Name: Opracowanie i walidacja ilościowej metody PCR do diagnostyki herpeswirusa koniowatego-2 w płynach oddechowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj walidowaną metodę qPCR do wykrywania EHV-2 w płynach oddechowych koni. Ta technika zapewnia czułą i specyficzną ilościową diagnostykę chorób układu oddechowego zgodnie z normą AFNOR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Sophie Castagnet i Nadii Doubli-Bounoua za ich wsparcie techniczne. Prace te uzyskały wsparcie finansowe ze strony Rady Generalnej Calvadosu oraz za zgodą Regionu Dolna Normandia i rządu francuskiego (CPER 2007-2013; projekt R25 p3). Autorzy pragną podziękować ekspertom grupy AFNOR, a w szczególności Jean-Philippe'owi Buffereau i Ericowi Dubois.

<ol><li>Brault, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+of+foals+to+natural+infection+with+equid+herpesvirus-2+and+its+association+with+febrile+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Immunol.Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The immune response of foals to natural infection with equid herpesvirus-2 and its association with febrile illness.</a> Vet.Immunol.Immunopathol. 137 (1-2), 136-141 (2010).</li>
<li>Fortier, G., Van Erck, E., Pronost, S., Lekeux, P., Thiry, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+gammaherpesviruses%3A+pathogenesis%2C+epidemiology+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.J%22%5BJournal%5D)">Equine gammaherpesviruses: pathogenesis, epidemiology and diagnosis.</a> Vet.J. 186 (2), 148-156 (2010).</li>
<li>Hue, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitation+of+equid+gammaherpesviruses+%28EHV-2%2C+EHV-5%29+in+nasal+swabs+using+an+accredited+standardised+quantitative+PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol.Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitation of equid gammaherpesviruses (EHV-2, EHV-5) in nasal swabs using an accredited standardised quantitative PCR method.</a> J Virol.Methods. 198 (1), 18-25 (2014).</li>
<li>Diallo, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+real-time+PCR+for+the+detection+and+differentiation+of+equid+herpesvirus+1+%28EHV-1%29+and+equid+herpesvirus+4+%28EHV-4%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4).</a> Vet.Microbiol. 4 (1-3), 93-103 (2007).</li>
<li>Williams, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+multinodular+pulmonary+fibrosis%3A+a+newly+recognized+herpesvirus-associated+fibrotic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Pathol%22%5BJournal%5D)">Equine multinodular pulmonary fibrosis: a newly recognized herpesvirus-associated fibrotic lung disease.</a> Vet.Pathol. 44 (6), 849-862 (2007).</li>
<li>Mullis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+enzymatic+amplification+of+DNA+in+vitro%3A+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Symp.Quant.Biol%22%5BJournal%5D)">Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction.</a> Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 51 (1), 263-273 (1986).</li>
<li>EPA Office of Water (4607). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EPA-815-B-04-001.+Quality+Assurance%2FQuality+Control+Guidance+for+Laboratories+Performing+PCR+Analyses+on+Environmental+Samples%22">EPA-815-B-04-001. Quality Assurance/Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples</a>. , (2004).</li>
<li>Telford, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+herpesviruses+2+and+5+are+gamma-herpesviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Equine herpesviruses 2 and 5 are gamma-herpesviruses.</a> Virology. 195 (2), 492-499 (1993).</li>
<li>Fortier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+equid+herpesvirus-5+in+respiratory+liquids%3A+A+retrospective+study+of+785+samples+taken+in+2006-2007%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.J%22%5BJournal%5D)">Identification of equid herpesvirus-5 in respiratory liquids: A retrospective study of 785 samples taken in 2006-2007.</a> Vet.J. 182 (2), 346-348 (2009).</li>
<li>Brault, S. A., Bird, B. H., Balasuriya, U. B., MacLachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+heterogeneity+and+variation+in+viral+load+during+equid+herpesvirus-2+infection+of+foals%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic heterogeneity and variation in viral load during equid herpesvirus-2 infection of foals.</a> Vet.Microbiol. 147 (3-4), 253-261 (2011).</li>
<li>Association Francaise de Normalisation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NFU+47-600-1.+Animal+health+analysis+methods-PCR-Part+1%3A+Requirements+and+recommandations+for+the+implementation+of+veterinary+PCR%22">NFU 47-600-1. Animal health analysis methods-PCR-Part 1: Requirements and recommandations for the implementation of veterinary PCR</a>. , (2015).</li>
<li>Association Francaise de Normalisation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NFU+47-600-2.+Animal+health+analysis+methods-PCR-Part+2%3A+Requirements+and+recommendations+for+the+development+and+the+validation+of+veterinary+PCR%22">NFU 47-600-2. Animal health analysis methods-PCR-Part 2: Requirements and recommendations for the development and the validation of veterinary PCR</a>. , (2015).</li>
<li>ISO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EN+ISO-CEI+17025.+General+requirements+for+the+competence+of+testing+and+calibration+laboratories%22">EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories</a>. , (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+of+Diagnostic+Tests+and+Vaccines+for+Terrestrial+Animals+2010.+Chapter1.1.1.4%2F+5.+Principles+and+Methods+of+Validation+of+Diagnostic+Assay+for+Infectious+Diseases%22">Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases</a>. , This thoroughly revised chapter replaces Chapter 1.1.4 Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases and Chapter 1.1.5 Validation and quality control of polymerase chain reaction methods used for the diagnosis of infectious diseases from the sixth edition of the OIE Terrestrial Manual (2009).</li>
<li>Apaza, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+genogrouping+of+noroviruses+from+children%27s+stools+by+Taqman+One-step+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Detection and genogrouping of noroviruses from children's stools by Taqman One-step RT-PCR.</a> J Vis.Exp. (65), e3232(2012).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis.Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Sanger, F., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+sequences+in+DNA+by+primed+synthesis+with+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase.</a> J Mol.Biol. 94 (3), 441-448 (1975).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>NCBI. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22BLAST+Homepage+and+Selected+Search+Pages.+Introducing+the+BLAST+homepage+and+form+elements%2Ffunctions+of+selected+search+pages%22">BLAST Homepage and Selected Search Pages. Introducing the BLAST homepage and form elements/functions of selected search pages</a>. , (2015).</li>
<li>Greiner, M., Gardner, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+diagnostic+tests+in+veterinary+epidemiologic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Prev.Vet+Med%22%5BJournal%5D)">Application of diagnostic tests in veterinary epidemiologic studies.</a> Prev.Vet Med. 45 (1-2), 43-59 (2000).</li>
<li>Blanchard, P., Regnault, J., Schurr, F., Dubois, E., Ribiere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-laboratory+validation+of+chronic+bee+paralysis+virus+quantitation+using+an+accredited+standardised+real-time+quantitative+RT-PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol.Methods%22%5BJournal%5D)">Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method.</a> J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Od 2000 roku PCR w czasie rzeczywistym zastępuje techniki złotego standardu (metody hodowli komórkowych i bakterii) w coraz większej liczbie laboratoriów. Wdrożenie tej techniki jest stosunkowo łatwe. Jednak walidacja metod laboratoryjnych jest niezbędna do molekularnego wykrywania i kwantyfikacji patogenów w celu zapewnienia dokładnych, powtarzalnych i wiarygodnych danych.
Ponieważ etap ekstrakcji jest głównym źródłem utraty materiału biologicznego, można go uznać za główne źródło błędu kwantyfikacji między jednym protokołem a drugim. W związku z tym utworzenie standardowej krzywej plazmidu DNA podczas qRT-PCR, opisywane głównie w literaturze, wskazuje na obciążenie genomem wirusa, ale nie uwzględnia etapu ekstrakcji.
Opis strategii de novo dla całego procesu walidacji metody w normie AFNOR NF U47-600-2 stanowi znaczący postęp w tej dziedzinie. Jak pokazano w tej pracy dla EHV-2 u koni lub innych u pszczół21, wymaga to wyraźnego rozróżnienia między etapem rozwoju a etapem walidacji z charakterystyką PCR i charakterystyką całej metody. Jednym z ograniczeń w tym interesującym podejściu jest to, że każda zmiana w protokole będzie skutkowała obowiązkiem ponownej walidacji całego procesu, co może być bardzo kosztowne. Ograniczenie to zostało również podkreślone przez fakt, że granice oznaczania ilościowego zależą od źródła, z którego wirus jest ekstrahowany (np . płyny oddechowe, narządy, krew lub mocz). W rzeczywistości każda matryca ma inną specyfikę w swojej charakterystyce fizykochemicznej i ważne jest, aby niezależnie zdefiniować każdą inną matrycę używaną do wykrywania i kwantyfikacji wirusa za pomocą qRT-PCR. W ten sposób ładunek genomu wirusa w każdej próbce biologicznej można dokładniej określić ilościowo na podstawie ekstrakcji. Charakterystyka uwzględnia również model termocyklera i w przypadku, gdy zastosowanie wcześniej dobrze scharakteryzowanej metody (np. metody EHV-2 qPCR opisanej w tym artykule) wymaga nowego typu maszyny w laboratorium macierzystym lub innym laboratorium, należy potwierdzić działanie tego urządzenia. Potwierdzenie wykonania testu qPCR jest warunkiem wstępnym dla wszystkich testów wprowadzanych do laboratorium. Zwykle osiąga się to poprzez analizę próbki referencyjnej o znanych właściwościach. Taka kontrola jest warunkiem wstępnym i jest uważana za obowiązkową zgodnie z wymogami normy NF 47-600-1 AFNOR w celu walidacji skuteczności qPCR (LOD, LOQ efficiency) i solidności całej metody (LOD, LOQ). Nie tylko na etapie opracowywania i charakteryzowania, ale także w przypadku stosowania w badaniach lub do celów diagnostycznych, czynniki ryzyka mogą być identyfikowane i dobrze kontrolowane, aby zapewnić standaryzację protokołu. Szczególną uwagę należy zwrócić na odpowiednie wyszkolenie personelu, wysoko wykwalifikowany personel, kontrolę jakości stosowanych materiałów eksploatacyjnych i ich przechowywania, kontrolę bezpośrednich warunków środowiskowych oraz świadomość warunków metrologicznych, które mogą mieć wpływ na działanie przyrządów naukowych biorących udział w badaniu. Wykorzystanie próbek referencyjnych do porównań międzylaboratoryjnych mogłoby również pomóc w kontrolowaniu niepewności. W ten sposób można ułatwić porównywanie danych między laboratoriami. Międzylaboratoryjne badania biegłości są bowiem niezbędne do oceny i potwierdzenia odtwarzalności metody.
Wyniki obciążenia genomem wirusa, które są wyrażone w jednostkach międzynarodowych (IU) analizowanej matrycy biologicznej (IU: kopie/ml dla płynów lub kopie/g dla tkanek) są łatwiejsze do wykorzystania w celu porównania wyników między różnymi laboratoriami. Wszystkie wyniki powyżej granicy oznaczalności są wyrażone w kopiach/ml, a wynik między LOD a LOQ przyjmuje się jako niekwantyfikowalny wynik dodatni. Przedstawienie w ten sposób danych kwantyfikacyjnych genomu jest bardziej zgodne z procesem analiz (amplifikacji genomu). W rzeczywistości w eksperymentach z hodowlami komórkowymi ekspresja wiremii przez TCID50 (mediana dawki infekcyjnej w hodowli tkankowej) zależy od charakteru komórek i szczepów wirusa. Każda linia szczepów ma swoją unikalną kinetykę infekcji, a niektóre wirusy, takie jak EHV-2, mogą potrzebować kilku dni, zanim pojawi się pierwszy efekt cytopatogenny.
Podsumowując, ta nowa metoda charakterystyki qRT-PCR powinna ułatwić harmonizację prezentacji i interpretacji danych między laboratoriami. Będzie to bardzo przydatne w przypadku potencjalnych nowych zastosowań qRT-PCR w przyszłości, takich jak ustalenie wartości odcięcia dla deklaracji statusu choroby, a nie tylko obecności lub braku patogenu.

Herpeswirus-2 (EHV-2) bierze udział w zespole oddechowym, z potencjalnymi objawami klinicznymi, takimi jak wydzielina z nosa, zapalenie gardła i obrzęk węzłów chłonnych1-3. Podejrzewa się również, że wirus ten jest związany ze słabą wydajnością koni, co może mieć znaczący i negatywny wpływ ekonomiczny na przemysł konny2.
Do tej pory złotym standardem wykrywania gamma-EHV (γ-EHV) była metoda hodowli komórkowych. Pierwszą niedogodnością tej procedury był brak dyskryminacji między EHV-2 a innymi γ-EHV (np. EHV-5). Drugą niedogodnością był powolny rozwój procesu cytopatycznego, który trwa od 12 do 28 dni, aby objawić się4,5.
Opracowanie zweryfikowanej i znormalizowanej ilościowej metody reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) pomoże w szybkim wykryciu wirusa, rozróżnieniu między EHV-2 i EHV-5 oraz zbadaniu związku między obciążeniem genomu wirusa a chorobą dzięki aspektowi kwantyfikacji.
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) została opisana po raz pierwszy w 1986 roku przez Mullisa6 i wkrótce stanie się nowym złotym standardem w większości dziedzin diagnostyki biologicznej (człowiek, środowisko i weterynaria). Ta metoda, która opiera się na amplifikacji części genomu patogenów, ma wiele zalet: swoistość, czułość i szybkość. Co więcej, ryzyko zanieczyszczenia amplikonem zmniejszyło się od czasu pojawienia się qRT-PCR i zapewnienia jakości7. Niemniej jednak uznanie PCR za nowy złoty standard metody wymagało czegoś więcej niż tylko poprawy danych dotyczących wydajności, ale także wykazania kontroli etapów rozwoju i walidacji całej metody bez pogorszenia wydajności w czasie.
Pierwsze narzędzia molekularne używane do wykrywania EHV-2 były czasochłonne i obejmowały niespecyficzną amplifikację za pomocą zagnieżdżonego PCR, a następnie sekwencjonowanie8. Genami docelowymi dla wirusów opryszczki były polimeraza kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) i pakowanie DNA9. Jednak zagnieżdżony PCR wiąże się z wysokim ryzykiem zanieczyszczenia amplikonami. Od tego czasu konwencjonalne testy PCR zostały zaprojektowane w celu amplifikacji genu podobnego do interleukiny 10 lub genu glikoproteiny B, poddanego przeglądowi w 2009 r.2. Niedawno opisano charakterystykę PCR w czasie rzeczywistym w celu oznaczania ilościowego EHV-210, ale nie było dostępnych danych dotyczących walidacji całej metody, w tym procesu ekstrakcji.
W tym protokole, procedury rozwoju i walidacji są opisane dla ilościowej metody PCR do wykrywania i kwantyfikacji DNA EHV-2 w płynach oddechowych koni zgodnie z normą Association française de normalisation (AFNOR) NF U47-6003,11,12, która jest francuskim przedstawicielem w międzynarodowym komitecie normalizacyjnym. Norma ta szczegółowo opisuje "Wymagania i zalecenia dotyczące wdrażania, rozwoju i walidacji weterynaryjnego PCR w metodzie analizy zdrowia zwierząt"11,12, zgodnie z NF EN ISO/CEI 17025, 200513 oraz zaleceniami OIE (Światowa Organizacja Zdrowia Zwierząt) 201014. Protokół walidacji EHV-2 qRT-PCR obejmuje trzyczęściową procedurę: (a) opracowanie testu qRT-PCR, (b) scharakteryzowanie samego testu qRT-PCR oraz (c) scharakteryzowanie całej metody analitycznej (od ekstrakcji kwasów nukleinowych z próbki biologicznej do analizy PCR).
Charakterystyka testu qRT-PCR i całej metody analitycznej obejmuje definicję dwóch granic: granicy wykrywalności (LOD) i granicy oznaczalności (LOQ). LOD95% PCR reprezentuje najniższą liczbę kopii kwasu nukleinowego na jednostkę objętości, którą można wykryć w 95% wszystkich przypadków. LOQ95% PCR reprezentuje najmniejszą ilość kopii kwasów nukleinowych, jaką można określić biorąc pod uwagę niepewności.
Ta metoda qRT-PCR pozwala na precyzyjne wykrycie i szybkie określenie ilościowe EHV-2 w płynach oddechowych. Co więcej, metoda ta może być stosowana w innych laboratoriach w celu zapewnienia ustandaryzowanej procedury i jako ogólny szablon do opracowywania innych nowych testów qRT-PCR.

<table><tbody><tr><td>AB-1900 naturalny kolor ABgene 96 dołków&nbsp;</td><td>Dutsher</td><td>16924</td><td></td></tr><tr><td>Folia samoprzylepna qPCR Absolute&nbsp;</td><td>Dutsher</td><td>16629</td><td>Folia samoprzylepna używana do uszczelniania płytki przed biegiem qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mikroprobówki 0,5 ml, z listwą przypodłogową, nakrętki</td><td>Dutsher</td><td>039258</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 98%</td><td>Sodipro</td><td>SAF322941000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Podkłady Eurofins</td><td>Na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Technologie żywotności</td><td>sondy</td> na <td>zamówienie niestandardowe</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid</td><td>Eurofins</td><td>Zamówienie</td><td></td>niestandardowe</tr><tr><td>QIAamp&nbsp; Mini zestaw wirusa RNA (zawierający: kolumnę QIAamp Mini, bufor AVL&nbsp;,&nbsp; Bufor AW1, bufor AW2, bufor AVE, probówki zbiorcze)&nbsp;</td>Bufor <td>Qiagen</td><td>52906</td><td>AVL: wstępne rozgrzanie 5 min przy 72 stopniach; C</td></tr><tr><td>Sekwencjonowanie metodą Sangera</td><td>Eurofins</td><td>Na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4364340</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy Tris-EDTA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-296653A</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 2000c</td><td>Thermoscientific</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Systemy PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Technologie życia</td><td>4376600</td><td>Podgrzewanie 15 min&nbsp;</td></tr></tbody></table>

opracowanie i walidacja ilościowej metody pcr do diagnostyki herpeswirusa koniowatego-2 w płynach oddechowych

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Protokół opisuje ilościową metodę RT-PCR do wykrywania i oznaczania ilościowego EHV-2 w płynach oddechowych koni zgodnie z normą NF U47-600. Po etapie rozwoju i pierwszej walidacji przeprowadzono dwa odrębne etapy charakterystyki zgodnie z normą AFNOR: (a) charakterystykę samego testu qRT-PCR oraz (b) charakterystykę całej metody analitycznej. Walidacja całej metody analitycznej obejmowała przedstawienie wszystkich etapów między ekstrakcją kwasów nukleinowych a końcową analizą PCR. 
Walidacja całej metody jest bardzo ważna dla wykrywania wirusów za pomocą qRT-PCR, aby uzyskać dokładne określenie obciążenia genomu wirusa. Ponieważ etap ekstrakcji jest głównym źródłem utraty materiału biologicznego, można go uznać za główne źródło błędu kwantyfikacji między jednym protokołem a drugim. Z tego powodu norma AFNOR NF-U-47-600 zaleca uwzględnienie zakresu rozcieńczenia plazmidu przed etapem ekstrakcji. Ponadto granice oznaczalności zależą od źródła, z którego wirus jest ekstrahowany. Wyniki obciążenia genomem wirusa, które są wyrażone w jednostkach międzynarodowych (j.m.), są łatwiejsze do wykorzystania w celu porównania wyników między różnymi laboratoriami. 
Ta nowa metoda charakterystyki qRT-PCR powinna ułatwić harmonizację prezentacji i interpretacji danych między laboratoriami.

Opisana powyżej metoda ilościowej RT-PCR została wdrożona w celu wykrywania i oznaczania ilościowego wirusa herpes koni typu 2 (EHV-2) w płynach z dróg oddechowych. Rysunek 1 przedstawia schematyczny wykres przebiegu prac nad opracowaniem i walidacją metody ilościowej RT-PCR zgodnie z normą AFNOR NF U47-600. Specyficzność starterów i sond została zweryfikowana podczas etapowego opracowywania procedury PCR. W tym systemie amplifikowano wyłącznie szczepy EHV-2. Następnie należało scharakteryzować wydajność metody qRT-PCR.
W pierwszej kolejności, w celu oszacowania LODPCR, wykonano 6 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych, aby wyznaczyć strefę wygasania (Ryc. 2). W tym przykładzie, w celu oszacowania LODPCR, przygotowano 6 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych w zakresie od 10-5 do 10-10 (od 26 000 do 0,26 kopii/2,5 µl próbki). Strefa wygasania znajduje się pomiędzy rozcieńczeniami 10-9 a 10-10 (między 2,6 a 0,26 kopii/2,5 µl próbki). Aby w tym przypadku wyznaczyć wartość LODPCR , w obrębie tej strefy wygasania wykonano 6 dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu w zakresie od 5,2 do 0,16 kopii/2,5 µl próbki. Wartość LODPCR wyniosła 2,6 kopii/2,5 µl próbki.
Aby określić zakres liniowości oraz LOQPCR, wartość LODPCR została wykorzystana jako punkt wyjścia dla serii 6 rozcieńczeń dziesięciokrotnych, w zakresie od 2,6 (LODPCR) do 260 000 kopii/2,5 µl próbki. Rycina 3 przedstawia regresję liniową dla qRT-PCR EHV2 z jednego badania. Parametry regresji liniowej (Rycina 4) zostały zweryfikowane w czterech powtórzeniach przy użyciu obliczeń opisanych w Tabeli 3. Obliczenia przeprowadzono w celu zdefiniowania zakresu liniowości zgodnie z kryterium wartości bezwzględnej Biasi ≤0,25 log10, niezależnie od poziomu i obciążenia plazmidowego. W tym przypadku zakres liniowości mieścił się między 2,6 a 260 000 kopii/2,5 µl próbki. LOQPCR to najniższe stężenie w zakresie liniowości (t.j. w tym przypadku 2,6 kopii/2,5 µl próbki). ULIN określono na poziomie 0,12 log10 w zakresie 2,6-260 000 kopii/2,5 µl DNA.
Po opracowaniu (Rycina 1, kolor niebieski) i charakterystyce qRT-PCR (Rycina 1, kolor żółty), norma AFNOR NF U47-600 zaleca charakterystykę całej metody analitycznej, od ekstrakcji DNA po qRT-PCR (Rycina 1, kolor pomarańczowy). Czułość i swoistość diagnostyczną obliczono zgodnie z opisem w Tabeli 4. Wydajność ilościowa całej metody analitycznej qRT-PCR została oceniona i zwalidowana za pomocą profilu dokładności (Rycina 5).
Niniejszy protokół, wykorzystujący najnowocześniejszą technologię molekularną, pozwolił nam wykryć i określić ilość kopii genomu wirusa EHV-2 w 172 próbkach wymazów z nozdrzy pobranych od koni z zaburzeniami oddechowymi i/lub klinicznym podejrzeniem infekcji. Częstość występowania EHV-2 w próbkach terenowych (biologicznych) w tej populacji wyniosła 50% (86/172). Analizy ilościowe wykazały, że ładunek genomu wirusa EHV-2 był znacznie wyższy u młodych koni, a rozkład ładunków genomu wirusa malał wraz z wiekiem (Rycina 6). W niniejszym badaniu najwyższy ładunek genomu wirusa EHV-2 (1.9 x 1011 kopii/ml) stwierdzono u źrebiąt (Rycina 6).
<img alt="Schemat procesu qRT-PCR przedstawiający opracowanie, charakterystykę i walidację; metody obejmują LOD i LOQ." src="/files/ftp_upload/53672/53672fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat blokowy opracowania (kolor niebieski), charakterystyki ilościowej RT-PCR (kolor żółty) oraz charakterystyki całej metody analitycznej od ekstrakcji DNA do qRT-PCR (kolor pomarańczowy) zgodnie z normą AFNOR NF U47-600-2. Schemat blokowy podsumowuje poszczególne etapy opracowania, charakterystyki ilościowej RT-PCR oraz charakterystyki całej metody analitycznej od ekstrakcji DNA do qRT-PCR. Dla każdego etapu schemat określa liczbę wymaganych serii pomiarowych, rozcieńczenia do wykonania oraz liczbę wymaganych analityków. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres amplifikacji PCR, qRn w funkcji cyklu, przedstawiający kwantyfikację DNA z obszarem zaniku i próbką ujemną." src="/files/ftp_upload/53672/53672fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wyznaczenie obszaru zaniku na podstawie reprezentatywnych wyników krzywych PCR w czasie rzeczywistym uzyskanych dla 6 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu. Aby oszacować obszar zaniku, przygotowano 6 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych w zakresie od 10-5 (26 000 kopii/2,5 µl próbki) do 10-10 (0,26 kopii/2,5 µl próbki). Obszar zaniku znajduje się pomiędzy rozcieńczeniami 10-9 (2,6 kopii/2,5 µl próbki) a 10-10 (0,26 kopii/2,5 µl próbki). W tym przypadku w obrębie tego obszaru zaniku wykonano 6 dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu, aby wyznaczyć LOD 95% PCR, pomiędzy 5,2 a 0,16 kopii/2,5 µl próbki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Krzywa standardowa PCR, równanie y=-3.34x+36.94, R²=0.999, wykres progu cyklu (Ct) w funkcji logarytmu plazmidu." src="/files/ftp_upload/53672/53672fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Regresja liniowa dla qRT-PCR EHV2. Liniowość badania ilościowego to zdolność do generowania wyników proporcjonalnych do stężenia celu w określonym zakresie. Można ją modelować za pomocą regresji liniowej (y = ax + b) pomiędzy odpowiedzią aparaturową (próg cyklu lub Ct) a logarytmem ilości celu (liczba kopii celu/2.5 µl próbki). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres poziomu plazmidu w funkcji średniego błędu systematycznego; słupki błędów wskazują zmienność danych w analizie edycji genów." src="/files/ftp_upload/53672/53672fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wyniki regresji liniowej qPCR dla EHV-2. Średni błąd systematyczny reprezentuje średnią różnicę między zmierzoną ilością plazmidu (<img alt="Symbol średniej z kreską nad Xi, reprezentujący średnią statystyczną w matematyce." src="/files/ftp_upload/53672/fig4-1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="fig4-1">) a teoretyczną ilością plazmidu (x'i) dla każdego poziomu plazmidu. Pionowe słupki reprezentują niepewność liniowości (ULINi) wyznaczoną według wzoru 
<img alt="Wzór na niepewność, U_LINI=2√(SD'i²+mean.bias²), równanie matematyczne." src="/files/ftp_upload/53672/fig4-2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="fig4-2"> 
gdzie SD'i to odchylenie standardowe zmierzonej ilości plazmidu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres bezwzględnego obciążenia w funkcji poziomu plazmidu EHV2 (Log₁₀), przedstawiający zmienność danych i linie trendu." src="/files/ftp_upload/53672/53672fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Profile dokładności opracowane na podstawie wyników walidacji metody qRT-PCR dla EHV-2. Zielona linia (kółka) reprezentuje prawdziwość danych (błąd systematyczny, czyli obciążenie). Granice akceptowalności zostały zdefiniowane przez laboratorium na poziomie ± 0.75 Log10 (linie przerywane). Dolne i górne granice dokładności zostały określone dla każdego poziomu zawartości plazmidu jako średnie obciążenie ± dwukrotność odchylenia standardowego danych niezawodności (linie czerwone). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres porównawczy ładunku wirusowego EHV2 z analizą statystyczną w grupach wiekowych koni; wyniki eksperymentu." src="/files/ftp_upload/53672/53672fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Ilościowe oznaczenie ładunków genomu wirusa EHV-2 w zależności od wieku. Przedstawiono rozkład ładunku genomu wirusa EHV-2 wykrytego w próbkach wymazów z nosa dla różnych grup wiekowych. Linie poziome reprezentują wartości mediany wraz z odchyleniem standardowym (m = miesiące). * Różnica istotna statystycznie w analizie ANOVA z testem post-hoc Newmana-Keulsa (p &lt;0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gen docelowy</td>
			<td colspan="3">Sekwencje starterów, sondy i plazmidu (5'-3')</td>
			<td>Pozycja nukleotydu</td>
			<td>Wielkość produktu (nukleotydy)</td>
			<td colspan="2">Warunki cyklu termicznego</td>
			<td>Bibliografia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">EHV2 gB 
			(HQ247755.1)</td>
			<td colspan="3">Forward: GTGGCCAGCGGGGTGTTC </td>
			<td>2113-2130</td>
			<td rowspan="4">78</td>
			<td>95 °C 5 min</td>
			<td></td>
			<td rowspan="4">11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Odwrócona sekwencja: AAGTTYTT AGGGAAACCCCC</td>
			<td>2189-2170</td>
			<td>95 °C 15 s</td>
			<td rowspan="2">45 cykli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Sonda: FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB</td>
			<td>2132-2157</td>
			<td>60 °C 1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Plazmid: 
			ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA 
			ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG 
			GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT 
			CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA 
			GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG 
			TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT 
			ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG 
			GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG 
			CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA 
			ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG</td>
			<td>2081-2381</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Sekwencje starterów, sond oraz pozytywnych syntetycznych kontroli DNA użytych w tym protokole. Sekwencja plazmidu (pozytywnej syntetycznej kontroli DNA) odpowiada pozycjom nukleotydowym 2081-2381 sekwencji EHV2gB (HQ247755.1). Projekt starterów i sond użytych w tym protokole został opracowany przy użyciu specjalistycznego oprogramowania.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td rowspan="2">PATOGENY</td>
			<td rowspan="2">Referencja (pochodzenie)</td>
			<td rowspan="2">Liczba szczepów</td>
			<td >WYNIKI</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EHV-2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2">EHV-2</td>
			<td >VR701 (ATCC)</td>
			<td rowspan="2">20</td>
			<td rowspan="2">Dodatnie</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >20 próbek (kolekcja FDL)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2">EHV-5</td>
			<td >KD05 (GERC)</td>
			<td rowspan="2">20</td>
			<td rowspan="2">Ujemne</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >20 próbek (kolekcja FDL)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2">EHV-3</td>
			<td >VR352 (ATCC)</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">Ujemne</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T934 WSV (GERC)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2">EHV-1</td>
			<td >Szczep Kentucky Ky A (ATCC)</td>
			<td rowspan="2">3</td>
			<td rowspan="2">Ujemne</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 próbki (kolekcja FDL)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EHV-4</td>
			<td >VR2230 (ATCC)</td>
			<td >1</td>
			<td >Ujemne</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Herpesvirus osłów AHV5</td>
			<td >Kolekcja FDL</td>
			<td >1</td>
			<td >Ujemne</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2">Wirus grypy koni </td>
			<td >A/equine/Jouars/4/2006 (H3N8)</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">Ujemne</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >(Numer dostępu JX091752)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wirus arteritis koni</td>
			<td >VR796 (ATCC)</td>
			<td >2</td>
			<td >Ujemne</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rhodococcus equi</td>
			<td >Kolekcja FDL</td>
			<td >1</td>
			<td >Ujemne</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus</td>
			<td >Kolekcja FDL</td>
			<td >1</td>
			<td >Ujemne</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Streptococcus equi subsp. equi</td>
			<td >Kolekcja FDL</td>
			<td >1</td>
			<td >Ujemne</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coxiella burnetii </td>
			<td >ADI-142-100 (Adiagene)</td>
			<td >1</td>
			<td >Ujemne</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chlamydophila abortus</td>
			<td >ADI-211-50 (Adiagene)</td>
			<td >1</td>
			<td >Ujemne</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Klebsiella pneumoniae</td>
			<td >Kolekcja FDL</td>
			<td >1</td>
			<td >Ujemne</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Specyficzność analityczna qRT-PCR dla EHV-2.
<img alt="Analiza wydajności PCR; równania, wzory i tabela statystyczna do analizy DNA i oceny błędu systematycznego." src="/files/ftp_upload/53672/53672table3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 3"> 
Tabela 3: Obliczanie błędu systematycznego (bias) i niepewności liniowości (adaptowano z NF U47-600-212). Dla każdej próby parametry regresji liniowej (y = ax+b) są walidowane przy użyciu tabeli, gdzie y to uzyskany próg cyklu (cycle threshold); a to uzyskany nachylenie; x to poziom plazmidu, a b to punkt przecięcia z osią rzędnych. i oznacza poziom plazmidu (i przyjmuje wartości od 1 do k poziomów); k to liczba użytych poziomów plazmidu (np. k = 6 w tej tabeli); j to próba (j przyjmuje wartości od 1 do I prób); I to liczba prób, mieszcząca się w przedziale od 3 do 6 (np. I = 4 w tej tabeli). xi to szacowana ilość plazmidu dla każdego poziomu plazmidu i. x'i  to teoretyczna ilość plazmidu uzyskana za pomocą równania x'i = log10(xi) dla każdego poziomu plazmidu i. Podczas każdej próby j próg cyklu uzyskany dla każdego poziomu plazmidu i jest obliczany za pomocą regresji liniowej yi,j = ajxi,j + bj. <img alt="Oznaczenie zmiennej statystycznej x̂ᵢⱼ, stosowane w równaniach statystycznych, oznacza wartości szacowane." src="/files/ftp_upload/53672/table3-1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="table3-1"> to zmierzona ilość plazmidu podczas próby j. Biasi to różnica zaobserwowana między zmierzoną ilością plazmidu a teoretyczną ilością plazmidu dla każdej próby i każdego poziomu plazmidu. <img alt="Symbol matematyczny wektora, oznaczenie estymatora średniej, schemat edukacyjny." src="/files/ftp_upload/53672/table3-2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="table3-2"> to wartość średnia z <img alt="Równanie zmiennej statystycznej \( \hat{x}_{i,j} \); stosowane w analizie danych i modelach predykcyjnych." src="/files/ftp_upload/53672/table3-3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="table3-3"> dla każdego poziomu plazmidu i; SD'i to odchylenie standardowe zmierzonej ilości <img alt="Symbol równania dla szacowania xi,j w analizie statystycznej." src="/files/ftp_upload/53672/table3-4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="table3-4"> dla każdego poziomu plazmidu i; Mean bias to średnia z Biasi; ULINi to niepewność liniowości określona dla każdego poziomu plazmidu i, obliczona z SD'i oraz mean bias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672table3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Rzeczywisty stan próbki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dodatni</td>
			<td>Ujemny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Wyniki uzyskane przy zastosowaniu pełnej metody</td>
			<td>Dodatni</td>
			<td>RP (prawdziwie dodatni)</td>
			<td>FP (wynik fałszywie dodatni)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negatywny</td>
			<td>wynik fałszywie ujemny (FN)</td>
			<td>RN (prawdziwie ujemny)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suma</td>
			<td>RP+FN</td>
			<td>FP+RN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Se = RP/(RP+FN)</td>
			<td>Sp = RN/(RN+FP)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Obliczenie czułości diagnostycznej (Se) i swoistości (Sp) całej metody. Do obliczenia 95% przedziału ufności dla czułości i swoistości całej metody, zgodnie z opisem w NF U47-600-2, wykorzystano tabelę Schwartza.

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i walidacji ilościowej metody PCR używanej do wykrywania i kwantyfikacji DNA EHV-2 w płynach oddechowych koni. Protokół walidacji EHV-2 qRT-PCR obejmuje trzyczęściową procedurę: opracowanie, scharakteryzowanie samego testu qRT-PCR oraz scharakteryzowanie całej metody analitycznej.

Opracowanie i walidacja ilościowej metody PCR do diagnostyki herpeswirusa koniowatego-2 w płynach oddechowych

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Ogólnym celem metody qPCR jest ocena miana wirusa herpes equine-2 w próbkach biologicznych pobranych od koni. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie diagnostyki chorób układu oddechowego u koni, dostarczając ilościowych danych służących jako nowe pomoce interpretacyjne dla praktyków. Główną zaletą tej techniki jest jej wysoka czułość, swoistość oraz szybkość wykonania.Kolejną zaletą jest opracowanie zgodnie z normą AFNOR NF U47-600, która reprezentuje Francję w międzynarodowym komitecie normalizacyjnym. Procedurę zaprezentuje Erika Hue, młoda badaczka z mojej jednostki. Aby wyizolować kwasy nukleinowe z biologicznej próbki płynów z dróg oddechowych, należy w dygestorium zacząć od dodania 140 µL próbki biologicznej do 560 µL roztworu lizującego, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Do próbki należy dodać 560 µL etanolu, a następnie nanieść 630 µL całkowitego roztworu na kolumnę krzemionkową i odwirować. Pozostałe 630 µL należy nanieść na kolumnę krzemionkową i ponownie odwirować. Po naniesieniu próbki na kolumnę należy dwukrotnie przemyć ją, używając po 500 µL buforów płuczących AW1 i AW2.Następnie, aby eluować kwasy nukleinowe z kolumny, dodaj 50 µL buforu do elucji lub buforu AVE o temperaturze pokojowej. Zamknij nakrętkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Następnie wiruj przy 6 000 ×g przez jedną minutę.Aby przeprowadzić amplifikację DNA, po miareczkowaniu starterów i sondy zgodnie z protokołem tekstowym, przygotować dla każdej reakcji 22,5 µL mieszaniny reakcyjnej, dodając 12,5 µL master mixu do PCR, startery bezpośrednie i odwrotne o stężeniu 20 µM, sondę o stężeniu 10 µM oraz odpowiednią ilość wody ultra-czystej, aby uzyskać objętość 22,5 µL. Aby uniknąć kontaminacji, mieszaninę reakcyjną do PCR należy zawsze przygotowywać w wydzielonej strefie. Odmierzyć 22,5 µL odpowiedniej mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka płytki 96-dołkowej.Należy uwzględnić kontrole negatywne dla ekstrakcji i PCR, aby upewnić się, że żadne z odczynników nie są zanieczyszczone niepożądanym DNA. Następnie należy dodać 2,5 µL próbki, kontroli negatywnej ekstrakcji, kontroli negatywnej PCR lub próbki kontroli pozytywnej do odpowiednich studzienek reakcyjnych. Płytkę należy następnie przykryć samoprzylepną folią uszczelniającą.Następnie wiruj przez 10 sekund przy 6 000 gs. Umieść płytkę w systemie do PCR w czasie rzeczywistym. Następnie wybierz szablon układu analizy oraz ustawienia programu PCR przedstawione tutaj i rozpocznij pomiar.Po przeniesieniu surowych danych z systemu PCR w czasie rzeczywistym do arkusza kalkulacyjnego, ustaw próg na wykresach amplifikacji powyżej linii bazowej i w obrębie regionu wzrostu wykładniczego, aby uzyskać cykl progowy dla każdej próbki. Wykreśl każdy punkt zestawu standardów jako krzywą standardową w celu uzyskania liniowości. Następnie oblicz liczbę kopii dla poszczególnych próbek na podstawie krzywej standardowej.Aby wyznaczyć granicę wykrywalności wyników qRT-PCR, do sześciu probówek należy odmierzyć 90 µL ultra czystej wody. W celu przygotowania sześciu dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych plazmidu w celu określenia strefy wygaszania sygnału, należy rozpocząć od przeniesienia 10 µL z roztworu roboczego plazmidu do probówki zawierającej 90 µL ultra czystej wody. Probówkę należy krótko wymieszać w wortexie, a następnie odwirować.Następnie przenieś 10 µL z probówki do kolejnej probówki z wodą. Po wymieszaniu w wortexie i odwirowaniu powtórz przenoszenie, aż wszystkie probówki z wodą otrzymają plazmid. Po amplifikacji DNA w sześciu dziesięciokrotnych rozcieńczeniach seryjnych, zgodnie z opisem w poprzedniej części tego filmu, wyznacz strefę redukcji, czyli ostatnie rozcieńczenie plazmidu dające sygnał dodatni oraz pierwsze rozcieńczenie, w którym nie stwierdzono detekcji.Aby przygotować sześć dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych, odmierz 25 µL ultra-czystej wody do sześciu probówek. Z ostatniego rozcieńczenia plazmidu, które dało sygnał dodatni w rozcieńczeniach dziesięciokrotnych, przenieś 25 µL z probówki do pierwszej probówki z wodą. Wymieszaj na wortexie i odwiruj w wirówce, a następnie przygotuj pozostałe pięć rozcieńczeń w sposób analogiczny do zaprezentowanego.Przeprowadź amplifikację DNA z dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych, zgodnie z opisem przedstawionym wcześniej w tym filmie. Po amplifikacji DNA z trzech niezależnych prób oblicz liczbę powtórzeń dodatnich spośród 24 powtórzeń dla każdego poziomu stężenia plazmidu. Wyznacz granicę wykrywalności z ufnością 95% lub LOD 95% PCR, która jest poziomem skutkującym wykryciem 23 powtórzeń dodatnich spośród 24 powtórzeń.Aby wyznaczyć LOD metody, należy przygotować pięć dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych, zaczynając od 25 µL roboczego roztworu plazmidu, który jest czterokrotnie bardziej skoncentrowany niż ostatnie stężenie z rozcieńczenia dziesięciokrotnego, które dało sygnał dodatni. Plazmid wykorzystywany w etapie amplifikacji pochodzi z roboczego roztworu plazmidu przygotowanego w wydzielonej strefie, aby uniknąć kontaminacji. Jest to krytyczny etap.Przenieś 5 µL z każdego rozcieńczenia plazmidu do czterech probówek zawierających 135 µL negatywnego materiału zasobowego, aby uzyskać cztery powtórzenia dla pięciu standardów dodatnich. Przeprowadź ekstrakcję czterech powtórzeń dla pięciu standardów dodatnich oraz wykonaj procedurę amplifikacji zgodnie z opisem zawartym we wcześniejszej części tego filmu. Policz liczbę dodatnich powtórzeń z ośmiu powtórzeń dla każdego poziomu stężenia plazmidu.Na koniec wyznacza się metodę LOD, która jest ostatnim poziomem, przy którym osiem z ośmiu powtórzeń daje wynik dodatni. Opisana w tym filmie metoda ilościowej RT-PCR wykrywa i kwantyfikuje wirus opryszczki koni klasy 2 w płynach z dróg oddechowych. W tym eksperymencie wykonano dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne w celu oszacowania strefy wygaszania, która znajduje się pomiędzy rozcieńczeniami 10⁻⁹ a 10⁻¹⁰.Wartość LOD PCR została wyznaczona za pomocą nowego dwukrotnego rozcieńczenia seryjnego w strefie redukcji. Aby określić zakres liniowości oraz LOQ PCR, wartość LOD PCR posłużyła jako punkt wyjściowy dla zakresu sześciu dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych pomiędzy 2,6, co stanowi wartość LOD PCR, a 260 000 kopii na 2,5 µl próbki. LOQ PCR to najniższe stężenie w zakresie liniowości.Charakterystyka całej metody polega na walidacji wszystkich kroków niezbędnych do uzyskania danych qRT-PCR, począwszy od ekstrakcji DNA z próbki materiału z dróg oddechowych, aż po amplifikację i kwantyfikację celu. Wydajność ilościowa całej analitycznej metody qRT-PCR została oceniona i zwalidowana z profilem dokładności przedstawionym na tym wykresie. Obciążenia genomem wirusa EHV2 w 172 próbkach wymazów z nosa koni z zaburzeniami oddechowymi zostały skwantyfikowane w sposób pokazany tutaj.Ładunki genomu wirusa były wyższe u młodych koni, przy czym najwyższy wykryty ładunek wyniósł 1,9 × 10¹¹ kopii na mililitr. Po opanowaniu technika ta może być przeprowadzana w czasie krótszym niż dwie godziny na jeden etap amplifikacji, a wszystkie etapy walidacji można przeprowadzić w mniej niż cztery tygodnie, pod warunkiem właściwej realizacji. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o unikaniu ryzyka kontaminacji, szczególnie podczas pracy z roztworem plazmidu.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące identyfikacji genomu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania ekstrakcji i amplifikacji DNA oraz charakteryzowania ich rezerw PCR. Należy pamiętać, że praca z próbkami biologicznymi, takimi jak patogeny, może być niezwykle niebezpieczna.Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w dygestorium oraz w obszarze o odpowiednim poziomie bezpieczeństwa.

development-validation-quantitative-pcr-method-for-equid-herpesvirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Badanie opisuje kosztowo efektywną metodę identyfikacji źródła zanieczyszczenia kałowego/moczowego lub zanieczyszczenia azotanami w wodzie z wykorzystaniem qPCR do specyficznej kwantyfikacji ludzkich/świńskich/bydlęcych wirusów DNA, adenowirusów i poliomawirusów, proponowanych jako narzędzia MST.

Kosztowo efektywna metoda śledzenia źródeł mikrobów z wykorzystaniem specyficznych wirusów ludzkich i zwierzęcych

Niniejsze badanie opisuje diagnostykę grypy ptaków u dzikiego ptactwa z wykorzystaniem przenośnego systemu rRT-PCR. Metoda ta wykorzystuje liofilizowane odczynniki do badania dzikich ptaków w warunkach poza laboratoryjnymi, typowych dla scenariusza ogniska choroby. Zastosowanie narzędzi molekularnych zapewnia dokładne i czułe alternatywy dla szybkiej diagnostyki.

Szybka diagnostyka wirusa grypy ptaków u dzikich ptaków: wykorzystanie przenośnego urządzenia rRT-PCR i liofilizowanych odczynników w warunkach terenowych

Ten film demonstruje ilościową metodę wykrywania infekcji wirusowej za pomocą PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Krok odwrotnej transkrypcji przekształca RNA w cDNA, które jest następnie amplifikowane w cyklach PCR. Obecność wirusowego RNA w próbce potwierdza się analizując krzywe amplifikacji i dysocjacji DNA uzyskane z PCR.

Ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym do diagnozowania infekcji wirusowych

W ciągu ostatnich 15 lat, wektory pochodzące od psiego adenowirusa typu 2 (CAV2) udowodniły swoją skuteczność w transdukcji komórek in vitro i in vivo i są szeroko stosowane w szczepieniach i terapii genowej. W tym miejscu opisujemy procedurę konstruowania, wytwarzania i oczyszczania wektorów CAV2, w wyniku której powstają zawiesiny wirusa o wysokim mianie.

Produkcja i oczyszczanie niereplikacyjnych wektorów pochodnych adenowirusa psów typu 2

Wysokoprzepustowe testowanie patogenów opartych na DNA i RNA za pomocą nanoskalowego PCR jest opisane za pomocą syndromicznego panelu PCR na psach i koniach.

Wysokoprzepustowe wykrywanie patogenów układu oddechowego w próbkach zwierzęcych metodą nanoscale PCR

To badanie opisuje wysokoprzepustowy, oparty na obrazowaniu test mikroneutralizacji w celu określenia miana przeciwciał neutralizujących specyficznych dla syncytialnego wirusa oddechowego (RSV). Ten format testu został przetestowany na różnych typach próbek.

Ulepszony i wysokoprzepustowy test mikroneutralizacji syncytialnego wirusa oddechowego (RSV)

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w pan-lyssavirus została opracowana w celu wykrywania wszystkich znanych lyssawirusów. Walidacja z wykorzystaniem próbek mózgu różnych gatunków zwierząt pod kątem wścieklizny wykazała, że metoda ta ma czułość i swoistość równoważną złotemu standardowi testu na przeciwciała fluorescencyjne i może być stosowana do rutynowej diagnostyki wścieklizny.

Ocena uniwersalnej zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w celu wykrycia lyssawirusów

Przedstawiamy kompletny protokół do pośmiertnej diagnozy wścieklizny zwierząt w warunkach polowych przy użyciu szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego (RIDT), od pobrania próbki z biopsji mózgu do ostatecznej interpretacji. Opisujemy również dalsze zastosowania urządzenia do analizy molekularnej i genotypowania wirusów.

Terenowy pośmiertny szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny wścieklizny do zastosowań o ograniczonych zasobach z dalszymi zastosowaniami molekularnymi

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i walidacji dobrych praktyk laboratoryjnych w zakresie zgodnego wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w ludzkich łzach za pomocą kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy w celu wsparcia klinicznego rozwoju wektorów terapii genowej.

Walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez

Poznaj walidowaną metodę qPCR do wykrywania EHV-2 w płynach oddechowych koni. Ta technika zapewnia czułą i specyficzną ilościową diagnostykę chorób układu oddechowego zgodnie z normą AFNOR.

Opracowanie i walidacja ilościowej metody PCR do diagnostyki herpeswirusa koniowatego-2 w płynach oddechowych

Przeglądaj więcej filmów