Ksenopus (Ksenopus) Oocyty: zoptymalizowane metody mikroiniekcji, usuwania warstw komórek pęcherzykowych i szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych

Opisano zoptymalizowane procedury izolacji pojedynczych pęcherzyków, mikroiniekcji cytoplazmatycznego RNA, usuwania otaczających warstw komórek i ekspresji białek w oocytach Xenopus. Ponadto przedstawiono prostą metodę szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych z kanałami jonowymi bramkowanymi ligandem.

Ogólnym celem tej procedury jest ekspresja nowych białek, takich jak kanały jonowe w oocytach Xenopus. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w każdej dziedzinie, która wymaga funkcjonalnego systemu wyrażeń. Głównymi zaletami odmian tej techniki są szybkość, niezawodność i poprawa przeżywalności oocytów.

Metoda ta może dostarczyć informacji na temat funkcjonowania kanałów jonowych. Dodatkowo można go zastosować do badania dowolnego innego białka. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że klasyczne metody skutkowały niskim wskaźnikiem przeżywalności oocytów.

Po usunięciu płatów jajników od samic żab zgodnie z protokołem tekstowym, należy umieścić płaty w sterylnym zmodyfikowanym roztworze Bartha uzupełnionym penicyliną i streptomycyną. Rozciąć płaty, aby umożliwić dostęp tkanki do tlenu. Aby wyodrębnić etap od piątego do sześciu pęcherzyków, użyj kleszczy do przytrzymania jajnika, a następnie opuść platynową pętlę na mieszki włosowe i delikatnie wycofaj pętlę, aby przerwać tkankę łączną z pęcherzykiem z tkanki jajnika.

Sortuj zdrowo wyglądające oocyty za pomocą platynowej pętli. Użyj plastikowej pipety Pasteura z końcówką przyciętą do średnicy 1,5 milimetra, aby przenieść wybrane mieszki włosowe na szalkę Petriego o średnicy 35 milimetrów. Po przygotowaniu cRNA do receptora GABA A i pipet do mikroiniekcji zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć oleju parafinowego i 10-mililitrowej strzykawki z cienką igłą do wypełnienia pipety do mikroiniekcji.

Następnie zamontuj pipetę na domowym aparacie do mikroiniekcji. Za pomocą pipety ze sterylną plastikową końcówką umieść kroplę roztworu mRNA na czystej stronie kawałka odpornego na wilgoć tworzywa termoplastycznego. Następnie zanurzyć końcówkę pipety iniekcyjnej w kropli i włączyć silnik, aby cofnąć tłok.

Roztwór mRNA powinien dostać się do pipety i utworzyć widoczną granicę faz z olejem. Następnie należy wycofać końcówkę pipety z kropli i przyłożyć nadciśnienie do wnętrza pipety iniekcyjnej. Na końcówce pipety iniekcyjnej powinna uformować się kropla roztworu mRNA.

Używając 60-milimetrowej szalki Petriego z nylonową siatką przyklejoną do dna i pokrytą MBS do wstrzykiwań, wyrównaj mieszki włosowe z ich biegunami roślinnymi skierowanymi do góry. Za pomocą mikromanipulatora umieścić pipetę iniekcyjną na pojedynczym pęcherzyku. Włóż igłę do wstrzykiwań w środek bieguna roślinnego i zastosuj nadciśnienie do wnętrza pipety, aby wstrzyknąć 50 nanolitrów mRNA przy natężeniu przepływu 0,6 mikrolitra na minutę.

Należy odczekać od pięciu do 10 sekund przed wyjęciem końcówki pipety do wstrzykiwań z mieszków włosowych, aby uniknąć ucieczki informacyjnego RNA. Przenieś wstrzyknięte mieszki włosowe na nową szalkę Petriego wypełnioną dwoma mililitrami MBS. Naczynie wstawiamy do chłodziarki do wina nastawionej na 18 stopni Celsjusza.

Inkubuj wstrzyknięte pęcherzyki przez jeden do siedmiu dni przed zapisem, w zależności od tożsamości nowo eksprymowanego białka. Aby usunąć mieszki włosowe, przenieś dziesięć wstrzykniętych pęcherzyków do probówki ze szkła borokrzemianowego zawierającej 0,5 mililitra MBS, jeden miligram na mililitr kolagenazy i 0,1 miligrama na mililitr inhibitora trypsyny. Zanurz rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 36 stopni Celsjusza i inkubuj mieszki włosowe przez 20 minut.

Temperatura tutaj jest krytyczna, ponieważ jeden stopień więcej może zabić oocyty. Wypłucz mieszki włosowe, przenosząc je do drugiej probówki zawierającej jeden mililitr MBS w temperaturze pokojowej i pozostaw je w probówce na około dziesięć sekund. Następnie przenieś mieszki włosowe do trzeciej probówki zawierającej 0,5 mililitra podwójnie stężonego MBS zawierającego cztery milimolowe EGTA i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez cztery minuty, od czasu do czasu potrząsając probówkami.

Czas inkubacji wynoszący cztery minuty ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia oderwania się warstw pęcherzykowych od oocytu. Wypłucz mieszki włosowe, przenosząc je do innej probówki zawierającej jeden mililitr MBS w temperaturze pokojowej i pozostaw je w probówce na około 10 sekund. Przenieś oocyty na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą dwa mililitry MBS.

Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, użyj platynowej pętli, aby oddzielić zewnętrzne otoczki od pęcherzyków, po prostu odpychając nagi oocyt. Przechowuj ogołocone oocyty do czasu użycia. W tym eksperymencie mechanicznie wyodrębnione oocyty Xenopus zostały mikrowstrzyknięte z powłoką mRNA dla podjednostek receptora GABA A.

Następnie usunięto warstwy komórek pęcherzykowych. Oocyty zostały zaciśnięte pod napięciem ujemnym 80 miliwoltów i wystawione na rosnące stężenie GABA i obecność THDOC, silnego dodatniego modulatora allosterycznego receptora GABA A. Panel ten pokazuje wywołane amplitudy prądu w zależności od stężeń GABA, co wskazuje na wrażliwość tej kombinacji podjednostek w stosunku do GABA.

Zastosowane równanie to I(c)Imax/n)gdzie c jest stężeniem GABA, EC50 jest stężeniem GABA w obecności jednego mikromolowego THDOC, wywołując połowę maksymalnej amplitudy prądu. Imax to maksymalna amplituda prądu. I jest amplitudą prądu, a n jest współczynnikiem Hilla.

EC50 receptora alfa cztery beta two delta GABA A wynosił 0,41 0,12 mikromola, a n wynosił 0,76 0,04 Po opanowaniu warstwy komórek pęcherzykowych można usunąć w ciągu pół godziny, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała naukowcom drogę do ulepszenia procedury ekspresji białek w oocytach Xenopus. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować oocyty Xenopus otoczone warstwami komórek pęcherzykowych, ich mikroiniekcję mRNA, a następnie usunięcie warstw komórek pęcherzykowych.