Name: Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości z wykorzystaniem ludzkich fibroblastów i keratynocytów. Automatyczne urządzenie do zadawania ran zapewnia powtarzalność w warunkach sterylnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują ISC Fraunhofera za współpracę przy budowie automatycznego urządzenia do ranienia. Projekt został założony przez wewnętrzny projekt Fraunhofera "Märkte von Übermorgen" (SkinHeal).

UWAGA: Protokół jest przeznaczony do produkcji 24 odpowiedników skóry o pełnej grubości. Ludzkie fibroblasty skóry i keratynocyty naskórka wyizolowano z biopsji skóry zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem. 21,22 Wcześniej uzyskano świadomą zgodę, a badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną ds. badań na ludziach Uniwersytetu Juliusza Maksymiliana w Würzburgu (głos 182/10).
1. Produkcja składnika skórnego
<ol>
	<li>Rozpuść kolagen w 0,1% kwasie octowym do końcowego stężenia 6 mg/ml. Aby uzyskać roztwór neutralizujący żel, wymieszaj 232,5 ml 2x DMEM, 7,5 ml płodowej surowicy cielęcej, 7,5 ml 3 M HEPES, 2,5 ml siarczanu chondroityny (5 mg / ml). Trzymaj roztwór neutralizujący żel i roztwór kolagenu na lodzie. Obliczać 500 μl żelu na wkładkę/ekwiwalent skóry. 
	UWAGA: Ponieważ roztwór neutralizujący żel zostanie zmieszany z dwiema częściami roztworu kolagenu, przygotuj podwójną ilość kolagenu.</li>
	<li>Umieść 24 wkładki w płytce 24-dołkowej.</li>
	<li>Zawiesić ludzkie fibroblasty skóry (hDF) w 10 ml DMEM, wirować przez 5 minut przy 270 x g i policzyć komórki. Wyekstrahuj potrzebną ilość hDF (5 x 104 komórki na 500 μl żelu kolagenowego) i odwiruj komórki przez 5 minut przy 270 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić hDF w 4 ml schłodzonego roztworu neutralizującego żel, nie wytwarzając pęcherzyków powietrza. Na tym etapie upewnij się, że pracujesz tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć przedwczesnego zestalenia żeli kolagenowych.</li>
	<li>Zawiesić roztwór z 8 ml roztworu kolagenu.</li>
	<li>Weź mieszaninę kolagenowo-komórkową za pomocą pipety wieloetapowej i szybko napełnij 500 μl mieszaniny do każdej wkładki. Inkubować żele przez 20 minut w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) w celu wypłukania żeli.</li>
	<li>Zanurzyć żele w 2 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) na dołek i inkubować przez 24 godziny w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).</li>
</ol>
2. Dodawanie ludzkich keratynocytów naskórka (hEK)
<ol>
	<li>Usunąć podłoże po 24 godzinach. Rozpuścić ludzkie białko fibronektyny w ultraczystej wodzie do końcowego stężenia 50 μg/ml. Pokryć każdy odpowiednik skórny 25 μl roztworu fibronektyny. Inkubować żele przez 30 minut w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).</li>
	<li>W międzyczasie ponownie zawiesić hEK w 10 ml KGM-2 i ustawić stężenie komórek na 1 x 106 komórek/ml z gotowym KGM-2 + 5% FCS. Wysiew 1 x 105 hEK na każdy żel. Inkubować żele przez 45 minut w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ), aby umożliwić przyleganie komórek.</li>
	<li>Zanurzyć żele w KGM-2 ready + 5% FCS i hodować je w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).</li>
</ol>
3. Kultura ekwiwalentów skóry pełnej grubości (ftSE)
<ol>
	<li>Hodowla ftSE przez 6-7 dni w malejącym stężeniu FCS (5%, 2% i 0% FCS). Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni z następnym niższym stężeniem FCS. W tym celu całkowicie usuń podłoże i dodaj 1,6 ml świeżego podłoża.</li>
	<li>W dniu 7 całkowicie usuń podłoże. 
	UWAGA: Nie dotykaj przy tym powierzchni ftSE końcówką pipety.</li>
	<li>Umieść każdą wkładkę w 1 dołku na 6-dołkowej płytce ze sterylnymi kleszkami. Dodaj 1,5 ml pożywki powietrznej do każdego dołka, uważając, aby nie zmoczyć powierzchni ftSE. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni przez dodatkowe 14 dni. 
	UWAGA: Poziom napełnienia pożywki wynosi do menisku ftSE.</li>
</ol>
4. Analiza histologiczna
<ol>
	<li>Utrwalanie i zatapianie parafiny w ftSE
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę hodowlaną, przenieść wkładki do świeżych 24-dołkowych płytek i utrwalić tkanki, dodając 1,6 ml 4% paraformaldehydu do każdej studzienki i inkubować tkanki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Uwaga! Paraformaldehyd jest toksyczny, manipuluje pod wyciągiem. Przenieś ftSE do kasety z zatopieniem tkanki. Usuń pozostały utrwalacz, przemywając go wodą i odwodnić tkankę za pomocą rosnących stężeń etanolu.</li>
		<li>Podziel odpowiednik skóry pionowym nacięciem pośrodku. Umieść dwa kawałki w metalowej formie wypełnionej parafiną z przyciętymi powierzchniami w dół. Dodaj kasetę z bibułkami na wierzchu formy jako podkład.</li>
		<li>Pokrój plastry o grubości 3-5 μm i umieść je na łaźni wodnej o temperaturze 40 °C w celu oczyszczenia, zamontuj szkiełka na odpowiednich szkiełkach mikroskopowych. Dokładnie wysuszyć plastry.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz immunohistochemią (IHC)
	<ol>
		<li>Umieścić szkiełka podstawowe w stojaku i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C. Upewnij się, że parafina jest stopiona. Ponownie nawodnione plastry należy zabarwić za pomocą H&E jako znormalizowanego barwienia przeglądowego.</li>
		<li>Do barwienia H&E przygotuj 4x szklane kuwety do barwienia z ksylolem, 3x z etanolem 96%, 2x z etanolem 70%, 1x z etanolem 50%, 4x wodę dejonizowaną, 1x hematoksylinę, 1x HCl-etanol (13,7 ml 1 M HCl i 200 ml 50% etanolu), 1x wodę w tabletce, 1x eozynę (1 g eozyny w 100 ml wody dejonizowanej) i 2x 2-propanol.</li>
		<li>Umieść szkiełka na 10 minut w ksylolu I i 10 minut w ksylolu II w celu odparafinowania i ponownego uwodnienia szkiełek. Szkiełka zanurzeniowe 3x w etanolu 96% I, 3x w etanolu 96% II, 3x w etanolu 70% i 3x w etanolu 50%. Obracaj szkiełka w wodzie dejonizowanej. Aby rozróżnić barwnik hematoksyninowy, zanurz 2x w HCl-etanolu. Spłucz w wodzie dejonizowanej. W celu zaniebieszczenia umieść szkiełka na 5 minut w wodzie z zakładkami. W przypadku barwienia eozyną umieść szkiełka na 1 minutę w eozynie, a następnie umyj w wodzie dejonizowanej. W celu odwodnienia zanurz szkiełka 2x w etanolu 70%, 2x w etanolu 96% i umieść je na 5 minut w 2-propanolu I, na 5 minut w 2-propanolu II, 5 minut w ksylolu I i 5 minut w ksylolu II. Po barwieniu H&E jądra komórkowe są barwione na niebiesko, cytoplazma i macierz zewnątrzkomórkowa są barwione na czerwono.</li>
		<li>W celu pobrania antygenu usuń parafinę ksylenem i ponownie uwodnij plastry do barwienia. Umieść plastry w parowarze i gotuj odparafinowane i ponownie uwodnione plastry przez 20 minut w podgrzanym 10 mM buforze cytrynianowym (pH 6).</li>
		<li>Umieść szkiełka w buforze do mycia (bufor PBS + 0,5% Polysorbat 20) i zakreśl plasterki za pomocą płynoodpornego markera do slajdów, pisaka lub rysika diamentowego.</li>
		<li>Umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej. Zablokuj endogenną peroksydazę, dodając 100 μl 3% roztworu nadtlenku wodoru na każdy plasterek. Ostrożność! Bardzo niebezpieczne w przypadku kontaktu ze skórą i oczami. Obchodzić się z osobistymi środkami ochrony osobistej. Umyj szkiełka w buforze myjącym.</li>
		<li>Zastosować przeciwciało pierwszorzędowe i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć szkiełka trzykrotnie buforem do mycia. Od tego momentu próbki należy przechowywać w ciemności.</li>
		<li>Użyj systemu wykrywania biotyny i streptawidyny do wykrywania specyficznego wiązania antygen-przeciwciało.</li>
		<li>Przeciwbarwić jądra hematoksyliną przez 1 min. Odwodnić i zamontować szkiełka.</li>
		<li>Obrazowanie próbek za pomocą mikroskopu odwrotnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Obrażenia spowodowane użyciem automatycznego urządzenia do ranienia (aWD)
<ol>
	<li>Przygotuj aWD, dezynfekując obszar roboczy 70% etanolem i światłem ultrafioletowym. Upewnij się, że zamocowana jest głowica wiertarska o żądanym rozmiarze (np. 1 mm).</li>
	<li>Umieść odpowiedniki skóry w wyznaczonych obszarach autoklawizowanej płytki nośnej próbki za pomocą sterylnych kleszczy. Umieść płytkę nośną próbki w gnieździe pod głowicą wiertarską.</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania sterującego ustaw parametry nawijania w następujący sposób: prędkość wirowania: 15 000 obr./min; penetracja: 1,5 mm; napęd: 100 Hz. Parametry te muszą być zdefiniowane indywidualnie dla każdego typu próbki. Przenieś parametry nawijania do aWD.</li>
	<li>Rozpocznij procedurę ranienia. Wyjąć płytkę nośną próbki z gniazda. Przenieś zraniony ftSE z powrotem do wkładek używanych do hodowli za pomocą sterylnych kleszczy.</li>
	<li>Kontynuuj posiew zranionego ftSE w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) w celu zbadania regeneracji. Alternatywnie, w dowolnym momencie można użyć modeli do analizy histologicznej.</li>
</ol>

<ol><li>Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin%3A+an+indispensable+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The skin: an indispensable barrier.</a> Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).</li>
<li>Guo, S., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Factors affecting wound healing.</a> J Dent Res. 89, 219-229 (2010).</li>
<li>Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wound+healing+process%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatol+Clin%22%5BJournal%5D)">The wound healing process.</a> Dermatol Clin. 11, 629-640 (1993).</li>
<li>Cory, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch-wound+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Scratch-wound assay.</a> Methods Mol Biol. 769, 25-30 (2011).</li>
<li>Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+skin+cells+in+3D+rather+than+2D+improves+their+ability+to+survive+exposure+to+cytotoxic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents.</a> J Biotechnol. 122 (3), 372-381 (2006).</li>
<li>Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+in+vitro+model+of+tissue-engineered+human+skin+to+study+keratinocyte+attachment+and+migration+in+the+process+of+reepithelialization%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization.</a> Wound Repair Regen. 14 (2), 203-209 (2006).</li>
<li>Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+bilayered+living+skin+construct+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Development of a bilayered living skin construct for clinical applications.</a> Biotechnol Bioeng. 43 (8), 747-756 (1994).</li>
<li>Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+3D+organotypic+cultures+using+human+neonatal+epidermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells.</a> Nat Protoc. 2 (1), 178-186 (2007).</li>
<li>Boyce, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+substitutes+from+cultured+cells+and+collagen-GAG+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers.</a> Med Biol Eng Comput. 36 (6), 791-800 (1998).</li>
<li>El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+PEGT%2FPBT+as+a+dermal+scaffold+for+skin+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering.</a> Biomaterials. 25 (5), 2987-2996 (2004).</li>
<li>Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+growth+regulation+in+fibroblast+cocultures+via+a+double+paracrine+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism.</a> J Cell Sci. 112 (Pt 12), 1843-1853 (1999).</li>
<li>Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+burn+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro burn wound model.</a> Wound Repair Regen. 16 (4), 559-567 (2008).</li>
<li>Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+wound+model+based+on+the+co-culture+of+human+dermal+microvascular+endothelial+cells+and+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts.</a> Biol Cell. 99 (4), 197-207 (2007).</li>
<li>Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+model+of+partial+thickness+scald+burns+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A standardized model of partial thickness scald burns in mice.</a> J Surg Res. 80 (1), 69-74 (1998).</li>
<li>Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+type%2C+but+neither+race+nor+gender%2C+influence+epidermal+permeability+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function.</a> Arch Dermatol. 131 (10), 1134-1138 (1995).</li>
<li>Pilcher, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+collagenase-1+expression+requires+an+epidermal+growth+factor+receptor+autocrine+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism.</a> J Biol Chem. 274 (15), 10372-10381 (1999).</li>
<li>Blank, I. H., Miller, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+separation+of+the+epidermis+from+the+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A method for the separation of the epidermis from the dermis.</a> J Invest Dermatol. 15 (1), 9-10 (1950).</li>
<li>El Ghalbzouri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+facilitate+re-epithelialization+in+wounded+human+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents.</a> Lab Invest. 84 (1), 102-112 (2004).</li>
<li>Vaughan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+laser-wounded+skin+equivalent+model+to+study+the+effects+of+aging+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Res%22%5BJournal%5D)">A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro.</a> Rejuvenation Res. 7 (2), 99-110 (2004).</li>
<li>Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+model+of+wound+healing+based+on+transplanted+tissue-engineered+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin.</a> Tissue Eng. 10 (7-8), 1006-1017 (2004).</li>
<li>Bell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstitution+of+living+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The reconstitution of living skin.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 2s-10s (1983).</li>
<li>Asselineau, D., Prunieras, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+%27simplified%27+skin%3A+control+of+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication.</a> Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 219-222 (1984).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Komórki in vitro są zwykle namnażane w dwuwymiarowych hodowlach komórkowych, w których komórki przylegają do powierzchni z tworzywa sztucznego. Jednak te warunki hodowli nie odzwierciedlają fizjologicznych warunków trójwymiarowych, w których komórki rosną in vivo. W warunkach trójwymiarowych komórki mogą tworzyć naturalne przyłącza komórka-komórka i komórka-matryca i migrować w trzech wymiarach. Szczególnie w przypadku gojenia się ran skórnych podobieństwo do sytuacji in vivo ma kluczowe znacze...

Skóra jest największym organem ciała. Tworzy barierę między środowiskiem zewnętrznym a narządami wewnętrznymi. Ponadto skóra chroni organizm przed utratą płynów, wpływami środowiska, urazami i infekcjami oraz pomaga regulować temperaturę ciała1. Ze względu na odsłonięte miejsce, skóra jest często dotknięta urazami mechanicznymi, termicznymi lub chemicznymi. Chociaż skóra jest ogólnie zdolna do samonaprawy, wiele czynników miejscowych, takich jak infekcja, dotlenienie i niewydolność żylna, może prowadzić do upośledzenia gojenia się ran. Gojenie się ran może być również zaburzone przez czynniki ogólnoustrojowe, takie jak otyłość, alkoholizm, palenie tytoniu, leki, odżywianie i choroby, takie jak cukrzyca. cyfra arabska
Proces gojenia się ran można podzielić na 3 fazy: (i) fazę zapalną, (ii) fazę proliferacyjną i (iii) fazę przebudowy. Po zranieniu skóry rozpoczyna się złożona kaskada sygnałowa, prowadząca do zamknięcia rany. 3 Po urazie rana krwawi i tworzy się skrzep krwi. Fibroblasty przemieszczają się do skrzepu krwi i zastępują go nową tkanką, która jest następnie przebudowywana przez lata.
Obecne zrozumienie procesów biologicznych leżących u podstaw naprawy skóry jest ograniczone. Modele małych zwierząt i świń zostały wykorzystane do badania gojenia się ran. Jednak wyników tych nie można bezpośrednio przenieść na ludzi ze względu na różnice specyficzne dla gatunku. Oprócz tych modeli in vivo, niektóre aspekty gojenia się ran można badać, symulując sytuację rany poprzez drapanie monowarstwowych kultur in vitro opartych na unieśmiertelnionych liniach komórkowych lub komórkach pierwotnych. 4 Te modele drapania są wysoce ustandaryzowane, ale nie odzwierciedlają w wystarczającym stopniu złożonej fizjologii in vivo. 5 Oprócz modeli dwuwymiarowych na potrzeby badań dermatologicznych opracowano trójwymiarowe odpowiedniki ludzkiej skóry. Część skórna tych modeli jest generowana przy użyciu różnych rusztowań, w tym pozbawionej komórek skóry właściwej6, hydrożeli kolagenowych,7,8 glikozaminoglikanów9 lub materiałów syntetycznych. 10 Wykorzystując te odpowiedniki skóry, można badać rolę oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych11, reepitelializację, przesłuch komórkowy między fibroblastami a keratynocytami oraz wpływ różnych czynników wzrostu. Co więcej, modele te są przydatne do zdobycia nowej wiedzy na temat tego, w jaki sposób fibroblasty migrują do zranionego obszaru i jak czynniki chemotaktyczne wpływają na regenerację tkanek. 12
Nie tylko generowanie modelu gojenia ran samo w sobie jest wyzwaniem, ale także ustalenie wysoce ustandaryzowanej rany w modelu jest problematyczne. Powszechnymi technikami tworzenia ran są testy zadrapań, 13 oparzeń, 14 ścieranie taśmy, 15 urazy termiczne, 16 pęcherzy ssących, 17 ciekłego azotu, 18 laserów, 19 skalpeli, 18 mesherów6 i stemple biopsyjne. 20 Większość z tych metod ma te same pułapki. Urazy wdrażane ręcznie są trudne do standaryzacji i odtworzenia między wieloma testami. Wielkość, kształt i głębokość rany różnią się w zależności od badania, a tym samym pogarszają jakość danych badawczych. Zastosowanie lasera do zdefiniowanych ran skóry może być stosunkowo łatwo ustandaryzowane, ale prowadzi do sytuacji naśladującej rany oparzeniowe. Ciepło stosowane laserem może powodować denaturację białek, agregację płytek krwi lub zwężenie naczyń, co może prowadzić do martwicy tkanki.
W alternatywnym podejściu, opracowaliśmy automatyczne urządzenie do ranienia (aWD), które pozwala nam generować zdefiniowane i precyzyjne rany skórne w sterylnych warunkach. Parametry nawijania, takie jak głębokość i prędkość penetracji oraz obroty głowicy wiertarskiej, można regulować. W tym badaniu połączyliśmy aWD z opracowanymi przez nas odpowiednikami skóry o pełnej grubości (ftSE), które są porównywalne z protokołem opublikowanym przez Gangatirkar i wsp. 8 Warstwa skórna odpowiednika skóry składa się z ludzkich fibroblastów skóry (hDF), które są osadzone w hydrożelu kolagenu I. Na warstwie skórnej wysiewane są ludzkie keratynocyty naskórka (hEK). W ciągu dwóch tygodni na granicy faz powietrze-ciecz hEK tworzy naskórek składający się z kilku ważnych warstw komórek i warstwy rogowej naskórka. Oprócz wygenerowania tego modelu, badanie to pokazuje wykorzystanie aWD do tworzenia zdefiniowanych i precyzyjnych ran w ftSE.

<table><tbody><tr><td>Trypsyna EDTA (1:250) 0,5% w DPBS</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td>0,05%</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen (6 mg / ml w 0,1% kwasie octowym)</td><td>Wyprodukowany w domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna Białko ludzkie, osocze (50&nbsp; &mikro; g / ml)</td> <td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki</td><td>Nunc</td><td>140627</td><td></td></tr><tr><td>płytka 6-dołkowa&nbsp;</td><td>Szkiełko mikroskopowe Nunc</td><td>140685</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe</td><td>142485</td><td></td><td>Nunc</td></tr> R<tr><td></td><td>. Langenbrinck</td><td>03-0070</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Fibroblasts hodowla (500 ml):</td></tr><tr><td>DMEM, wysoki poziom glukozy</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>89% (445 ml)</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Bio & Sprzedaj</td><td>SKO. ADD.0500</td><td>10% (50 ml)</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1% (5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4"><silna>Pożywka do hodowli keratynozyny (500 ml):</td></tr><tr><td>Keratynocyte Pożywka wzrostowa 2</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-20111</td><td>89% (445 ml)</td></tr><tr><td>Pożywka dla wzrostu keratynocytów 2 Suplement</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-39011</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1% (5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Roztwór neutralizujący żel (250 ml):</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium, wysoka zawartość glukozy w proszku z L-glutaminą</td><td>PAA</td><td>G0001,3010</td><td>93% (232,5 ml)</td></tr><tr><td>Sól sodowa siarczanu chondroityny z chrząstki rekina</td><td>Sigma</td><td>C4384-1g</td><td>1% (2,5 ml)</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Bio & Sprzedaj</td><td>SKO. ADD.0500</td><td>3% (7,5 ml)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H3375-1kg</td><td>3% (7,5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4"><mocny>Podłoże do modelu skóry (500&nbsp; ml):</td></tr><tr><td>Keratynocyte Pożywka wzrostowa 2</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-20111</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka wzrostowa keratynocytów 2 Pakiet uzupełniający</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-39011</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Bio & Sprzedaj</td><td>SKO. ADD.0500</td><td>5%-2% (25 ml-10 ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1% (5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4"><silna>Podłoże na granicy powietrze-ciecz model skóry (500 ml):</td></tr><tr><td>Keratynocyte Growth Medium 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pakiet suplementów</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-39011</td><td>dodając tylko suplementy: insulinę, hydrokortyzon, epinefrynę, transferynę, CaCl2</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1% (5 ml)</td></tr><tr><td>CaCl2 (300 mM)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C7902-500g</td><td>0,62% (3,1 ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Histology:</td></tr><tr><td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td><td>DCS</td><td>PD000KIT</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wimentyny</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CK14</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>HPA023040-100 i mikro; l</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CK10</td><td>Dako</td><td>M7002</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Filaggrin</td><td>Abcam</td><td>ab81468</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">H& Barwienie E: < / silne></td></tr> <tr><td>Mayer i ostre; s Haemalaun</td><td>AppliChem</td><td>A0884,2500</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296325-4X2L</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-4X2.5L</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009-5G</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanolol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Mocowanie medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1289-10ML</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Modele in vitro są opłacalną i etyczną alternatywą do badania procesów gojenia się ran skórnych. Co więcej, dzięki wykorzystaniu komórek ludzkich, modele te lepiej odzwierciedlają sytuację ran u ludzi niż modele zwierzęce. Chociaż modele dwuwymiarowe są szeroko stosowane do badania procesów takich jak migracja i proliferacja komórek, do uzyskania głębszej wiedzy na temat gojenia się ran potrzebne są modele, które są bardziej złożone. Oprócz odpowiedniego systemu modelowego, generowanie precyzyjnych i powtarzalnych ran ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia porównywalnych wyników między różnymi seriami testowymi. W tym badaniu pokazano generowanie trójwymiarowej skóry o pełnej grubości odpowiadającej badanemu gojeniu się ran. Część skórna modeli składa się z ludzkiego fibroblastu skórnego osadzonego w hydrożelu kolagenu typu I ze szczurzego ogona. Po inokulacji ludzkimi keratynocytami naskórka i wynikającej z tego hodowli na granicy faz powietrze-ciecz, na modelach tworzy się wielowarstwowy naskórek. Aby zbadać proces gojenia się ran, opracowaliśmy dodatkowo zautomatyzowane urządzenie do ranienia, które generuje standaryzowane rany w sterylnej atmosferze.

Izolowane hDF i hEK różnią się zarówno pod względem morfologii, jak i ekspresji typowych markerów. hDF wykazywały typową morfologię wrzecionowatą, podczas gdy morfologię hEK można opisać jako brukową. Przed wykorzystaniem komórek do ftSE przeprowadzono ich charakterystykę za pomocą barwienia immunohistochemicznego (Rysunek 1). hDF są pozytywne w kierunku wimentyny (Rysunek 1A), która jest markerem fibroblastów. Pierwotne hEK wykazują wysoką ekspresję białka wczesnego różnicowania, cytoke...

Celem tego protokołu jest stworzenie trójwymiarowego odpowiednika skóry o pełnej grubości, który przypomina naturalną skórę. Dzięki specjalnie skonstruowanemu zautomatyzowanemu urządzeniu do nawijania można generować precyzyjne i powtarzalne rany przy zachowaniu bezpłodności.

Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości, który przypomina skórę naturalną, oraz wygenerowanie precyzyjnych i powtarzalnych ran w warunkach sterylnych przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do zadawania ran. Osiąga się to poprzez wstępne osadzenie pierwotnych ludzkich fibroblastów skórnych w hydrożelu z kolagenu typu I. Następnie na wierzchu hydrożelu powleczonego fibronektyną osadza się pierwotne ludzkie keratynocyty naskórka.Następnie model jest hodowany w warunkach zanurzenia, a następnie w warunkach interfejsu powietrze-ciecz, w wyniku czego tworzy się trójwymiarowy pełnowarstwowy ekwiwalent skóry, składający się z komponentu dermalnego i wielowarstwowego naskórka. Na koniec w sterylnym środowisku powstaje ustandaryzowana rana. Ostatecznie, do oceny struktury histologicznej rannego pełnowarstwowego ekwiwalentu skóry wykorzystuje się barwienie immunohistochemiczne i mikroskopię.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak na przykład modele zwierzęce, jest fakt, że ekwiwalent skóry o pełnej grubości składa się z pierwotnych ludzkich komórek. Dzięki zastosowaniu zautomatyzowanego urządzenia do zadawania ran możemy generować ustandaryzowane uszkodzenia, co pozwala zautomatyzowanemu urządzeniu do zadawania ran dostarczyć wiedzy na temat procesów gojenia ran skóry w środowisku zhumanizowanym. Metodę tę można zastosować również w naszych systemach, takich jak inżynieria tkanki kostnej.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące gojenia ran, takie jak procesy biologiczne leżące u podstaw regeneracji skóry oraz komunikacja międzykomórkowa pomiędzy komponentem naskórkowym a skórą właściwą. Aby rozpocząć, rozpuść kolagen w 0,1% kwasie octowym do końcowego stężenia 6 mg/mL. Przygotuj roztwór do neutralizacji żelu, mieszając 232,5 ml 2X DMEM, 7,5 ml FCS, 7,5 ml 3 M HEPES oraz 2,5 ml roztworu o stężeniu 5 mg/mL.Umieść wkłady siarczanu chondroityny w dołkach płytki 24-dołkowej, odklej ludzkie fibroblasty skórne (HDF) i odwiruj zawiesiny komórkowe przez pięć minut przy 270 G. Policz komórki i odwiruj aliquot zawierający 1 200 000 HDF przez pięć minut przy 270 G, usuń nadsącz i użyj 4 mL schłodzonego roztworu neutralizującego żel, aby ostrożnie resuspendować HDF, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.Następnie resuspender roztwór w ośmiu mililitrach roztworu kolagenu. Potem, za pomocą pipety wielokanałowej, dodać 500 µL mieszaniny komórek z kolagenem do każdego wkładu. W płytce 24-dołkowej inkubować żele przez 20 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2, aby umożliwić ich zestalenie.Następnie użyj 2 mL DMM z dodatkiem 10% FCS na każdą studnię. Aby żele były całkowicie zanurzone, inkubuj je przez 24 h. Użyj wody ultrapure do rozpuszczenia ludzkiej fibonektyny do końcowego stężenia 50 µg/mL.Po inkubowaniu żeli ekwiwalentu skóry właściwej przez 24 godziny należy usunąć medium. Należy użyć 25 µL roztworu fibronektyny, aby pokryć każdy ekwiwalent skóry właściwej, i inkubować żele przez 30 minut. W tym czasie należy resuspender ludzkie keratynocyty epidermalne lub HKS w medium kgm two plus 5% FCS do końcowego stężenia 1 miliona komórek na litr i wysiać 100 000 heeks na wierzchu każdego żelu.Następnie inkubuj żele przez 45 minut, aby umożliwić adhezję komórek, używając pożywki kgm two ready z dodatkiem 5% FCS; zanurz komórki i kontynuuj inkubację. Po inkubacji przez dwa do trzech dni wymień pożywkę na taką z 2% FCS, a następnie, dwa lub trzy dni później, wymień pożywkę na taką bez FCS. Siódmego dnia całkowicie usuń pożywkę.Za pomocą sterylnej pęsety umieść każdy wkład w oddzielnej studni płytki 6-dołkowej. Następnie dodaj 1,5 milliliters pożywki airlift do każdej studni, uważając, aby nie zamoczyć powierzchni FTSC.Wymieniaj medium co dwa do trzech dni przez kolejne 14 dni. Przygotuj automatyczne urządzenie do zadawania ran, dezynfekując obszar roboczy za pomocą 70% etanolu i światła ultrafioletowego przy użyciu sterylnej pęsety. Umieść ekwiwalenty skóry w wyznaczonych obszarach płyty nośnej próbek w autoklawie.Umieść płytkę z próbkami w gnieździe poniżej głowicy wiertniczej. Za pomocą oprogramowania sterującego ustaw parametry nacinania w następujący sposób: prędkość obrotowa 15 000 RPM, głębokość penetracji 1,5 millimeters.Napęd 100 Hz. Przenieś parametry zranienia do zautomatyzowanego urządzenia do zadawania ran. Po zakończeniu rozpocznij procedurę zranienia.Wyjmij płytkę z nośnikiem próbki z gniazda i za pomocą sterylnej pęsety przenieś uszkodzony FTSE z powrotem do wkładki używanej do hodowli. Inkubuj uszkodzony FTSE do czasu przeprowadzenia oceny eksperymentalnej. Modele można wykorzystać do analizy histologicznej w dowolnym momencie.Wyizolowane HDFS i HKS poddano charakterystyce poprzez barwienie immunohistochemiczne przed ich wykorzystaniem do FTSE. HDF wykazują pozytywną reakcję na menton, marker fibroblastów; pierwotne HEK wykazują wysoką ekspresję białka wczesnego różnicowania CYTOKERATIN 14, lecz prawie całkowity brak białka późnego różnicowania keratynocytów CYTOKERATIN 10. FTSE hodowano przez siedem dni w warunkach zanurzenia w pożywce, a następnie przez 14 dni na granicy fazy powietrze-ciecz.W trakcie tego procesu FTSC ulega znacznemu obkurczeniu w ciągu 21 dni. Komórki HEK proliferują poprzez zmianę poziomu medium w taki sposób, aby powierzchnia modeli była wystawiona na działanie powietrza. Poprzez zwiększenie stężenia wapnia komórki HKS są stymulowane do różnicowania się w wielokomórkowy naskórek, który składa się z kilku żywotnych warstw keratynocytów.W różnych stanach różnicowania D oraz w rogówce przedsionka. Porównując barwienie hematoksyliną i eozyną FTSE z natywną skórą ludzką, staje się oczywiste, że FTSE naśladuje architekturę histologiczną skóry. HDF w hydrożelu kolagenowym typu one można barwić przeciwciałami pierwotnymi przeciwko wimentynie.Dodatkowo keratynocyty tworzą warstwę naskórkową składającą się z komórek pozytywnych pod kątem cytokeratyny 14 oraz późnego markera różnicowania. CYTOKERATIN 10 jest ekspresowany w warstwach nadbazalnych. Co więcej, stratum corneum jest pozytywne pod kątem RIN po jego wykształceniu.Technika ta otworzyła przed badaczami z dziedziny dermatologii drogę do eksploracji gojenia ran skórnych oraz opracowania zstandaryzowanego układu in vitro, który ściśle naśladuje ludzką skórę.

generation-three-dimensional-full-thickness-skin-equivalent-automated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Generacja trójwymiarowego równoważnika skóry o pełnej grubości i zautomatyzowane rany

Ten film opisuje szczegółowy protokół generowania organotypowych rekonstrukcji skóry in vitro 3D w celu zbadania progresji czerniaka. Ten model skóry naśladuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządów in vivo.

Generowanie organotypowych rekonstrukcji całej skóry: procedura tworzenia modelu 3D skóry na podstawie próbek ludzkiej skóry

Unaczynienie jest kluczem do skutecznego podejścia do inżynierii tkankowej. W związku z tym potrzebne są niezawodne technologie do oceny rozwoju sieci naczyniowych w konstruktach tkankowych. Tutaj przedstawiamy prostą i opłacalną metodę wizualizacji i ilościowego określania unaczynienia in vivo.

Pełny model ubytku skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo

Podczas rozwoju ssaków, rany skóry na wczesnym etapie ciąży goją się bez blizny. Tutaj szczegółowo opisujemy wiarygodny i powtarzalny model gojenia się ran bez blizn płodu w grzbietu skóry zarodków myszy E16.5 (bez blizn) i E18.5 (bliznowaciejących).

Model skóry płodu myszy z gojeniem ran bez blizn

Ten artykuł przedstawia metody wytwarzania i charakteryzowania konformalnego, podobnego do skóry systemu elektronicznego oraz protokoły do wykorzystania w zastosowaniach klinicznych, szczególnie w leczeniu ran skórnych.

Wytwarzanie i charakterystyka konforemnego, przypominającego skórę elektronicznego systemu do ilościowego leczenia ran skórnych

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego i szczegółowego protokołu generowania genetycznie zmodyfikowanej ludzkiej organotypowej skóry z keratynocytów naskórka i zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej

Protokół opisuje nową metodę dezagregacji tkanek ludzkich i tworzenia autologicznych mikro-przeszczepów, które w połączeniu z gąbkami kolagenowymi dają początek ludzkim bio-kompleksom gotowym do użycia w leczeniu zmian skórnych. Co więcej, system ten zachowuje żywotność mikroprzeszczepów w różnym czasie po mechanicznej dezagregacji.

Charakterystyka tkanek po nowej metodzie dezagregacji do generowania mikroprzeszczepów skóry

Ten protokół opisuje prostą metodę hodowli trójwymiarowego, zrekonstruowanego ludzkiego naskórka w powtarzalny i solidny sposób. Dodatkowo scharakteryzowano zależność struktura-funkcja modelu bariery naskórkowej. Przedstawiono również reakcje biologiczne zrekonstruowanego naskórka ludzkiego na bodźce prozapalne.

Hodowla trójwymiarowego zrekonstruowanego ludzkiego naskórka na dużą skalę

Celem tego protokołu jest opisanie generacji i analizy objętościowej unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry przy użyciu dostępnych i prostych technik dla długoterminowej hodowli. W miarę możliwości opisano uzasadnienie kroków, aby umożliwić badaczom dostosowanie ich do ich potrzeb badawczych.

Generacja samoorganizujących się unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry

Tutaj prezentujemy protokół do generowania trójwymiarowego, uproszczonego i niezróżnicowanego modelu skóry za pomocą mikroobrabianej platformy mikroprzepływowej. Podejście oparte na przepływie równoległym pozwala na osadzanie na miejscu komory skórnej w celu wysiewu komórek nabłonka na wierzchu, a wszystko to kontrolowane przez pompy strzykawkowe.

Generowanie uproszczonego trójwymiarowego modelu typu skin-on-a-chip w mikroobrabianej platformie mikroprzepływowej

Tutaj prezentujemy niedrogie i proste procedury wprowadzania różnych modeli 3D skóry do rutynowych badań w laboratorium hodowli komórkowych. Badacze mogą tworzyć modele dostosowane do ich potrzeb bez konieczności polegania na modelach dostępnych na rynku.

Tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2D) monokultury do trójwymiarowej (3D) wielokulturowości

Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości z wykorzystaniem ludzkich fibroblastów i keratynocytów. Automatyczne urządzenie do zadawania ran zapewnia powtarzalność w warunkach sterylnych.

Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Przeglądaj więcej filmów