Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Nasz protokół umożliwia jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. Może być szeroko stosowany do badania zachowania nadzoru mikrogleju lub interakcji z neuronami. Zaletą tej metody jest to, że artefakty ruchu nie zanieczyszczają łatwo danych obrazowych ze względu na solidne mocowanie głowy.

Również przywracanie po obrazowaniu z dużą liczbą klatek na sekundę pozwala nam wyeliminować artefakty ruchu z danych. W tej metodzie iniekcja AAV i operacja implantacji okienka czaszkowego są technicznie wymagające. Niepowodzenia są powszechne na początku, więc nie denerwuj się i ćwicz więcej.

Aby przygotować aparat do wstrzykiwań, należy umieścić szklaną pipetę podłączoną do strzykawki Hamiltona w rozmiarze 26 przez rurkę na uchwycie pipety przyrządu stereotaktycznego. Następnie przechyl uchwyt pipety o 60 stopni do przodu od osi pionowej. Napełnij szklaną pipetę, strzykawkę i rurkę łączącą ciekłą parafiną i umieść strzykawkę na mikrowstrzykiwaczu.

Podaj środek przeciwbólowy znieczulonej myszy i załóż pomocnicze nauszniki. Następnie przymocuj zwierzę do instrumentu stereotaktycznego grzbietową stroną do góry. Po usunięciu owłosienia z pola operacyjnego i zdezynfekowaniu pola operacyjnego należy wykonać dwucentymetrowe nacięcie na skórze głowy wzdłuż linii środkowej, zapewniając dobrą ekspozycję czaszki powyżej prawej pierwszorzędowej kory wzrokowej.

Użyj kleszczy, aby usunąć okostną na odsłoniętej czaszce. Wywierć czaszkę na współrzędnych stereotaktycznych trzy milimetry w bok od linii środkowej i 5 mililitrów przed linią lambda, aby utworzyć mały otwór o średnicy około 0,5 milimetra. Następnie umieść kawałek przezroczystej folii o wymiarach około dwa centymetry na dwa centymetry na odsłoniętej czaszce myszy.

Usunąć jeden mikrolitr kropli roztworu AAV na folię za pomocą pipetera. Przesunąć strzykawkę. Następnie umieść szklaną końcówkę pipety w kropli roztworu AAV na folii i delikatnie pociągnij strzykawkę, aby zassać roztwór AAV.

Następnie włóż szklaną pipetę na głębokość 500 mikrometrów od powierzchni mózgu przez otwór utworzony w czaszce. Następnie wstrzyknąć 0,5 mikrolitra roztworu AAV za pomocą mikrowtryskiwacza przy natężeniu przepływu objętościowego wtrysku wynoszącym dwa mikrolitry na godzinę. Wyjąć igłę i przepłukać powierzchnię mózgu solą fizjologiczną.

Utwórz okrągły rowek wzdłuż znaku na czaszce, wiercąc. Oczyść zanieczyszczenia, aby zapewnić widoczność czaszki i nałóż sól fizjologiczną, aby zapobiec nagrzewaniu się podczas wiercenia. Delikatnie dociśnij środkową czaszkę kleszczami.

Głębokość wiercenia jest wystarczająca, jeśli porusza się pionowo z niewielkim oporem. Gdy rowek osiągnie wystarczającą głębokość, włóż końcówkę kleszczy w dno środkowego fragmentu czaszki. Delikatnie podnieś i zdejmij, aby odsłonić powierzchnię mózgu.

Za pomocą igły o rozmiarze 27 nakłuj i rozerwij oponę twardą na krawędzi odsłoniętej powierzchni mózgu. Włóż końcówkę kleszczy przez otwór wykonany na krawędzi opony twardej i oderwij ją, aby odsłonić powierzchnię mózgu. Po rozproszeniu włókien hemostatycznych jeden po drugim w soli fizjologicznej, umieść włókna hemostatyczne wzdłuż brzegów otworu, w którym znajduje się przecięta opona twarda.

Umieść okienko czaszki na odsłoniętej powierzchni mózgu, a następnie przyklej je do czaszki za pomocą kleju błyskawicznego, delikatnie naciskając okienko. Następnie nałóż natychmiastowy klej na całą odsłoniętą czaszkę. Następnie ostrożnie przymocuj płytkę głowy do czaszki, aby zlokalizować okno czaszki pośrodku kwadratowego otworu w płycie głowy.

Gdy klej wystarczająco stwardnieje, nałóż cement dentystyczny na odsłoniętą czaszkę, aby wzmocnić mocowanie między głową a ostrzem głowy. Aby zainstalować wykonane na zamówienie urządzenie zacieniające i monitor LCD do stymulacji wizualnej, najpierw ustaw soczewkę tak, aby skupiała się na powierzchni mózgu, a następnie ustaw tę pozycję soczewki jako oryginalną pozycję Z. Utrzymuj stałe współrzędne XY i podnieś soczewkę obiektywu.

Wyjmij mysz i przyrząd stereotaktyczny z soczewki obiektywu. Przymocuj urządzenie zacieniające na górze płyty czołowej za pomocą silikonu, upewniając się, że przestrzeń między płytą główną a urządzeniem zaciemniającym jest dobrze uszczelniona. Napełnij urządzenie zacieniające wodą destylowaną.

Następnie zamocuj mysz z ramką stereotaktyczną pod soczewką obiektywu. Ostrożnie zresetuj płaszczyznę ogniskową na powierzchni mózgu, sprawdzając głębokość soczewki obiektywu. Przykryj soczewkę obiektywu czarną folią aluminiową, aby uniknąć zanieczyszczenia światłem przez monitor LCD.

Ustaw 10-calowy monitor LCD na 12.5 centymetra przed oczami myszy, aby prezentować bodźce wizualne. Skonfiguruj filtry zbierania fluorescencji dla EGFP i R-CaMP oraz długość fali wzbudzenia na 1 000 nanometrów. Uzyskuj obrazy o rozdzielczości przestrzennej 0,25 mikrona na piksel.

Znajdź region obrazowania, w którym neurony R-CaMP-dodatnie i EGFP-dodatni mikroglej mogą być jednocześnie obrazowane. W warstwie 2, 3. Uzyskuj obrazy z częstotliwością odświeżania 30 Hz.

Równocześnie z akwizycją obrazu, prezentuj myszce dryfujące bodźce wizualne w 12 kierunkach w sześciu orientacjach, od zera do 150 stopni w krokach co 30 stopni. Po uzyskaniu obrazu wyjmij mysz ze stolika mikroskopu. Odłącz urządzenie zacieniające i instrument stereotaktyczny od myszy i umieść mysz z powrotem w klatce domowej.

Korzystając z tego protokołu, przeprowadzono wstrzyknięcie AAV i implantację okna czaszkowego w pierwszorzędowej korze wzrokowej ośmiotygodniowej myszy transgenicznej, a następnie obrazowanie dwufotonowe aktywności neuronalnej opartej na R-CaMP i dynamiki mikrogleju w warstwie 2, 3. Myszowi przedstawiono zgrzytliwe bodźce wzrokowe, a reakcje wzrokowe w kręgosłupie przydatkowym analizowano za pomocą śladów wapnia. Procesy mikrogleju wykazywały szybką dynamikę i zmieniały swoją morfologię w ciągu 10 sekund.

Korzystając z obrazowania dwufotonowego w warstwie 2, 3 pierwszorzędowej kory wzrokowej u 12-tygodniowej myszy transgenicznej, R-CaMP zaobserwowano w neuronach, widocznym tutaj w kolorze magenta. EGFP zaobserwowano w mikrogleju, widocznym na zielono. Zaobserwowano również indywidualne sygnały dla EGFP i R-CaMP.

Udane wstrzyknięcie AAV ma kluczowe znaczenie dla tej metody. Głównymi przyczynami nieudanego wstrzyknięcia AAV są szklane pipety zegarowe i uszkodzenie tkanek. Stwierdzono, że zachowanie związane z nadzorem nad mikroglejem i interakcja mikrogleju SNAP są powszechne w różnych mechanizmach patogennych, takich jak choroba Alzheimera.

Nasza metoda jest korzystna dla badań skoncentrowanych na tej dziedzinie.