Name: Ksenopus (Ksenopus) Oocyty: zoptymalizowane metody mikroiniekcji, usuwania warstw komórek pęcherzykowych i szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Poznaj zoptymalizowane metody mikroiniekcji RNA i usuwania warstw komórek pęcherzykowych w oocytach Xenopus. Techniki te poprawiają przeżywalność komórek i umożliwiają badanie kanałów jonowych w eksperymentach elektrofizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki 315230_156929/1. M.C.M. jest stypendystą (Beca Chile Postdoctorado z CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).

Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalny komitet Kantonu Bern Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85/15).
1. Przygotowanie oocytów Xenopus 
<ol>
	<li>Utrzymuj żaby (Xenopus laevis) w cyklu 12 godzin/12 godzin światła/ciemności w wodzie, która jest ściśle utrzymywana w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Usuń płaty jajników z samic żab9. 
	UWAGA: Usunięcie płatów jest bodźcem do regeneracji, a często jakość oocytów poprawia się po operacji. Oocyt jest pokryty warstwą witeliny, warstwą komórek pęcherzykowych i tkanką łączną zawierającą naczynia krwionośne21. Cała struktura nazywana jest "mieszkiem włosowym".</li>
	<li>Umieść płaty jajników, które są gęsto upakowane pęcherzykami zawierającymi oocyty, w sterylnym roztworze soli Barth's Saline7 (MBS) uzupełnionym penicyliną i streptomycyną (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 0,82 mM MgSO4, 0,41 mM CaCl2, 0,33 mM Ca(NO3)2, 10 mM kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny).</li>
	<li>Pojedyncze pęcherzyki etapu V-VI21. Przytrzymaj płat jajnika kleszczami. Opuść platynową pętlę (ryc. 1) na mieszki włosowe i delikatnie wycofaj pętlę, aby przerwać tkankę łączną zawierającą pęcherzyk od tkanki jajnika. 
	UWAGA: Pęcherzyki Stage V-VI21 charakteryzują się wielkością (1,0 - 1,2 mm średnicy) oraz dobrym kontrastem między ciemną pigmentowaną półkulą zwierzęcą a żółtawą półkulą roślinną.</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety Pasteura należy przenieść tylko zdrowo wyglądające pęcherzyki (tj. idealnie kuliste i z nienaruszoną pigmentacją) na szalkę Petriego o średnicy 35 mm (przyciąć grzbiet do średnicy otworu 1,5 mm).</li>
</ol>
2. Mikroiniekcja mRNA do cytoplazmy
Uwaga: Opisany tutaj system mikroiniekcji wywodzi się z tego zgłoszonego przez Kressmanna i Birnstiela22.
<ol>
	<li>Przygotować cRNA z odpowiednich cDNA kodujących podjednostki receptora α4β2δ GABAA przez transkrypcję in vitro, dodanie ogona poli (A+) i kwantyfikację RNA za pomocą elektroforezy żelowej23.</li>
	<li>Pipety do mikroiniekcji należy przygotować z kapilar ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1,0 mm), średnica wewnętrzna 0,58 mm (ID), długość 100 mm) za pomocą ściągacza do mikropipet. Odłamać końcówki szklanych naczyń włosowatych pod mikroskopem za pomocą mikromanipulatora i mikrofilamentu, aby uzyskać średnicę końcówki 12 - 15 μm ze ściętą końcówką.</li>
	<li>Napełnij pipety do mikroiniekcji olejem parafinowym za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml, a następnie zamontuj pipetę do mikroiniekcji na domowym aparacie do mikroiniekcji (Rysunek 2). 
	UWAGA: Domowy aparat do wtrysku oleju hydraulicznego składa się z silnika grilla sterowanego za pomocą przełącznika nożnego. Dodatkowy przełącznik zmienia tryb obracania silnika. Silnik ten napędza mikrometryczną (0,5 mm/obrót), która przesuwa lub cofa tłok szklanej strzykawki o pojemności 10 μl. Wstrzyknięcie odbywa się z prędkością około 3 obr./min, a 0,5 obrotu odpowiada wstrzyknięciu 50 nL do pęcherzyka. Końcówka strzykawki jest połączona z grubościenną rurką z politetrafluoroetylenu, która z kolei jest połączona z igłą iniekcyjną za pomocą bardzo krótkiego odcinka rurki Tygon. Kapilara iniekcyjna jest utrzymywana przez uchwyt wiertarski, który jest sterowany przez mikromanipulator. Cały układ wypełniony jest olejem parafinowym. Należy unikać wszelkich pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one uszkodzić układ wtryskowy. Zestaw jest oświetlony zimnym źródłem światła. Do kontroli optycznej wymagany jest mikroskop stereoskopowy. Mieszki włosowe są wizualizowane w zimnym świetle za pomocą mikroskopu stereoskopowego (powiększenie 40X). Skuteczność zestawu do iniekcji jest testowana poprzez wstrzyknięcie radioaktywnego znacznika do oocytów Xenopus. Na jedno wstrzyknięcie należy dostarczyć objętość 45 - 55 nl.</li>
	<li>Za pomocą pipety ze sterylną plastikową końcówką przetestuj konfigurację, umieszczając kroplę sterylnej wody na czystym wnętrzu odpornego na wilgoć tworzywa termoplastycznego (2 x 2 cm). Zanurz końcówkę pipety iniekcyjnej w tej kropli, a następnie obróć silnik, aby cofnąć tłok (podciśnienie wewnątrz pipety iniekcyjnej). 
	UWAGA: Woda powinna dostać się do pipety i utworzyć widoczną powierzchnię styku z olejem.</li>
	<li>Wycofać końcówkę pipety z kropli i przyłożyć nadciśnienie do wnętrza pipety iniekcyjnej. Na końcówce pipety iniekcyjnej powinna utworzyć się kropelka wody.</li>
	<li>Przygotuj się do wstrzyknięcia pęcherzyków, ustawiając je w jednej linii z biegunami roślinnymi skierowanymi do góry w szczelinach nylonowej siatki (G: 0,8 mm) przyklejonej do dna szalki Petriego (60 mm) pokrytej MBS.</li>
	<li>Dozuj 2 μl mRNA za pomocą pipety ze sterylną plastikową końcówką na czyste wnętrze tworzywa termoplastycznego. Przenieś mRNA do pipety iniekcyjnej, wywierając podciśnienie na wnętrze pipety iniekcyjnej.</li>
	<li>Umieścić pipetę iniekcyjną na pojedynczym mieszku włosowym za pomocą mikromanipulatora.</li>
	<li>Wprowadzić igłę do wstrzykiwań w środek bieguna roślinnego i wstrzyknąć 50 nL mRNA z natężeniem przepływu 0,6 μl/min, wywierając nadciśnienie do wnętrza pipety. Odczekaj 5 - 10 s przed wyjęciem końcówki pipety iniekcyjnej z mieszków włosowych, aby uniknąć ucieczki mRNA. 
	UWAGA: mRNA należy wstrzyknąć w roślinny (żółtawy) biegun, aby uniknąć wstrzyknięcia do jądra, które znajduje się na półkuli zwierzęcej.</li>
	<li>Przenieść wstrzyknięte pęcherzyki na nową szalkę Petriego (35 mm) wypełnioną 2 ml MBS. Umieścić naczynie w chłodziarce do wina ustawionej na temperaturę 18 °C. Inkubować wstrzyknięte pęcherzyki przez 1-7 dni przed zapisem, w zależności od tożsamości nowo wyrażonego białka.</li>
</ol>
3. Usuwanie mieszków włosowych (Rysunek 3)
UWAGA: Jak wspomniano powyżej, oocyt pokryty warstwą witeliny, komórkami pęcherzykowymi i tkanką łączną, która zawiera naczynia krwionośne24, jest znany jako "pęcherzyk". Wszystkie warstwy z wyjątkiem warstwy witeliny, która zapewnia stabilność mechaniczną, nie uniemożliwiając dostępu roztworów do powierzchni komórki, muszą zostać usunięte przed eksperymentami elektrofizjologicznymi. Pęcherzyk bez otaczających go warstw komórkowych był wcześniej określany jako "ogołocony" oocyt25. Ten etap jest zwykle wykonywany tego samego dnia, co eksperymenty elektrofizjologiczne.
<ol>
	<li>Przenieś dziesięć wstrzykniętych pęcherzyków do probówki ze szkła borokrzemianowego zawierającej 0,5 ml MBS, 1 mg / ml kolagenazy i 0,1 mg / ml inhibitora trypsyny. Zanurzyć probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 36 °C. Inkubować pęcherzyki przez 20 minut i od czasu do czasu wstrząsać probówkami.</li>
	<li>Wypłucz mieszki włosowe, przenosząc je do drugiej probówki zawierającej 1 ml MBS w temperaturze pokojowej. Pozostaw je w probówce na około 10 sekund.</li>
	<li>Przenieść pęcherzyki do trzeciej probówki zawierającej 0,5 ml podwójnie stężonego MBS zawierającego 4 mM kwasu bis(2-aminoetyloetero)-glikolu etylenowego-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowego (EGTA) i inkubować je przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Od czasu do czasu wstrząsać probówką. 
	UWAGA: Roztwór hipertoniczny (podwójnie skoncentrowany MBS) służy do wywoływania kurczenia się oocytów w warstwach komórek pęcherzykowych, a tym samym do odrywania warstw komórek pęcherzykowych od oocytu; EGTA jest dodawana w celu zahamowania aktywności kolagenazy.</li>
	<li>Wypłucz mieszki włosowe, przenosząc je do drugiej probówki zawierającej 1 ml MBS w temperaturze pokojowej. Pozostaw je w probówce na około 10 sekund.</li>
	<li>Przenieść oocyty na szalkę Petriego (o średnicy 35 mm) zawierającą 2 ml MBS. Pod mikroskopem stereoskopowym oddziel zewnętrzne otoczki od pęcherzyków, po prostu odpychając nagi oocyt za pomocą platynowej pętli. 
	UWAGA: Zewnętrzne otoczki oocytów mocno przylegają do naczynia hodowlanego i można je łatwo oddzielić od oocytów. Niektóre oocyty spontanicznie tracą swoje zewnętrzne otoczki i zostaną odzyskane jako ogołocone oocyty. W wyniku tego zabiegu uzyskuje się w miarę stabilny preparat, który zachowuje kulisty wygląd oocytów.</li>
</ol>
4. Szybka zmiana roztworu wokół oocytu
<ol>
	<li>Przeprowadzić eksperyment z cęgami napięciowymi, jak opisanow punkcie 9,26.</li>
	<li>Zmień roztwór grawitacyjnego systemu perfuzyjnego, obracając przełączniki perfuzji zgodnie z wymaganiami eksperymentu.
	<ol>
		<li>Roztwór perfuzyjny nanieść w dawce 6 ml/min przez szklaną kapilarnę o średnicy wewnętrznej 1,35 mm, której ujście znajduje się około 0,4 mm od powierzchni oocytu, aby umożliwić szybkie zmiany stężenia agonisty wokół oocytu. 
		UWAGA: Tempo zmian zostało wcześniej oszacowane na 70% w czasie krótszym niż 0,5 s27.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+frog+eggs+and+oocytes+for+the+study+of+messenger+RNA+and+its+translation+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells.</a> Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).</li>
<li>Soreq, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthesis+of+biologically+active+proteins+in+mRNA-microinjected+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22CRC+Crit+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes.</a> CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).</li>
<li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Xenopus+oocytes+for+the+functional+expression+of+plasma+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins.</a> J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).</li>
<li>Dascal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Xenopus+oocytes+for+the+study+of+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22CRC+Crit+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels.</a> CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).</li>
<li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+single+sodium+channels+translated+by+Xenopus+oocytes+after+injection+with+messenger+ribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid.</a> J Physiol. 386, 73-90 (1987).</li>
<li>Sigel, E., Minier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+oocyte%3A+system+for+the+study+of+functional+expression+and+modulation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins.</a> Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).</li>
<li>Colman, A. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aColman%2C+A+%22Transcription+and+Translation%27A+Practical+Approach%22">Transcription and Translation'A Practical Approach</a>. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. Oxford. 49-69 (1984).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defolliculation+of+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Defolliculation of Xenopus oocytes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).</li>
<li>Smart, T. G., Krishek, B. J. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmart%2C+TG+%22Patch-Clamp+Applications+and+Protocols%22">Patch-Clamp Applications and Protocols</a>. Boulton, A. A., Baker,, Wolfgang, W. alz , Humana Press. New Jersey. 259-305 (1995).</li>
<li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+sites+involved+in+modulation+of+the+GABA+receptor+channel+by+the+intravenous+anesthetics+propofol%2C+etomidate+and+pentobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital.</a> Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).</li>
<li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+positive+allosteric+modulators+of+GABAA+receptors+with+anesthetic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity.</a> Sci Rep. 6, 25943(2016).</li>
<li>Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWongsamitkul%2C+N+%22J+Biol+Chem%22">J Biol Chem</a>. 291 (35), 18474-18483 (2016).</li>
<li>Burgunder, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chloride+channel+mutations+leading+to+mild+myotonia+among+Chinese%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese.</a> Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).</li>
<li>Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heteromeric+potassium+channel+involved+in+the+modulation+of+the+plasma+membrane+potential+is+essential+for+the+survival+of+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes.</a> FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).</li>
<li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((myo-Inositol+uptake+is+essential+for+bulk+inositol+phospholipid+but+not+glycosylphosphatidylinositol+synthesis+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei.</a> J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).</li>
<li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+Bloodstream+Forms+Depend+upon+Uptake+of+myo-Inositol+for+Golgi+Complex+Phosphatidylinositol+Synthesis+and+Normal+Cell+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth.</a> Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).</li>
<li>Wu, M., Gerhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raising+Xenopus+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Raising Xenopus in the laboratory.</a> Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).</li>
<li>Gurdon, J. B. American clawed frogs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGurdon%2C+JB+%22Methods+in+developmental+biology%22">Methods in developmental biology</a>. Wilt, F. H., Wessels, N. K. , Thomas Y. Crowell Co. New York. 75-84 (1967).</li>
<li>Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poor+quality+of+oocytes+from+Xenopus+laevis+used+in+laboratory+experiments%3A+prevention+by+use+of+antiseptic+surgical+technique+and+antibiotic+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation.</a> Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).</li>
<li>Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+oogenesis+in+the+South+African+clawed+frog+%28Xenopus+laevis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis).</a> Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).</li>
<li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).</li>
<li>Kressmann, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKressmann%2C+A+%22Transfer+of+Cell+Constituents+into+Eucaryotic+Cells%22">Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells</a>. Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. , Plenum Press. 388-407 (1980).</li>
<li>Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+modulation+of+synaptic+and+extrasynaptic+GABAA+receptors+by+an+antagonist+of+the+high+affinity+benzodiazepine+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site.</a> Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).</li>
<li>Dumont, J. N., Brummett, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+V.+Relationships+between+developing+oocytes+and+their+investing+follicular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues.</a> J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).</li>
<li>Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+oocyte+resting+potential%2C+muscarinic+responses+and+the+role+of+calcium+and+guanosine+3%27%2C5%27-cyclic+monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate.</a> J Physiol. 352, 551-574 (1984).</li>
<li>Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocytes+as+an+expression+system+for+studying+receptor%2Fchannel+targets+of+drugs+and+pesticides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides.</a> Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).</li>
<li>Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+subunit+combination+of+rat+brain+GABAA+receptors+on+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function.</a> Neuron. 5, 703-711 (1990).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metody opisane w tym artykule odbiegają od tych stosowanych tradycyjnie7-9. Standardem jest wystawienie płatów jajnika na 1 do 2 godzin leczenia kolagenazą8; wyizolować nieuszkodzone, pozbawione oocytów; i wstrzyknąć im mRNA za pomocą komercyjnych urządzeń do iniekcji. Ta klasyczna procedura ma następujące wady: 1) Oocyty mogą zostać uszkodzone przez długą ekspozycję na wysokie stężenia kolagenazy. 2) Niestabilne, obnażone oocyty muszą być przechowywane do czasu eksperymentu. 3) Pozbawione komórek j...

oocyty Xenopus są powszechnie używane jako system ekspresji (Bibliografia 2 - 3 i odniesienia w niej). Są w stanie prawidłowo składać i włączać funkcjonalnie aktywne białka wielocząsteczkowe do swoich błon plazmatycznych. Korzystając z tego systemu, możliwe jest funkcjonalne badanie białek błonowych samodzielnie lub w połączeniu z innymi białkami, w celu zbadania właściwości zmutowanych, chimerycznych lub połączonych białek oraz przeprowadzenia badań przesiewowych potencjalnych leków.
Zalety korzystania z oocytów w porównaniu z innymi heterologicznymi systemami ekspresji obejmują prostą obsługę gigantycznych komórek, wysoki odsetek komórek wyrażających obcą informację genetyczną, prostą kontrolę środowiska oocytu za pomocą perfuzji w kąpieli oraz kontrolę potencjału błonowego.
Wadą tego systemu wyrażeń jest sezonowa zmienność obserwowana w wielu laboratoriach17-20. Przyczyna tej zmienności jest daleka od jasności. Ponadto często obserwuje się, że jakość oocytów znacznie się różni. Tradycyjne metody7-9 obejmowały izolację płatów jajników, ekspozycję płatów jajników na kolagenazę przez około godzinę, selekcję ogołoconych oocytów i mikroiniekcję oocytów. W tym przypadku opisano szereg alternatywnych, szybkich procedur, które pozwoliły nam pracować z tym systemem ekspresji przez ponad 30 lat bez zmienności sezonowej i niewielkiej zmienności jakości oocytów.
Opisane tutaj zmodyfikowane i ulepszone metody izolacji oocytów, mikroiniekcji cRNA i usuwania warstw komórek pęcherzykowych mogą być używane do ekspresji dowolnego białka w oocycie Xenopus. Bardzo prosta metoda szybkiej wymiany roztworu pożywki wokół oocytu może być zastosowana do badania dowolnego kanału jonowego bramkowanego ligandem i nośników.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M-1880</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>223560</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO3)2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td>100 &mu; g penicyliny/ml i 100 &mu; g streptomycyna/ml</td></tr><tr><td>Platynowa pętla druciana</td><td>domowej roboty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Zeitz-Instruments GmBH</td><td>DMZ</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>10 &mu; L, Typ 701N</td></tr><tr><td>Grubościenne rurki z politetrafluoroetylenu</td><td>Labmarket GmBH</td><td></td><td>1,0 mm OD&nbsp;</td></tr><tr><td>Olej parafinowy</td><td>Sigma</td><td>18512</td><td></td></tr><tr><td>Siatka nylonowa, G: 0,8 mm&nbsp;</td><td>ZBF Z&uuml; bogatsza Beuteltuchfabrik AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurka ze szkła borokrzemianowego&nbsp;</td><td>Corning</td><td>99445-12</td><td>PYREX</td></tr><tr><td>Collagenase NB Standard Grade</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny typu I-S</td><td>Sigma</td><td>T-9003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3389</td><td></td></tr><tr><td>Szklana kapilara</td><td>Jencons (Scientific) LTD.</td><td>H15/10</td><td>1,35 ID mm (do perfuzji), alternatywna firma: Harvard Apparatus Limited</td></tr><tr><td>Kapilara ze szkła borokrzemianowego</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0019</td><td>1,0 OD x&nbsp; 0,58 ID x 100 Długość mm (do mikroiniekcji)&nbsp;</td></tr><tr><td>Kapilara ze szkła borokrzemianowego&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0044</td><td>1,2 OD x 0,69 ID x 100 Długość mm (dla dwuelektrodowego cęgowania napięciowego)</td></tr><tr><td>&gamma;-Kwas aminomasłowy (GABA)</td><td>Sigma</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>3&alpha;,21-Dihydroxy-5&alpha;-pregnan-20-one (THDOC)</td><td>Sigma</td><td>P2016</td><td></td></tr><tr>silnik<td>grillowy</td><td>Faulhaber&nbsp;</td><td></td><td>Mikrosilnik prądu stałego Typ 2230 z przekładnią Typ 22/2</td></tr><tr><td>śruba mikrometryczna</td><td>Kiener-Wittlin</td><td>10400</td><td>TESA, AR 02.11201</td></tr><tr><td>Sterylne plastikowe pipety transferowe</td><td>Saint-Amand&nbsp; Mfg.</td><td>222-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

ksenopus (ksenopus) oocyty: zoptymalizowane metody mikroiniekcji, usuwania warstw komórek pęcherzykowych i szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Oocyt Xenopus jako heterologiczny system ekspresji białek, został po raz pierwszy opisany przez Gurdona i wsp.1 i jest szeroko stosowany od czasu jego odkrycia (Odnośniki 2 - 3 i odniesienia w nich). Cechą, która sprawia, że oocyt jest atrakcyjny dla ekspresji kanału obcego, jest słaba obfitość endogennych kanałów jonowych4. Ten system ekspresji okazał się przydatny do charakteryzacji wielu białek, w tym kanałów jonowych bramkowanych ligandem.
Ekspresja receptorów GABAA w oocytach Xenopus i ich charakterystyka funkcjonalna jest opisana tutaj, w tym izolacja oocytów, mikroiniekcje z cRNA, usuwanie warstw komórek pęcherzykowych i szybkie zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych. Procedury zostały zoptymalizowane w tym laboratoriumpod kątem 5,6 i odbiegają od rutynowo stosowanych7-9. Tradycyjnie, ogołocone oocyty są przygotowywane z przedłużonym leczeniem kolagenazą płatów jajników w RT, a te ogołocone oocyty są mikrowstrzykiwane mRNA. Korzystając ze zoptymalizowanych metod, za pomocą tego systemu stwierdzono ekspresję i zbadano różne białka błonowe, takie jak rekombinowane receptory GABAA 10-12, ludzkie rekombinowane kanały chlorkowe13, kanały potasowe trypanosomów14 i transporter mio-inozytolu15, 16.
Opisane tutaj metody mogą być stosowane do ekspresji dowolnego białka w oocytach Xenopus, a szybka zmiana roztworu może być wykorzystana do badania innych kanałów jonowych bramkowanych ligandem.

Xenopus oocyty zostały oddzielone mechanicznie przy użyciu pętli platynowej (Rysunek 1). Do oocytów mikroiniektoowano mRNA kodujące podjednostki receptora GABAA α4, β2, δ w stosunku 0,5:0,5:2,5 fmol/oocyt (Rysunek 2). Po 4 d usunięto warstwy komórek pęcherzykowych (Rysunek 3). Oocyty poddano clampowaniu napięciowemu przy -80 mV i eksponowano na rosnące stężenia kwasu gamma-aminomasłowego (GABA) w ...

Opisano zoptymalizowane procedury izolacji pojedynczych pęcherzyków, mikroiniekcji cytoplazmatycznego RNA, usuwania otaczających warstw komórek i ekspresji białek w oocytach Xenopus. Ponadto przedstawiono prostą metodę szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych z kanałami jonowymi bramkowanymi ligandem.

Ksenopus (Ksenopus) Oocyty: zoptymalizowane metody mikroiniekcji, usuwania warstw komórek pęcherzykowych i szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

Ogólnym celem tej procedury jest ekspresja nowych białek, takich jak kanały jonowe w oocytach Xenopus. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w każdej dziedzinie, która wymaga funkcjonalnego systemu wyrażeń. Głównymi zaletami odmian tej techniki są szybkość, niezawodność i poprawa przeżywalności oocytów.Metoda ta może dostarczyć informacji na temat funkcjonowania kanałów jonowych. Dodatkowo można go zastosować do badania dowolnego innego białka. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że klasyczne metody skutkowały niskim wskaźnikiem przeżywalności oocytów.Po usunięciu płatów jajników od samic żab zgodnie z protokołem tekstowym, należy umieścić płaty w sterylnym zmodyfikowanym roztworze Bartha uzupełnionym penicyliną i streptomycyną. Rozciąć płaty, aby umożliwić dostęp tkanki do tlenu. Aby wyodrębnić etap od piątego do sześciu pęcherzyków, użyj kleszczy do przytrzymania jajnika, a następnie opuść platynową pętlę na mieszki włosowe i delikatnie wycofaj pętlę, aby przerwać tkankę łączną z pęcherzykiem z tkanki jajnika.Sortuj zdrowo wyglądające oocyty za pomocą platynowej pętli. Użyj plastikowej pipety Pasteura z końcówką przyciętą do średnicy 1,5 milimetra, aby przenieść wybrane mieszki włosowe na szalkę Petriego o średnicy 35 milimetrów. Po przygotowaniu cRNA do receptora GABA A i pipet do mikroiniekcji zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć oleju parafinowego i 10-mililitrowej strzykawki z cienką igłą do wypełnienia pipety do mikroiniekcji.Następnie zamontuj pipetę na domowym aparacie do mikroiniekcji. Za pomocą pipety ze sterylną plastikową końcówką umieść kroplę roztworu mRNA na czystej stronie kawałka odpornego na wilgoć tworzywa termoplastycznego. Następnie zanurzyć końcówkę pipety iniekcyjnej w kropli i włączyć silnik, aby cofnąć tłok.Roztwór mRNA powinien dostać się do pipety i utworzyć widoczną granicę faz z olejem. Następnie należy wycofać końcówkę pipety z kropli i przyłożyć nadciśnienie do wnętrza pipety iniekcyjnej. Na końcówce pipety iniekcyjnej powinna uformować się kropla roztworu mRNA.Używając 60-milimetrowej szalki Petriego z nylonową siatką przyklejoną do dna i pokrytą MBS do wstrzykiwań, wyrównaj mieszki włosowe z ich biegunami roślinnymi skierowanymi do góry. Za pomocą mikromanipulatora umieścić pipetę iniekcyjną na pojedynczym pęcherzyku. Włóż igłę do wstrzykiwań w środek bieguna roślinnego i zastosuj nadciśnienie do wnętrza pipety, aby wstrzyknąć 50 nanolitrów mRNA przy natężeniu przepływu 0,6 mikrolitra na minutę.Należy odczekać od pięciu do 10 sekund przed wyjęciem końcówki pipety do wstrzykiwań z mieszków włosowych, aby uniknąć ucieczki informacyjnego RNA. Przenieś wstrzyknięte mieszki włosowe na nową szalkę Petriego wypełnioną dwoma mililitrami MBS. Naczynie wstawiamy do chłodziarki do wina nastawionej na 18 stopni Celsjusza.Inkubuj wstrzyknięte pęcherzyki przez jeden do siedmiu dni przed zapisem, w zależności od tożsamości nowo eksprymowanego białka. Aby usunąć mieszki włosowe, przenieś dziesięć wstrzykniętych pęcherzyków do probówki ze szkła borokrzemianowego zawierającej 0,5 mililitra MBS, jeden miligram na mililitr kolagenazy i 0,1 miligrama na mililitr inhibitora trypsyny. Zanurz rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 36 stopni Celsjusza i inkubuj mieszki włosowe przez 20 minut.Temperatura tutaj jest krytyczna, ponieważ jeden stopień więcej może zabić oocyty. Wypłucz mieszki włosowe, przenosząc je do drugiej probówki zawierającej jeden mililitr MBS w temperaturze pokojowej i pozostaw je w probówce na około dziesięć sekund. Następnie przenieś mieszki włosowe do trzeciej probówki zawierającej 0,5 mililitra podwójnie stężonego MBS zawierającego cztery milimolowe EGTA i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez cztery minuty, od czasu do czasu potrząsając probówkami.Czas inkubacji wynoszący cztery minuty ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia oderwania się warstw pęcherzykowych od oocytu. Wypłucz mieszki włosowe, przenosząc je do innej probówki zawierającej jeden mililitr MBS w temperaturze pokojowej i pozostaw je w probówce na około 10 sekund. Przenieś oocyty na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą dwa mililitry MBS.Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, użyj platynowej pętli, aby oddzielić zewnętrzne otoczki od pęcherzyków, po prostu odpychając nagi oocyt. Przechowuj ogołocone oocyty do czasu użycia. W tym eksperymencie mechanicznie wyodrębnione oocyty Xenopus zostały mikrowstrzyknięte z powłoką mRNA dla podjednostek receptora GABA A.Następnie usunięto warstwy komórek pęcherzykowych. Oocyty zostały zaciśnięte pod napięciem ujemnym 80 miliwoltów i wystawione na rosnące stężenie GABA i obecność THDOC, silnego dodatniego modulatora allosterycznego receptora GABA A. Panel ten pokazuje wywołane amplitudy prądu w zależności od stężeń GABA, co wskazuje na wrażliwość tej kombinacji podjednostek w stosunku do GABA.Zastosowane równanie to I(c)Imax/n)gdzie c jest stężeniem GABA, EC50 jest stężeniem GABA w obecności jednego mikromolowego THDOC, wywołując połowę maksymalnej amplitudy prądu. Imax to maksymalna amplituda prądu. I jest amplitudą prądu, a n jest współczynnikiem Hilla.EC50 receptora alfa cztery beta two delta GABA A wynosił 0,41 0,12 mikromola, a n wynosił 0,76 0,04 Po opanowaniu warstwy komórek pęcherzykowych można usunąć w ciągu pół godziny, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała naukowcom drogę do ulepszenia procedury ekspresji białek w oocytach Xenopus. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować oocyty Xenopus otoczone warstwami komórek pęcherzykowych, ich mikroiniekcję mRNA, a następnie usunięcie warstw komórek pęcherzykowych.

xenopus-oocytes-optimized-methods-for-microinjection-removal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym materiale demonstrujemy mikroiniekcję cytoplazmatyczną oocytów Xenopus laevis z substratem importu jądrowego, a także przygotowanie wstrzykniętych oocytów do wizualizacji za pomocą elektronowej mikroskopii sekcji cienkich.<br...

Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis

Wizualizacja transportu RNA in vivo jest realizowana poprzez mikroiniekcję fluorescencyjnie znakowanych transkryptów RNA do oocytów Xenopus, a następnie za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wizualizacja lokalizacji RNA w oocytach Xenopus

Procedura zapłodnienia oocytów Xenopus metodą transferu do gospodarza.

Zapłodnienie oocytów Xenopus metodą transferu do gospodarza

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Prąd jonowy kanałów BK rejestruje się przy użyciu technik patch clamp. Kanały BK są eksprymowane w oocytach Xenopus poprzez wstrzykiwanie mRNA. Roztwór wewnątrzkomórkowy podczas pomiarów patch clamp jest kontrolowany przez system perfuzyjny.

Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Opisujemy metody manipulowania niedojrzałymi oocytami Xenopus laevis, dojrzewania in vitro oocytów do komórek jajowych oraz docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników. Protokół ten umożliwia degradację niektórych białek matczynych i nadekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania podczas zapłodnienia, a zatem jest cenny dla badania ról określonych czynników we wczesnym rozwoju embrionalnym.

Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego

Kontrola syntezy białek występuje głównie na etapie inicjacji translacji, której niedobory są związane z różnymi zaburzeniami. Aby lepiej zrozumieć ich etiologię, opisaliśmy tutaj protokół z wykorzystaniem oocytów Xenopus laevis oceniający translację transkryptu mos w obecności mutanta czynnika inicjacji translacji eIF4G1.

Xenopus laevis jako model do identyfikacji upośledzenia translacji

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

Opisujemy system oocytów i czapeczek zwierzęcych Xenopus do klonowania ekspresji genów zdolnych do wywołania odpowiedzi w kompetentnej ektodermie i omawiamy techniki późniejszej analizy takich genów. System ten jest przydatny w funkcjonalnej identyfikacji szerokiej gamy produktów genowych.

Klonowanie funkcjonalne przy użyciu systemu ekspresji oocytów Xenopus

Ten artykuł opisuje ulepszenie konwencjonalnej fluorometrii zaciskowej (VCF), gdzie zamiast barwników maleimidowych stosuje się fluorescencyjne nienaturalne aminokwasy (fUAA), aby badać strukturalne przegrupowania w kanałach jonowych. Procedura obejmuje iniekcję DNA oocytów Xenopus, koiniekcję RNA/fUAA oraz jednoczesne pomiary prądu i fluorescencji.

Fluorometria zaciskowa napięcia w oocytach Xenopus przy użyciu fluorescencyjnych nienaturalnych aminokwasów

Tutaj prezentujemy protokół do wyrażania białek połączeniowych w oocytach Xenopus i rejestrowania prądu połączeniowego między dwoma przypisanymi oocytami za pomocą komercyjnego wzmacniacza zaprojektowanego do zapisów napięcia z dwoma oocytami w trybie pomiaru wysokiego prądu bocznego.

Rejestrowanie prądu złącza szczelinowego z oocytów Xenopus

Poznaj zoptymalizowane metody mikroiniekcji RNA i usuwania warstw komórek pęcherzykowych w oocytach Xenopus. Techniki te poprawiają przeżywalność komórek i umożliwiają badanie kanałów jonowych w eksperymentach elektrofizjologicznych.

Ksenopus (Ksenopus) Oocyty: zoptymalizowane metody mikroiniekcji, usuwania warstw komórek pęcherzykowych i szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych (Wideo) | JoVE Journal

Ksenopus (Ksenopus) Oocyty: zoptymalizowane metody mikroiniekcji, usuwania warstw komórek pęcherzykowych i szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych

Przeglądaj więcej filmów