Name: Rekonstrukcja oscylacji cyklu komórkowego w mikroemulsjach bezkomórkowych ekstraktów jajowych Xenopus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Poznaj metodę rekonstrukcji oscylacji mitotycznych w mikroemulsjach z ekstraktów jajowych Xenopus laevis. Technika umożliwia badanie dynamiki cyklu komórkowego i sieci mitotycznej w skali wysokoprzepustowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Madeleine Lu za skonstruowanie plazmidu securin-mCherry, Lap Man Lee, Kenneth Ho i Allen P Liu za dyskusje na temat generowania kropel, Jeremy'emu B. Changowi i Jamesowi E. Ferrellowi Jr za dostarczenie konstrukcji GFP-NLS. Prace te były wspierane przez National Science Foundation (Early CAREER Grant #1553031), National Institutes of Health (MIRA #GM119688) oraz Sloan Research Fellowship.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Michigan.
1. Przygotowanie materiałów do rekonstytucji i detekcji cyklu komórkowego
<ol>
	<li>Klonowanie zespołu Gibsona w celu budowy plazmidowego DNA i oczyszczania mRNA securin-mCherry
	<ol>
		<li>Przygotuj trzy fragmenty DNA, w tym szkielet wektora pMTB2, sekurynę i mCherry poprzez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) i oczyszczanie żelu21,22.</li>
		<li>Zmierzyć stężenia fragmentów za pomocą fluorospektrometru. Połącz 100 ng szkieletu z wkładkami sekuryny i mCherry w stosunku molekularnym 1:1:1 i dodaj wodę dejonizowaną, aby dostosować całkowitą objętość reakcji do 5 μl.</li>
		<li>Przygotuj 6 ml 5x buforu reakcyjnego zespołu izotermicznego z 3 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 300 μL 1 M MgCl2, 600 μL 10 mM dNTP, 300 μL 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000 i 20 mg NAD23.</li>
		<li>Dodać połączone fragmenty do 15 μl 1x podwielokrotności buforu reakcyjnego zespołu izotermicznego. Inkubować reakcję w probówce reakcyjnej do PCR w temperaturze 50 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Przygotuj 0,8% żel agarozowy i uruchom pod napięciem 10 V/cm, aby sprawdzić skuteczność wyżarzania tych fragmentów.</li>
		<li>Oczyść zbudowany plazmid i eluuj za pomocą 15 μl wody wolnej od RNaz. Przekształć 1 μl oczyszczonego plazmidowego DNA w 50 μl komórek E. coli kompetentnych DH5α24 do wykorzystania w przyszłości.</li>
		<li>Ekstrahuj i oczyść plazmidowe DNA securin-mCherry z komórek E. coli kompetentnych DH5α.</li>
		<li>Transkrybuj zlinearyzowane DNA plazmidu sekuryny-mCherry na mRNA i oczyść mRNA. Za pomocą spektrofotometru sprawdzić, czy stężenie mRNA przekracza 100 ng/μl, a stosunek absorbancji przy 260 nm i 280 nm wynosi około 2,0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zdemembranowanego DNA plemnika Xenopus laevis<br />
	UWAGA: Na podstawie Murray 19911.
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji dorosłego samca Xenopus laevis25 i wypreparuj jądra czterech samców żab26,27.</li>
		<li>Umieść jądra czterech żab na tej samej 100 ml szalce Petriego. Przepłukać jądra trzykrotnie w 50 ml zimnego roztworu 1x MMR (0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA).</li>
		<li>Usunąć nadmiar krwi i tłuszczu z jąder na 100 ml szalki Petriego, a następnie przemyć dwukrotnie w zimnym buforze do przygotowania jądrowego (NPB) (250 mM sacharozy, 15 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,5 mM trichlorowodorku spermidyny, 0,2 mM tetrachlorowodorku sperminy).</li>
		<li>Usunąć bufor do przygotowania jądra (NPB) i pokroić jądra na kawałki o długości mniejszej niż 0,2 cm za pomocą ostrych nożyczek preparacyjnych na 100 ml szalki Petriego. Dodaj 8 ml zimnego NPB do jąder w celu dalszego rozkładu.</li>
		<li>Użyj nylonowych tkanin siatkowych o wielkości porów 70 μm, aby przefiltrować jądra i pobrać próbkę nasienia do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odkręcać zebrane plemniki w temperaturze 1 730 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.</li>
		<li>Dostarczyć plemnikom 1 ml NPB i 50 μl lizolecytyny 10 mg/ml i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut w celu demembranacji plemników.</li>
		<li>Przemyj zdemembranowane DNA plemników 10 ml zimnego NPB z 3% roztworem BSA trzy razy.</li>
		<li>Zmierz gęstość DNA plemników za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Zamrozić DNA plemników w 5 μl porcji w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Optymalne stężenie DNA plemników wynosi około 105 jąder/μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie białek z sygnału lokalizacji jądrowej GFP (GFP-NLS)
	<ol>
		<li>Przekształć plazmid GFP-NLS oznaczony GST w kompetentne komórki E. coli BL21 (DE3)5.</li>
		<li>Inkubować komórki bez antybiotyków w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie rozprowadzić na płytce z agarozą LB ze 100 μg/ml ampicyliny.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 14-18 godzin, aby wyhodować komórki w pojedyncze kolonie. Pobrać i zaszczepić pojedyncze kolonie w 4 ml pożywki LB ze 100 μg/ml ampicyliny. Wstrząsać komórkami w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.</li>
		<li>Przygotować autoklawowane podłoże YT (16 g bakto-tryptonu, 10 g ekstraktu bakto-drożdżowego, 5 g NaCl) i podgrzać podłoże YT do 37 °C.</li>
		<li>Zaszczepić 1 ml inkubowanych przez noc komórek w pożywce LB w 250 ml podgrzanej pożywki YT ze 100 μg/ml ampicyliny i wstrząsać przez 2 godziny w celu zwiększenia gęstości komórek.</li>
		<li>Mierz gęstość optyczną komórki (OD) co 30 minut za pomocą spektrofotometru o długości fali 600 nm. Dodaj 0,1 mM IPTG do komórek, aby indukować ekspresję białka GFP-NLS, gdy wartość OD osiągnie 0,1.</li>
		<li>Wstrząśnij komórkami w temperaturze 18 °C przez noc, aby zmniejszyć tempo wzrostu komórek i umożliwić lepszą ekspresję i syntezę białek.</li>
		<li>Wirować komórki w temperaturze 34,524 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osady komórkowe w 40 ml buforu PBS (dostarczanym z 800 μl lizozymu 50 mg/mL, 100 μl 0,2 M PMSF, 13,2 μl mieszaniny leupeptyny, pepstatyny i chymostatyny 10 mg/ml oraz 8 μl 0,5 M EDTA) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Rozbij komórki za pomocą sonikatora o częstotliwości 20 kHz przez 4 x 30 s, z 30-sekundowymi przerwami między każdą sonikacją, aby uwolnić ekspresję białka GFP-NLS.</li>
		<li>Wiruj w 20 000 x g przez 35 minut, aby usunąć uszkodzone komórki.</li>
		<li>Użyj chromatografii powinowactwa do ekstrakcji i oczyszczenia białka GFP-NLS.</li>
		<li>Przemyć zawiesinę z kulkami o objętości 1,5 ml trzykrotnie 15 ml buforu PBS i inkubować 250 ml lizatu z kulkami przez 4 godziny w temperaturze 4 °C z odwróceniem.</li>
		<li>Odkręć kulki o masie 2000 x g przez 5 minut i dodaj 10 ml roztworu myjącego (25 mM zasady Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl i 5 mM DTT) do kulek. Inkubować kulki w 700 μl buforu elucyjnego (50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20 mM zredukowanego glutationu i 5 mM DTT) z rotacją w temperaturze 4 °C. Zebrać podwielokrotność elucji o objętości 50 μL.</li>
		<li>Zmierz stężenie zebranego białka, uruchamiając Coomassie blue gel28.</li>
		<li>Eluować białka za pomocą kolumn PD-10 z 3 ml buforu magazynującego (20 mM HEPES, 150 mM KCl, 10% glicerolu, pH 7,7) poprzez wymianę buforową.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie cyklicznych ekstraktów z Xenopus
UWAGA: Ogólna procedura przygotowania ekstraktów jest zilustrowana w Rysunek 1A. Na podstawie Murray 19911.
<ol>
	<li>Wstrzyknąć trzem dojrzałym samicom Xenopus laevis gonadotropinę surowicy ciężarnej klaczy o stężeniu 66 j.m. (PMSG) na 10 dni przed złożeniem jaj.</li>
	<li>Wstrzyknij tym żabom Xenopus 500 IU ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (HCG) w celu wywołania składania jaj na 18 godzin przed przygotowaniem ekstraktów rowerowych.</li>
	<li>Wyrzuć złożone jaja na noc. Na podstawie eksperymentów (dane nie pokazane), ekstrakty przygotowane ze świeżo wyciśniętych jaj generują długotrwałą aktywność niż ekstrakty przygotowane ze złożonych jaj tej samej samicy żaby. Wyciśnij jaja każdej samicy żaby na 100-milimetrowe szalki Petriego zawierające 10 ml 0,2-krotnego buforu MMR i zbadaj pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Wyrzuć partie jaj, które mają niejasne granice między biegunami zwierzęcymi i roślinnymi lub mają nieregularne białe plamy na słupach zwierzęcych.</li>
	<li>Wybrać partię jaj od jednej samicy żaby prezentującej jednorodną populację jaj z wyraźnie zróżnicowanymi biegunami zwierzęcymi i roślinnymi i przenieść jaja do zlewki o pojemności 600 ml.</li>
	<li>Wylej nadmiar 0,2x buforu MMR i delikatnie dodaj 250 ml 2 g na 100 ml cysteiny (pH 7,7) do 1x buforu ekstraktu (100 mM KCl, 0,1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 50 mM sacharozy, pH 7,7) do jaj.</li>
	<li>Energicznie potrząśnij jajami ręcznie i usuń galaretki z jaj podczas trzech myć o łącznej objętości 800 ml buforu cysteinowego przez 3 minuty lub do momentu, gdy jaja zgromadzą się i osiądą na dnie zlewki, co wskazuje, że usunięcie galaretki zakończyło się pomyślnie.</li>
	<li>Umyj jajka 1 litrem 0,2x roztworu MMR ponad cztery razy.</li>
	<li>Zbieraj i wyrzucaj jaja, które stają się białe, za pomocą szklanej pipety transferowej.</li>
	<li>Wylać bufor MMR i dostarczyć jajom 200 ml 0,1 μg/ml roztworu jonoforu wapnia A23187 w 0,2 buforze MMR w celu aktywacji.</li>
	<li>Użyj szerokiej strony szklanej pipety, aby delikatnie wymieszać jajka, aż jaja zostaną aktywowane i usuń roztwór jonoforu wapnia.</li>
	<li>Sprawdź skuteczność aktywacji po tym, jak jaja osiądą na dnie zlewki. Dobrze aktywowane jaja mają około 25% bieguna zwierzęcego i 75% bieguna roślinnego.</li>
	<li>Umyj aktywowane jaja dwukrotnie 50 ml 1x buforu ekstraktu uzupełnionego inhibitorami proteazy (po 10 μg / ml leupeptyny, pepstatyny i chymostatyny).</li>
	<li>Ostrożnie przenieś jaja do mikroprobówki zatrzaskowej o pojemności 0,4 ml, a następnie zapakuj jaja przez wirowanie w temperaturze 200 x g przez 60 sekund, a następnie 600 x g przez 30 sekund.</li>
	<li>Usuń dodatkowy bufor z wierzchu jaj za pomocą szklanej pipety Pasteura, aby zmniejszyć rozcieńczenie ekstraktów.</li>
	<li>Rozdrabniać jajka w temperaturze 15 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przetnij rurki żyletką, aby oddzielić trzy warstwy zmiażdżonych jaj i utrzymać surową cytoplazmę w środkowej warstwie.</li>
	<li>Przenieś surową cytoplazmę do nowych probówek ultrawirówkowych i uzupełnij inhibitorami proteazy i cytochalazyną B w stężeniu 10 μg/ml każdy.</li>
	<li>Ponownie odwirować surową cytoplazmę w temperaturze 15 000 x g w temperaturze 4 ° C przez 5 minut, aby dalej oczyścić cytoplazmę poprzez usunięcie nadmiaru lipidów i żółtka.</li>
	<li>Świeżo przygotowane ekstrakty należy przechowywać na lodzie.</li>
</ol>
3. Generowanie kropel
<ol>
	<li>Przygotowanie szklanej komory 2D 
	UWAGA: Prostokątne szklane rurki służą jako komory, które ograniczają kropelki w jednej 2-wymiarowej płaszczyźnie, co pozwala na łatwiejszą obserwację i zbieranie danych.
	<ol>
		<li>Pokrój prostokątne rurki szklane o wymiarze wewnętrznym 2 mm x 100 μm na kawałki o długości 4 mm. Użyj ostrej krawędzi osełki, zaznacz żądane granice na zewnętrznej powierzchni szklanej rurki za pomocą lekkich wytrawień, a następnie delikatnie dociśnij po obu stronach wytrawień, aby odłamać kawałki szklanych rurek.</li>
		<li>Podgrzej inkubator w suchej kąpieli do temperatury 95 °C. Wyjmij blok grzewczy i umieść go w eksykatorze próżniowym z poliwęglanu.</li>
		<li>Umieścić 1,5 ml probówki mikrowirówkowej zawierającej 30 μl trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanu w bloku grzewczym. Pocięte szklane rurki umieścić wewnątrz eksykatora próżniowego na wysokości około 5 cm od bloku grzewczego.</li>
		<li>Podłączyć eksykator do pompy próżniowej. Włącz pompę na 1 minutę, aby osiągnąć żądany poziom próżni, a następnie zamknij zawór 3-drogowy, aby uszczelnić eksykator i pozwól, aby para trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan pokryła wewnętrzną ściankę szklanych rurek. Stworzy to hydrofobowe środowisko do stabilizacji kropel.</li>
		<li>Pozostawić szklane probówki wewnątrz eksykatora w celu powlekania przez noc. Probówki będą gotowe do użycia następnego dnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie kropelek i obrazowanie 
	UWAGA: Procedury generowania kropel i obrazowania zilustrowano na rysunkach 1B i 1C.
	<ol>
		<li>Dostarcz ekstrakty przygotowane w kroku 2 z 10 ng/μl mRNA securin-mCherry do prostych eksperymentów z cyklem komórkowym tylko cytoplazmatycznym. Alternatywnie, podaj ekstrakty z demembranowaną chromatyną plemnika (250 na μl ekstraktu), 10 μM GFP-NLS białka i 10 ng/μL mRNA securin-mCherry, aby utworzyć kropelki wykazujące okresowe zmiany morfologii jąder.</li>
		<li>W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml wymieszaj 20 μl ekstraktu zaopatrzonego w rekombinowane białko lub mRNA z 200 μl 2% fluorosurfaktantu perfluoropolieterowo-glikolu polietylenowego (PFPE-PEG) w HFE7500 oleju fluorowanym.</li>
		<li>Generuj kropelki za pomocą miksera wirowego. Zakres rozmiarów kropel może być modulowany przez prędkość i czas trwania wiru. Aby wytworzyć kropelki o promieniu od 50 do 200 μm, należy ustawić prędkość wiru na 56 x g (3 200 obr./min przy promieniu 4,9 mm) i delikatnie docisnąć probówkę do mikrowirówki zawierającą mieszaninę ekstraktu i środka powierzchniowo czynnego na mieszalniku przez 3,5 sekundy. Sprawdź wzrokowo, czy kropelki są jednakowej wielkości.</li>
		<li>Za pomocą pipety o pojemności 20 μl przenieś unoszące się na wierzchu kropelki i równą objętość środka powierzchniowo czynnego PFPE-PEG do probówki PCR. Zanurz przygotowaną przez schodek rurkę w warstwie kropelek w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i poczekaj, aż kropelki wypełnią około 75% probówki, a następnie wepchnij probówkę w dół do warstwy środka powierzchniowo czynnego, aż probówka zostanie całkowicie napełniona. Obniży to gęstość kropel i pozwoli kropelkom uformować jedną warstwę wewnątrz komory bez nakładania się lub zniekształceń kształtu spowodowanych przepełnieniem.</li>
		<li>Napełnij naczynie ze szklanym dnem o średnicy 40 mm olejem mineralnym. Zanurz rurki wypełnione kropelkami w oleju, delikatnie dociskając je w dół za pomocą drobnej pęsety.</li>
		<li>Po załadowaniu wszystkich próbek użyj szklanej pipety, aby usunąć wszelkie widoczne zanieczyszczenia lub wyciekające kropelki. Dodaj więcej oleju mineralnego, jeśli rurki nie są lub nie będą całkowicie zanurzone w procesie obrazowania.</li>
		<li>Przeprowadzić obrazowanie kropel na mikroskopie epifluorescencyjnym wyposażonym w zmotoryzowany stolik x-y (patrz tabela materiałów). Używaj obiektywu pneumatycznego 4X do wszystkich rodzajów obrazowania. Do obrazowania fluorescencyjnego należy użyć lampy rtęciowej o krótkim łuku o mocy 130 W jako fluorescencyjnego źródła światła do oświetlenia oraz zestawu filtrów GFP (wzbudzenie 482/35 nm i emisja 514/LP nm) i zestawu filtrów mCherry (wzbudzenie 562/40 nm i emisja 641/75 nm) do obrazowania sygnałów GFP-NLS i securin-mCherry.</li>
		<li>Nagrywaj filmy poklatkowe w jasnym polu i wielu kanałach fluorescencyjnych co 6 do 9 minut, aż kropelki stracą swoją aktywność.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przetwarzanie obrazów i analiza danych
<ol>
	<li>Segmentacja i śledzenie kropel
	<ol>
		<li>Importuj zarejestrowane dane w formacie ".tif" lub ".oif" do oprogramowania do analizy obrazu (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Segmentuj pojedyncze krople za pomocą kanału jasnego pola. Obraz w jasnym polu pokaże kropelki jako jasne koła z ciemnymi granicami. Zastosuj progi do obrazu. Dodaj powierzchnię śledzenia do każdej kropli, dostrajając próg między ciemnymi i jasnymi pikselami tak, aby każda powierzchnia obejmowała cały obszar odpowiedniej kropli.</li>
		<li>Automatycznie śledź segmenty między sąsiednimi klatkami za pomocą algorytmu ruchu autoregresyjnego. Dostosuj dopuszczalną maksymalną odległość przemieszczania się kropli między dwiema sąsiednimi klatkami, aby była mniejsza niż promień większości kropel, aby dokładnie śledzić małe kropelki.</li>
		<li>Sprawdź wizualnie wszystkie ścieżki w całym filmie, aby wykryć nieprawidłowe segmentacje, które segmentują pustą przestrzeń między kroplami zamiast rzeczywistych kropel. Ręcznie usuń nieprawidłowe ścieżki.</li>
		<li>Segmentuj i śledź obszar tła bez żadnych kropel, aby uzyskać intensywność fluorescencji tła. Aby poprawić stosunek sygnału do szumu, odejmij intensywność tła od intensywności fluorescencji kropel w każdej klatce czasowej.</li>
		<li>Eksportuj zmierzone parametry dla każdej ścieżki w czasie, w tym średnią i odchylenie standardowe intensywności fluorescencji oraz obszar kropli, do plików ".csv".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych dotyczących wielkości kropli i okresu oscylacji
	<ol>
		<li>Załaduj pliki ".csv" do R, aby utworzyć wykresy intensywności fluorescencji w czasie dla każdej kropli. Zapisz identyfikator kropli w pliku ".csv".</li>
		<li>Zaimportuj pliki ".csv" wyeksportowane z oprogramowania analitycznego oraz plik ".csv" z listą identyfikatorów kropli do Matlaba i zapisz jako pliki ".mat" w celu dalszej analizy danych.</li>
		<li>Oblicz objętość skompresowanej kropli na podstawie informacji o wyeksportowanym obszarze kropli po segmentacji i wysokości szklanej komory19. Użyj objętości, aby obliczyć promień kropli jako kuli.</li>
		<li>Wyodrębnij punkty czasowe szczytów i minimów za pomocą algorytmu wykrywania szczytu/minimum. Wykonuj ręczne korekty położenia szczytów i dołków, aby upewnić się, że są one dokładnie wykrywane.</li>
		<li>Aby obliczyć okres cyklu komórkowego, oblicz czas interwału między dwoma sąsiednimi pikami. Weź średnią ze wszystkich przedziałów dla każdej kropli jako okres cyklu komórkowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1839804">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li>
<li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li>
<li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cdk1-APC%2FC+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed%2C+ultrasensitive+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li>
<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li>
<li>Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitivity+in+the+Regulation+of+Cdc25C+by+Cdk1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1.</a> Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).</li>
<li>Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+competition+as+a+source+of+ultrasensitivity+in+the+inactivation+of+Wee1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1.</a> Cell. 128, 1133-1145 (2007).</li>
<li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator%3A+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li>
<li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+cell+cycle+oscillator%3A+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li>
<li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li>
<li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li>
<li>Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Oscillatory+Dynamics+in+the+Cell+Cycle+of+Early+Xenopus+laevis+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos.</a> PLoS Biology. 12, e1001788(2014).</li>
<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li>
<li>Yang, Q., Ferrell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cdk1-APC%2FC+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed%2C+ultrasensitive+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li>
<li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claspin%2C+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).</li>
<li>Chen, R. H., Murray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).</li>
<li>Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+spindle+assembly+checkpoint+component+XMAD2+with+unattached+kinetochores%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores.</a> Science. 274, 242-246 (1996).</li>
<li>Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MAP+kinase-dependent+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 79, 475-486 (1994).</li>
<li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Volume+Modulates+Spindle+Size+During+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis.</a> Science. 342, 856-860 (2013).</li>
<li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342, 853-856 (2013).</li>
<li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4102308/">Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6(2013).</li>
<li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20, 478-485 (1996).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6, 343-345 (2009).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. 6, e253(2007).</li>
<li>Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+refinement+of+euthanasia+methods+for+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Xenopus+laevis+Testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating Xenopus laevis Testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007, pdb.prot4735 (2007).</li>
<li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+Collection+and+In+vitro+Fertilization+of+the+Western+Clawed+Frog+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li>
<li>Wilson, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+CM+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 91, Academic Press. 236-247 (1983).</li>
<li>Schutze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).</li>
<li>Weitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+the+dynamical+behaviour+of+a+compartmentalized+programmable+biochemical+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator.</a> Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).</li>
<li>Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+with+poly%28vinyl%29+alcohol+surfactant+reduces+double+emulsion-encapsulated+mammalian+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression.</a> PloS One. 12, e0174689(2017).</li>
<li>Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+circadian+oscillation+of+cyanobacterial+KaiC+phosphorylation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro.</a> Science. 308, 414-415 (2005).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> eLife. 7, (2018).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Przedstawiliśmy nowatorską metodę opracowania wysokoprzepustowego systemu sztucznej komórki, który umożliwia rekonstytucję in vitro i długoterminowe śledzenie samopodtrzymujących się oscylacji cyklu komórkowego na poziomie pojedynczej komórki. Istnieje kilka krytycznych kroków, które sprawiają, że ta metoda jest skuteczna. Po pierwsze, świeżo wyciśnięte jaja Xenopus o dobrej jakości, w porównaniu z jajami złożonymi, mają tendencję do wytwarzania ekstraktów o długotrwałej aktywności oscylacyjnej. Po drug...

Ekstrakty cytoplazmatyczne przygotowane z jaj Xenopus laevis stanowią jeden z najbardziej dominujących modeli do biochemicznych badań cykli komórkowych, biorąc pod uwagę dużą objętość oocytów, szybki postęp cyklu komórkowego i zdolność do odtwarzania zdarzeń mitotycznych in vitro1,2. System ten pozwolił na wstępne odkrycie i mechanistyczną charakterystykę podstawowych regulatorów cyklu komórkowego, takich jak czynnik sprzyjający dojrzewaniu (MPF), a także dalsze procesy mitotyczne, w tym składanie wrzeciona i segregacja chromosomów1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Ekstrakty z jaj Xenopus zostały również wykorzystane do szczegółowej analizy sieci regulacyjnych cyklu komórkowego clock8,12,13,14 oraz do badań punktu kontrolnego uszkodzenia/replikacji DNA15 oraz punktu kontrolnego zespołu wrzeciona mitotowego16,17,18.
Te badania cykli komórkowych z użyciem ekstraktów z jaj Xenopus opierały się głównie na pomiarach masowych. Jednak konwencjonalne masowe testy reakcji mogą nie naśladować rzeczywistych zachowań komórek, biorąc pod uwagę dużą rozbieżność w ich wymiarach i subkomórkowym przestrzennym podziale cząsteczek reakcyjnych. Co więcej, masowe pomiary aktywności mitotycznej mają tendencję do podawania ograniczonej liczby cykli przed szybkim tłumieniem8. Te wady reakcji masowych uniemożliwiły systemowi ekstrakcji dalsze zrozumienie złożonych właściwości i funkcji dynamicznych zegara. Ostatnie badania zamknęły bezkomórkowe ekstrakty Xenopus z zatrzymanym czynnikiem cytostatycznym (CSF)19,20 w zdefiniowanych rozmiarach przedziałach przypominających komórki, co pomogło wyjaśnić, w jaki sposób rozmiar wrzeciona jest modulowany przez objętość cytoplazmatyczną. Jednak ten system in vitro jest zatrzymywany w metafazie mejozy II przez działanie czynnika cytostatycznego1, a do dalszych badań oscylatora cyklu komórkowego potrzebny jest system zdolny do długotrwałych, utrzymujących się oscylacji na poziomie pojedynczej komórki.
Aby badać oscylacje cyklu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki, opracowaliśmy wysokoprzepustowy system do rekonstytucji i jednoczesnego pomiaru wielu samopodtrzymujących się mitotycznych procesów oscylacyjnych w pojedynczych kropelkach mikroemulsji. W tym szczegółowym protokole wideo demonstrujemy tworzenie sztucznego systemu oscylacji mitotycznych poprzez enkapsulację cyklicznej cytoplazmy jaj Xenopus laevis w mikroemulsjach o rozmiarach od 10 do 300 μm. W tym systemie udało się odtworzyć oscylacje mitotyczne, w tym kondensację i dekondensację chromosomów, rozpad i reformację otoczki jądrowej oraz degradację i syntezę substratów anafazowych (np. securyny-mCherry w tym protokole).

<table><tbody><tr><td>Xenopus laevis żaby</td><td>Xenopus-I Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep spin miniprep zestaw do miniprep</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcji</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3)-T-1 kompetentna komórka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2935</td><td></td></tr><tr><td>Jonofor wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A23187</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>Trichloro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>Toksyczny</td></tr> <tr><td>(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFPE-PEG Środek powierzchniowo czynny Ran</td><td>Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfaktant-2wtH-50G</td><td></td></tr><tr><td>GE Opieka zdrowotna Glutation Sepharose 4B koraliki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna PD-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>VitroCom miniaturowe rurki szklane VitroCom</td><td>VitroCom</td><td>5012</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Olympus SZ61</td><td>Mikroskop Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX83</td><td>Mikroskop</td> konfokalny Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV1200</td><td>Spektrofotometr Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermofisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>0,4 ml mikroprobówki typu snap-cap</td><td>E& K Scientific</td><td>485050-B</td><td></td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit</td><td>ThermoFisher (Ambion)</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Analogowy mikser wirowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>w wersji 7.3</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr></tbody></table>

rekonstrukcja oscylacji cyklu komórkowego w mikroemulsjach bezkomórkowych ekstraktów jajowych xenopus

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Pomiar oscylacji w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczej komórki jest ważny dla odkrycia mechanizmów działania zegarów biologicznych. Chociaż masowe ekstrakty przygotowane z jaj Xenopus laevis były skuteczne w analizowaniu sieci biochemicznych leżących u podstaw progresji cyklu komórkowego, ich średni pomiar zespołu zazwyczaj prowadzi do stłumionych oscylacji, pomimo utrzymania każdego pojedynczego oscylatora. Wynika to z trudności w idealnej synchronizacji między poszczególnymi oscylatorami w hałaśliwych systemach biologicznych. Aby odtworzyć dynamikę pojedynczej komórki oscylatora, opracowaliśmy sztuczny system komórkowy oparty na kropelkach, który może odtwarzać cykle mitotyczne w przedziałach przypominających komórki, zawierających cykliczne ekstrakty cytoplazmatyczne z jaj Xenopus laevis. Te proste komórki cytoplazmatyczne wykazują ciągłe oscylacje przez ponad 30 cykli. Aby zbudować bardziej skomplikowane komórki z jądrami, dodaliśmy zdebłonowaną chromatynę plemników, aby wywołać samoorganizację jąder w systemie. Zaobserwowaliśmy okresową progresję kondensacji/dekondensacji chromosomów i rozpadu/reformacji obwiedni jąder atomowych, jak w prawdziwych komórkach. Oznacza to, że oscylator mitotyczny działa wiernie, kierując wieloma dalszymi zdarzeniami mitotycznymi. Równolegle śledziliśmy dynamikę oscylatora mitotycznego i dalszych procesów w poszczególnych kropelkach za pomocą wielokanałowej poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. Sztuczny system cyklu komórkowego zapewnia wysokowydajne ramy do ilościowej manipulacji i analizy oscylacji mitotycznych z rozdzielczością pojedynczej komórki, co prawdopodobnie dostarcza ważnych informacji na temat mechanizmów regulacyjnych i funkcji zegara.

Na Rysunku 2 pokazujemy, że protokół ten indukuje oscylacje mitotyczne zarówno w prostych komórkach pozbawionych jąder, jak i w złożonych komórkach z jądrami, w których oscylator napędza cykliczną zmianę formowania się i deformacji jąder. Krople pozbawione jąder generują oscylacje mitotyczne obejmujące do 30 nieamortyzowanych cykli w ciągu 92 godzin, co wskazuje okresowa synteza i degradacja fluorescencyjnego reportera securin-mCherry (Ry...

Prezentujemy metodę generowania in vitro samopodtrzymujących się oscylacji mitotycznych na poziomie pojedynczej komórki poprzez kapsułkowanie ekstraktów jajecznych Xenopus laevis w mikroemulsjach typu woda w oleju.

Rekonstrukcja oscylacji cyklu komórkowego w mikroemulsjach bezkomórkowych ekstraktów jajowych Xenopus

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii systemowej, takie jak mechanizm regulujący sieć mitotyczną oraz dynamiczne właściwości i funkcje zegara cyklu komórkowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że wygeneruje ona dużą ilość kropel z wieloma cyklami komórkowymi w każdej, zapewniając nam wysokowydajne ramy do ilościowej manipulacji i analizy. Na początek wyrzuć partie jaj, które mają niejasne granice między biegunami zwierzęcymi i roślinnymi lub nieregularne białe plamy na słupach zwierzęcych.Następnie wybierz odpowiednią partię jaj od jednej samicy żaby i przenieś jaja do 600-mililitrowej zlewki. Wylej nadmiar 0,2x buforu MMR i delikatnie dodaj cysteinę w 1x buforze ekstraktu do jaj. Następnie energicznie potrząśnij ręcznie zlewką, aby usunąć galaretki z jaj.Powtórz to mycie trzy razy, w sumie 800 mililitrów buforu cysteiny lub do momentu, gdy jaja się zgromadzą i osiądą na dnie zlewki. Po usunięciu galaretki umyj jajka cztery razy w jednym litrze 0,2x roztworu MMR. Użyj szklanej pipety, aby zebrać i wyrzucić jaja, które stają się białe.Wylej bufor MMR ze zlewki i dodaj 200 mililitrów roztworu jonoforu wapnia do jaj. Za pomocą szklanej pipety delikatnie wymieszaj jajka, aż zostaną aktywowane, a następnie usuń roztwór jonoforu wapnia. Pozostawienie jaj w roztworze jonoforu wapnia zbyt długo zainicjuje apoptozę.Mieszamy jajka przez 1,5 minuty i sprawdzamy skuteczność aktywacji. Jeśli nie są aktywowane, wznów mieszanie i sprawdzaj częściej, aż zostanie osiągnięta 90% aktywacja. Po tym, jak jaja osiądą na dnie zlewki, sprawdź skuteczność aktywacji.Dobrze aktywowane jaja mają około 25% bieguna zwierzęcego i 75% bieguna roślinnego. Następnie dwukrotnie umyj jaja łączną objętością 50 mililitrów buforu ekstraktu uzupełnionego inhibitorami proteazy. Następnie ostrożnie przenieś jajka do mikroprobówki zatrzaskowej o pojemności 0,4 mililitra.Wirować mikroprobówkę przez 60 sekund przy 200 g, a następnie przy 600 g przez 30 sekund, aby zapakować jaja. Następnie użyj szklanej pipety Pasteura, aby usunąć nadmiar buforu z jaj po każdym kroku. Następnie zmiażdż jajka w temperaturze 15 000 g przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza.Użyj żyletki, aby przeciąć rurki, aby oddzielić trzy warstwy zmiażdżonych jaj i utrzymać surową cytoplazmę w środkowej warstwie. Następnie przenieś surową cytoplazmę do czystych probówek ultrawirówek. Uzupełnij cytoplazmę inhibitorami proteazy i cytochalazyną B w dawce 10 mikrogramów na mililitr każdy.Wirować surową cytoplazmę w temperaturze 15 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie użyj żyletki, aby przeciąć rurkę i utrzymać cytoplazmę w środkowej warstwie. Umieść świeżo przygotowane ekstrakty na lodzie.Najpierw dodaj mRNA securin-mCherry do przygotowanych ekstraktów. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 2% fluorosurfaktantu PFPE-PEG do mieszaniny ekstraktu mRNA. Użyj miksera wirowego, aby wygenerować kropelki, dostosowując prędkość i czas trwania wiru w razie potrzeby.Następnie sprawdź wzrokowo kropelki, aby upewnić się, że mają jednolitą wielkość. Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów przenieś unoszące się na wierzchu kropelki i równą objętość środka powierzchniowo czynnego do probówki PCR. Zanurz szklaną rurkę w warstwie kropel i poczekaj, aż kropelki wypełnią około 75% probówki.Następnie wepchnij rurkę w warstwę środka powierzchniowo czynnego i całkowicie napełnij rurkę. Następnie napełnij naczynie ze szklanym dnem olejem mineralnym. Następnie za pomocą cienkiej pęsety zanurz rurkę wypełnioną kropelkami w oleju.Użyj szklanej pipety, aby usunąć wszelkie widoczne zanieczyszczenia lub wyciekające kropelki. Aby uniknąć przemieszczania się i wycieku kropel, szklaną rurkę wypełnioną kropelkami należy ostrożnie zanurzyć pod olejem mineralnym. Możemy albo popchnąć rurkę na obu końcach z równowagą, albo najpierw dodać kilka kropel oleju mineralnego na końce tubki.Następnie użyj mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w zmotoryzowany stolik xy, aby zobrazować kropelki. Nagrywaj filmy poklatkowe w jasnym polu i wielu kanałach fluorescencyjnych co sześć do dziewięciu minut, aż kropelki stracą swoją aktywność. Za pomocą tego protokołu wyprodukowano oscylacje mitotyczne zarówno w prostych, bezjądrowych komórkach, jak i skomplikowanych komórkach z jądrami.Kropelki pozbawione jąder wygenerowały oscylacje mitotyczne do 30 nietłumionych cykli w ciągu 92 godzin. Zbadano również zdolność oscylatora mitotycznego do kierowania dalszymi zdarzeniami mitotycznymi. Samopodtrzymujący się oscylator mitotyczny napędzał zmiany morfologii jądrowej obserwowane poprzez autonomiczną zmianę różnych faz cyklu komórkowego.Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, aby pamiętać o czasie podczas przygotowywania ekstraktu, ponieważ jest on wrażliwy na czas i zawsze trzymać jajka i ekstrakt na lodzie. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią systemową do zbadania podstawowych zasad złożonych właściwości zegara, takich jak przestrajalność i stochastyczność u Xenopus laevis.

reconstitution-cell-cycle-oscillations-microemulsions-cell-free

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Surowe i frakcjonowane ekstrakty z jaj Xenopus mogą służyć do pozyskiwania składników niezbędnych do rekonstrukcji procesów komórkowych w celu analizy morfologicznej i biochemicznej. Do przygotowania surowego ekstraktu wykorzystuje się lizę jaj oraz wirowanie różnicowe, który z kolei służy do sporządzenia ekstraktów frakcjonowanych oraz preparatów lekkich błon.

Przygotowanie i frakcjonowanie ekstraktów z jaj Xenopus laevis

Opisujemy zbieranie niezapłodnionych jaj Xenopus tropicalis i produkcję ekstraktu z jaj zatrzymanego przez mejozę II. Ten ekstrakt z jaj może być stosowany do oczyszczania mikrotubul i RNA związanych z mikrotubulami.

Produkcja ekstraktów jajowych Xenopus tropicalis w celu identyfikacji RNA związanych z mikrotubulami

Opisano metodę analizy degradacji białek za pomocą radioaktywnego i lucyferazy-fuzyjnego białka w ekstrakcie z jaj Xenopus oraz jej adaptację do wysokoprzepustowych badań przesiewowych dla małocząsteczkowych modulatorów degradacji białek.

Rekonstytucja degradacji β-kateniny w ekstrakcie z jaj Xenopus

Opisujemy metody manipulowania niedojrzałymi oocytami Xenopus laevis, dojrzewania in vitro oocytów do komórek jajowych oraz docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników. Protokół ten umożliwia degradację niektórych białek matczynych i nadekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania podczas zapłodnienia, a zatem jest cenny dla badania ról określonych czynników we wczesnym rozwoju embrionalnym.

Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego

Molekularne mechanizmy dekondensacji wysoce zagęszczonej chromatyny mitotycznej są źle zdefiniowane. Przedstawiamy bezkomórkowy test oparty na mitotycznych klastrach chromatyny wyizolowanych z komórek HeLa i ekstraktu z jaj Xenopus laevis, który wiernie odtwarza proces dekondensacji in vitro.

Test bezkomórkowy do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy

Opisujemy system oocytów i czapeczek zwierzęcych Xenopus do klonowania ekspresji genów zdolnych do wywołania odpowiedzi w kompetentnej ektodermie i omawiamy techniki późniejszej analizy takich genów. System ten jest przydatny w funkcjonalnej identyfikacji szerokiej gamy produktów genowych.

Klonowanie funkcjonalne przy użyciu systemu ekspresji oocytów Xenopus

Mechanizmy skalowania komórkowego i wewnątrzkomórkowego pozostają nieuchwytne. Stosowanie ekstraktów z zarodków Xenopus staje się coraz bardziej powszechne w celu wyjaśnienia mechanizmów regulacji wielkości organelli. Metoda ta opisuje przygotowanie ekstraktu z zarodka i nowatorski test skalowania jądrowego, za pomocą którego można zidentyfikować mechanizmy regulacji wielkości jądra.

Bezkomórkowy test wykorzystujący ekstrakty z zarodków Xenopus laevis do badania mechanizmów regulacji wielkości jądra

Montaż i ustawienie wrzeciona mitotycznego zależy od połączonych sił generowanych przez dynamikę mikrotubul, białka motoryczne i sieciery. Tutaj przedstawiamy nasze ostatnio opracowane metody, w których geometryczne uwięzienie sferycznych kropelek emulsji jest wykorzystywane do odtworzenia od dołu do góry podstawowych wrzecion mitotycznych.

Rekonstytucja podstawowych wrzecion mitotycznych w sferycznych kropelkach emulsji

Zgłaszamy dwa protokoły synchronizacji komórek, które dostarczają kontekstu do badania zdarzeń związanych z określonymi fazami cyklu komórkowego. Pokazujemy, że to podejście jest przydatne do analizy regulacji określonych genów w niezakłóconym cyklu komórkowym lub po ekspozycji na czynniki wpływające na cykl komórkowy.

Badanie ekspresji genów regulowanej cyklem komórkowym za pomocą dwóch uzupełniających się protokołów synchronizacji komórek

Opisujemy metodę przygotowania i obrazowania na żywo nierozcieńczonych ekstraktów cytoplazmatycznych z jaj Xenopus laevis.

Xenopus laevis (Xenopus laevis) Przygotowanie ekstraktu z jaj i metody obrazowania na żywo do wizualizacji dynamicznej organizacji cytoplazmy

Protokół hodowli i manipulacji tkanką embrionalną myszy na chipie mikroprzepływowym jest dostarczony. Stosując impulsy modulatorów szlaku, system ten może być wykorzystany do zewnętrznego sterowania oscylacjami sygnałowymi w celu funkcjonalnego badania somitogenezy myszy.

Podejście mikrofluidyczne do funkcjonalnego badania oscylacji sygnalizacyjnych rządzących somitogenezą

Poznaj metodę rekonstrukcji oscylacji mitotycznych w mikroemulsjach z ekstraktów jajowych Xenopus laevis. Technika umożliwia badanie dynamiki cyklu komórkowego i sieci mitotycznej w skali wysokoprzepustowej.

Rekonstrukcja oscylacji cyklu komórkowego w mikroemulsjach bezkomórkowych ekstraktów jajowych Xenopus

Przeglądaj więcej filmów