Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Ogólnym celem tej procedury jest zbudowanie trójwymiarowego odpowiednika skóry o pełnej grubości, który przypomina naturalną skórę oraz wygenerowanie precyzyjnych i powtarzalnych ran w sterylnych warunkach za pomocą automatycznego urządzenia do ranienia. Osiąga się to poprzez pierwsze osadzenie pierwotnych ludzkich fibroblastów skóry w hydrożelu kolagenowym. Następnie pierwotne ludzkie keratynocyty naskórkowe są osadzone na wierzchu hydrożelu pokrytego fibronektyną.

Następnie model jest hodowany w warunkach zanurzonych, a następnie pod powierzchnią powietrzno-cieczową tworzy się trójwymiarowy odpowiednik skóry o pełnej grubości, składający się ze składnika skórnego i wielowarstwowego naskórka. Na koniec w sterylnym środowisku tworzona jest standaryzowana rana. Ostatecznie barwienie immunohistochemiczne i mikroskopia służą do oceny struktury histologicznej uszkodzonego odpowiednika skóry o pełnej grubości.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak na przykład modele zwierzęce, jest to, że odpowiednik skóry o pełnej grubości składa się z pierwotnych komórek ludzkich. Tak więc wraz z automatycznym urządzeniem do ranienia możemy generować ustandaryzowane rany, dzięki czemu automatyczne urządzenie do ranienia może zapewnić wgląd w procesy gojenia się ran skóry w humanizowanym środowisku. Może być również stosowany w naszych systemach, takich jak inżynieria tkanki kostnej.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące gojenia się ran, takie jak procesy biologiczne, podstawowa naprawa skóry i przesłuch komórkowy między naskórkiem a skórą. Na początek rozpuść kolagen w 0,1% kwasie octowym do końcowego stężenia sześciu miligramów na mililitr. Przygotuj roztwór neutralizujący żel, mieszając 232,5 mililitra dwóch X dmm, 7,5 mililitra FCS, 7,5 mililitra trzech molowców i 2,5 mililitra pięciu miligramów na mililitr.

Siarczan chondroityny umieszcza się w dołkach 24-dołkowej płytki, odłącza ludzkie fibroblasty skórne lub HDFS i odwirowuje zawiesiny komórkowe przez pięć minut. W sile 270 G policz komórki i odwiruj Eloqua o wartości 1 200 000 HDF przez pięć minut. Przy 270 G usunąć i użyć czterech mililitrów schłodzonego roztworu neutralizującego żel, aby ostrożnie zawiesić HDF bez powodowania pęcherzyków powietrza.

Następnie ponownie zamieszaj roztwór z ośmioma mililitrami roztworu kolagenu. Następnie użyj wieloetapowej pipety i dodaj 500 mikrolitrów mieszaniny komórek kolagenowych do każdej wkładki. Na 24-dołkowej płytce inkubuj żele przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby żele mogły się zestalić.

Następnie użyj dwóch mililitrów DMM plus 10% FCS na studzienkę. Aby zanurzyć żele, inkubuj je przez 24 godziny. Użyj ultraczystej wody, aby rozpuścić ludzkie białko fibronektyny do końcowego stężenia 50 mikrogramów na mililitr.

Po inkubacji żeli równoważnych przez skórę przez 24 godziny, usunąć podłoże. Użyj 25 mikrolitrów roztworu fibronektyny, aby pokryć każdy odpowiednik skórny i inkubować żele przez 30 minut. W międzyczasie ponownie zawieź ludzki naskórek, keratynocyty lub HKS za pomocą kgm dwa plus 5% FCS do końcowego stężenia 1 miliona komórek na litr nasion, 100 000 heek na wierzchu każdego żelu.

Następnie inkubuj żele przez 45 minut, aby umożliwić komórkom przyleganie przy użyciu kgm dwa gotowe plus 5% FCS zanurzone komórki i kontynuuj inkubację. Po inkubacji przez dwa do trzech dni zastąp pożywkę 2% FCS, a następnie wymień pożywkę bez FCS, dwa do trzech dni później. Siódmego dnia całkowicie usuń podłoże.

Użyj sterylnych kleszczyków, aby umieścić każdą wkładkę w jednym dołku sześciodołkowej płytki. Następnie dodaj 1,5 mililitra pożywki powietrznej na dołek. Uważając, aby nie zmoczyć powierzchni FTSC.

Zmieniaj podłoże co dwa do trzech dni przez dodatkowe 14 dni. Przygotuj automatyczne urządzenie do nawijania, używając 70% etanolu i światła ultrafioletowego do dezynfekcji obszaru roboczego za pomocą sterylnych kleszczy. Umieść odpowiedniki skóry w wyznaczonych obszarach płytki nośnej próbki w autoklawie.

Umieść płytkę nośną próbki w gnieździe pod głowicą wiertarską. Użyj oprogramowania sterującego, aby ustawić parametry nawijania w następujący sposób. Prędkość wirowania 15 000 obr./min, penetracja 1,5 milimetra.

Napęd 100 Hz. Przenieś parametry nawijania do automatycznego urządzenia do nawijania. Po zakończeniu rozpocznij procedurę zraniania.

Wyjąć płytkę nośną próbki z leja i za pomocą sterylnych kleszczy przenieść zraniony FTSE z powrotem do wkładki używanej do hodowli. Inkubuj zraniony FTSE do czasu oceny eksperymentalnej. Korzystaj z modeli do jego analizy histologicznej w dowolnym momencie.

Wyizolowane HDFS i HKS charakteryzowały się barwieniem immunohistochemicznym przed użyciem ich do FTSE. HDF są dodatnie dla mentonu, markera dla fibroblastów pierwotnego HEK o wysokiej ekspresji białka wczesnego różnicowania CYTOKERATYNY 14, ale prawie nie ma późnego białka różnicowania keratynocytów CYTOKERATYNY 10. FTSE hodowano przez siedem dni w warunkach zanurzenia, a następnie przez 14 dni na granicy faz powietrze-ciecz.

W trakcie tego procesu FTSC zawiera znaczne umowy w ciągu 21 dni. HEK rozmnażają się poprzez zmianę poziomu medium w taki sposób, że powierzchnia modeli jest wystawiona na działanie powietrza. Zwiększając stężenie wapnia, HKS są stymulowane do różnicowania się w wielokomórkowy naskórek, który składa się z kilku ważnych warstw komórkowych keratynocytów.

W różnych stanach różnicowania D i przedsionka rogówki. Porównując barwienie hematyną i eozyną FTSE z rodzimą ludzką skórą, staje się oczywiste, że FTSE naśladuje histologiczną architekturę skóry. HDF w kolagenie jeden hydrożel może być barwiony pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko wimentynie.

Ponadto keratynocyty tworzą warstwę naskórka złożoną z komórek 14-dodatnich cytokeratyny i markera późnego różnicowania. CYTOKERATYNA 10 ulega ekspresji w warstwach super podstawowych. Ponadto St.Stratum cornium jest dodatni dla RIN po jego rozwoju.

Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie dermatologii do zbadania gojenia się ran skórnych i standaryzowanej konfiguracji in vitro, która ściśle naśladuje ludzką skórę.