Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonka u Xenopus laevis
May 23rd, 2010
Nabłonek embrionalny Xenopus to idealny system modelowy do badania zachowań komórek, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonka. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez obrazowanie konfokalne żywych komórek. Tutaj pokazujemy metody izolowania tkanek żab i wizualizacji żywych komórek nabłonka i ich cytoszkieletu za pomocą mikroskopii konfokalnej żywych komórek.
Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie obrazowania na żywo i prostych metod kwantyfikacji w celu analizy morfologii komórek nabłonka embrionalnego. Osiąga się to poprzez przygotowanie wszystkich narzędzi i aparatury. Drugim etapem procedury jest wycięcie X explan z zarodków żab i umieszczenie ich w komorach do długotrwałej hodowli.
Trzecim etapem zabiegu jest zebranie obrazów komórek nabłonka w wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym. Ostatnim etapem procedury jest ilościowe określenie szczegółów morfologicznych komórek nabłonkowych za pomocą obrazu J.Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują śledzone obszary komórek i intensywność błony za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Cześć, nazywam się Sagar Joshi i pracuję w Davidson Laboratory na Wydziale Bioinżynierii Uniwersytetu w Pittsburghu.
Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę obrazowania żywych komórek i analizy ilościowej embrionalnych komórek nabłonkowych Xenos lavia. Używamy tej procedury do badania zmian cytoszkieletu w komórkach w czasie rzeczywistym. Więc zacznijmy.
Aby przygotować komory do hodowli nakrętek zwierzęcych, użyj smaru silikonowego, aby uszczelnić niestandardową komorę akrylową lub małą nylonową podkładkę do dużego szkła osłonowego o wymiarach 45 na 50 milimetrów. Dodaj jeden mililitr 1% BSA w jednej trzeciej XMBS do komory. Małe fragmenty szkiełek nakrywkowych pokryć tym samym roztworem w inkubacji przez dwie do czterech godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Aby zmniejszyć przyczepność X explan do szkła, należy przepłukać i napełnić komorę medium DFA, aż tuż przed przeniesieniem do The xs przepłukać fragmenty szkiełek nakrywkowych w ten sam sposób. Następnie zanurz je w naczyniu z zarodkami hodowli DFA, które zostały mikrowstrzyknięte w stadium od jednej do czterech komórek z pożądanym MR NA do pożądanego etapu w jednej trzeciej XMBS. Użyj pipety transferowej z ukośnym otworem, aby przenieść zarodki do naczynia z DFA pod mikroskopem stereoskopowym do preparacji.
Użyj kleszczy, aby zobrazować zarodki w celu wycięcia rośliny CapEx dla zwierząt. Użyj pętli do włosów, aby podeprzeć zarodek w jednej pozycji. Użyj noża do włosów, aby zrobić małe nacięcie w słupie zwierzęcia.
Wykonuj wielokrotne gładkie cięcia, aby przedłużyć nacięcie i usunąć ektodermę kapelusza. W ten sam sposób należy wyciąć trzy lub cztery x explan. I użyj pipety transferowej, aby przenieść je do przygotowanej komory hodowlanej.
Za pomocą pętli na włosy ustaw każdy X explan tak, aby nabłonek był skierowany w stronę dna komory. Za pomocą kleszczy. Przytrzymaj fragment szkiełka nakrywkowego w jego środku.
Zanurz końce w smarze silikonowym. Umieść jeden fragment na każdym planie X. Delikatnie przymocuj każdy fragment na miejscu małymi kroplami smaru silikonowego.
Uważając, aby całkowicie nie rozbić X explan z nadmierną siłą. Napełnij komorę DFA, posmaruj górne krawędzie komory smarem silikonowym. Następnie uszczelnij górę szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 x 40 milimetrów.
Dostosuj poziom DFA w komorze, aby zredukować pęcherzyki powietrza i użyj chusteczki do usunięcia przepełnienia. Rośliny X można teraz hodować długoterminowo w szczelnie zamkniętej komorze przez jeden dzień w temperaturze pokojowej, przesunąć obiektyw 20 x mikroskopu konfokalnego na miejsce. Umieść komorę zawierającą X explan na stoliku mikroskopu i umieść małe ciężarki równoważące na komorze, aby utrzymać ją na miejscu w jasnym polu.
Dostosuj ostrość i użyj pozycjonowania kursu, aby zwizualizować wierzchołkowe końce powierzchownych komórek. Przełącz się na fluorescencję i obiektyw o wyższej mocy. Aby zebrać pojedyncze obrazy lub filmy poklatkowe nabłonka explan, dostosuj akwizycję, aby uzyskać najlepszy możliwy obraz.
Zapoznaj się z pisemną częścią tego protokołu, aby uzyskać wskazówki dotyczące strojenia i obrazowania. Utrzymywanie mocy lasera na jak najniższym poziomie. Rób zdjęcia lub filmy poklatkowe nabłonka x explan.
Zapoznaj się z pisemną częścią protokołu, aby uzyskać sugestie dotyczące gromadzenia danych. Konfokalne pliki obrazów mogą być wydobywane w celu uzyskania danych na różne sposoby. Oto dwa przykłady analizowania plików danych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu J z wtyczką do formatów biologicznych.
Aby zmierzyć obszar komórki nabłonka, rozwiń menu analizy w dół i kliknij ustaw pomiary. Wybierz narzędzie do zaznaczania z paska narzędzi i obrysuj komórkę w menu analizy, wybierz narzędzia, a następnie Menedżer ROI. Aby otworzyć menedżera obszarów zainteresowania, naciśnij control t.
Aby dodać kontur do menedżera ROI, wybierz i dodaj tyle konturów z obrazu, ile chcesz. Następnie kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać ustawiony zwrot z inwestycji w menedżerze zwrotu z inwestycji. Kliknij przycisk Zmierz miarę.
Okno wyników pokaże teraz zmierzone obszary każdego ROI. Aby zmierzyć intensywność błony komórkowej, wybierz narzędzie Linia prosta z paska narzędzi obrazu J. Narysuj prostopadłą linię w poprzek membrany.
Naciśnij CTRL T, tak jak w poprzednim przykładzie. Aby dodać wybór do menedżera ROI, rozwiń menu analizy i kliknij profil wykresu, aby wygenerować wykres o względnej intensywności w poprzek linii. Aby zapisać wykres jako obraz, kliknij przycisk Zapisz w nowym oknie wykresu, które zostanie wyświetlone.
Rozwiń menu listy, aby złożyć plik, a następnie zapisz, ponieważ właśnie pokazaliśmy, jak na żywo obrazować i określać ilościowo embrionalne komórki nabłonkowe z wyciętych zwierząt CapEx explan. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dodaniu antybiotyku i antybiotyku do DFA. Aby zniechęcić do rozwoju bakterii i grzybów, należy zachować szczególną ostrożność podczas wciskania eksplantatów pod szkiełka nakrywkowe, ponieważ większy niż wymagany nacisk może rozbić eksplan.
Ważne jest również, aby pamiętać o optymalnych ustawieniach mikroskopu konfokalnego, aby uzyskać maksymalną jakość danych obrazu. Więc to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł demonstruje techniki obrazowania na żywo do badania morfologii komórek nabłonkowych zarodkowych u Xenopus. Prezentuje metody izolowywania tkanek żab i wizualizacji żywych komórek nabłonkowych za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia rozwojowa
Tło
- Nabłonek zarodkowy Xenopus służy jako model do badania zachowań komórek.
- Obrazowanie na żywo uzupełnia tradycyjną histologię.
- Rozumienie morfogenezy nabłonkowej jest kluczowe dla badań rozwojowych.
- Mikroskopia konfokalna pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki komórkowej.
Cel badania
- Zdemonstrować techniki obrazowania na żywo dla komórek nabłonkowych.
- Zmierzyć szczegóły morfologiczne komórek nabłonkowych.
- Podać protokół izolowywania i hodowli tkanek żab.
Stosowane metody
- Przygotowanie narzędzi i urządzeń do obrazowania.
- Wycinanie tkanek z zarodków żab do hodowli.
- Zbieranie wysokiej rozdzielczości obrazów komórek nabłonkowych.
- Ilościowa analiza morfologii komórek za pomocą oprogramowania Image J.
Główne wyniki
- Uzyskano wysokiej rozdzielczości obrazy żywych komórek nabłonkowych.
- Analiza ilościowa ujawnił obszary komórek i intensywności błon śledzonych.
- Obrazowanie na żywo dostarczyło wglądu w zachowania komórek podczas morfogenezy.
- Metody zostały zweryfikowane dla długotrwałej hodowli tkanek żab.
Wnioski
- Mikroskopia konfokalna na żywo jest skuteczna do badania komórek nabłonkowych.
- Metody mogą być stosowane w różnych badaniach z zakresu biologii rozwojowej.
- Wyniki poprawiają rozumienie morfogenezy nabłonkowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Live-cell imaging and quantitative analysis of embryonic epithelial cells in Xenopus laevis provide a dynamic platform for interrogating morphogenetic processes relevant to early discovery and target validation. High-resolution confocal microscopy enables real-time measurement of cellular morphology and protein localization, supporting predictive confidence in developmental biology models. This workflow enhances the translational value of epithelial systems for mechanistic de-risking and portfolio triage in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of cytoskeletal changes and cell shape dynamics in real time.
- Supports functional validation of molecular targets involved in epithelial morphogenesis.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying cell area and membrane intensity changes.
- Provides a platform for hypothesis-driven interrogation of developmental pathways.
Screening & Assay Development
- Prepares validated live-cell systems for downstream quantitative imaging workflows.
- Standardizes measurement of morphological parameters using reproducible Image J analysis.
- Enables high-content screening of compounds affecting epithelial cell behavior.
- Supports assay scalability and platform reuse for comparative studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by capturing dynamic epithelial processes.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation via quantitative outputs.
- Reduces biological risk by providing predictive, real-time cellular readouts.
- Supports biomarker identification through live imaging of protein localization.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model validation, leveraging live-cell imaging for robust data generation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification through real-time morphological analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers precise measurements of cell area and membrane intensity for comparative analytics.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by supporting disease-relevant system modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform for diverse epithelial studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in epithelial biology.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Demands access to specialized imaging instrumentation and analysis software (e.g., Image J).
- Necessitates cross-team standardization of imaging and measurement protocols.
- May require adaptation for different model systems or tissue types.
- Dependent on optimal culture conditions and careful sample handling to ensure data quality.
