Name: Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonka u Xenopus laevis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Poznaj techniki obrazowania żywych komórek i analizy morfologii komórek nabłonka embrionalnego u Xenopus laevis. Metoda obejmuje izolację tkanek, mikroskopię konfokalną oraz ilościową analizę w programie Image J.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health (R01-HD044750), grant CAREER z National Science Foundation oraz wsparcie American Heart Association (Beginning Grant-in-Aid). Autorzy dziękują członkom laboratorium Davidsona: H.Y. Kim, M. von Dassow oraz J. Zhou (za pomoc w codziennych obowiązkach laboratoryjnych), a także Lin Zhang za pomoc w biologii molekularnej i syntezie mRNA. Wyrażamy wdzięczność za wysiłki eksperymentalne wszystkich laboratoriów zajmujących się płazami (w szczególności laboratoriów Raya Kellera i Douga DeSimone'a), które przyczyniły się do opracowania tego protokołu poprzez tworzenie i testowanie różnych metod na przestrzeni lat. Dziękujemy Richardowi Harlandowi i Johnowi Wallingford za uprzejme przekazanie odpowiednio plazmidów mem-gfp oraz moesin-gfp.

<ol><li>Ninomiya, H., Winklbauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+coating+controls+mesenchymal+shape+change+through+tissue-positioning+effects+and+reduction+of+surface-minimizing+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial coating controls mesenchymal shape change through tissue-positioning effects and reduction of surface-minimizing tension.</a> Nat Cell Biol. 10 (1), 61-61 (2008).</li>
<li>Kay, B. K., Peng, H. B. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1991).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Cohen, S., Au, S., Pante, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Tables of Xenopus laevis (Daudin). , Elsevier North-Holland Biomedical Press. Amsterdam. (1967).</li>
<li>Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+wound+healing+by+apical+contraction+and+ingression+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 53 (3), 163-163 (2002).</li>
<li>Joshi, S. D., Dassow, M. von, Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+control+of+excitable+embryonic+tissues%3A+three+stimuli+induce+rapid+epithelial+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental control of excitable embryonic tissues: three stimuli induce rapid epithelial contraction.</a> Exp Cell Res. 316 (1), 103-103 (2010).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Przedstawiliśmy protokoły eksperymentalne regularnie stosowane w naszym laboratorium do obrazowania dynamicznie zmieniającego się cytoszkieletu w apikalnej korze komórkowej oraz oscylujących błon komórkowych komórek nabłonkowych w embrionach Xenopus. Protokoły te należy traktować jako punkt wyjścia do obrazowania na żywo kształtów komórek nabłonkowych; optymalizacja tej procedury jest niezbędna, a niektóre ustawienia będą się różnić w zależności od rodzaju posiadanego systemu mikroskopowego oraz rodzaju białek, ...

obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Zarodkowe komórki nabłonkowe stanowią idealny model do badania morfogenezy, podczas której wielokomórkowe tkanki przechodzą zmiany geometrii, takie jak zmiany powierzchni komórki i wysokości komórki, a komórki przechodzą mitozę i migrują. Co więcej, komórki nabłonkowe mogą również regulować ruchy morfogenetyczne w sąsiednich tkankach1Tradycyjna metoda badania komórek i tkanek nabłonkowych obejmuje fiksację chemiczną oraz metody histologiczne w celu określenia morfologii komórek lub lokalizacji konkretnych białek będących przedmiotem zainteresowania. Podejścia te pozostają użyteczne i dostarczają „migawek” kształtów komórek oraz architektury tkanek, jednak wiele kwestii dotyczących tego, w jaki sposób komórki nabywają specyficzne kształty, jak różne białka przemieszczają się lub lokalizują w konkretnych pozycjach oraz jakimi drogami komórki zmierzają ku swojemu ostatecznemu zróżnicowanemu przeznaczeniu, wciąż wymaga wyjaśnienia. Obrazowanie żywych komórek o wysokiej rozdzielczości uzupełnia metody tradycyjne i pozwala na bardziej bezpośrednie badanie dynamicznych procesów komórkowych zaangażowanych w tworzenie, utrzymanie i morfogenezę wielokomórkowych płatów nabłonkowych. W niniejszym materiale prezentujemy metody eksperymentalne, poczynając od izolacji tkanek czapki zwierzęcej zXenopus laeviszarodki do obrazowania konfokalnego komórek nabłonkowych oraz proste podejścia pomiarowe, które razem mogą wzbogacić badania molekularne i komórkowe morfogenezy nabłonka.

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Zarodkowe komórki nabłonkowe stanowią idealny model do badania morfogenezy, w przebiegu której tkanki wielokomórkowe ulegają zmianom geometrii, takim jak zmiany...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie metod obrazowania na żywo oraz prostych metod ilościowych służących do analizy morfologii embrionalnych komórek nabłonkowych. Zostaje to zrealizowane poprzez przygotowanie wszystkich niezbędnych narzędzi i aparatury. Drugim krokiem procedury jest wycięcie eksplantów X z embrionów żaby i umieszczenie ich w komorach do długoterminowej hodowli.Trzecim krokiem procedury jest gromadzenie obrazów komórek nabłonkowych w wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym. Ostatnim krokiem procedury jest ilościowe określenie szczegółów morfologicznych komórek nabłonkowych przy użyciu programu Image J. W rezultacie można uzyskać obrazy przedstawiające śledzone obszary komórek oraz intensywność błon dzięki konfokalnej mikroskopii wysokiej rozdzielczości. Cześć, jestem Sagar Joshi z Laboratorium Davidsona w Departamencie Bioinżynierii na Uniwersytecie Pittsburgha.Dzisiaj przedstawimy procedurę obrazowania żywych komórek oraz analizy ilościowej embrionalnych komórek nabłonkowych Xenos lavia. Procedurę tę wykorzystujemy do badania zmian w cytoszkielecie komórkowym w czasie rzeczywistym. Zapraszamy do oglądania.Aby przygotować komory do hodowli kapturem zwierzęcych, należy użyć smaru silikonowego do uszczelnienia wykonanej na zamówienie komory akrylowej lub małej nylonowej podkładki do dużego szkiełka podstawowego o wymiarach 45 by 50 mm. Do komory należy dodać 1 mL 1%BSA w jednej trzeciej XMBS. Małe fragmenty szkiełek nakrywkowych należy pokryć tym samym roztworem i inkubować przez dwie do czterech godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.Aby zmniejszyć adhezję eksplantu X do szkła, należy wypłukać i napełnić komorę medium DFA. Przed przeniesieniem eksplantów, fragmenty szkiełka nakrywkowego należy wypłukać w ten sam sposób. Następnie zanurzyć je w naczyniu z embrionami w kulturze DFA, które zostały mikroiniekcyjne na etapie od jednej do czterech komórek pożądanym MR NA do pożądanego etapu w jednej trzeciej XMBS. Należy użyć pipety transferowej ze skośnym otworem, aby przenieść embriony do naczynia z DFA pod stereo-mikroskopem dissectingowym.Za pomocą pęsety przygotuj embriony do wycięcia zwierzęcej części czapki (CapEx). Użyj pętli z włosa, aby ustabilizować embrion w jednej pozycji. Użyj noża z włosa, aby wykonać niewielkie nacięcie w biegunie zwierzęcym.Wykonuj powtarzalne, płynne cięcia typu „flick”, aby poszerzyć nacięcie i usunąć ektodermę czepka. W ten sam sposób wycinaj od trzech do czterech eksplantów. Następnie za pomocą pipety transferowej przenieś je do przygotowanej komory hodowlanej.Używając pętli z włosa, umieść każdy X explan w taki sposób, aby nabłonek był skierowany w stronę dna komory. Używając pęsety, przytrzymaj fragment szkiełka nakrywkowego za jego środek.Zanurz końce w smarze silikonowym. Umieść jeden fragment nad każdym X explan. Delikatnie przymocuj każdy fragment za pomocą niewielkich kropel smaru silikonowego.Należy uważać, aby nie zmiażdżyć całkowicie X explan nadmierną siłą. Wypełnić komorę DFA i pokryć górne krawędzie komory smarem silikonowym. Następnie zamknąć górę szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 x 40 milimetrów.Dostosuj poziom DFA w komorze, aby zredukować pęcherzyki powietrza, a następnie użyj chusteczki do odsączenia nadmiaru cieczy. Rośliny X mogą być teraz hodowane długoterminowo w zamkniętej komorze przez jeden dzień w temperaturze pokojowej; przesuń obiektyw 20x mikroskopu konfokalnego na miejsce. Umieść komorę zawierającą preparat X na stoliku mikroskopu i połóż na komorze niewielkie ciężarki stabilizujące, aby utrzymać ją w pozycji w świetle pola jasnego.Wyreguluj ostrość i wykorzystaj pozycjonowanie w osi Z, aby zwizualizować końce apikalne komórek powierzchniowych. Przełącz na tryb fluorescencji i użyj obiektywu o większym powiększeniu. Aby zebrać pojedyncze obrazy lub filmy time-lapse nabłonka rozpostartego, dostrój parametry akwizycji, aby uzyskać możliwie najlepszy obraz.W celu uzyskania wskazówek dotyczących strojenia i obrazowania należy zapoznać się z pisemną częścią niniejszego protokołu. Należy utrzymywać moc lasera na możliwie najniższym poziomie. Należy zarejestrować obrazy lub filmy time-lapse nabłonka x explan.W celu uzyskania sugestii dotyczących gromadzenia danych należy odnieść się do pisemnej części protokołu. Pliki obrazów konfokalnych mogą być analizowane pod kątem danych na różne sposoby. Poniżej przedstawiono dwa przykłady analizy plików danych przy użyciu oprogramowania analizującego Image J z wtyczką bio formats.Aby zmierzyć powierzchnię komórki nabłonkowej, rozwiń menu analyze i kliknij set measurements. Wybierz narzędzie selection tool z paska narzędzi i obrysuj komórkę; w menu analyze wybierz tools, a następnie ROI manager. Aby otworzyć menedżera obszarów zainteresowania, naciśnij control t.Aby dodać obrysy do menedżera ROI, zaznacz i dodaj z obrazu taką liczbę obrysów, jaka jest potrzebna. Następnie kliknij „save”, aby zapisać zestaw ROI w menedżerze ROI. Kliknij „measure”.Okno wyników wyświetli teraz zmierzone obszary każdego ROI. Aby zmierzyć intensywność błony komórkowej, należy wybrać narzędzie linii prostej z paska narzędzi ImageJ. Należy narysować linię prostopadłą do błony.Naciśnij CTRL T, tak jak w poprzednim przykładzie. Aby dodać zaznaczenie do menedżera ROI, rozwiń menu Analyze i kliknij Plot Profile, aby wygenerować wykres względnych intensywności wzdłuż linii. Aby zapisać wykres jako obraz, kliknij Save w nowym oknie wykresu, które się pojawi.Rozwiń menu listy do pliku, a następnie zapisz jako. Właśnie pokazaliśmy, jak obrazować na żywo i kwantyfikować embrionalne komórki nabłonkowe z wyciętym eksplantem CapEx zwierzęcia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dodaniu antybiotyku i antybiotyku do DFA. Aby zapobiec wzrostowi bakterii i grzybów, należy zachować szczególną ostrożność podczas dociskania eksplantów pod szkiełkami nakrywkowymi, ponieważ zbyt silny nacisk może zmiażdżyć eksplant.Ważne jest również pamiętanie o zastosowaniu optymalnych ustawień mikroskopu konfokalnego, aby uzyskać dane obrazowe o najwyższej jakości. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

live-cell-imaging-quantitative-analysis-embryonic-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie komórek żywych i analiza ilościowa komórek nabłonkowych zarodkowych w Xenopus laevis

Za pomocą mikropipet z cienkimi końcówkami wstrzykujemy plazmidowe DNA do poddomen somitów lub cewek nerwowych kurczaka. Stężenie plazmidu jest tak dostosowane, aby uzyskać pojedyncze transfekowane komórki. Następnie pozwalamy komórkom przekształcić się w populacje klonalne.

Transfekcja pojedynczych komórek w zarodkach kurczęt

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Xenopus laevis dostarcza idealnego systemu modelowego do badania specyfikacji losu komórki i funkcji fizjologicznych poszczególnych komórek siatkówki w pierwotnej hodowli komórkowej. Tutaj przedstawiamy technikę preparowania tkanek siatkówki i generowania pierwotnych kultur komórkowych, które są obrazowane pod kątem aktywności wapnia i analizowane przez hybrydyzację in situ.

Sekcja, hodowla i analiza embrionalnej tkanki siatkówki Xenopus laevis

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Opisujemy prosty protokół tworzenia organoidów nabłonkowych śluzowo-rzęskowych z głębokich komórek ektodermy wyizolowanych z zarodków Xenopus laevis. Multipotencjalne komórki progenitorowe regenerują prekursory nabłonkowych komórek kubkowych i umożliwiają śledzenie na żywo inicjacji i progresji przemian komórkowych na powierzchni organoidów.

Organoidy nabłonkowe śluzowo-rzęskowe z komórek embrionalnych Xendopus: generacja, hodowla i obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Opisujemy metodę przygotowania i obrazowania na żywo nierozcieńczonych ekstraktów cytoplazmatycznych z jaj Xenopus laevis.

Xenopus laevis (Xenopus laevis) Przygotowanie ekstraktu z jaj i metody obrazowania na żywo do wizualizacji dynamicznej organizacji cytoplazmy

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Poznaj techniki obrazowania żywych komórek i analizy morfologii komórek nabłonka embrionalnego u Xenopus laevis. Metoda obejmuje izolację tkanek, mikroskopię konfokalną oraz ilościową analizę w programie Image J.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Przeglądaj więcej filmów