Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonka u Xenopus laevis

Nabłonek embrionalny Xenopus to idealny system modelowy do badania zachowań komórek, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonka. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez obrazowanie konfokalne żywych komórek. Tutaj pokazujemy metody izolowania tkanek żab i wizualizacji żywych komórek nabłonka i ich cytoszkieletu za pomocą mikroskopii konfokalnej żywych komórek.

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie obrazowania na żywo i prostych metod kwantyfikacji w celu analizy morfologii komórek nabłonka embrionalnego. Osiąga się to poprzez przygotowanie wszystkich narzędzi i aparatury. Drugim etapem procedury jest wycięcie X explan z zarodków żab i umieszczenie ich w komorach do długotrwałej hodowli.

Trzecim etapem zabiegu jest zebranie obrazów komórek nabłonka w wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym. Ostatnim etapem procedury jest ilościowe określenie szczegółów morfologicznych komórek nabłonkowych za pomocą obrazu J.Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują śledzone obszary komórek i intensywność błony za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Cześć, nazywam się Sagar Joshi i pracuję w Davidson Laboratory na Wydziale Bioinżynierii Uniwersytetu w Pittsburghu.

Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę obrazowania żywych komórek i analizy ilościowej embrionalnych komórek nabłonkowych Xenos lavia. Używamy tej procedury do badania zmian cytoszkieletu w komórkach w czasie rzeczywistym. Więc zacznijmy.

Aby przygotować komory do hodowli nakrętek zwierzęcych, użyj smaru silikonowego, aby uszczelnić niestandardową komorę akrylową lub małą nylonową podkładkę do dużego szkła osłonowego o wymiarach 45 na 50 milimetrów. Dodaj jeden mililitr 1% BSA w jednej trzeciej XMBS do komory. Małe fragmenty szkiełek nakrywkowych pokryć tym samym roztworem w inkubacji przez dwie do czterech godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Aby zmniejszyć przyczepność X explan do szkła, należy przepłukać i napełnić komorę medium DFA, aż tuż przed przeniesieniem do The xs przepłukać fragmenty szkiełek nakrywkowych w ten sam sposób. Następnie zanurz je w naczyniu z zarodkami hodowli DFA, które zostały mikrowstrzyknięte w stadium od jednej do czterech komórek z pożądanym MR NA do pożądanego etapu w jednej trzeciej XMBS. Użyj pipety transferowej z ukośnym otworem, aby przenieść zarodki do naczynia z DFA pod mikroskopem stereoskopowym do preparacji.

Użyj kleszczy, aby zobrazować zarodki w celu wycięcia rośliny CapEx dla zwierząt. Użyj pętli do włosów, aby podeprzeć zarodek w jednej pozycji. Użyj noża do włosów, aby zrobić małe nacięcie w słupie zwierzęcia.

Wykonuj wielokrotne gładkie cięcia, aby przedłużyć nacięcie i usunąć ektodermę kapelusza. W ten sam sposób należy wyciąć trzy lub cztery x explan. I użyj pipety transferowej, aby przenieść je do przygotowanej komory hodowlanej.

Za pomocą pętli na włosy ustaw każdy X explan tak, aby nabłonek był skierowany w stronę dna komory. Za pomocą kleszczy. Przytrzymaj fragment szkiełka nakrywkowego w jego środku.

Zanurz końce w smarze silikonowym. Umieść jeden fragment na każdym planie X. Delikatnie przymocuj każdy fragment na miejscu małymi kroplami smaru silikonowego.

Uważając, aby całkowicie nie rozbić X explan z nadmierną siłą. Napełnij komorę DFA, posmaruj górne krawędzie komory smarem silikonowym. Następnie uszczelnij górę szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 x 40 milimetrów.

Dostosuj poziom DFA w komorze, aby zredukować pęcherzyki powietrza i użyj chusteczki do usunięcia przepełnienia. Rośliny X można teraz hodować długoterminowo w szczelnie zamkniętej komorze przez jeden dzień w temperaturze pokojowej, przesunąć obiektyw 20 x mikroskopu konfokalnego na miejsce. Umieść komorę zawierającą X explan na stoliku mikroskopu i umieść małe ciężarki równoważące na komorze, aby utrzymać ją na miejscu w jasnym polu.

Dostosuj ostrość i użyj pozycjonowania kursu, aby zwizualizować wierzchołkowe końce powierzchownych komórek. Przełącz się na fluorescencję i obiektyw o wyższej mocy. Aby zebrać pojedyncze obrazy lub filmy poklatkowe nabłonka explan, dostosuj akwizycję, aby uzyskać najlepszy możliwy obraz.

Zapoznaj się z pisemną częścią tego protokołu, aby uzyskać wskazówki dotyczące strojenia i obrazowania. Utrzymywanie mocy lasera na jak najniższym poziomie. Rób zdjęcia lub filmy poklatkowe nabłonka x explan.

Zapoznaj się z pisemną częścią protokołu, aby uzyskać sugestie dotyczące gromadzenia danych. Konfokalne pliki obrazów mogą być wydobywane w celu uzyskania danych na różne sposoby. Oto dwa przykłady analizowania plików danych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu J z wtyczką do formatów biologicznych.

Aby zmierzyć obszar komórki nabłonka, rozwiń menu analizy w dół i kliknij ustaw pomiary. Wybierz narzędzie do zaznaczania z paska narzędzi i obrysuj komórkę w menu analizy, wybierz narzędzia, a następnie Menedżer ROI. Aby otworzyć menedżera obszarów zainteresowania, naciśnij control t.

Aby dodać kontur do menedżera ROI, wybierz i dodaj tyle konturów z obrazu, ile chcesz. Następnie kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać ustawiony zwrot z inwestycji w menedżerze zwrotu z inwestycji. Kliknij przycisk Zmierz miarę.

Okno wyników pokaże teraz zmierzone obszary każdego ROI. Aby zmierzyć intensywność błony komórkowej, wybierz narzędzie Linia prosta z paska narzędzi obrazu J. Narysuj prostopadłą linię w poprzek membrany.

Naciśnij CTRL T, tak jak w poprzednim przykładzie. Aby dodać wybór do menedżera ROI, rozwiń menu analizy i kliknij profil wykresu, aby wygenerować wykres o względnej intensywności w poprzek linii. Aby zapisać wykres jako obraz, kliknij przycisk Zapisz w nowym oknie wykresu, które zostanie wyświetlone.

Rozwiń menu listy, aby złożyć plik, a następnie zapisz, ponieważ właśnie pokazaliśmy, jak na żywo obrazować i określać ilościowo embrionalne komórki nabłonkowe z wyciętych zwierząt CapEx explan. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dodaniu antybiotyku i antybiotyku do DFA. Aby zniechęcić do rozwoju bakterii i grzybów, należy zachować szczególną ostrożność podczas wciskania eksplantatów pod szkiełka nakrywkowe, ponieważ większy niż wymagany nacisk może rozbić eksplan.

Ważne jest również, aby pamiętać o optymalnych ustawieniach mikroskopu konfokalnego, aby uzyskać maksymalną jakość danych obrazu. Więc to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.