Rekonstrukcja oscylacji cyklu komórkowego w mikroemulsjach bezkomórkowych ekstraktów jajowych Xenopus

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii systemowej, takie jak mechanizm regulujący sieć mitotyczną oraz dynamiczne właściwości i funkcje zegara cyklu komórkowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że wygeneruje ona dużą ilość kropel z wieloma cyklami komórkowymi w każdej, zapewniając nam wysokowydajne ramy do ilościowej manipulacji i analizy. Na początek wyrzuć partie jaj, które mają niejasne granice między biegunami zwierzęcymi i roślinnymi lub nieregularne białe plamy na słupach zwierzęcych.

Następnie wybierz odpowiednią partię jaj od jednej samicy żaby i przenieś jaja do 600-mililitrowej zlewki. Wylej nadmiar 0,2x buforu MMR i delikatnie dodaj cysteinę w 1x buforze ekstraktu do jaj. Następnie energicznie potrząśnij ręcznie zlewką, aby usunąć galaretki z jaj.

Powtórz to mycie trzy razy, w sumie 800 mililitrów buforu cysteiny lub do momentu, gdy jaja się zgromadzą i osiądą na dnie zlewki. Po usunięciu galaretki umyj jajka cztery razy w jednym litrze 0,2x roztworu MMR. Użyj szklanej pipety, aby zebrać i wyrzucić jaja, które stają się białe.

Wylej bufor MMR ze zlewki i dodaj 200 mililitrów roztworu jonoforu wapnia do jaj. Za pomocą szklanej pipety delikatnie wymieszaj jajka, aż zostaną aktywowane, a następnie usuń roztwór jonoforu wapnia. Pozostawienie jaj w roztworze jonoforu wapnia zbyt długo zainicjuje apoptozę.

Mieszamy jajka przez 1,5 minuty i sprawdzamy skuteczność aktywacji. Jeśli nie są aktywowane, wznów mieszanie i sprawdzaj częściej, aż zostanie osiągnięta 90% aktywacja. Po tym, jak jaja osiądą na dnie zlewki, sprawdź skuteczność aktywacji.

Dobrze aktywowane jaja mają około 25% bieguna zwierzęcego i 75% bieguna roślinnego. Następnie dwukrotnie umyj jaja łączną objętością 50 mililitrów buforu ekstraktu uzupełnionego inhibitorami proteazy. Następnie ostrożnie przenieś jajka do mikroprobówki zatrzaskowej o pojemności 0,4 mililitra.

Wirować mikroprobówkę przez 60 sekund przy 200 g, a następnie przy 600 g przez 30 sekund, aby zapakować jaja. Następnie użyj szklanej pipety Pasteura, aby usunąć nadmiar buforu z jaj po każdym kroku. Następnie zmiażdż jajka w temperaturze 15 000 g przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza.

Użyj żyletki, aby przeciąć rurki, aby oddzielić trzy warstwy zmiażdżonych jaj i utrzymać surową cytoplazmę w środkowej warstwie. Następnie przenieś surową cytoplazmę do czystych probówek ultrawirówek. Uzupełnij cytoplazmę inhibitorami proteazy i cytochalazyną B w dawce 10 mikrogramów na mililitr każdy.

Wirować surową cytoplazmę w temperaturze 15 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie użyj żyletki, aby przeciąć rurkę i utrzymać cytoplazmę w środkowej warstwie. Umieść świeżo przygotowane ekstrakty na lodzie.

Najpierw dodaj mRNA securin-mCherry do przygotowanych ekstraktów. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 2% fluorosurfaktantu PFPE-PEG do mieszaniny ekstraktu mRNA. Użyj miksera wirowego, aby wygenerować kropelki, dostosowując prędkość i czas trwania wiru w razie potrzeby.

Następnie sprawdź wzrokowo kropelki, aby upewnić się, że mają jednolitą wielkość. Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów przenieś unoszące się na wierzchu kropelki i równą objętość środka powierzchniowo czynnego do probówki PCR. Zanurz szklaną rurkę w warstwie kropel i poczekaj, aż kropelki wypełnią około 75% probówki.

Następnie wepchnij rurkę w warstwę środka powierzchniowo czynnego i całkowicie napełnij rurkę. Następnie napełnij naczynie ze szklanym dnem olejem mineralnym. Następnie za pomocą cienkiej pęsety zanurz rurkę wypełnioną kropelkami w oleju.

Użyj szklanej pipety, aby usunąć wszelkie widoczne zanieczyszczenia lub wyciekające kropelki. Aby uniknąć przemieszczania się i wycieku kropel, szklaną rurkę wypełnioną kropelkami należy ostrożnie zanurzyć pod olejem mineralnym. Możemy albo popchnąć rurkę na obu końcach z równowagą, albo najpierw dodać kilka kropel oleju mineralnego na końce tubki.

Następnie użyj mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w zmotoryzowany stolik xy, aby zobrazować kropelki. Nagrywaj filmy poklatkowe w jasnym polu i wielu kanałach fluorescencyjnych co sześć do dziewięciu minut, aż kropelki stracą swoją aktywność. Za pomocą tego protokołu wyprodukowano oscylacje mitotyczne zarówno w prostych, bezjądrowych komórkach, jak i skomplikowanych komórkach z jądrami.

Kropelki pozbawione jąder wygenerowały oscylacje mitotyczne do 30 nietłumionych cykli w ciągu 92 godzin. Zbadano również zdolność oscylatora mitotycznego do kierowania dalszymi zdarzeniami mitotycznymi. Samopodtrzymujący się oscylator mitotyczny napędzał zmiany morfologii jądrowej obserwowane poprzez autonomiczną zmianę różnych faz cyklu komórkowego.

Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, aby pamiętać o czasie podczas przygotowywania ekstraktu, ponieważ jest on wrażliwy na czas i zawsze trzymać jajka i ekstrakt na lodzie. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią systemową do zbadania podstawowych zasad złożonych właściwości zegara, takich jak przestrajalność i stochastyczność u Xenopus laevis.