Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy
August 23rd, 2022
Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.
Nasz protokół umożliwia jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. Może być szeroko stosowany do badania zachowania nadzoru mikrogleju lub interakcji z neuronami. Zaletą tej metody jest to, że artefakty ruchu nie zanieczyszczają łatwo danych obrazowych ze względu na solidne mocowanie głowy.
Również przywracanie po obrazowaniu z dużą liczbą klatek na sekundę pozwala nam wyeliminować artefakty ruchu z danych. W tej metodzie iniekcja AAV i operacja implantacji okienka czaszkowego są technicznie wymagające. Niepowodzenia są powszechne na początku, więc nie denerwuj się i ćwicz więcej.
Aby przygotować aparat do wstrzykiwań, należy umieścić szklaną pipetę podłączoną do strzykawki Hamiltona w rozmiarze 26 przez rurkę na uchwycie pipety przyrządu stereotaktycznego. Następnie przechyl uchwyt pipety o 60 stopni do przodu od osi pionowej. Napełnij szklaną pipetę, strzykawkę i rurkę łączącą ciekłą parafiną i umieść strzykawkę na mikrowstrzykiwaczu.
Podaj środek przeciwbólowy znieczulonej myszy i załóż pomocnicze nauszniki. Następnie przymocuj zwierzę do instrumentu stereotaktycznego grzbietową stroną do góry. Po usunięciu owłosienia z pola operacyjnego i zdezynfekowaniu pola operacyjnego należy wykonać dwucentymetrowe nacięcie na skórze głowy wzdłuż linii środkowej, zapewniając dobrą ekspozycję czaszki powyżej prawej pierwszorzędowej kory wzrokowej.
Użyj kleszczy, aby usunąć okostną na odsłoniętej czaszce. Wywierć czaszkę na współrzędnych stereotaktycznych trzy milimetry w bok od linii środkowej i 5 mililitrów przed linią lambda, aby utworzyć mały otwór o średnicy około 0,5 milimetra. Następnie umieść kawałek przezroczystej folii o wymiarach około dwa centymetry na dwa centymetry na odsłoniętej czaszce myszy.
Usunąć jeden mikrolitr kropli roztworu AAV na folię za pomocą pipetera. Przesunąć strzykawkę. Następnie umieść szklaną końcówkę pipety w kropli roztworu AAV na folii i delikatnie pociągnij strzykawkę, aby zassać roztwór AAV.
Następnie włóż szklaną pipetę na głębokość 500 mikrometrów od powierzchni mózgu przez otwór utworzony w czaszce. Następnie wstrzyknąć 0,5 mikrolitra roztworu AAV za pomocą mikrowtryskiwacza przy natężeniu przepływu objętościowego wtrysku wynoszącym dwa mikrolitry na godzinę. Wyjąć igłę i przepłukać powierzchnię mózgu solą fizjologiczną.
Utwórz okrągły rowek wzdłuż znaku na czaszce, wiercąc. Oczyść zanieczyszczenia, aby zapewnić widoczność czaszki i nałóż sól fizjologiczną, aby zapobiec nagrzewaniu się podczas wiercenia. Delikatnie dociśnij środkową czaszkę kleszczami.
Głębokość wiercenia jest wystarczająca, jeśli porusza się pionowo z niewielkim oporem. Gdy rowek osiągnie wystarczającą głębokość, włóż końcówkę kleszczy w dno środkowego fragmentu czaszki. Delikatnie podnieś i zdejmij, aby odsłonić powierzchnię mózgu.
Za pomocą igły o rozmiarze 27 nakłuj i rozerwij oponę twardą na krawędzi odsłoniętej powierzchni mózgu. Włóż końcówkę kleszczy przez otwór wykonany na krawędzi opony twardej i oderwij ją, aby odsłonić powierzchnię mózgu. Po rozproszeniu włókien hemostatycznych jeden po drugim w soli fizjologicznej, umieść włókna hemostatyczne wzdłuż brzegów otworu, w którym znajduje się przecięta opona twarda.
Umieść okienko czaszki na odsłoniętej powierzchni mózgu, a następnie przyklej je do czaszki za pomocą kleju błyskawicznego, delikatnie naciskając okienko. Następnie nałóż natychmiastowy klej na całą odsłoniętą czaszkę. Następnie ostrożnie przymocuj płytkę głowy do czaszki, aby zlokalizować okno czaszki pośrodku kwadratowego otworu w płycie głowy.
Gdy klej wystarczająco stwardnieje, nałóż cement dentystyczny na odsłoniętą czaszkę, aby wzmocnić mocowanie między głową a ostrzem głowy. Aby zainstalować wykonane na zamówienie urządzenie zacieniające i monitor LCD do stymulacji wizualnej, najpierw ustaw soczewkę tak, aby skupiała się na powierzchni mózgu, a następnie ustaw tę pozycję soczewki jako oryginalną pozycję Z. Utrzymuj stałe współrzędne XY i podnieś soczewkę obiektywu.
Wyjmij mysz i przyrząd stereotaktyczny z soczewki obiektywu. Przymocuj urządzenie zacieniające na górze płyty czołowej za pomocą silikonu, upewniając się, że przestrzeń między płytą główną a urządzeniem zaciemniającym jest dobrze uszczelniona. Napełnij urządzenie zacieniające wodą destylowaną.
Następnie zamocuj mysz z ramką stereotaktyczną pod soczewką obiektywu. Ostrożnie zresetuj płaszczyznę ogniskową na powierzchni mózgu, sprawdzając głębokość soczewki obiektywu. Przykryj soczewkę obiektywu czarną folią aluminiową, aby uniknąć zanieczyszczenia światłem przez monitor LCD.
Ustaw 10-calowy monitor LCD na 12.5 centymetra przed oczami myszy, aby prezentować bodźce wizualne. Skonfiguruj filtry zbierania fluorescencji dla EGFP i R-CaMP oraz długość fali wzbudzenia na 1 000 nanometrów. Uzyskuj obrazy o rozdzielczości przestrzennej 0,25 mikrona na piksel.
Znajdź region obrazowania, w którym neurony R-CaMP-dodatnie i EGFP-dodatni mikroglej mogą być jednocześnie obrazowane. W warstwie 2, 3. Uzyskuj obrazy z częstotliwością odświeżania 30 Hz.
Równocześnie z akwizycją obrazu, prezentuj myszce dryfujące bodźce wizualne w 12 kierunkach w sześciu orientacjach, od zera do 150 stopni w krokach co 30 stopni. Po uzyskaniu obrazu wyjmij mysz ze stolika mikroskopu. Odłącz urządzenie zacieniające i instrument stereotaktyczny od myszy i umieść mysz z powrotem w klatce domowej.
Korzystając z tego protokołu, przeprowadzono wstrzyknięcie AAV i implantację okna czaszkowego w pierwszorzędowej korze wzrokowej ośmiotygodniowej myszy transgenicznej, a następnie obrazowanie dwufotonowe aktywności neuronalnej opartej na R-CaMP i dynamiki mikrogleju w warstwie 2, 3. Myszowi przedstawiono zgrzytliwe bodźce wzrokowe, a reakcje wzrokowe w kręgosłupie przydatkowym analizowano za pomocą śladów wapnia. Procesy mikrogleju wykazywały szybką dynamikę i zmieniały swoją morfologię w ciągu 10 sekund.
Korzystając z obrazowania dwufotonowego w warstwie 2, 3 pierwszorzędowej kory wzrokowej u 12-tygodniowej myszy transgenicznej, R-CaMP zaobserwowano w neuronach, widocznym tutaj w kolorze magenta. EGFP zaobserwowano w mikrogleju, widocznym na zielono. Zaobserwowano również indywidualne sygnały dla EGFP i R-CaMP.
Udane wstrzyknięcie AAV ma kluczowe znaczenie dla tej metody. Głównymi przyczynami nieudanego wstrzyknięcia AAV są szklane pipety zegarowe i uszkodzenie tkanek. Stwierdzono, że zachowanie związane z nadzorem nad mikroglejem i interakcja mikrogleju SNAP są powszechne w różnych mechanizmach patogennych, takich jak choroba Alzheimera.
Nasza metoda jest korzystna dla badań skoncentrowanych na tej dziedzinie.
Przegląd
To badanie opisuje protokół, który łączy wstrzyknięcie wirusa adeno-skojarzonego (AAV) z implantacją okna czaszkowego, aby umożliwić jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronów u czujnych myszy. Metoda ta pozwala badaczom badać zachowanie czujności mikrogleju i ich interakcje z neuronami, minimalizując przy tym artefakty ruchowe podczas obrazowania.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Neuroobrazowanie
- Neurobiologia
Tło
- Mikroglej odgrywa istotną rolę w zdrowiu i chorobach mózgu.
- Obrazy w czasie rzeczywistym dynamiki mikrogleju są niezbędne do zrozumienia ich funkcji.
- AAV jest powszechnie stosowany do dostarczania materiału genetycznego w zastosowaniach neuronauki.
- Utrzymanie głowy w miejscu u czujnych myszy zmniejsza artefakty ruchowe podczas obrazowania.
Cel badania
- Rozwój niezawodnej metody obrazowania interakcji mikrogleju i neuronów.
- Poprawa rozumienia dynamiki mikrogleju i aktywności neuronów w warunkach fizjologicznych.
- Minimalizacja zanieczyszczenia danych z powodu artefaktów ruchowych podczas obrazowania.
Zastosowanie metod
- Protokół obejmuje wstrzyknięcie AAV i implantację okna czaszkowego w pierwotnej korze wzrokowej u czujnych myszy.
- Model biologiczny składa się z myszy transgenicznych wytwarzających białka fluorescencyjne.
- Kluczowe kroki obejmują precyzyjne współrzędne stereotaksyjne do wstrzyknięcia i procedury chirurgiczne do umieszczenia okna czaszkowego.
- Obrazy były przeprowadzane za pomocą mikroskopii dwufotonowej z częstotliwością klatek 30 Hz.
- Ślady wapnia z neuronów i mikrogleju były analizowane w odpowiedzi na bodźce wzrokowe.
Główne wyniki
- Obserwowano szybką dynamikę w procesach mikrogleju, które zmieniały morfologię w ciągu 10 sekund.
- Jednoczesne obrazowanie ujawniło aktywność neuronów i dynamikę mikrogleju w odpowiedzi na bodźce wzrokowe.
- Protokół potwierdził skuteczność AAV i okien czaszkowych dla wysokiej jakości obrazowania.
Wnioski
- Ta metoda umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym mikrogleju i interakcji neuronów, zapewniając wgląd w dynamikę mózgu.
- Badanie wkłada cenne narzędzia do zrozumienia ról mikrogleju w mechanizmach neuronowych.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować badania wpływu różnych interwencji na aktywność mikrogleju i neuronów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice enables direct interrogation of neuroimmune interactions at single-cell resolution. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early CNS target validation, especially for neuroinflammatory and neurodegenerative disease models. Integrating real-time glial-neuronal readouts advances portfolio decisions by clarifying pathway engagement and functional outcomes in translationally relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of microglia-neuron interactions under physiological and stimulated conditions.
- Supports functional target validation by linking immune cell dynamics to neuronal activity in vivo.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuroinflammatory and synaptic plasticity hypotheses.
- Improves predictive confidence for CNS target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Establishes validated in vivo imaging systems for quantitative assessment of neuronal and microglial responses.
- Provides reproducible, motion-artifact-minimized datasets for downstream analysis and screening.
- Enables standardization of visual stimulus protocols and imaging parameters for assay development.
- Supports reliable evaluation of compound effects on neuroimmune interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant neuroimmune mechanisms observed in human CNS disorders.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking dynamic cellular responses.
- Supports risk-adjusted advancement of neuroinflammation and synaptic modulation programs.
- Provides translational biomarker candidates based on real-time cellular activity patterns.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven testing of neuroimmune interactions in awake, behaving mice.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial surveillance and neuron-glia signaling in response to peripheral and central stimuli.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible imaging outputs suitable for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Provides high-resolution calcium traces and morphological data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant mechanisms and biomarker development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable in vivo imaging platform adaptable to diverse CNS targets and interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging workflows and minimizes motion artifacts for reproducible data.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of neuroimmune programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS assets based on functional in vivo evidence.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in stereotaxic surgery, AAV delivery, and cranial window implantation.
- Demands access to two-photon microscopy and advanced imaging infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of imaging protocols and data analysis.
- Adaptable to various brain regions and transgenic models with protocol optimization.
- Initial technical failure rates may be high; proficiency improves with practice and experience.
