Opracowanie i walidacja ilościowej metody PCR do diagnostyki herpeswirusa koniowatego-2 w płynach oddechowych

Ogólnym celem metody qPCR jest ocena wiremii herpeswirusa-2 koni w próbkach biologicznych od koni. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie diagnostyki chorób układu oddechowego u koni, dane ilościowe dotyczące nowych pomocy interpretacyjnych dla praktyków. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to metoda wrażliwa, specyficzna i szybka.

Kolejną zaletą jest rozwój zgodnie z normą AFNOR NF U47-600, która jest francuskim przedstawicielem w międzynarodowym komitecie normalizacyjnym. Procedurę zademonstruje Erika Hue, młoda badaczka z mojej jednostki. Aby wyekstrahować kwasy nukleinowe z biologicznej próbki płynów oddechowych, pod wyciągiem należy rozpocząć od dodania 140 mikrolitrów próbki biologicznej do 560 mikrolitrów roztworu do lizy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Dodać 560 mikrolitrów etanolu do próbki i nanieść 630 mikrolitrów całkowitego roztworu na kolumnę krzemionkową i wirówkę. Nałóż pozostałe 630 mikrolitrów na kolumnę krzemionkową i ponownie odwiruj. Po nałożeniu próbki na kolumnę należy użyć 500 mikrolitrów każdego z płuczących AW1 i AW2 do dwukrotnego przepłukania kolumny.

Następnie, aby wymyć kwasy nukleinowe z kolumny, dodaj 50 mikrolitrów elucji w temperaturze pokojowej lub buforu AVE. Zamknij nakrętkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez minutę. Następnie odwirować w temperaturze 6 000 g przez jedną minutę.

Aby amplifikować DNA, po miareczkowaniu starterów i sondy zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj 22,5 mikrolitra mieszanki reakcyjnej dla każdej reakcji, dodając 12,5 mikrolitra głównej mieszanki PCR, 20 mikromolowych starterów do przodu i do tyłu, 10 mikromoli sondy i wystarczającą ilość ultraczystej wody, zgodnie z wymaganiami, aby osiągnąć 22,5 mikrolitra. Aby uniknąć zanieczyszczenia, zawsze przygotowuj mieszaninę reakcyjną PCR w określonym obszarze. Podwielokrotność 22,5 mikrolitra odpowiedniej mieszaniny reakcyjnej do każdej studzienki reakcyjnej na płytce 96-dołkowej.

Należy uwzględnić kontrole ujemne dla ekstrakcji i PCR, aby upewnić się, że żaden z odczynników nie jest zanieczyszczony niepożądanym DNA. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra próbki, kontroli ujemnej ekstrakcyjnej, kontroli ujemnej PCR lub próbki kontroli pozytywnej do odpowiednich studzienek reakcyjnych. Następnie użyj samoprzylepnej uszczelki płytowej, aby zakryć płytę.

I odwirować przy 6 000 g przez 10 sekund. Umieść płytkę w systemie PCR w czasie rzeczywistym. Następnie wybierz szablon dla układu testu i ustawień programu PCR pokazanych w tym miejscu, a następnie rozpocznij przebieg.

Po przeniesieniu surowych danych z systemu PCR w czasie rzeczywistym do arkusza kalkulacyjnego należy ustawić próg na wykresach amplifikacji powyżej linii podstawowej i w obszarze wykładniczego wzrostu, aby uzyskać cykl progowy dla każdej próbki. Wykreśl każdy zestaw standardów punktowych jako krzywą standardową, aby uzyskać liniowość. Następnie oblicz liczbę kopii dla różnych próbek na podstawie krzywej standardowej.

Aby określić granicę wykrywalności wyników qRT-PCR, należy dozować 90 mikrolitrów ultraczystej wody do sześciu probówek. Aby przygotować sześć dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń plazmidu w celu ukierunkowania na strefę redukcji, należy rozpocząć od przeniesienia 10 mikrolitrów z rozcieńczenia roboczego plazmidu do probówki z 90 mikrolitrami ultraczystej wody. Krótko zwirować i odwirować probówkę.

Następnie przenieś 10 mikrolitrów z rurki do następnej probówki z wodą. Po wirowaniu i odwirowaniu powtarzaj transfer, aż wszystkie probówki z wodą otrzymają plazmid. Po amplifikacji DNA w sześciu dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeniach, jak opisano wcześniej w tym filmie, określ strefę redukcji, która jest ostatnim rozcieńczeniem plazmidu, który wytwarza sygnał dodatni i pierwszym rozcieńczeniem bez wykrywania.

Aby przygotować sześć podwójnych seryjnych rozcieńczeń, należy dozować 25 mikrolitrów ultraczystej wody do sześciu probówek. Z ostatniego rozcieńczenia plazmidu, które dało dodatni sygnał z dziesięciokrotnych rozcieńczeń, przenieś 25 mikrolitrów z rurki do pierwszej probówki z wodą. Wirować i odwirować przed przygotowaniem pozostałych pięciu rozcieńczeń, jak właśnie pokazano.

Amplifikuj DNA z dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych, jak opisano wcześniej w tym filmie. Po amplifikacji DNA z trzech niezależnych badań Oblicz liczbę dodatnich powtórzeń z 24 powtórzeń dla każdego poziomu stężenia plazmidu. Określ LOD z pewnością 95 procent lub LOD 95 procent PCR, czyli poziom, który powoduje wykrycie 23 dodatnich kontrprób z 24 powtórzeń.

Aby określić granicę oznaczalności metody: Przygotować pięć dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych, zaczynając od 25 mikrolitrów roboczego rozcieńczenia plazmidu, które jest czterokrotnie bardziej skoncentrowane niż ostatnie stężenie z dziesięciokrotnego rozcieńczenia, które dało sygnał dodatni. Plazmid stosowany na etapie amplifikacji pochodzi z roboczego rozcieńczenia plazmidu przygotowanego w określonym obszarze w celu uniknięcia zanieczyszczenia. To krytyczny krok.

Przenieść 5 mikrolitrów z każdego rozcieńczenia plazmidu do czterech probówek ze 135 mikrolitrami ujemnego materiału źródłowego, aby otrzymać cztery powtórzenia pięciu dodatnich wzorców. Przeprowadź ekstrakcję czterech powtórzeń dla pięciu dodatnich wzorców i wykonaj procedurę amplifikacji, jak opisano wcześniej w tym filmie. Policz liczbę dodatnich kontrprób z ośmiu kontrprób dla każdego poziomu stężenia plazmidu.

Na koniec należy określić metodę LOD, która jest ostatnim poziomem, przy którym osiem z ośmiu powtórzeń jest dodatnich. Ilościowa metoda RT-PCR opisana w tym filmie wykrywa i określa ilościowo herpeswirusa-2 koni w płynach oddechowych. W tym eksperymencie wykonano dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia w celu oszacowania strefy redukcji, która leży między rozcieńczeniami 10 do ujemnego 9. i od 10 do ujemnego 10.

Wartość LOD PCR oznaczono za pomocą nowego dwukrotnego seryjnego rozcieńczenia w strefie redukcji emisji. Aby określić zakres liniowości i LOQ PCR: Wartość LOD PCR wykorzystano do rozpoczęcia zakresu sześciu dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń między 2,6, wartością LOD PCR i 260 000 kopii na 2,5 mikrolitra próbki. LOQ PCR jest najniższym stężeniem w zakresie liniowości.

Charakterystyka całej metody polega na walidacji wszystkich kroków niezbędnych do uzyskania danych qRT-PCR od ekstrakcji DNA z próbki oddechowej, do amplifikacji i kwantyfikacji celu. Ilościowa wydajność całej metody analitycznej qRT-PCR została oceniona i zwalidowana za pomocą profilu dokładności przedstawionego na tym wykresie. Genom wirusa EHV2 ładuje się w 172 próbkach wymazów z nosa od koni z zaburzeniami oddychania, gdzie określono ilościowo, jak pokazano tutaj.

Obciążenie genomem wirusa było wyższe u młodych koni, przy czym najwyższe obciążenie wykryto przy 1,9 razy 10 do 11 kopii na mililitr. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w mniej niż dwie godziny na etap amplifikacji, a wszystkie etapy walidacji można wykonać w mniej niż cztery tygodnie, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby unikać ryzyka zanieczyszczenia, szczególnie podczas pracy z roztworem plazmidu.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak sekwencjonowanie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak identyfikacja genomu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić ekstrakcję i amplifikację DNA oraz scharakteryzować ich rezerwy PCR. Nie zapominaj, że praca z próbkami biologicznymi, takimi jak patogeny, może być niezwykle niebezpieczna.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować pewne środki ostrożności, takie jak praca w kapturze i dostosowany obszar poziomu bezpieczeństwa.