.  </li>
	<li>Napełnij wibratomat wodą destylowaną i zamontuj blok w wibratomie. Ustaw wibratom tak, aby cięł odcinki 100 μm przy użyciu niskiej prędkości (ustawienie 2) i wysokich wibracji (ustawienie 8). Ustaw kąt ostrza tnącego na 16°. Włącz wibratom, włącz światło wibratomu i tnij sekcje od góry agarozy, aż zostaną wycięte sekcje sferoidalne 100 μm. Umieść pocięte skrawki sferoidów w HBSS na 24-dołkowej płytce.</li>
	<li>Wybierz środkowe sekcje do analizy obrazu. Zamontuj sekcje na szkiełkach, przenosząc sekcję płasko na szkiełko za pomocą pęsety. Napełnij 10 ml cylindra strzykawki smarem próżniowym; Dodaj cienką linię smaru próżniowego wokół krawędzi sekcji, aby zapobiec spływaniu mediów montażowych z krawędzi szkiełka i pomóc uszczelnić sekcję pod szkiełkiem nakrywkowym. Przykryj sekcję medium montażowym i szkiełkiem nakrywkowym. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Preparaty należy przechowywać w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem.</li>
</ol>
4. Akwizycja obrazu konfokalnego
<ol>
	<li>Zrób zdjęcie z przekrojem środkowego przekroju sferoidalnego FUCCI za pomocą obiektywu 10X lub 20X, jak opisano wcześniej 7. Upewnij się, że nie ma nakładania się ani przesłuchów między Kusabira Orange2 i Azami Green. Porównując analizę obrazu między wieloma sekcjami sferoidowymi, utrzymuj moc lasera i inne ustawienia takie same między próbkami.</li>
</ol>
5. Test dyfuzji barwnika Hoechst do sortowania przepływowego
<ol>
	<li>Przenieść żywe sferoidy (3-5 dni po wysiewie agarozy) do probówki o pojemności 15 ml. Niech sferoidy grawitacyjnie osiądą na dnie rury. W jednej probówce można zabarwić kilka sferoid. Około 20 sferoid jest potrzebnych do uzyskania wystarczającej liczby komórek do cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Usunąć nadmiar pożywki i dodać 1 ml 10 μM Hoechst rozcieńczonego w normalnym podłożu. Inkubować sferoidy w temperaturze 37 °C przez około 1 godzinę. Użyj delikatnego przesuwania, aby ponownie zawiesić sferoidy raz lub dwa razy podczas inkubacji. 
	Uwaga: Czas inkubacji może być zróżnicowany w celu zmiany stopnia wnikania barwnika Hoechst w sferoidy. Będzie się to różnić w zależności od wielkości sferoidy, gęstości i linii komórkowej. W przypadku niektórych dużych/gęstych sferoid maksymalna penetracja barwnika może być mniejsza niż 100%.</li>
	<li>Delikatnie umyć sferoidy 5 ml HBSS za pomocą osadzania grawitacyjnego.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie: Do obrazowania penetracji barwnika: Utrwalić sferoidy za pomocą 10% neutralnej buforowanej formaliny przez co najmniej 2 godziny w temperaturze RT lub O/N w temperaturze 4 °C. Przygotować skrawki wibratomiczne, zamontować na szkiełkach i obraz na konfokalnym, jak opisano w krokach 3 i 4 powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przygotować komórki do cytometrii przepływowej, trypsynizuj sferoidy 1 ml 0,05% trypsyny/EDTA w temperaturze 37 °C przez około 30 minut z trzepaniem co 10 minut w celu rozdzielenia sferoid. 
	Uwaga: Sferoidy są trudne do dostania się do zawiesiny pojedynczej komórki, warunki mogą wymagać optymalizacji. Żywotność 4-dniowych sferoid C8161 po tym procesie wynosi około 95%.</li>
	<li>Barwić ogniwa żywą/martwą plamą w bliskiej podczerwieni zgodnie z protokołem producenta. Przemyć HBSS, a następnie utrwalić 1 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny przez około 30 minut. Komórki mogą być przechowywane w HBSS w temperaturze 4 °C przez kilka dni przed analizą przepływu.</li>
</ol>
6. Analiza cytometrii przepływowej sferoid FUCCI barwionych metodą Hoechst
<ol>
	<li>Upewnij się, że komórki nie są zlepione ze sobą, przepuszczając je przez sitko do komórek. Ponownie zawiesić barwione sferoidy FUCCI Hoechst w lodowatym płuczeniu FACS (PBS z 5% płodową surowicą cielęcą) o stężeniu 1-5 x 106 komórek/ml. Przenieść 200 μl próbki do probówek okrągłodennych o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Przygotować następujące jednobarwne próbki kontrolne, jak opisano w ppkt 6.1: niebarwione komórki czerniaka; przylegające komórki czerniaka barwione 10 μM Hoechst przez 1 godzinę; Azami Green wyraża tylko komórki czerniaka; i Kusabira Orange tylko z ekspresją komórek czerniaka. 
	Uwaga: Jednokolorowe wzorce mogą być utrwalone w formalinie i przechowywane w praniu FACS z 0,1% azydkiem sodu w temperaturze 4 °C przez tygodnie, a nawet miesiące.</li>
	<li>Przeprowadzić zawiesiny pojedynczych komórek na analizatorze cytometrii przepływowej z odpowiednimi laserami i jednokolorowymi/niebarwionymi kontrolami, jak opisano wcześniej 7,16.</li>
	<li>Użyj komercyjnego oprogramowania do cytometrii, takiego jak FlowJo, aby przeanalizować wewnętrzne i zewnętrzne komórki sferoidalne w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Usuń zanieczyszczenia, bramkując główną populację komórek w trybie światła rozproszonego do przodu (FSC) i światła rozproszonego po stronie (SSC).</li>
		<li>Usuń dublety, bramkując na pojedynczych komórkach za pomocą FSC (obszar) i FSC (wysokość)</li>
		<li>Brama dla żywych komórek poprzez bramkowanie na żywej/martwej niskiej populacji.</li>
		<li>Zdefiniuj wysokie komórki Hoechsta, bramkowane na podstawie pozytywnego sygnału z przylegających komórek barwionych Hoechstem, jako komórki "zewnętrzne".</li>
		<li>Zdefiniuj niskie lub ujemne komórki Hoechst, bramkowane na podstawie sygnału z niebarwionej kontroli, jako komórki "wewnętrzne".</li>
		<li>Po bramkowaniu dla populacji wewnętrznej i zewnętrznej, komórki mogą być dalej bramkowane dla koloru czerwonego FUCCI (G1), żółtego (wczesne S), zielonego (S / G2 / M) lub ujemnego (wczesny G1). 
		Uwaga: Kompensacja przy użyciu jednokolorowych elementów sterujących może być wymagana do prawidłowego zdefiniowania populacji czerwonej, żółtej, zielonej i negatywnej FUCCI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zoptymalizowaniu testu i walidacji penetracji Hoechsta za pomocą mikroskopii konfokalnej, należy uruchomić komórki bez utrwalania na przepływowym sortowniku komórek, jak opisano wcześniej 7,16 w celu dalszej analizy subpopulacji żywych komórek.</li>
</ol>
7. Analiza obrazu przekrojów sferoidalnych FUCCI
<ol>
	<li>Otwarte oprogramowanie, np. Volocity, wybierz konfigurację Quantitation ONLY.</li>
	<li>Utwórz nową bibliotekę. Zaimportuj plik obrazu konfokalnego sferoidalnego FUCCI do oprogramowania, przeciągając plik surowych danych z konfokalnego obrazu do biblioteki. Można też użyć polecenia Plik >Importuj.</li>
	<li>Przejdź do zakładki pomiary, aby zbudować protokół analizy obrazu. Protokół jest tworzony przez przeciągnięcie i upuszczenie odpowiednich poleceń w odpowiedniej kolejności, jak w oknie protokołu.</li>
	<li>Znajdź obiekty w zielonym kanale: Przeciągnij polecenie znajdź obiekty (znalezione w 'Znajdowanie') do okna protokołu, wybierz właściwy kanał w protokole znajdź obiekty. Dodaj polecenie otwarcia (znajdujące się w 'Przetwarzaniu'), a następnie oddzielne polecenie dotykania obiektów (znajdujące się w 'Przetwarzaniu' - spowoduje to rozdzielenie komórek). Wyklucz obiekty według rozmiaru <50 μm (znajduje się w 'Filtrowaniu' - spowoduje to wykluczenie małych obiektów niekomórkowych). 
	Uwaga: Zmienne, takie jak próg znajdowania obiektów, liczba otwartych iteracji, rozmiar obiektów do rozdzielenia i rozmiar obiektów do wykluczenia, muszą być ręcznie zoptymalizowane, aż maski obiektów będą pasować do obrazu.</li>
	<li>Znajdź obiekty w czerwonym kanale: Powtórz wyszukiwanie obiektów jak powyżej dla czerwonego kanału. Protokoły zielony i czerwony mogą wymagać osobnej regulacji. 
	Uwaga: Ze względu na to, że jądra znajdują się w G2, zielone jądra są często nieco większe.</li>
	<li>Upewnij się, że znalezione obiekty są dokładne: Upewnij się, że czerwone i zielone obiekty pasują do czerwonych i zielonych jąder na obrazie, wyłączając i włączając kanały zielony i czerwony (za pomocą polecenia ukryj lub pokaż kanał) podczas wyświetlania czerwonych i zielonych masek znalezionych przez protokół. Opcje sprzężenia zwrotnego (Pomiary >Opcje informacji zwrotnej) mogą być używane do modyfikowania wyglądu masek obiektów.</li>
	<li>Znajdź żółte obiekty (wczesne komórki fazy S): Aby znaleźć żółte komórki, dodaj polecenie przecięcia czerwonego z zielonymi komórkami (znajduje się w "Łączeniu"). Wyklucz obiekty według rozmiaru (<50 μm, znalezione w 'Filtrowaniu'), aby wykluczyć wszelkie małe obiekty niekomórkowe.</li>
	<li>Znajdź wyłącznie czerwone obiekty (komórki fazy G1): Aby znaleźć wyłącznie czerwone jądra, odejmij żółte krwinki od czerwonych krwinek (znalezione w 'Łączeniu'). Wyklucz obiekty według rozmiaru <50 μm (znajduje się w 'Filtrowaniu'), aby usunąć wszelkie małe obiekty niekomórkowe utworzone</li>.
	<li>Znajdź wyłącznie zielone obiekty (komórki fazowe S/G2/M): Powtórz dla kanału zielonego, aby znaleźć wyłącznie zielony. 
	Uwaga: Jeśli nadal pozostają obiekty niekomórkowe, do protokołu Wyłączny zielony lub Wyłączny czerwony (znajdujący się w 'Filtrowaniu') można dodać polecenie filtrowania populacji, aby zachować tylko obiekty o współczynniku kształtu większym niż 0,25. Spowoduje to usunięcie obiektów nieokrągłych.</li>
	<li>Znajdź kontur sferoidy: Znajdź kontur sferoidy za pomocą polecenia znajdź obiekty (znajdującego się w 'Znajdowaniu') z zielonym lub czerwonym kanałem (w zależności od tego, który z nich ma więcej komórek wokół krawędzi sferoidy). Do znalezienia konturu sferoidy trzeba będzie użyć znacznie niższego progu (znajdującego się w zmiennych find objects) w porównaniu z pojedynczymi komórkami.
	<ol>
		<li>Użyj polecenia close, aby połączyć obiekty (znalezionego w 'Processing'), następnie wypełnij w obiektach (znalezionego w 'Processing'), a następnie użyj dokładnego filtra (znajdującego się w 'Filtrowaniu'), aby usunąć szum z obiektów. Na koniec wyklucz obiekty według rozmiaru, aby usunąć mniejsze obiekty <30 000 μm (w zależności od rozmiaru sferoidy). 
		Uwaga: Ten protokół będzie musiał zostać zoptymalizowany ręcznie, aż kontur sferoidy będzie dokładny. Można również użyć obrazu w jasnym polu - jednak jest to zwykle mniej dokładne w przypadku przekroju sferoidalnego i konieczne będzie użycie polecenia odwrócenia (znajdującego się w 'Łączeniu').</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz odległości jąder od konturu sferoidy: Zmierz odległości (znalezione w "Relacja") od żółtych, wyłącznie zielonych i wyłącznie czerwonych populacji od środka ciężkości komórki do krawędzi konturu sferoidy. Aby zobrazować minimalne odległości, które powinny znajdować się od komórki do najbliższej krawędzi sferoidy, włącz opcję pokaż odległości na karcie relacji w opcjach informacji zwrotnej (Pomiary >Opcje informacji zwrotnej >Relacje).</li>
	<li>Zapisz protokół. Protokół ten można ponownie zastosować do innych obrazów za pomocą polecenia Measurements >Restore protocol.</li>
	<li>Utwórz element pomiaru (Pomiary >Utwórz element pomiaru). Dane mogą być analizowane za pomocą funkcji analizy.
	<ol>
		<li>Przejdź do zakładki analiza w pozycji pomiary. Przejdź do menu Analiza (Analiza >Analizuj) i przeanalizuj minimalną odległość od środka ciężkości komórki (czerwonej, zielonej lub żółtej) do krawędzi sferoidalnej, podsumowaną według liczby i uporządkowaną według populacji.</li>
		<li>Aby policzyć liczbę komórek znajdujących się w określonej odległości od krawędzi, utwórz filtr (Analiza >Filtr). Filtr minimalnej odległości na rysunku 2 opiera się na penetracji Hoechst (np. minimalna odległość jest mniejsza niż 80 daje populację "zewnętrzną"). Możesz też wyeksportować nieprzetworzone dane do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).</li>
<li>Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Melanoma+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Healthcare%22%5BJournal%5D)">Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo.</a> Healthcare. 2, 27-46 (2014).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+tumor+microenvironment+models+for+anticancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery.</a> Expert opinion on drug discovery. 3, 1-10 (2008).</li>
<li>Reid, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+multicellular+tumor+spheroid+models+for+high-content+imaging+and+screening+in+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+chemical+genomics+and+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Live multicellular tumor spheroid models for high-content imaging and screening in cancer drug discovery.</a> Current chemical genomics and translational medicine. 8, 27-35 (2014).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening%3A+the+multicellular+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+screening%22%5BJournal%5D)">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model.</a> Journal of biomolecular screening. 9, 273-285 (2004).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of biotechnology. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Haass, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cell+cycle+imaging+during+melanoma+growth%2C+invasion%2C+and+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+cell+%26+melanoma+research%22%5BJournal%5D)">Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response.</a> Pigment cell & melanoma research. 27, 764-776 (2014).</li>
<li>Lucas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+NOXA+and+MCL-1+as+a+strategy+for+sensitizing+melanoma+cells+to+the+BH3-mimetic+ABT-737%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Modulation of NOXA and MCL-1 as a strategy for sensitizing melanoma cells to the BH3-mimetic ABT-737.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 18, 783-795 (2012).</li>
<li>Smalley, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+pathways+must+be+targeted+to+overcome+drug+resistance+in+cell+lines+derived+from+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases.</a> Molecular cancer therapeutics. 5, 1136-1144 (2006).</li>
<li>Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems+modeling+tumor+growth+determinants+in+cancer+target+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery.</a> Advanced drug delivery reviews. 69-70, 29-41 (2014).</li>
<li>Santini, M. T., Rainaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+model+in+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Pathobiology+%3A+journal+of+immunopathology%2C+molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid model in tumor biology.</a> Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. 67, 148-157 (1999).</li>
<li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240, 177-184 (1988).</li>
<li>Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+tumour+heterogeneity+in+melanoma+therapy%3A+how+do+we+address+this+in+a+novel+model+system%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Melanoma+Manag%22%5BJournal%5D)">Dynamic tumour heterogeneity in melanoma therapy: how do we address this in a novel model system?</a> Melanoma Manag. 2, 93-95 (2015).</li>
<li>Desoize, B., Jardillier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+resistance%3A+a+paradigm+for+clinical+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+reviews+in+oncology%2Fhematology%22%5BJournal%5D)">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance.</a> Critical reviews in oncology/hematology. 36, 193-207 (2000).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132, 487-498 (2008).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li>
<li>Smalley, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulated+expression+of+zonula+occludens+protein-1+in+human+melanoma+associates+with+N-cadherin+and+contributes+to+invasion+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Up-regulated expression of zonula occludens protein-1 in human melanoma associates with N-cadherin and contributes to invasion and adhesion.</a> The American journal of pathology. 166, 1541-1554 (2005).</li>
<li>Using a Hemacytometer to Count Cells | Protocol. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2015).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glutamine+transport+to+suppress+melanoma+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer.+Journal+international+du+cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting glutamine transport to suppress melanoma cell growth.</a> International journal of cancer. Journal international du cancer. 135, 1060-1071 (2014).</li>
<li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+division%22%5BJournal%5D)">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell division. 6, 22(2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+deep+imaging+of+live+cellular+spheroids+with+light-sheet-based+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+tissue+research%22%5BJournal%5D)">High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy.</a> Cell and tissue research. 352, 161-177 (2013).</li>
<li>Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Hoechst+33342+for+cell+selection+from+multicell+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).</li>
<li>Laurent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroid+models+to+explore+cell+cycle+checkpoints+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D.</a> BMC cancer. 13, 73(2013).</li>
<li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).</li>
<li>Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+distribution+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+is+strongly+dose+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent.</a> Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
<li>Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiobiological+studies+of+cells+in+multicellular+spheroids+using+a+sequential+trypsinization+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+research%22%5BJournal%5D)">Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique.</a> Radiation research. 86, 368-386 (1981).</li>
</ol>

PerkinElmer partycypował w kosztach publikacji.

Półautomatyczna analiza obrazu pozwoliła zidentyfikować sferoidalny wewnętrzny obszar zatrzymany G1 i proliferujące warstwy zewnętrzne. Metoda ta może być stosowana na żywych sferoidach przy użyciu przekroju optycznego lub w stałych przekrojach sferoidalnych, w celu identyfikacji zmian nie tylko w cyklu komórkowym, ale także w ekspresji markerów (poprzez immunofluorescencję), śmierci komórki lub morfologii komórki w tych różnych regionach. Ruchliwość komórek w różnych regionach sferoidalnych można również określić ilości...

Wielokomórkowe sferoidy 3D są znane jako modele nowotworów od dziesięcioleci, jednak dopiero niedawno stały się bardziej powszechne jako model in vitro dla wielu nowotworów litych. Są one coraz częściej stosowane w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych odkrywania leków jako rozwiązanie pośrednie między złożonymi, drogimi i czasochłonnymi modelami in vivo a prostym, tanim monowarstwowym modelem 2D 1-6. Badania nad kulturą 2D często nie są możliwe do powtórzenia in vivo. Modele sferoidalne wielu typów nowotworów są w stanie naśladować charakterystykę wzrostu, wrażliwość na leki, penetrację leków, interakcje komórka-komórka, ograniczoną dostępność tlenu i składników odżywczych oraz rozwój martwicy, która jest obserwowana in vivo w guzach litych 6-11. Sferoidy rozwijają nekrotyczne jądro, spoczynkowy lub zatrzymany G1 obszar otaczający jądro i proliferujące komórki na obrzeżach sferoidy 7. Rozwój tych regionów może się różnić w zależności od gęstości komórek, tempa proliferacji i wielkości sferoidy 12. Postawiono hipotezę, że heterogeniczność komórkowa obserwowana w tych różnych podregionach może przyczyniać się do oporności na terapię nowotworową 13,14. Dlatego możliwość oddzielnej analizy komórek w tych regionach ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia odpowiedzi na leki nowotworowe.
System wskaźnika cyklu komórkowego ubikwitynacji fluorescencji (FUCCI) opiera się na czerwonym (Kusabira Orange - KO) i zielonym (Azami Green - AG) fluorescencyjnym znakowaniu Cdt1 i gemininy, które są degradowane w różnych fazach cyklu komórkowego 15. W ten sposób jądra komórkowe są czerwone w G1, żółte we wczesnej fazie S i zielone w fazie S/G2/M. Opisujemy tutaj dwie uzupełniające się metody, zarówno wykorzystujące FUCCI do identyfikacji cyklu komórkowego, jak i użycie oprogramowania do obrazowania lub testu cytometrii przepływowej dyfuzji barwnika w celu określenia, czy komórki znajdują się w centrum zatrzymanym G1, czy w zewnętrznym pierścieniu proliferacyjnym, oraz odległości poszczególnych komórek od krawędzi sferoidy. Metody te zostały opracowane w naszej poprzedniej publikacji, w której wykazaliśmy, że komórki czerniaka w niedotlenionych regionach w środku sferoidy i/lub w obecności terapii celowanych są w stanie pozostać w zatrzymaniu G1 przez dłuższy czas i mogą ponownie wejść w cykl komórkowy, gdy pojawią się bardziej sprzyjające warunki 7.

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Life Technologies</td><td>16520-050</td><td>Do krojenia</td></tr><tr><td>agaru szlachetnego&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5431</td><td>Do wytwarzania sferoid</td></tr><tr><td>agaroza do sferoid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>Do wytwarzania sferoid</td></tr><tr><td>0,05% trypsyna/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>10% formalina</td><td>Sigma</td><td>HT5014-1CS</td><td>UWAGA: Szkodliwe,. Używaj środków ochrony osobistej, nie &nbsp; nie wdychać oparów (otwarte w dygestorium).</td></tr><tr><td>żywy/martwy w pobliżu IR</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>wibratom</td><td>Produkty techniczne International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kubek coulture</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>SIE936</td><td>Forma do cięcia sferoid</td></tr><tr><td>hemocytometr</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Invitro</td><td>FAL353072</td><td></td></tr><tr><td>kolagenaza</td><td>Sigma</td><td>C5138&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Analizator cytometru przepływowego</td><td>Becton Dickinson</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Oprogramowanie do obrazowania</td></tr><tr><td>flowjo</td><td>Tree Star</td><td></td><td>Oprogramowanie do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Smar próżniowy</td><td>Sigma</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Media montażowe</td><td>Wektor Laboratoria</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>FUCCI (konstrukcje komercyjne)</td><td>Life Technologies</td><td>P36238</td><td>Tylko transfekcja przejściowa</td></tr><tr><td>Sitko do komórek 70 &#956; m</td><td>In Vitro</td><td>FAL352350</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 5 ml z okrągłym dnem (sterylne)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352003</td><td></td></tr><tr><td>Probówki z okrągłym dnem 5 ml (niesterylne)Probówki 5 ml in vitro (sterylne)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352008</td><td></td></tr></tbody></table>

oparta na obrazowaniu i cytometrii przepływowej analiza położenia komórki i cyklu komórkowego w sferoidach czerniaka 3d

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Trójwymiarowe (3D) sferoidy guza są wykorzystywane w badaniach nad rakiem jako dokładniejszy model mikrośrodowiska guza in vivo, w porównaniu do tradycyjnej dwuwymiarowej (2D) hodowli komórek. Model sferoidalny jest w stanie naśladować skutki interakcji komórka-komórka, niedotlenienie i deprywacja składników odżywczych oraz przenikanie leków. Jedną z cech charakterystycznych tego modelu jest rozwój nekrotycznego rdzenia, otoczonego pierścieniem zatrzymanych komórek G1, z proliferującymi komórkami na zewnętrznych warstwach sferoidy. Interesujące w dziedzinie nowotworów jest to, w jaki sposób różne regiony sferoidy reagują na terapie lekowe, a także manipulacje genetyczne lub środowiskowe. Opisujemy tutaj zastosowanie systemu wskaźnika cyklu komórkowego ubikwitynacji fluorescencji (FUCCI) wraz z cytometrią i analizą obrazu przy użyciu komercyjnego oprogramowania do scharakteryzowania stanu cyklu komórkowego komórek w odniesieniu do ich położenia wewnątrz sferoid czerniaka. Metody te mogą być stosowane do śledzenia zmian w statusie cyklu komórkowego, ekspresji genów/białek lub żywotności komórek w różnych podregionach sferoid nowotworowych w czasie i w różnych warunkach.

Istnieje kilka metod wytwarzania sferoidów nowotworowych; w niniejszym protokole zastosowano metodę wzrostu nieadherentnego, w której komórki hoduje się na agarze lub agarozie 3,7,9. Rysunek 1 przedstawia przykład sferoidu czerniaka C8161 po 3 dniach hodowli na agarze. Sferoidy C8161 tworzą regularne sferoidy o średnicy 500 - 600 μm (średnia = 565, SD = 19, n = 3) po 3 dniach. Inne linie komórkowe czerniaka, które tworzą sferoidy, to m.in.: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1205lu (sferoidy utworz...

Opisujemy dwie uzupełniające się metody wykorzystujące wskaźnik cyklu komórkowego ubikwitynacji fluorescencji (FUCCI) oraz analizę obrazu lub cytometrię przepływową do identyfikacji i izolacji komórek w wewnętrznych obszarach zatrzymanych G1 i zewnętrznych proliferujących sferoidach 3D.

Oparta na obrazowaniu i cytometrii przepływowej analiza położenia komórki i cyklu komórkowego w sferoidach czerniaka 3D

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Ogólnym celem tej metody jest identyfikacja, charakterystyka i izolacja komórek z wielokomórkowego steroidu w odniesieniu do ich stanu w cyklu komórkowym oraz pozycji w obrębie steroidu w porównaniu z dwuwymiarową (2D) hodowlą komórkową. Trójwymiarowy (3D) model OID odtwarza biologię raka in vivo, ponieważ naśladuje architekturę guza oraz jego mikrośrodowisko. Dzięki połączeniu sferoidów z cytometrią przepływową i technikami obrazowania, metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie onkologii, takie jak wpływ mikrośrodowiska guza na zmianę wrażliwości na leki, ruchliwość komórek oraz ich proliferację.Główną zaletą tej metody jest to, że umożliwia ona wizualizację cyklu komórkowego w czasie rzeczywistym oraz pozwala na oczyszczanie żywych komórek z konkretnego regionu steroidowego. Procedurę przeprowadzi A sharp, asystent badawczy z naszego laboratorium. Przygotowanie do tworzenia 3D steroidów rozpoczyna się od podgrzania w kuchence mikrofalowej 1,5% aros w 100 mililitrach zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS). Przez trzy do pięciu minut należy okresowo zakręcać kolbą, aby upewnić się, że aros został całkowicie rozpuszczony. Następnie należy niezwłocznie pipetować 100 µL roztworu aros do każdego dołka płaskodنnej 96-dołkowej płytki hodowlanej. Płytkę należy inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby umożliwić stężenie aros.Następnie wyjmij z inkubatora hodowlę komórek czerniaka wykazujących konfluencję 80%, w których ekspresowane są konstrukty FCI. Przemyj komórki 10 milliliters HBSS. Dodaj 1.5 milliliters 0.05% EDTA, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 degrees Celsius przez około dwie minuty.Po odczepieniu komórek zawiesić je w 10 ml pożywki do hodowli komórkowych. Ręcznie policzyć komórki za pomocą hemocytometru i mikroskopu odwróconego, a następnie rozcieńczyć je w pożywce do stężenia 25 000 komórek na ml. Następnie nanieść pipetą 200 µL zawiesiny komórkowej na każdą studzienkę płytki 96-dołkowej.Inkubuj płytkę w temperaturze 37°C i 5% carbon dioxide przez około trzy dni, aby utworzyły się sferoidy komórkowe. Po inkubacji wykonaj obrazowanie sferoidów za pomocą mikroskopu odwróconego, używając obiektywu Forex i filtra kontrastu fazowego. Sferoidy powinny wyglądać jak zwarte, w przybliżeniu sferyczne agregaty komórkowe, aby przygotować sferoid komórkowy do sekcjonowania i obrazowania.Użyj pipety o objętości 1 ml, aby przenieść je do probówki typu Falcon. Następnie pozwól steroidom osiąść na dnie stożka. Kolejnym krokiem jest usunięcie medium za pomocą ssaka, a następnie utrwalenie sferoidów poprzez inkubację w 10% neutralnie buforowanej formalinie przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej.SP można następnie przechowywać w HBSS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka dni po wykonaniu przekrojów i obrazowaniu komórki. Następnie należy otworzyć oprogramowanie do analizy obrazu i wybrać konfigurację służącą wyłącznie do kwantyfikacji. Potem należy utworzyć nową bibliotekę i zaimportować plik obrazu konfokalnego sferoidu, przeciągając plik z surowymi danymi do biblioteki.Następnie przejdź do karty pomiarów, aby stworzyć protokół analizy obrazu, przeciągając i upuszczając polecenia w odpowiedniej kolejności w oknie protokołu. Aby znaleźć obiekty w kanale zielonym, przeciągnij i upuść polecenie find objects z sekcji finding do okna protokołu, a następnie wybierz odpowiedni kanał. Dodaj polecenie open znajdujące się w sekcji processing, a następnie dodaj oddzielne polecenie touching objects, aby rozdzielić komórki.Na koniec, w sekcji filtrowania, dodaj i wyklucz obiekty według rozmiaru. Ustaw polecenie dla obiektów mniejszych niż 50 µm, aby wykluczyć małe obiekty niekomórkowe. Następnie przeciągnij i upuść nową komendę „find objects” do okna protokołu.Postępując zgodnie z tymi samymi krokami, należy wybrać kanał czerwony i zastosować wszystkie kolejne polecenia. Po wykryciu obiektów należy użyć poleceń ukryj kanał (hide channel) lub pokaż kanał (show channel), aby wizualnie upewnić się, że obiekty czerwone i zielone odpowiadają czerwonym i zielonym jądrom. W razie potrzeby należy kliknąć pomiary (measurements), a następnie opcje informacji zwrotnej (feedback options), aby zmodyfikować wygląd masek obiektów.Aby znaleźć żółte obiekty odpowiadające komórkom wczesnej fazy S, należy użyć polecenia intersect w sekcji combining i wybrać opcję intersect red objects with green objects. Ponownie należy wykluczyć obiekty o rozmiarze mniejszym niż 50 micrometers. W celu identyfikacji komórek w fazie G1 należy użyć polecenia subtract w sekcji combining i wybrać opcję subtract yellow object from red objects, aby wyodrębnić wyłącznie czerwone obiekty.Analogicznie, należy odjąć obiekty żółte od obiektów zielonych, aby zidentyfikować wyłącznie obiekty zielone, które odpowiadają SG dwa oraz komórkom w fazie MPH, zarówno dla obiektów wyłącznie czerwonych, jak i wyłącznie zielonych. W razie potrzeby należy usunąć obiekty niekomórkowe, stosując polecenie filter population z sekcji filtrowania z parametrem shape factor większym niż 0,25. Następnie należy wyznaczyć obrys sferoidu S.Użyj polecenia find objects z sekcji finding w kanale zielonym lub czerwonym. Skorzystaj z polecenia closed z sekcji processing, aby połączyć poszczególne komórki w jeden obiekt. Następnie dodaj polecenie fill holes in objects, aby wypełnić otwory w sferze.Następnie użyj filtru drobnego (fine filter), aby usunąć szum z obiektu Sphero. Zakończ wyznaczanie obrysu sferoidy, wybierając opcję wykluczania obiektów według rozmiaru (exclude objects by size), aby usunąć obiekty mniejsze niż 30 000 µm. Po zdefiniowaniu wszystkich obiektów dodaj funkcję pomiaru odległości (measure distances) z odpowiedniej sekcji, aby określić odległość każdego OID od krawędzi obrysu sferoidy S.Wykonaj tę czynność w każdej z populacji: żółtej, wyłącznie czerwonej oraz wyłącznie zielonej. Aby zwizualizować minimalne odległości od komórki do najbliższej krawędzi sferoidu S, otwórz kartę pomiarów, wybierz opcje sprzężenia zwrotnego, a następnie relacje. Następnie wybierz opcję pokaż odległości.Na koniec zapisz protokół, aby zachować dane przez niego utworzone. W sekcji pomiarów wybierz element wykonaj pomiar (make measurement). Następnie, aby zinterpretować dane, wybierz element pomiaru, przejdź do karty analiza w sekcji pomiarów i wybierz Analizuj (Analyze) w menu analizy, aby zliczyć komórki znajdujące się w określonej odległości od krawędzi steroidu.Utwórz filtr, wybierając opcję filter z karty analysis. Na przykład wyświetl tylko dane, w których odległość od krawędzi sfery jest mniejsza niż 100 microns. Aby wyeksportować surowe dane, wybierz opcję export z karty file, a następnie zapisz dane jako tekst rozdzielany przecinkami lub tabulatorami.Te dane można otworzyć w programie do arkuszy kalkulacyjnych w celu przeprowadzenia dalszej analizy. Sferoidy komórkowe wygenerowane z C 8 1 16 1. Ludzkie komórki czerniaka, które zostały transdukowane za pomocą systemu Fuji, utrwalono i poddano sekcjonowaniu.Wykonano obrazowanie konfokalne z użyciem barwnika AZA green, który znakuje komórki w fazie S i M cyklu komórkowego, oraz Berra orange, który znakuje komórki w fazie G1. Po nałożeniu tych obrazów na siebie można zaobserwować oczekiwane kluczowe cechy, takie jak rdzeń nekrotyczny. Komórki w fazie G1 (kolor czerwony) przeważają w pobliżu tego rdzenia nekrotycznego, natomiast liczba proliferujących komórek czerwonych i zielonych wzrasta gradientowo w kierunku zewnętrznej krawędzi sferoidu, gdzie dostęp do tlenu i składników odżywczych jest największy.Po półautomatycznej analizie obrazu można zdefiniować maski komórek fucci oraz obrys sferoidu S. Oprogramowanie do obrazowania zostało wykorzystane do ilościowego oznaczenia komórek czerwonych i zielonych w regionie wewnętrznym lub zewnętrznym sferoidu S. Analiza ta wykazała, że komórki zablokowane w fazie G1 są wzbogacone w regionie wewnętrznym, natomiast komórki proliferujące przeważają bliżej krawędzi sferoidu.Po opanowaniu tej techniki, proces można przeprowadzić w ciągu jednego do dwóch tygodni; ramy czasowe te obejmują hodowlę sferoidu, obrazowanie oraz analizę. Po wykonaniu tych procedur sferoidy mogą zostać zaimplantowane w matrycy kolagenowej, a następnie obrazowane za pomocą mikroskopii TimeLapse. Następnie mogą one zostać poddane analizie białek lub RNA, co może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania dotyczące tego, czy położenie w sferoidzie oraz dostęp do tlenu i składników odżywczych mogą zmieniać fenotypy komórek nowotworowych.

imaging-flow-cytometry-based-analysis-cell-position-cell-cycle-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Tutaj prezentujemy protokół generowania 3D organotypowego modelu skóry czerniaka sferoidalnego, który podsumowuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządu/guza in vivo, ale jednocześnie uwzględnia systematyczną interwencję eksperymentalną.

Organotypowy model sferoidalny czerniaka 3D

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Tutaj prezentujemy kilka prostych metod oceny żywotności i śmierci w sferoidach komórek rakowych 3D, które znacznie lepiej naśladują gradienty fizykochemiczne guzów in vivo niż hodowla 2D. Model sferoidalny umożliwia zatem ocenę skuteczności leku przeciwnowotworowego z lepszą translacją do warunków in vivo.

Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu 3D in vitro do badania różnicowania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) w środowisku podobnym do masy guza, które mogą być adresowane w różnych systemach analizy, takich jak immunofluorescencja, analiza transkrypcyjna i obrazowanie żywych komórek.

Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro

Powstaje nowy trójwymiarowy model sferoidalny oparty na heterotypowym oddziaływaniu komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu. Tutaj prezentujemy kokulturę komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną w celu wizualizacji powstawania sferoid. Ten trójwymiarowy model stanowi istotną platformę do badania interakcji między guzem a zrębem i testowania terapii przeciwnowotworowych.

Nowatorski, modulowany fibroblastami zrębu model sferoidalny 3D guza do badania interakcji guz-zręb i odkrywania leków

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

Prezentowany tutaj jest protokół produkcji urządzenia do obrazowania sferoidowego. Urządzenie to umożliwia dynamiczne lub podłużne obrazowanie fluorescencyjne sferoid komórek nowotworowych. Protokół oferuje również prostą procedurę przetwarzania obrazu do analizy inwazji komórek rakowych.

Czasowo-rozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne i analiza inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3D

Sferoidy nowotworowe są coraz częściej wykorzystywane do oceny interakcji komórek nowotworowych z mikrośrodowiskiem i odpowiedzi na terapię. Niniejszy protokół opisuje solidną, ale prostą metodę pół-wysokoprzepustowego obrazowania sferoid guza 3D przy użyciu szybkiego usuwania optycznego.

Szybkie oczyszczanie optyczne do półwysokoprzepustowej analizy sferoidów nowotworowych

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów z sferoidą guza w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenu I, z możliwością porównania wpływu rozpuszczalnych i fizycznych właściwości mikrośrodowiska na inwazję komórek.

Test koinwazji sferoidów makrofagów i guzów

Poznaj metodę analizy cyklu komórkowego w sferoidach czerniaka 3D z wykorzystaniem FUCCI, obrazowania i cytometrii przepływowej. Technika umożliwia identyfikację i izolację komórek w różnych fazach cyklu w czasie rzeczywistym.

Oparta na obrazowaniu i cytometrii przepływowej analiza położenia komórki i cyklu komórkowego w sferoidach czerniaka 3D

Przeglądaj więcej filmów