Oparta na obrazowaniu i cytometrii przepływowej analiza położenia komórki i cyklu komórkowego w sferoidach czerniaka 3D

Ogólnym celem tej metody jest identyfikacja, scharakteryzowanie i wyizolowanie komórek z wielokomórkowego steroidu w odniesieniu do ich stanu cyklu komórkowego i pozycji w obrębie steroidu w porównaniu do hodowli komórkowej 2D. Model 3D OID podsumowuje biologię raka in vivo, naśladując architekturę guza i jego mikrośrodowisko, łącząc sfery z cytometrią przepływową i technikami obrazowania. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka, takie jak to, w jaki sposób mikrośrodowisko guza zmienia wrażliwość na leki, ruchliwość komórek i proliferację.

Główną zaletą tej metody jest to, że umożliwia wizualizację cyklu komórkowego w czasie rzeczywistym i pozwala na oczyszczanie żywych komórek z określonego regionu steroidowego, pokazując, że procedura zostanie wykonana Ostry, asystent naukowy z naszego laboratorium Rozpocznij przygotowania do tworzenia sterydów 3D od podgrzewania w kuchence mikrofalowej 1,5% aros w 100 mililitrach roztworu soli równoważącej Hanka lub HBSS lub od trzech do pięciu minut przerywaj kolbę, aby upewnić się, że że aros jest całkowicie rozpuszczony. Następnie natychmiast odpipetować 100 mikrolitrów roztworu aros do każdego dołka płaskodennej 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby aros zastygł.

Następnie należy usunąć 80% konfluencyjną hodowlę komórkową komórek czerniaka wykazujących ekspresję konstruktów FCI z inkubatora hodowli komórkowych. Umyj komórki 10 mililitrami HBSS. Dodaj 1,5 mililitra 0,05% w EDTA, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około dwie minuty.

Gdy komórki odłączą resus, zawieś je w 10 mililitrach hodowli komórkowej. Średni. Ręcznie policz komórki za pomocą hemometru, cytometru i odwróconego mikroskopu i rozcieńcz je do 25 000 komórek na mililitr w pożywce do hodowli komórkowych. Następnie odpipetować 200 mikrolitrów zawiesiny komórek, aby nałożyć na każdą studzienkę 96-dołkowej płytki aros.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez około trzy dni, aby utworzyć sferoidy komórkowe. Po inkubacji zobrazuj sferoidy pod odwróconym mikroskopem za pomocą obiektywu Forex i filtra kontrastu fazowego. Sferoidy powinny wyglądać jak zwarte, z grubsza kuliste agregaty komórek, aby przygotować steroid komórkowy do cięcia i obrazowania.

Użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby przenieść je do probówki Falcon. Następnie pozwól sterydowi osiąść na dnie stożka. Następnie usuń średnie ssanie bi, a następnie utrwal sferoidy, inkubując je w 10% neutralnej buforowanej forminie przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej.

SP może być następnie przechowywany w HBSS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka dni po podziale i obrazowaniu komórki. Sphe Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu i wybierz konfigurację tylko do oceny ilościowej. Następnie utwórz nową bibliotekę i zaimportuj plik obrazu konfokalnego sferoidalnego, przeciągając plik surowych danych do biblioteki.

Następnie przejdź do zakładki pomiary, aby zbudować protokół analizy obrazu, przeciągając i upuszczając polecenia w odpowiedniej kolejności w oknie protokołu. Aby znaleźć obiekty w zielonym kanale, przeciągnij i upuść polecenie znajdź obiekty z sekcji wyszukiwania do okna protokołu i wybierz odpowiedni kanał. Dodaj polecenie otwierania znalezione w obszarze przetwarzania, a następnie dodaj osobne polecenie dotykających się obiektów, aby oddzielić komórki.

Na koniec z sekcji filtrowania dodawaj i wykluczaj obiekty według rozmiaru. Polecenie dla obiektów mniejszych niż 50 mikrometrów w celu wykluczenia małych obiektów niekomórkowych. Następnie przeciągnij i upuść nowe polecenie wyszukiwania obiektów do okna protokołu.

Wykonując te same kroki, wybierz czerwony kanał i zastosuj wszystkie kolejne polecenia. Po znalezieniu obiektów użyj poleceń ukryj kanał lub pokaż kanał, aby wizualnie upewnić się, że czerwone i zielone obiekty odpowiadają czerwonym i zielonym jądrom. W razie potrzeby kliknij pomiary, a następnie opcje informacji zwrotnej, aby zmodyfikować wygląd masek obiektów.

Teraz, aby znaleźć żółte obiekty, które odpowiadają wczesnym komórkom fazy S, użyj polecenia przecięcia znajdującego się w sekcji łączenia i wybierz przecinanie czerwonych obiektów z zielonymi obiektami. Ponownie wyklucz obiekty o rozmiarze mniejszym niż 50 mikrometrów. Aby zidentyfikować komórki jednofazowe G, użyj polecenia odejmowania znajdującego się w sekcji łączenia i wybierz opcję odejmij żółty obiekt od czerwonych obiektów, aby znaleźć wyłącznie czerwone obiekty.

Podobnie, odejmij żółte obiekty od zielonych, aby zidentyfikować wyłącznie zielone obiekty, które korelują z komórkami fazy SG dwie i MPH zarówno dla wyłącznie czerwonych, jak i wyłącznie zielonych obiektów. W razie potrzeby usuń obiekty niekomórkowe, stosując polecenie filtrowania populacji z sekcji filtrowania o współczynniku kształtu większym niż 0,25. Następnie znajdź kontur sferoidy S.

Za pomocą polecenia znajdź obiekty z sekcji wyszukiwania w kanale zielonym lub czerwonym. Użyj zamkniętego polecenia z sekcji przetwarzania, aby połączyć poszczególne komórki w jeden obiekt. Następnie dodaj polecenie Wypełnij otwory w obiektach, aby wypełnić otwory w sphe

Następnie użyj dokładnego filtra, aby usunąć szum z obiektu Sphero. Zakończ znajdowanie konturu sferoidy, wybierając opcję wykluczania obiektów według rozmiaru, aby usunąć obiekty mniejsze niż 30 000 mikrometrów. Po zdefiniowaniu wszystkich obiektów dodaj odległości pomiarowe od powiązanej sekcji, aby określić odległość od każdego OID do krawędzi konturu sferoidalnego S.

Zrób to w każdej z żółtych, wyłącznie czerwonych i wyłącznie zielonych populacji. Aby zwizualizować minimalne odległości od komórki do najbliższej krawędzi sferoidy S, otwórz kartę pomiarów i wybierz opcje informacji zwrotnej, a następnie relacje. Następnie wybierz opcję pokaż odległości.

Na koniec zapisz protokół, aby zapisać dane utworzone przez protokół. Wybierz pozycję do pomiaru z sekcji pomiaru. Następnie, aby zinterpretować dane, wybierz element pomiaru, przejdź do zakładki analiza w sekcji pomiaru i wybierz Analizuj w menu analizy, aby policzyć komórki znajdujące się w określonej odległości od krawędzi sterydu.

Utwórz filtr, wybierając filtr na karcie analizy. Na przykład pokaż tylko dane, w których odległość od krawędzi kuli jest mniejsza niż 100 mikronów. Aby wyeksportować nieprzetworzone dane, wybierz opcję eksportuj na karcie pliku, a następnie zapisz dane jako tekst oddzielony przecinkami lub z ograniczoną ilością tabulatorów.

Dane te można otworzyć w programie arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy. Plon komórkowy wygenerowany z C 8 1 16 1. Ludzkie komórki czerniaka, które zostały transdukowane za pomocą systemu Fuji, zostały unieruchomione i podzielone na sekcje.

Wykonano obrazowanie konfokalne dla AZA na zielono, które oznaczają komórki w fazie SG dwie M cyklu komórkowego oraz na pomarańczowo Berra, które oznaczają komórki w fazie G one. Gdy te obrazy nakładają się na siebie, można zaobserwować kluczowe cechy, takie jak nekrotyczne jądro, zgodnie z oczekiwaniami. Czerwone G jeden zatrzymane komórki dominują bliżej tego martwiczego rdzenia, podczas gdy czerwone i zielone komórki proliferujące zwiększają się w sposób gradientowy w kierunku zewnętrznej krawędzi sterydu lub dostęp do tlenu i składników odżywczych jest największy.

Po półautomatycznej analizie obrazu można zdefiniować maski komórek fucci i kontur sferoidalny S. Oprogramowanie do obrazowania wykorzystano do ilościowego określenia liczby czerwonych i zielonych krwinek w wewnętrznym lub zewnętrznym obszarze sferoidy S. Analiza ta wykazała, że komórki zatrzymane w jednej fazie G są wzbogacone w obszarze wewnętrznym, podczas gdy komórki proliferujące dominują bliżej steroidu Edge.

Po opanowaniu, technika ta może być wykonana w ciągu jednego do dwóch tygodni, ramy czasowe, które obejmują uprawę sterydów, obrazowania i analizy. Zgodnie z tą procedurą rads można wszczepić do macierzy kolagenowej, a następnie zobrazować za pomocą mikroskopu TimeLapse. Można je następnie poddać analizie białek lub RNA, a to może pomóc nam odpowiedzieć na pytania, takie jak to, czy pozycja w sterydach oraz dostęp do tlenu i składników odżywczych mogą zmieniać fenotypy komórek rakowych.