Opracowanie i walidacja ilościowej metody PCR do diagnostyki herpeswirusa koniowatego-2 w płynach oddechowych

Ogólnym celem metody qPCR jest ocena miana wirusa herpes equine-2 w próbkach biologicznych pobranych od koni. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie diagnostyki chorób układu oddechowego u koni, dostarczając ilościowych danych służących jako nowe pomoce interpretacyjne dla praktyków. Główną zaletą tej techniki jest jej wysoka czułość, swoistość oraz szybkość wykonania.

Kolejną zaletą jest opracowanie zgodnie z normą AFNOR NF U47-600, która reprezentuje Francję w międzynarodowym komitecie normalizacyjnym. Procedurę zaprezentuje Erika Hue, młoda badaczka z mojej jednostki. Aby wyizolować kwasy nukleinowe z biologicznej próbki płynów z dróg oddechowych, należy w dygestorium zacząć od dodania 140 µL próbki biologicznej do 560 µL roztworu lizującego, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Do próbki należy dodać 560 µL etanolu, a następnie nanieść 630 µL całkowitego roztworu na kolumnę krzemionkową i odwirować. Pozostałe 630 µL należy nanieść na kolumnę krzemionkową i ponownie odwirować. Po naniesieniu próbki na kolumnę należy dwukrotnie przemyć ją, używając po 500 µL buforów płuczących AW1 i AW2.

Następnie, aby eluować kwasy nukleinowe z kolumny, dodaj 50 µL buforu do elucji lub buforu AVE o temperaturze pokojowej. Zamknij nakrętkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Następnie wiruj przy 6 000 ×g przez jedną minutę.

Aby przeprowadzić amplifikację DNA, po miareczkowaniu starterów i sondy zgodnie z protokołem tekstowym, przygotować dla każdej reakcji 22,5 µL mieszaniny reakcyjnej, dodając 12,5 µL master mixu do PCR, startery bezpośrednie i odwrotne o stężeniu 20 µM, sondę o stężeniu 10 µM oraz odpowiednią ilość wody ultra-czystej, aby uzyskać objętość 22,5 µL. Aby uniknąć kontaminacji, mieszaninę reakcyjną do PCR należy zawsze przygotowywać w wydzielonej strefie. Odmierzyć 22,5 µL odpowiedniej mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka płytki 96-dołkowej.

Należy uwzględnić kontrole negatywne dla ekstrakcji i PCR, aby upewnić się, że żadne z odczynników nie są zanieczyszczone niepożądanym DNA. Następnie należy dodać 2,5 µL próbki, kontroli negatywnej ekstrakcji, kontroli negatywnej PCR lub próbki kontroli pozytywnej do odpowiednich studzienek reakcyjnych. Płytkę należy następnie przykryć samoprzylepną folią uszczelniającą.

Następnie wiruj przez 10 sekund przy 6 000 gs. Umieść płytkę w systemie do PCR w czasie rzeczywistym. Następnie wybierz szablon układu analizy oraz ustawienia programu PCR przedstawione tutaj i rozpocznij pomiar.

Po przeniesieniu surowych danych z systemu PCR w czasie rzeczywistym do arkusza kalkulacyjnego, ustaw próg na wykresach amplifikacji powyżej linii bazowej i w obrębie regionu wzrostu wykładniczego, aby uzyskać cykl progowy dla każdej próbki. Wykreśl każdy punkt zestawu standardów jako krzywą standardową w celu uzyskania liniowości. Następnie oblicz liczbę kopii dla poszczególnych próbek na podstawie krzywej standardowej.

Aby wyznaczyć granicę wykrywalności wyników qRT-PCR, do sześciu probówek należy odmierzyć 90 µL ultra czystej wody. W celu przygotowania sześciu dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu w celu określenia strefy wygaszania sygnału, należy rozpocząć od przeniesienia 10 µL z roztworu roboczego plazmidu do probówki zawierającej 90 µL ultra czystej wody. Probówkę należy krótko wymieszać w wortexie, a następnie odwirować.

Następnie przenieś 10 µL z probówki do kolejnej probówki z wodą. Po wymieszaniu w wortexie i odwirowaniu powtórz przenoszenie, aż wszystkie probówki z wodą otrzymają plazmid. Po amplifikacji DNA w sześciu dziesięciokrotnych rozcieńczeniach seryjnych, zgodnie z opisem w poprzedniej części tego filmu, wyznacz strefę redukcji, czyli ostatnie rozcieńczenie plazmidu dające sygnał dodatni oraz pierwsze rozcieńczenie, w którym nie stwierdzono detekcji.

Aby przygotować sześć dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych, odmierz 25 µL ultra-czystej wody do sześciu probówek. Z ostatniego rozcieńczenia plazmidu, które dało sygnał dodatni w rozcieńczeniach dziesięciokrotnych, przenieś 25 µL z probówki do pierwszej probówki z wodą. Wymieszaj na wortexie i odwiruj w wirówce, a następnie przygotuj pozostałe pięć rozcieńczeń w sposób analogiczny do zaprezentowanego.

Przeprowadź amplifikację DNA z dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych, zgodnie z opisem przedstawionym wcześniej w tym filmie. Po amplifikacji DNA z trzech niezależnych prób oblicz liczbę powtórzeń dodatnich spośród 24 powtórzeń dla każdego poziomu stężenia plazmidu. Wyznacz granicę wykrywalności z ufnością 95% lub LOD 95% PCR, która jest poziomem skutkującym wykryciem 23 powtórzeń dodatnich spośród 24 powtórzeń.

Aby wyznaczyć LOD metody, należy przygotować pięć dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych, zaczynając od 25 µL roboczego roztworu plazmidu, który jest czterokrotnie bardziej skoncentrowany niż ostatnie stężenie z rozcieńczenia dziesięciokrotnego, które dało sygnał dodatni. Plazmid wykorzystywany w etapie amplifikacji pochodzi z roboczego roztworu plazmidu przygotowanego w wydzielonej strefie, aby uniknąć kontaminacji. Jest to krytyczny etap.

Przenieś 5 µL z każdego rozcieńczenia plazmidu do czterech probówek zawierających 135 µL negatywnego materiału zasobowego, aby uzyskać cztery powtórzenia dla pięciu standardów dodatnich. Przeprowadź ekstrakcję czterech powtórzeń dla pięciu standardów dodatnich oraz wykonaj procedurę amplifikacji zgodnie z opisem zawartym we wcześniejszej części tego filmu. Policz liczbę dodatnich powtórzeń z ośmiu powtórzeń dla każdego poziomu stężenia plazmidu.

Na koniec wyznacza się metodę LOD, która jest ostatnim poziomem, przy którym osiem z ośmiu powtórzeń daje wynik dodatni. Opisana w tym filmie metoda ilościowej RT-PCR wykrywa i kwantyfikuje wirus opryszczki koni klasy 2 w płynach z dróg oddechowych. W tym eksperymencie wykonano dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne w celu oszacowania strefy wygaszania, która znajduje się pomiędzy rozcieńczeniami 10⁻⁹ a 10⁻¹⁰.

Wartość LOD PCR została wyznaczona za pomocą nowego dwukrotnego rozcieńczenia seryjnego w strefie redukcji. Aby określić zakres liniowości oraz LOQ PCR, wartość LOD PCR posłużyła jako punkt wyjściowy dla zakresu sześciu dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych pomiędzy 2,6, co stanowi wartość LOD PCR, a 260 000 kopii na 2,5 µl próbki. LOQ PCR to najniższe stężenie w zakresie liniowości.

Charakterystyka całej metody polega na walidacji wszystkich kroków niezbędnych do uzyskania danych qRT-PCR, począwszy od ekstrakcji DNA z próbki materiału z dróg oddechowych, aż po amplifikację i kwantyfikację celu. Wydajność ilościowa całej analitycznej metody qRT-PCR została oceniona i zwalidowana z profilem dokładności przedstawionym na tym wykresie. Obciążenia genomem wirusa EHV2 w 172 próbkach wymazów z nosa koni z zaburzeniami oddechowymi zostały skwantyfikowane w sposób pokazany tutaj.

Ładunki genomu wirusa były wyższe u młodych koni, przy czym najwyższy wykryty ładunek wyniósł 1,9 × 10¹¹ kopii na mililitr. Po opanowaniu technika ta może być przeprowadzana w czasie krótszym niż dwie godziny na jeden etap amplifikacji, a wszystkie etapy walidacji można przeprowadzić w mniej niż cztery tygodnie, pod warunkiem właściwej realizacji. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o unikaniu ryzyka kontaminacji, szczególnie podczas pracy z roztworem plazmidu.

Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące identyfikacji genomu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania ekstrakcji i amplifikacji DNA oraz charakteryzowania ich rezerw PCR. Należy pamiętać, że praca z próbkami biologicznymi, takimi jak patogeny, może być niezwykle niebezpieczna.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w dygestorium oraz w obszarze o odpowiednim poziomie bezpieczeństwa.