Dwufotonowe obrazowanie in vivo dynamiki mikrogleju w hipokampie myszy

Weźmy znieczuloną transgeniczną mysz wykazującą ekspresję białek fluorescencyjnych w mikrogleju. Zamocuj go na stereotaktycznej ramie z zmotoryzowanym stolikiem pod mikroskopem dwufotonowym.

Czaszka jest wyposażona w metalową rurkę ze szklanym dnem, która delikatnie spłaszcza zębodoł powyżej obszaru hipokampa cornu amonisa 1 lub CA1, zapewniając wyraźny interfejs optyczny bez

nadmiernego nacisku na leżącą pod spodem tkankę.

Napełnij metalową rurkę wodą, aby zoptymalizować transmisję optyczną.

Aktywuj laser impulsowy na długości fali wzbudzenia.

Wykorzystując fluorescencję z miąższu mózgu i światło odbite od metalowej rurki, dostosuj ostrość do obszaru CA1.

Zmień położenie głowicy myszy, aby wyrównać szklane dno równolegle do płaszczyzny obrazowania, zapewniając jednolitą ostrość w całym polu widzenia.

Dostosuj obiektyw, aby uzyskać optymalną rozdzielczość i obserwuj dynamikę mikrogleju in vivo w regionie CA1.

Następnie zobrazuj zakręt zębaty, w którym fluorescencyjny mikroglej potwierdza integralność CA1.

Umieść mysz w urządzeniu przytrzymującym głowę pod soczewką obiektywu mikroskopu dwufotonowego i na zmotoryzowanym stoliku skanującym XY. Następnie wypełnij przestrzeń między szklanym dnem a soczewką obiektywu wodą, nie tworząc pęcherzyków powietrza. Ustaw ostrość na CA1 pod kierunkiem fluorescencji emitowanej przez miąższ mózgu i światła odbitego od krawędzi metalowej rurki, przy ciągłym oświetleniu laserem impulsowym.

Dostosuj kąt nachylenia głowicy myszy, przechylając urządzenie przytrzymujące głowicę tak, aby szklane dno było równoległe do płaszczyzny obrazowania. Następnie należy wyregulować kołnierz korekcyjny obiektywu, aby osiągnąć najwyższą rozdzielczość na głębokości struktury docelowej w CA1. Następnie upewnij się, że komórki fluorescencyjne w warstwie molekularnej zakrętu zębatego lub DG na głębokości 500 mikrometrów od szklanego dna są obrazowane w całym polu widzenia. Tylko w przypadku udanej operacji sygnały DG mogą być natychmiast wykryte.

Upewnij się, że mikroglej odzyskał swoją rozgałęzioną morfologię. Następnie wykonaj obrazowanie in vivo na warstwie zainteresowania w CA1.