Rekonstrukcja oscylacji cyklu komórkowego w mikroemulsjach bezkomórkowych ekstraktów jajowych Xenopus
27 września 2018
Prezentujemy metodę generowania in vitro samopodtrzymujących się oscylacji mitotycznych na poziomie pojedynczej komórki poprzez kapsułkowanie ekstraktów jajecznych Xenopus laevis w mikroemulsjach typu woda w oleju.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii systemowej, takie jak mechanizm regulujący sieć mitotyczną oraz dynamiczne właściwości i funkcje zegara cyklu komórkowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że wygeneruje ona dużą ilość kropel z wieloma cyklami komórkowymi w każdej, zapewniając nam wysokowydajne ramy do ilościowej manipulacji i analizy. Na początek wyrzuć partie jaj, które mają niejasne granice między biegunami zwierzęcymi i roślinnymi lub nieregularne białe plamy na słupach zwierzęcych.
Następnie wybierz odpowiednią partię jaj od jednej samicy żaby i przenieś jaja do 600-mililitrowej zlewki. Wylej nadmiar 0,2x buforu MMR i delikatnie dodaj cysteinę w 1x buforze ekstraktu do jaj. Następnie energicznie potrząśnij ręcznie zlewką, aby usunąć galaretki z jaj.
Powtórz to mycie trzy razy, w sumie 800 mililitrów buforu cysteiny lub do momentu, gdy jaja się zgromadzą i osiądą na dnie zlewki. Po usunięciu galaretki umyj jajka cztery razy w jednym litrze 0,2x roztworu MMR. Użyj szklanej pipety, aby zebrać i wyrzucić jaja, które stają się białe.
Wylej bufor MMR ze zlewki i dodaj 200 mililitrów roztworu jonoforu wapnia do jaj. Za pomocą szklanej pipety delikatnie wymieszaj jajka, aż zostaną aktywowane, a następnie usuń roztwór jonoforu wapnia. Pozostawienie jaj w roztworze jonoforu wapnia zbyt długo zainicjuje apoptozę.
Mieszamy jajka przez 1,5 minuty i sprawdzamy skuteczność aktywacji. Jeśli nie są aktywowane, wznów mieszanie i sprawdzaj częściej, aż zostanie osiągnięta 90% aktywacja. Po tym, jak jaja osiądą na dnie zlewki, sprawdź skuteczność aktywacji.
Dobrze aktywowane jaja mają około 25% bieguna zwierzęcego i 75% bieguna roślinnego. Następnie dwukrotnie umyj jaja łączną objętością 50 mililitrów buforu ekstraktu uzupełnionego inhibitorami proteazy. Następnie ostrożnie przenieś jajka do mikroprobówki zatrzaskowej o pojemności 0,4 mililitra.
Wirować mikroprobówkę przez 60 sekund przy 200 g, a następnie przy 600 g przez 30 sekund, aby zapakować jaja. Następnie użyj szklanej pipety Pasteura, aby usunąć nadmiar buforu z jaj po każdym kroku. Następnie zmiażdż jajka w temperaturze 15 000 g przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza.
Użyj żyletki, aby przeciąć rurki, aby oddzielić trzy warstwy zmiażdżonych jaj i utrzymać surową cytoplazmę w środkowej warstwie. Następnie przenieś surową cytoplazmę do czystych probówek ultrawirówek. Uzupełnij cytoplazmę inhibitorami proteazy i cytochalazyną B w dawce 10 mikrogramów na mililitr każdy.
Wirować surową cytoplazmę w temperaturze 15 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie użyj żyletki, aby przeciąć rurkę i utrzymać cytoplazmę w środkowej warstwie. Umieść świeżo przygotowane ekstrakty na lodzie.
Najpierw dodaj mRNA securin-mCherry do przygotowanych ekstraktów. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 2% fluorosurfaktantu PFPE-PEG do mieszaniny ekstraktu mRNA. Użyj miksera wirowego, aby wygenerować kropelki, dostosowując prędkość i czas trwania wiru w razie potrzeby.
Następnie sprawdź wzrokowo kropelki, aby upewnić się, że mają jednolitą wielkość. Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów przenieś unoszące się na wierzchu kropelki i równą objętość środka powierzchniowo czynnego do probówki PCR. Zanurz szklaną rurkę w warstwie kropel i poczekaj, aż kropelki wypełnią około 75% probówki.
Następnie wepchnij rurkę w warstwę środka powierzchniowo czynnego i całkowicie napełnij rurkę. Następnie napełnij naczynie ze szklanym dnem olejem mineralnym. Następnie za pomocą cienkiej pęsety zanurz rurkę wypełnioną kropelkami w oleju.
Użyj szklanej pipety, aby usunąć wszelkie widoczne zanieczyszczenia lub wyciekające kropelki. Aby uniknąć przemieszczania się i wycieku kropel, szklaną rurkę wypełnioną kropelkami należy ostrożnie zanurzyć pod olejem mineralnym. Możemy albo popchnąć rurkę na obu końcach z równowagą, albo najpierw dodać kilka kropel oleju mineralnego na końce tubki.
Następnie użyj mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w zmotoryzowany stolik xy, aby zobrazować kropelki. Nagrywaj filmy poklatkowe w jasnym polu i wielu kanałach fluorescencyjnych co sześć do dziewięciu minut, aż kropelki stracą swoją aktywność. Za pomocą tego protokołu wyprodukowano oscylacje mitotyczne zarówno w prostych, bezjądrowych komórkach, jak i skomplikowanych komórkach z jądrami.
Kropelki pozbawione jąder wygenerowały oscylacje mitotyczne do 30 nietłumionych cykli w ciągu 92 godzin. Zbadano również zdolność oscylatora mitotycznego do kierowania dalszymi zdarzeniami mitotycznymi. Samopodtrzymujący się oscylator mitotyczny napędzał zmiany morfologii jądrowej obserwowane poprzez autonomiczną zmianę różnych faz cyklu komórkowego.
Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, aby pamiętać o czasie podczas przygotowywania ekstraktu, ponieważ jest on wrażliwy na czas i zawsze trzymać jajka i ekstrakt na lodzie. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią systemową do zbadania podstawowych zasad złożonych właściwości zegara, takich jak przestrajalność i stochastyczność u Xenopus laevis.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę generowania in vitro samopodtrzymujących się oscylacji mitotycznych na poziomie pojedynczej komórki z wykorzystaniem ekstraktów z jaj Xenopus laevis zamkniętych w mikroemulsjach woda w oleju. Technika ta ma na celu pogłębienie naszej wiedzy na temat sieci mitotycznej oraz dynamiki cyklu komórkowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Biologia systemowa
- Biofizyka
Wstęp
- Zrozumienie mechanizmów regulujących sieć mitotyczną jest kluczowe.
- Zegary cyklu komórkowego odgrywają istotną rolę w procesach komórkowych.
- Do analizy ilościowej niezbędne są techniki wysokoprzepustowe.
- Jaja Xenopus laevis stanowią model do badania tych procesów.
Cel badania
- Opracowanie metody generowania oscylacji mitotycznych in vitro.
- Ułatwienie wysokoprzepustowej analizy dynamiki cyklu komórkowego.
- Zbadanie mechanizmów regulacyjnych sieci mitotycznej.
Zastosowane metody
- Enkapsulacja ekstraktów z jaj Xenopus laevis w mikroemulsjach.
- Przygotowanie jaj poprzez usunięcie otoczek galaretowatych.
- Zastosowanie buforu 0.2x MMR oraz cysteiny w procesie ekstrakcji.
- Intensywne wstrząsanie w celu zapewnienia prawidłowej ekstrakcji i enkapsulacji.
Główne wyniki
- Skuteczne generowanie kropel obejmujących wiele cykli komórkowych.
- Ustanowienie wysokoprzepustowego systemu analizy.
- Zdobycie wiedzy na temat dynamicznych właściwości zegara cyklu komórkowego.
- Potencjalne zastosowania w badaniu regulacji cyklu komórkowego.
Wnioski
- Ta metoda stanowi nowatorskie podejście do badania oscylacji mitotycznych.
- Umożliwia ona ilościową manipulację oraz analizę cykli komórkowych.
- Dalsze badania mogą opierać się na tych wynikach w celu zgłębienia biologii komórki.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten system sztucznych komórek oparty na kropelkach umożliwia wysokoprzepustową analizę oscylacji mitotycznych z rozdzielczością pojedynczej komórki, rozwiązując kluczowe ograniczenie testów z użyciem ekstraktów w masie, które są obarczone desynchronizacją i tłumieniem sygnałów. Dzięki utrzymaniu oscylacji przez ponad 30 cykli w przedziałach z ekstraktem z jaj Xenopus laevis, metoda ta zapewnia powtarzalną platformę do ilościowej manipulacji dynamiką cyklu komórkowego. Wspiera to walidację celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć, łącząc funkcję oscylatora z późniejszymi zdarzeniami mitotycznymi, takimi jak dynamika otoczki jądrowej i kondensacja chromosomów.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie aktywności oscylatora mitotycznego z wynikami fenotypowymi w kontrolowanym, regulowanym systemie.
- Wartość operacyjna: Zapewnia trwałe, synchroniczne oscylacje w tysiącach kropel, co redukuje szum i zwiększa moc statystyczną badań nad oddziaływaniem z celem.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia uzyskanie ilościowych, wielokanałowych odczytów fluorescencji oscylatora i procesów downstream, co pozwala na standaryzację testów w badaniach przesiewowych związków chemicznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera skalowalne formaty oparte na kropelkach, kompatybilne z automatyzacją i monitorowaniem zaburzeń cyklu komórkowego w czasie rzeczywistym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje wierność systemu istotną dla przebiegu choroby poprzez odtworzenie cykli składania i rozkładu jądra komórkowego, co wspiera dopasowanie biomarkerów do progresji mitozy.
- Wartość operacyjna: Ułatwia ciągłość badań przedklinicznych, umożliwiając podłużne śledzenie funkcji oscylatora i zdarzeń mitotycznych w poszczególnych przedziałach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi procesami badawczymi, zapewniając skalowalny, ilościowy odczyt funkcji oscylatora mitotycznego, co wspiera identyfikację związków wiodących oraz decyzje dotyczące rozwoju przedklinicznego dzięki dynamicznym danym o rozdzielczości pojedynczej komórki.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie korelacji w czasie rzeczywistym fazy oscylatora ze zmianami morfologii jądra.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne systemy o stabilnym sygnale oscylacyjnym, odpowiednie do przesiewania bibliotek związków.
- Analityka: Zapewnia wieloparametryczne pomiary poklatkowe amplitudy, okresu i synchronizacji oscylatora do analizy porównawczej różnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną poprzez wierne odtworzenie zdarzeń mitotycznych następujących po działaniu oscylatora.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę mikrofluidyczną do iteracyjnej optymalizacji związków modulujących cykl komórkowy w ramach różnych projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez oddzielenie zachowania oscylatora w pojedynczej komórce od artefaktów wynikających z uśredniania populacyjnego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację i powtarzalność dzięki jednorodności kropel oraz kontrolowanemu składowi ekstraktu.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go poprzez powiązanie modulacji celu z dynamicznymi wynikami fenotypowymi w formacie wysokoprzepustowym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez kwantyfikację wpływu związków na stabilność oscylatora i następującą po niej progresję mitotyczną.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowaniu ekstraktu z jaj Xenopus oraz w generowaniu kropli mikrofluidycznych.
- Zależne od dostępu do mieszadeł wiorkowych (vortex), mikroskopów fluorescencyjnych z zmotoryzowanymi stolikami oraz możliwości obrazowania wielokanałowego.
- Wymaga standaryzacji jakości ekstraktu i stężeń surfaktantów w poszczególnych partiach w celu zapewnienia spójnych oscylacji.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy wprowadzaniu jąder komórkowych lub innych komponentów subkomórkowych w celu modelowania zwiększonej złożoności.
- Ograniczone przez wrażliwość aktywności ekstraktu na czas oraz konieczność przechowywania próbek w lodzie w celu zachowania ich funkcjonalności.
