Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis
23 maja 2010
Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie metod obrazowania na żywo oraz prostych metod kwantyfikacji w celu analizy morfologii embrionalnych komórek nabłonkowych. Zostanie to osiągnięte poprzez przygotowanie wszystkich niezbędnych narzędzi i aparatury. Drugim krokiem procedury jest wycięcie eksplantów X z embrionów żaby i umieszczenie ich w komorach do długoterminowej hodowli.
Trzecim krokiem procedury jest zarejestrowanie obrazów komórek nabłonkowych w wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym. Ostatnim krokiem procedury jest ilościowa analiza szczegółów morfologicznych komórek nabłonkowych przy użyciu programu Image J. W rezultacie można uzyskać dane przedstawiające śledzone obszary komórek oraz intensywność błon za pomocą konfokalnej mikroskopii wysokiej rozdzielczości. Witajcie, nazywam się Sagar Joshi i reprezentuję Laboratorium Davidsona w Departamencie Bioinżynierii na Uniwersytecie Pittsburgha.
Dzisiaj przedstawimy procedurę obrazowania żywych komórek oraz analizę ilościową embrionalnych komórek nabłonkowych Xenos lavia. Procedury tej używamy do badania zmian cytoszkieletu komórkowego w czasie rzeczywistym. Zapraszamy do oglądania.
Aby przygotować komory do hodowli czapeczek zwierzęcych, należy użyć smaru silikonowego do uszczelnienia niestandardowej komory akrylowej lub małej nylonowej podkładki do dużego szkiełka podstawowego o wymiarach 45 by 50 mm. Do komory należy dodać 1 mL 1% BSA w 1/3 XMBS. Małe fragmenty szkiełek nakrywkowych należy pokryć tym samym roztworem i inkubować od dwóch do czterech godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
Aby zmniejszyć przyleganie eksplantatów X do szkła, przepłucz i napełnij komorę pożywką DFA; tuż przed przeniesieniem xs, w ten sam sposób przepłucz fragmenty szkiełka nakrywkowego. Następnie zanurz je w naczyniu z embrionami w kulturze DFA, które zostały mikroiniekowane pożądanym mRNA w stadium od jednej do czterech komórek i rozwinięte do pożądanego stadium w 1/3 XMBS. Użyj pipety transferowej ze ściętym otworem, aby przenieść embriony do naczynia z DFA pod stereotypowym mikroskopem sekcyjnym.
Za pomocą pincety przygotuj embriony do wycięcia zwierzęcego CapEx. Użyj pętli z włosa, aby ustabilizować embrion w jednej pozycji. Za pomocą noża z włosa wykonaj niewielkie nacięcie w biegunie zwierzęcym.
Wykonaj powtarzalne, gładkie nacięcia w celu poszerzenia otworu i usunięcia ektodermy czepka. W ten sam sposób wycinij trzy lub cztery eksplanty. Następnie za pomocą pipety transferowej przenieś je do przygotowanej komory hodowli.
Używając pętli z włosa, ustaw każdy eksplant X tak, aby nabłonek był skierowany w stronę dna komory. Za pomocą pęsety przytrzymaj fragment szkiełka nakrywkowego za jego środek.
Zanurz końce w smarze silikonowym. Umieść jeden fragment nad każdym X explan. Delikatnie przymocuj każdy fragment za pomocą niewielkich ilości smaru silikonowego.
Należy uważać, aby nie zgnieść całkowicie X explan nadmierną siłą. Napełnić komorę DFA i pokryć górne krawędzie komory smarem silikonowym. Następnie zamknąć górę za pomocą szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 x 40 mm.
Dostosuj poziom DFA wewnątrz komory, aby zredukować pęcherzyki powietrza, a następnie użyj chusteczki do odsączenia nadmiaru cieczy. Rośliny X mogą być teraz hodowane długoterminowo w zamkniętej komorze przez jeden dzień w temperaturze pokojowej; w tym czasie ustaw obiektyw 20x mikroskopu konfokalnego w odpowiedniej pozycji. Umieść komorę zawierającą eksplant X na stole mikroskopu i połóż na komorze niewielkie ciężarki stabilizujące, aby utrzymać ją w pozycji w świetle pola jasnego.
Dostosuj ostrość i wykorzystaj pozycjonowanie w osi Z, aby zwizualizować końce apikalne komórek powierzchownych. Przełącz na tryb fluorescencji i użyj obiektywu o większym powiększeniu. Aby zebrać pojedyncze obrazy lub filmy time-lapse z preparatu nabłonka, dostrój parametry akwizycji, aby uzyskać obraz możliwie najlepszej jakości.
W celu uzyskania wskazówek dotyczących strojenia i obrazowania należy zapoznać się z częścią opisową niniejszego protokołu. Należy utrzymywać moc lasera na jak najniższym poziomie. Wykonaj obrazy lub filmy poklatkowe nabłonka x explan.
W celu uzyskania sugestii dotyczących gromadzenia danych należy zapoznać się z pisemną częścią protokołu. Pliki obrazów konfokalnych mogą być analizowane pod kątem danych na różne sposoby. Oto dwa przykłady analizy plików danych przy użyciu oprogramowania analitycznego Image J z wtyczką Bio-Formats.
Aby zmierzyć powierzchnię komórki nabłonkowej, rozwiń menu Analyze i kliknij Set Measurements. Wybierz narzędzie zaznaczania z paska narzędzi i obrysuj komórkę, a następnie w menu Analyze wybierz Tools, a potem ROI Manager. Aby otworzyć menedżera obszarów zainteresowania (ROI Manager), naciśnij Ctrl+T.
Aby dodać obrys do menedżera ROI, zaznacz i dodaj z obrazu taką liczbę obrysów, jaka jest potrzebna. Następnie kliknij „save”, aby zapisać zestaw ROI w menedżerze ROI. Kliknij „measure”.
W oknie wyników wyświetlone zostaną teraz zmierzone obszary każdego ROI. Aby zmierzyć intensywność błony komórkowej, wybierz narzędzie linii prostej z paska narzędzi programu ImageJ. Narysuj linię prostopadłą do błony.
Naciśnij CTRL T, tak jak w poprzednim przykładzie. Aby dodać zaznaczenie do menedżera ROI, rozwiń menu analyze i kliknij plot profile, aby wygenerować wykres względnych intensywności wzdłuż linii. Aby zapisać wykres jako obraz, kliknij save w nowym oknie wykresu, które się pojawi.
Rozwiń menu listy do pliku, a następnie zapisz jako. Właśnie pokazaliśmy, jak obrazować na żywo i kwantyfikować embrionalne komórki nabłonkowe z wyciętego eksplantatu CapEx zwierzęcia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dodaniu antybiotyku i antybiotyku do DFA. Aby zapobiec wzrostowi bakterii i grzybów, zachowaj szczególną ostrożność podczas dociskania eksplantatów pod szkiełkami nakrywkami, ponieważ zbyt silny nacisk może zmiażdżyć eksplantat.
Ważne jest również pamiętanie o zastosowaniu optymalnych ustawień mikroskopu konfokalnego, aby uzyskać dane obrazowe najwyższej jakości. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł prezentuje techniki obrazowania na żywo służące do badania morfologii zarodkowych komórek nabłonkowych u Xenopus. Przedstawiono w nim metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia rozwoju
Wstęp
- Nabłonki embrionalne Xenopus służą jako model do badania zachowań komórkowych.
- Obrazowanie żywych komórek uzupełnia tradycyjną histologię.
- Zrozumienie morfogenezy nabłonka jest kluczowe dla badań nad rozwojem.
- Mikroskopia konfokalna umożliwia wizualizację dynamiki komórkowej w czasie rzeczywistym.
Cel badania
- Przedstawienie technik obrazowania na żywo dla komórek nabłonkowych.
- Ilościowa ocena szczegółów morfologicznych komórek nabłonkowych.
- Przedstawienie protokołu izolacji i hodowli tkanek żaby.
Zastosowane metody
- Przygotowanie narzędzi i aparatury do obrazowania.
- Wycinanie tkanek z embrionów żaby do hodowli.
- Pozyskiwanie obrazów wysokiej rozdzielczości komórek nabłonkowych.
- Kwantyfikacja morfologii komórek przy użyciu oprogramowania Image J.
Główne wyniki
- Uzyskano obrazy żywych komórek nabłonkowe o wysokiej rozdzielczości.
- Analiza ilościowa pozwoliła wyznaczyć śledzone obszary komórek oraz intensywność sygnału z błon.
- Obrazowanie na żywo dostarczyło informacji na temat zachowania komórek podczas morfogenezy.
- Metody zostały zwalidowane pod kątem długoterminowej hodowli tkanek żaby.
Wnioski
- Konfokalna mikroskopia żywych komórek jest skuteczną metodą badania komórek nabłonkowych.
- Opisane metody można zastosować w różnorodnych badaniach z zakresu biologii rozwoju.
- Wyniki pogłębiają zrozumienie morfogenezy nabłonka.
Najczęściej zadawane pytania
Przemysłowe zastosowanie i znaczenie
Obrazowanie żywych komórek oraz analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonka u Xenopus laevis stanowią dynamiczną platformę do badania procesów morfogenetycznych istotnych dla wczesnego etapu odkryć i walidacji celów terapeutycznych. Konfokalna mikroskopia o wysokiej rozdzielczości umożliwia pomiar morfologii komórkowej i lokalizacji białek w czasie rzeczywistym, co zwiększa wiarygodność prognostyczną modeli biologii rozwoju. Niniejszy schemat postępowania zwiększa wartość translacyjną systemów nabłonkowych w zakresie ograniczania ryzyka mechanistycznego i selekcji projektów w badaniach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią obserwację zmian cytoszkieletu i dynamiki kształtu komórek w czasie rzeczywistym.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów molekularnych biorących udział w morfogenezie nabłonkowej.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ilościowe określanie zmian powierzchni komórek i intensywności błony.
- Zapewnia platformę do weryfikacji hipotez dotyczących szlaków rozwojowych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane systemy żywych komórek do dalszych procesów ilościowego obrazowania.
- Standaryzuje pomiar parametrów morfologicznych przy użyciu powtarzalnej analizy w programie Image J.
- Umożliwia wysokoprzepustowy screening związków wpływających na zachowanie komórek nabłonkowych.
- Zapewnia skalowalność testu i możliwość ponownego wykorzystania platformy w badaniach porównawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla przebiegu choroby dzięki rejestrowaniu dynamicznych procesów nabłonkowych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną za pomocą wyników ilościowych.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne, dostarczając predykcyjnych odczytów komórkowych w czasie rzeczywistym.
- Wspiera identyfikację biomarkerów poprzez obrazowanie na żywo lokalizacji białek.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkryć, od wczesnego testowania hipotez po walidację modeli przedklinicznych, wykorzystując obrazowanie żywych komórek do generowania wiarygodnych danych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez i wyjaśnienie szlaków sygnałowych poprzez analizę morfologiczną w czasie rzeczywistym.
- Przesiewy: Zapewniają powtarzalne, ilościowe wyniki niezbędne do opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Pozwala na precyzyjne pomiary powierzchni komórek i intensywności błony do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączą etap odkryć z badaniami przedklinicznymi poprzez wspieranie modelowania układów istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość ponownego wykorzystania platformy obrazowania i analizy w różnorodnych badaniach nad nabłonkiem.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w biologii nabłonka.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji, powtarzalności i skalowalności w procesach obrazowania żywych komórek.
- Wartość strategiczna: Uzasadnia decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową poprzez dostarczanie solidnych danych ilościowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów na etapie odkryć.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii konfokalnej i ilościowej analizy obrazu.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury obrazującej oraz oprogramowania analitycznego (np. Image J).
- Konieczna jest standaryzacja protokołów obrazowania i pomiarów pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych systemów modelowych lub typów tkanek.
- Zależne od optymalnych warunków hodowli oraz starannego obchodzenia się z próbkami w celu zapewnienia jakości danych.
