Name: Walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Poznaj walidowalny protokół ddPCR do wykrywania wektorów AAV w ludzkich łzach. Ta metoda zapewnia precyzyjną ilościową analizę wektorów wirusowych w złożonych matrycach klinicznych zgodnie z wymogami regulacyjnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Nickowi Russellowi i Brandonowi McKethanowi z Bio-Rad za ich pomocne dyskusje podczas rozwoju tej metody.

Quantification of Viral Vectors in Tears Using ddPCR for Bioshedding Studies

<ol><li>Sherkow, J. S., Zettler, P. J., Greeley, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+%27gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Law+and+the+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Is it 'gene therapy.</a> Journal of Law and the Biosciences. 5 (3), 786-793 (2018).</li>
<li>Ginn, S. L., Amaya, A. K., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+clinical+trials+worldwide+to+2017%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: an update.</a> The Journal of Gene Medicine. 20 (5), 3015(2018).</li>
<li>Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vector+systems+for+gene+therapy%3A+a+comprehensive+literature+review+of+progress+and+biosafety+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biosafety%22%5BJournal%5D)">Viral vector systems for gene therapy: a comprehensive literature review of progress and biosafety challenges.</a> Applied Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).</li>
<li>Gene, Cell, & RNA therapy landscape, Q4 2022 quarterly data report. American Society for Gene & Cell Therapy. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx">https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx</a> (2022).</li>
<li>Approved Cellular and Gene Therapy Products. United States Food and Drug Administration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products">https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products</a> (2022).</li>
<li>Au, H. K. E., Isalan, M., Meilcarek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+advances%3A+a+meta-analysis+of+AAV+usage+in+clinical+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene therapy advances: a meta-analysis of AAV usage in clinical settings.</a> Frontiers in Medicine. 8, 809118(2022).</li>
<li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases%22%5BJournal%5D)">Viral vectors in gene therapy.</a> Diseases. 6 (2), 42(2018).</li>
<li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+as+a+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31, 317-334 (2017).</li>
<li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+%28AAV2-hRPE65v2%29+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy%3A+a+randomized%2C+controlled%2C+open-label%2C+phase+3+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomized, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li>
<li>Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drugs (INDs). United States Food and Drug Administration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug</a> (2020).</li>
<li>Long term follow-up after administration of human gene therapy products. United States Food and Drug Administration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products</a> (2020).</li>
<li>Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up. United States Food and Drug Administration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during</a> (2020).</li>
<li>Recommendations for microbial vectors used in gene therapy. United States Food and Drug Administration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy</a> (2016).</li>
<li>Multidisciplinary: gene therapy. European Medicines Agency. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy">https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy</a> (2023).</li>
<li>Human gene therapy for retinal disorders. United States Food and Drug Administration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders</a> (2020).</li>
<li>Design and analysis of shedding studies for virus or bacterial-based gene therapy and oncolytic products. United States Food and Drug Administration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products</a> (2015).</li>
<li>Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products. European Medicines Agency. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf">https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf</a> (2018).</li>
<li>Kaur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((white+paper+on+recent+issues+in+bioanalysis%3A+mass+spec+of+proteins%2C+extracellular+vesicles%2C+CRISPR%2C+chiral+assays%2C+oligos%3B+nanomedicines+bioanalysis%3B+ICH+M10+section+7.1%3B+non-liquid+%26+rare+matrices%3B+regulatory+inputs+%28part+1A+-+recommendations+on+endogenous+compounds%2C+small+molecules%2C+complex+methods%2C+regulated+mass+spec+of+large+molecules%2C+small+molecule%2C+PoC+%26+part+1B+-+regulatory+agencies%27+inputs+on+bioanalysis%2C+biomarkers%2C+immunogenicity%2C+gene+%26+cell+therapy+and+vaccine%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">white paper on recent issues in bioanalysis: mass spec of proteins, extracellular vesicles, CRISPR, chiral assays, oligos; nanomedicines bioanalysis; ICH M10 section 7.1; non-liquid & rare matrices; regulatory inputs (part 1A - recommendations on endogenous compounds, small molecules, complex methods, regulated mass spec of large molecules, small molecule, PoC & part 1B - regulatory agencies' inputs on bioanalysis, biomarkers, immunogenicity, gene & cell therapy and vaccine).</a> Bioanalysis. 14 (9), 505-580 (2022).</li>
<li>Hays, A., Islam, R., Matys, K., Williams, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+in+qPCR+and+qPCR+validation+in+regulated+bio+analytical+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Best practices in qPCR and qPCR validation in regulated bio analytical laboratories.</a> The AAPS Journal. 24 (2), 36(2022).</li>
<li>Ma, H., Bell, K. N., Loker, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qPCR+and+qRT-PCR+analysis%3A+Regulatory+points+to+consider+when+conducting+biodistribution+and+vector+shedding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">qPCR and qRT-PCR analysis: Regulatory points to consider when conducting biodistribution and vector shedding studies.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 17 (20), 152-168 (2020).</li>
<li>Wissel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+on+qPCR%2FddPCR+assay+validation+by+GCC%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Recommendations on qPCR/ddPCR assay validation by GCC.</a> Bioanalysis. 14 (12), 853-863 (2022).</li>
<li>Expectations for biodistribution (BD) assessments for gene therapy (GT) products. International Pharmaceutical Regulators Programme. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf">https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf</a> (2018).</li>
<li>Pinheiro, L., Emslie, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+concepts+and+validation+of+digital+PCR+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic concepts and validation of digital PCR measurements.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 11-24 (2018).</li>
<li>Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+counting+statistics+in+digital+PCR%3A+I+measured+two+target+copies-what+does+it+mean%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of counting statistics in digital PCR: I measured two target copies-what does it mean.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 25-43 (2018).</li>
<li>Prantner, A., Marr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+concentration%2C+characterization%2C+and+integrity+analysis+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+using+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR.</a> PLoS One. 18, 0280242(2023).</li>
<li>Primer-BLAST. National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/">https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/</a> (2023).</li>
<li>Koressaar, T., Remm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancements+and+modifications+of+primer+design+program+Primer+3%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Enhancements and modifications of primer design program Primer 3.</a> Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).</li>
<li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).</li>
<li>Droplet Digital PCR Application Guide. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf</a> (2023).</li>
<li>Qian, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dPCR%3A+A+technology+review%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">dPCR: A technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271(2018).</li>
<li>Basu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+assays+part+I%3A+portioning+statistics+and+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Technology%22%5BJournal%5D)">Digital assays part I: portioning statistics and digital PCR.</a> SLAS Technology. 22 (4), 369-386 (2017).</li>
<li>Sanmiguel, J., Gao, G., Vandeberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+digital+droplet-based+AAV+genome+titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).</li>
<li>Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+biomarkers+in+tear+fluid%3A+from+sampling+to+preanalytical+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing.</a> Scientific Reports. 11, 10064(2021).</li>
<li>Martinez-Fernandez de la Camara, C., McClements, M. E., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+of+AAV+vector+genomes+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification of AAV vector genomes by quantitative PCR.</a> Genes. 12 (4), 601(2021).</li>
<li>Ai, J., Ibraheim, R., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+and+accurate+method+for+quantifying+vector+genomes+of+recombinant+adeno-associated+viruses+in+crude+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+TherapyMethods%22%5BJournal%5D)">A scalable and accurate method for quantifying vector genomes of recombinant adeno-associated viruses in crude lysate.</a> Human Gene TherapyMethods. 28 (3), 139-147 (2017).</li>
<li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570(2019).</li>
<li>Bennett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stability+as+a+determinant+of+AAV+serotype+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Thermal stability as a determinant of AAV serotype identity.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 6, 171-182 (2017).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są pracownikami KCAS Bioanalytical and Biomarker Services, organizacji zajmującej się badaniami na zlecenie, świadczącej kompleksowe usługi rozwojowe zgodne z Dobrymi Praktykami Laboratoryjnymi/Dobrymi Praktykami Klinicznymi, od wsparcia wczesnego odkrywania po rejestrację produktu, w tym wspieranie testów opartych na AAV, zgodnie z opisem w niniejszym protokole. KCAS sfinansował ten projekt i publikację tego protokołu. Chociaż nie ma aktualnych wytycznych FDA dotyczących projektowania i walidacji eksperymentów przedstawionych w tym artykule, eksperci i liderzy opinii opracowujący takie badania w KCAS przyjęli to podejście jako podejście podstawowe. Dodatkowe kryteria i parametry są omawiane indywidualnie dla każdego projektu i mogą być uwzględniane w zależności od zamierzonego zastosowania.

Istnieje kilka etapów protokołu ddPCR, które mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego wykonania testu. Pierwszym krytycznym krokiem jest zaprojektowanie i optymalizacja podkładów i sondy. Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się stosowanie chemii opartej na sondzie hydrolizy zamiast chemii opartej na barwniku (np. SYBR Green) w warunkach przedklinicznych lub klinicznych ze względu na ich lepszą specyficzność. Ponadto wybór celu wzmocnienia ma kluczowe znaczenie. Zazwyczaj celem jest transgen będący przedmiotem zainteresowania wektora. Jednak we wcześniejszych stadiach przedklinicznych lub w wektorach, w których może nie być możliwe odróżnienie transgenu wektora od genomowego DNA, właściwe może być zastosowanie standardowych celów wektorowych. Na przykład, można celować w odwrócony region powtórzeń końcowych, promotor, ogon poli-A lub połączenia międzysegmentowe między tymi składnikami wektorowymi. Wybór celu będzie się różnić w zależności od projektu wektorowego. Tradycyjne strategie i oprogramowanie do projektowania starterów i sond qPCR są zazwyczaj odpowiednie dla ddPCR. Parametry projektowe, które mają zapewnić stałą temperaturę wyżarzania (na przykład 60°C), powinny być tak dobrane, aby zmniejszyć wymaganą optymalizację. Zaleca się również zaprojektowanie, zamówienie i ocenę co najmniej trzech różnych zestawów dla każdego celu. Następnie należy wybrać zestaw, który wykazuje największą swoistość (brak amplifikacji w studzience kontroli ujemnej lub w matrycy pokrewnego docelowego DNA) i czułość (tj. granicę wykrywalności)20.
Jeśli korzystna jest możliwość przejścia testu między qPCR a ddPCR, zaleca się najpierw optymalizację warunków testu za pomocą qPCR i zidentyfikowanie warunków dla wybranego zestawu, które skutkują wydajnością amplifikacji 90%-110% przy R2 ≥ 0,98. Jednak ddPCR jako metoda końcowa jest zwykle mniej czuła niż qPCR ze względu na różnice w wydajności amplifikacji. Jako minimum zaleca się przeprowadzenie termicznego gradientu temperatury na etapie wyżarzania/wydłużania w celu pokrycia temperatur powyżej i poniżej oczekiwanych temperatur wyżarzania oraz oceny separacji amplitudy deszczu i fluorescencji między ujemnymi i dodatnimi klastrami kropel w funkcji temperatury. Jeśli pozwala na to przestrzeń robocza, zaleca się posiadanie indywidualnych dedykowanych stanowisk roboczych do przygotowania miksu głównego, dodawania szablonów i wzmacniania. Tam, gdzie to możliwe, powinny one być fizycznie segregowane przez jednokierunkowy przepływ pracy z wbudowanymi kontrolami inżynieryjnymi, takimi jak kontrolowany dostęp i różnica ciśnień powietrza, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego i wyników fałszywie dodatnich. Jeśli nie jest to możliwe, należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
W tym protokole są dwa kroki, które mogą wydawać się niezwykłe dla tych, którzy są bardziej przyzwyczajeni do opracowywania testów qPCR. Pierwszym z nich jest włączenie enzymu restrykcyjnego do głównej mieszanki PCR. Podczas amplifikacji ddPCR każda kropla jest poddawana termocyklowi do punktu końcowego. W prawidłowo zoptymalizowanym teście daje to dwie populacje kropel, z których jedna wykazuje niezmiennie wysoki poziom sygnałów fluorescencyjnych - sygnałów dodatnich - a druga konsekwentnie wyświetla niski poziom sygnału fluorescencyjnego - negatywów. Jeśli dojdzie do interferencji PCR, może to spowodować desynchronizację inicjacji amplifikacji PCR, co spowoduje, że kropla nie osiągnie plateau amplifikacji, a tym samym niespójne fluorescencyjne punkty końcowe. W takim przypadku kropelki zostaną rozprowadzone między negatywami i pozytywami, co spowoduje zjawisko zwane deszczem ddPCR. Może to prowadzić do niedokładnej kwantyfikacji celu oraz niespójnych i subiektywnie stosowanych progów. Zalecamy ustawienie progu nieco powyżej sygnału NTC, co powinno zminimalizować wpływ deszczu w końcowej kwantyfikacji, ponieważ wszystkie kropelki są nadal uważane za dodatnie, nawet jeśli nie są w pełni cyklicznie przekazywane do punktu końcowego. AAV mają bardzo złożoną strukturę drugorzędową, która, w zależności od celu amplifikacji, może ograniczać dostęp do starterów i sond, powodując zakłócenia PCR, a tym samym deszcz. Włączenie enzymu restrykcyjnego do mieszanki wzorcowej rozszczepia tę drugorzędową strukturę, aby zwiększyć dostęp starterów i sond, zmniejszając opady deszczu, co może w ten sposób poprawić dokładność testu. Skutki włączenia enzymu restrykcyjnego do reakcji ddPCR zostały opisane wcześniej25,32. Można użyć dowolnego enzymu restrykcyjnego, o ile potwierdzono, że nie przecina się w docelowym obszarze amplifikacji. Nie są wymagane żadne etapy wstępnego trawienia ani alternatywne kompozycje buforowe.
Drugim nietypowym etapem jest przygotowanie próbki łez zawierającej AAV. W tym protokole wykorzystano stosunek łez 1:10 (lub większy), a następnie próbkę podgrzano. Zazwyczaj, gdy łzy są zbierane za pomocą rurki kapilarnej, która jest szeroko stosowaną metodą pobierania, średnio można zebrać około 10,0 μl33. Rozcieńczenie pomaga rozwiązać problem ograniczonej objętości próbki i zapewnić wystarczającą ilość materiału do powtórnego testowania odwiertu. Chociaż zmniejsza to teoretyczną granicę wykrywalności, solidna czułość ddPCR powinna nadal skutkować wykryciem wszystkich, z wyjątkiem bardzo małej liczby cząstek wektorowych. Takie podejście dodatkowo tworzy studnię "zapasową" na wypadek, gdyby jeden z nich nieoczekiwanie uległ awarii. W takim przypadku lub w przypadku niewystarczającej objętości próbki do uruchomienia dwóch odwiertów, błąd Poissona może być wykorzystany do oceny precyzji. Ponadto w przypadkach, gdy stężenie jest poniżej granicy wykrywalności, stwarza to możliwość połączenia danych z odwiertu w celu określenia stężenia. Konieczne jest uwolnienie wektorów AAV od kapsydów wirusa w celu wykrycia ddPCR. Niektóre metody oznaczania ilościowego AAV obejmowały etap trawienia proteinazy K w celu usunięcia kapsyduwirusa 34,35,36. Wszystkie naturalnie występujące serotypy AAV mają temperaturę topnienia równą lub niższą niż około 90 °C, przy czym większość z nich spada poniżej 80 °C; W związku z tym wydaje się, że jest to zbędne włączenie37. Samo ogrzewanie wydaje się być wystarczające do uwolnienia DNA wektora.
Ponadto ddPCR jest na ogół mniej podatny na inhibitory PCR, które mogą być obecne w próbce, co może mieć wpływ na test qPCR. Jeśli uwzględniony jest konkretny etap izolacji DNA, wymagałoby to również specyficznej walidacji, której unika się w tym protokole. Próbki rozcieńcza się przed podgrzaniem ze względu na kinetykę dyfuzji genomów wektorów w cieczy. Podczas procesu ogrzewania i późniejszego chłodzenia dodatnie i ujemne nici zmysłowe jednoniciowego genomu DNA mogą wyżarzać się razem, tworząc dwuniciowy produkt pośredni, jeśli stężenia są wystarczająco wysokie. Rozcieńczenie przed ogrzewaniem zmniejsza stężenia i sprawia, że jest matematycznie mało prawdopodobne, aby wytworzyła się wystarczająca ilość dwuniciowych produktów pośrednich, aby mieć niekorzystny wpływ na dokładność oznaczania ilościowego. Należy zauważyć, że syntetyczne fragmenty DNA lub zlinearyzowane plazmidy stosowane do kontroli jakości nie mogą być poddawane temu etapowi podgrzewania. Ponieważ są one dwuniciowe, ogrzewanie spowodowałoby konwersję na półprodukty jednoniciowe. Oczekuje się, że po niezależnym podziale tych jednoniciowych QC na kropelki, spowoduje to dwukrotny wzrost stężenia QC w stosunku do stężenia nominalnego. Alternatywnie, jeśli QC mają być podgrzewane w celu standaryzacji metody, musi to być uwzględnione przy rekonstytucji i przypisaniu stężenia nominalnego.
Wreszcie, jeśli chodzi o przygotowanie próbki, wiele protokołów zaleca również włączenie etapu leczenia DNazą w celu usunięcia niekapsułkowanego DNA wektora. Etap ten ma kluczowe znaczenie w przypadkach, gdy nie jest pożądane ilościowe oznaczanie wolnego DNA związanego z preparatem wektora (np. podczas oznaczania ilościowego w celu dawkowania). Jednak w kontekście badań nad biodystrybucją i biolinieniem zazwyczaj chce się wiedzieć, dokąd przemieścił się jakikolwiek wektor DNA, niezależnie od tego, czy jest on zamknięty, czy nie. Dlatego sugeruje się, aby zazwyczaj nie wykonywać etapu leczenia DNazy podczas takich badań. Jeżeli zostanie stwierdzone, że konieczne jest uwzględnienie etapu DNazy, etap ten powinien poprzedzać rozcieńczanie i ogrzewanie.
W artykule przedstawiono dane reprezentatywne dla podejścia do oceny zakresu dynamiki, czułości, dokładności i precyzji metody w kontekście walidacji zgodnej z dobrą praktyką laboratoryjną. Obecny brak wytycznych w tym zakresie sprawia, że laboratoria walidacyjne muszą samodzielnie określić kryteria oznaczania docelowego, zgodnie z obecnym myśleniem branży. Różne grupy postawiły zarówno wyższe, jak i niższe kryteria docelowe niż zastosowane w tym badaniu 19,20,21,22,23,24,25. Docelowe kryteria testu, do czasu ich bardziej rygorystycznego określenia, powinny być wybierane przed walidacją w oparciu o zamierzone zastosowania kliniczne metody. W zależności od dalszych decyzji, które należy podjąć na podstawie danych, może być wymagany wyższy poziom dokładności i precyzji. I odwrotnie, prosty wynik pozytywny i negatywny może być wystarczający.
W ramach podejścia skupiono się również na zaleceniach dotyczących oceny swoistości i efektu matrycy. Pula łez pobranych od osób nieleczonych nie dała pozytywnego wyniku w tym teście, podczas gdy cel można było wykryć, gdy wektor został wstrzyknięty do łez w wysokim i niskim stężeniu w zalecanych wskaźnikach odzyskiwania. Idealnie byłoby, gdyby matryca zawierająca wektor endogenny (np. pobrana po leczeniu wektorem wirusowym) była również uwzględniona w tych ocenach. Jest jednak mało prawdopodobne, aby takie próbki były dostępne do wykorzystania w walidacji. Aby zwiększyć wiarygodność walidacji, można ocenić wiele pul łez lub łez pobranych od różnych osób w celu określenia, czy występuje efekt matrycy specyficzny dla pacjenta. Na koniec zaleca się ocenę stabilności. W przepływach pracy, w których ekstrakcja DNA odbywa się poza matrycą biologiczną, może być konieczna ocena stabilności zarówno próbki, jak i wyekstrahowanego DNA. W tym procesie pracy próbka jest testowana bezpośrednio w teście bez konieczności ekstrakcji DNA. W związku z tym, biorąc pod uwagę ocenę stabilności dla tej metody, należy ocenić stabilność próbek łez. Zazwyczaj zaleca się ocenę stabilności na stole, w lodówce, zamrażanie/rozmrażanie i długoterminową stabilność. Nie zostały one przeprowadzone w ramach tego badania, ale opracowane tutaj metody mogą być wykorzystane w tej ocenie, po manipulacjach próbkami wejściowymi.
Ogólnie rzecz biorąc, wykazano, że metoda ta jest solidnym, powtarzalnym i walidowalnym testem do wykrywania wektorów opartych na AAV w próbkach łez. Może służyć jako platforma do dostosowania do określonych wektorów w celu wsparcia badań klinicznych i stanowi podstawę do walidacji testu zgodnego z dobrą praktyką laboratoryjną.

Definicje terapii genowej różnią się, ale zazwyczaj wywołują celową i często oczekiwaną trwałą zmianę określonej sekwencji DNA genomu komórkowego w celu modyfikacji lub manipulacji ekspresji genu lub zmiany właściwości biologicznych żywej komórki w celach klinicznych1,2. Wektory wirusowe są coraz częściej wykorzystywane jako nośniki terapii genowej ze względu na ich skuteczność transdukcji, a jeden raport sugeruje, że ponad 70% obecnych badań klinicznych terapii genowej wykorzystuje wektory wirusowe3. Zainteresowanie wektorami wirusowymi w terapii genowej stale rośnie. Kwartalny raport danych za 4 kwartał 2022 r. na temat krajobrazu terapii genów, komórek i RNA opracowany przez American Society of Gene and Cell Therapy poinformował, że w 2022 r. linia terapii genów, komórek i RNA od przedklinicznej do wstępnej rejestracji wzrosła o 7%, zwiększając całkowitą liczbę opracowywanych terapii do 3 726, z czego 2 053 (55%) stanowiły terapie genowe4. Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (USA FDA) zatwierdziła obecnie 27 terapii komórkowych i genowych do użytku klinicznego u ludzi, z których pięć wykorzystuje wektory wirusowe5.
Wirusy związane z adenowirusami (AAV) zyskały szczególne zainteresowanie jako nośniki terapii genowej. Niedawna metaanaliza wykazała, że w ciągu ostatnich dwóch dekad przeprowadzono około 136 badań klinicznych badających zastosowanie AAV: 6. Ponadto trzy z pięciu zatwierdzonych przez amerykańską FDA terapii genowych są oparte na AAV. Wynika to z ich wysoce edytowalnego charakteru, szerokiego zakresu żywicieli, który można dostroić w oparciu o użycie specyficznych naturalnie występujących lub sztucznie zaprojektowanych wektorów, niskiej patogenności i toksyczności u ludzi oraz ogólnie niskiej immunogenności7,8. AAV są również z powodzeniem stosowane w leczeniu chorób oczu w zatwierdzonych warunkach klinicznych. Voretigene neparvovec-rzyl jest terapią opartą na AAV2, która została zatwierdzona przez amerykańską FDA w 2017 r. i przez Europejską Agencję Leków (EMA) w 2018 r. do leczenia biallelicznej dystrofii siatkówki związanej z mutacją RPE659.
Wraz z rosnącym zainteresowaniem rozwojem terapii opartych na AAV pojawia się potrzeba wytycznych regulacyjnych dotyczących testów. Dokładne wykrywanie i oznaczanie ilościowe każdego wektora wirusowego jest integralną częścią faz odkrywania, produkcji i testów przedklinicznych/klinicznych w ramach opracowywania produktu. Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zaczęła wydawać wytyczne dotyczące terapii genowych, w tym dotyczące chemii, produkcji i kontroli nowych leków eksperymentalnych w terapii genowej u ludzi10, długoterminowa obserwacja po podaniu terapii genowej11, testy retrowirusowe z kompetencjami replikacyjnymi12, oraz zalecenia dotyczące wektorów mikrobiologicznych stosowanych w terapiach genowych13. EMA wydała również szereg wytycznych dotyczących rozwoju produktów terapii genowej, które generalnie są zgodne z zaleceniami FDA, chociaż istnieją pewne różnice14. Należy zauważyć, że chociaż niniejsze wytyczne nie ustanawiają prawnie egzekwowalnych obowiązków, z wyjątkiem przypadków, w których odniesione są do konkretnych przepisów, zapewniają one jasność co do obecnego sposobu myślenia agencji regulacyjnych na ten temat i ich oczekiwań dotyczących testów wymaganych do składania wniosków o dopuszczenie do obrotu i zatwierdzanie przez organy regulacyjne.
FDA wyraźnie zaleca przeprowadzenie badań w celu oceny dystrybucji, trwałości i usuwania wektora z miejsca podania do docelowych tkanek oka i nieocznego, płynów wewnątrzgałkowych i krwi15. Przyjmują one formę badań nad biodystrybucją i wydalaniem. Badania biodystrybucji oceniają narażenie, badając, w jaki sposób produkt rozprzestrzenia się po organizmie pacjenta od miejsca podania. Wydalanie w szczególności ocenia uwalnianie produktu od pacjenta do środowiska i zwiększa możliwość przeniesienia wektora na osoby nieleczone16. FDA wydaje zalecenia dotyczące projektowania badań biodystrybucji i wydalania w odniesieniu do częstotliwości pobierania próbek, czasu trwania pobierania próbek, rodzajów pobieranych próbek i warunków przechowywania.
Dodatkowo, FDA zaleca stosowanie ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR, lub real-time PCR) do ilościowego wykrywania genomów wektorowych ze względu na łatwość wykonania, format o wysokiej przepustowości, szybki czas realizacji i czułość testu. Istnieje jednak względny brak zaleceń dotyczących projektowania i oceny wydajności metod molekularnych w porównaniu z tymi, które istnieją dla małych i dużych cząsteczek. Wiele wytycznych dotyczących takich badań jest trudnych do zastosowania w odniesieniu do metod molekularnych ze względu na unikalną i złożoną konstrukcję zarówno produktów, jak i samych testów, co rodzi pytania co do adekwatności dostępnych platform dla zalecanych ocen i odpowiednich metod walidacji testów. Do tej pory FDA nie wymagała formalnej walidacji testów opartych na PCR, chociaż EMA nałożyła ten wymóg17. W związku z tą pustką różne grupy i warsztaty wydały białe księgi i zalecenia, których producenci i organizacje badawcze starają się przestrzegać18,19,20,21,22,23,24,25. Większość z tych zaleceń została napisana specjalnie z myślą o testach qPCR, z sugestiami lub zmianami dotyczącymi pojawiających się platform, takich jak cyfrowy PCR kropelkowy (ddPCR), uwzględnionymi tylko wtedy, gdy zostaną uznane za istotne. Nowsze zalecenia koncentrowały się na rozważaniach dotyczących testów ddPCR, ale w dużej mierze koncentrowały się na ich zastosowaniach do kwantyfikacji genomu wektorowego w warunkach produkcyjnych, a nie w złożonych matrycach biologicznych napotkanych w badaniach nad biowydzielaniem.
W zależności od zastosowania klinicznego i celów, ddPCR może być preferowany zamiast qPCR w badaniach nad biodystrybucją i wydalaniem ze względu na zwiększoną czułość ddPCR i jego zdolność do radzenia sobie z zakłóceniami matrycy w porównaniu do qPCR. Ponadto, dzięki podziałowi próbek na około 20 000 kropel, dokładne określenie ilościowe liczby kopii można osiągnąć bez użycia standardowej krzywej przy użyciu statystyki Poissona, co upraszcza opracowywanie i walidację metody. Celem tego protokołu jest opisanie znormalizowanego podejścia do opracowania i walidacji metody opartej na ddPCR do wykrywania wektorów AAV we łzach pobranych z powierzchni oka w celu wsparcia klinicznych badań biowydzielania.

<table><tbody><tr><td>AAV-eGFP Vector</td><td>Charles River Laboratories</td><td>RS-AAV2-FL</td><td>Lot AAV2-0720-FL, używany jako wektor dowodu zasady</td></tr><tr><td>AutoDG Droplet Digital PCR system</td><td>Bio-Rad</td><td>QX200</td><td>Alternatywny system ddPCR może być stosowany zgodnie z wymaganiami producenta s protokół.</td></tr><tr><td>AutoDG Olej do sond</td><td>Bio-Rad</td><td>1864110</td><td>Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.</td></tr><tr><td>Kontrola bufora ddPCR dla sond</td><td>Bio-Rad</td><td>1863052</td><td>Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR i chemią PCR.</td></tr><tr><td>ddPCR Droplet Reader Oil</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td>Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.</td></tr><tr><td>Uszczelki z folii przebijającej ddPCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td>Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.</td></tr><tr><td>ddPCR Płytki 96-dołkowe, półlistkowe</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td>Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.</td></tr><tr><td>ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863023, 1863024 lub 1863025</td><td>Użyj mieszanki głównej kompatybilnej ze starterami/sondami i systemem ddPCR.</td></tr><tr><td>DG32 AutoDG Cartidges</td><td>Bio-Rad</td><td>1864108</td><td>Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.</td></tr><tr><td>Czytnik kropelkowy</td><td>Bio-Rad</td><td>QX200</td><td>Alternatywny system ddPCR może być stosowany zgodnie z zaleceniami producenta s protokół.</td></tr><tr><td>GeneAmp PCR</td><td>Buffer Applied Biosystems</td><td>N8080129</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>Dwuskładnikowy</td><td>system wodny bez nukleaz</td><td>AM9906</td><td>N/A</td></tr><tr><td>PCR Plate Sealer</td><td>Bio-Rad</td><td>PX1</td><td>Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet do AutoDG</td><td>Bio-Rad</td><td>1864120</td><td>Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 Niejonowy środek powierzchniowo czynny</td><td>Gibco</td><td>24040</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sondy podkładowe i hydrolizy</td><td>Różne</td><td>różne</td><td>Konstrukcja oparta na sekwencji docelowej przy użyciu ogólnych podejść do projektowania startera / sondy. Wybierz fluorofory i wygaszacze kompatybilne z systemem ddPCR.</td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny</td><td>Różne</td><td>Różni</td><td>się w zależności od docelowej sekwencji amplifikacji. Użyj enzymu restrykcyjnego, który nie tnie w amplifikowanej sekwencji</td></tr><tr><td>Ścięte DNA nasienia łososia</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9680</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Syntetyczny fragment genu DNA lub zlinearyzowany plazmid</td><td>Różne</td><td>Różne</td><td>Projektuj syntetyczny fragment DNA zawierający docelowy region amplifikacji do użycia jako kontrola jakości</td></tr><tr><td>Bufor TE</td><td>Teknova</td><td>T0224</td><td>Upewnij się, że przygotowane lub zakupione są wolne od nukleaz. 10 mM Tris-HCl, 1,0 mM EDTA, pH = 8,0</td></tr><tr><td>Dotykowy termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000</td><td>Lub użyj materiału kompatybilnego z systemem ddPCR.</td></tr></tbody></table>

walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez

A Validatable Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of Adeno-Associated Viral Vectors in Bioshedding Studies of Tears

Wykorzystanie wektorów wirusowych w leczeniu chorób genetycznych znacznie wzrosło w ostatnich latach, z ponad 2,000 zarejestrowanych do tej pory badań. Wektory wirusowe związane z adenowirusem (AAV) odniosły szczególny sukces w leczeniu chorób związanych z oczami, czego przykładem jest zatwierdzenie leku voretigene neparvovec-rzyl. Aby wprowadzić nowe terapie na rynek, agencje regulacyjne zazwyczaj wymagają kwalifikowanych lub zwalidowanych badań nad biowydzielaniem w celu oceny uwalniania wektora do środowiska. Jednak Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków nie wydała żadnych oficjalnych wytycznych dotyczących opracowywania testów molekularnych wspierających takie badania nad zrzucaniem, pozostawiając twórcom najlepsze praktyki dla siebie. Celem tego protokołu jest przedstawienie walidowanego protokołu wykrywania wektorów AAV w ludzkich łzach za pomocą kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (ddPCR) w celu wsparcia klinicznych badań nad biowydzielaniem. W niniejszym artykule omówiono obecne podejścia przemysłu do walidacji testów molekularnych i wykazano, że metoda wykracza poza kryteria akceptacji testów docelowych proponowane obecnie w białych księgach. Na koniec omówiono etapy krytyczne w wykonaniu dowolnego testu ddPCR, niezależnie od zastosowania.

Dla celów demonstracyjnych opracowano test przeznaczony do wykrywania dostępnego na rynku, wzmocnionego wektora AAV2 z ekspresją zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP), z syntetycznym dwuniciowym fragmentem DNA zawierającym eGFP jako kontrolę jakości. Obecnie toczy się debata na temat tego, czy sam wektor, czy syntetyczny fragment DNA lub zlinearyzowany plazmid jest najbardziej odpowiedni do użycia jako kontrola jakości. Ogólnie rzecz biorąc, syntetyczny fragment DNA lub zlinearyzowany plazmid może być użyty, jeśli w procesie opracowywania metody zostanie wykazana równoważność z wektorem (dane nie pokazane). Startery i sondy zostały zaprojektowane i zoptymalizowane pod kątem wykrywania transgenu eGFP. Patrz Tabela Uzupełniająca S1, aby zapoznać się z sekwencjami wykorzystanymi w tej pracy. Stężenie zapasu fragmentów QC określono empirycznie za pomocą ddPCR. Wszystkie testy przeprowadzono przy użyciu stężeń i warunków PCR podanych jako przykłady w sekcji protokołu.
Dla testów qPCR zaleca się ocenę liniowości, czułości, zakresu dynamiki, dokładności i precyzji krzywej wzorcowej. Ponieważ ddPCR nie opiera się na krzywej standardowej do oznaczania docelowego oznaczania ilościowego, zalecenia te muszą zostać zmodyfikowane. Zamiast tego wykorzystano QC składające się z syntetycznych dwuniciowych fragmentów DNA rozcieńczonych do różnych stężeń w celu objęcia oczekiwanego wymiernego zakresu reakcji ddPCR w oparciu o modelowanie statystyczne Poissona29,30,31,32 w celu zdefiniowania zakresu dynamiki i czułości oraz oceny dokładności i precyzji. Wybór stężeń QC opierał się przede wszystkim na oczekiwanym stosunku dodatnich do całkowitych kropel w studzience przy danym stężeniu. Matematycznie ddPCR jest teoretycznie najdokładniejszy, gdy około 80% partycji dodatnio się wzmacnia. Gdy stosunek dodatni do całkowitego stosunku kropel wzrasta powyżej 0,8, dokładność zmniejsza się z powodu nasycenia przegród, przy czym kwantyfikacja nie jest możliwa, gdy 100% kropel jest dodatnich. Z drugiej strony, teoretycznie, można wykryć i określić ilościowo zaledwie jedną dodatnią kroplę, chociaż dokładność jest gorsza, a test jest podatny na fałszywe alarmy na niskim poziomie. Zazwyczaj co najmniej trzy krople muszą być dodatnie, aby wynik został obliczony z 95% pewnością, co jest progiem do obliczenia stężenia, którego tutaj użyliśmy.
Przygotowano serię pięciu różnych stężeń QC, z obliczoną docelową liczbą kopii/objętościami reakcji μL PCR, które mają dać dodatnie proporcje kropel do całkowitej obejmujące mierzalny zakres ddPCR, jak pokazano w Tabeli 5. Wykorzystano je do oceny dokładności i precyzji testu. W tej ocenie górna i dolna granica oznaczalności nie zostały przesunięte do teoretycznego maksimum możliwego w ddPCR. Dokładna kwantyfikacja może być możliwa przy wyższych i niższych poziomach niż wykazane tutaj. Zakres ten powinien być rozwijany zgodnie z dalszymi zastosowaniami tej metody.
Łącznie trzy niezależnie przygotowane serie rozcieńczeń tych QC zostały przygotowane w buforze do rozcieńczania próbki dla każdej partii, aby ocenić dokładność i precyzję testu wewnątrztestowego. Uwzględniono zduplikowane studzienki każdego rozcieńczenia QC. Aby zasymulować rzeczywisty protokół walidacji, wielu analityków przeprowadziło łącznie sześć partii dokładności i precyzji w ciągu kilku dni. Wyniki z tych sześciu partii przeanalizowano w celu określenia dokładności i precyzji metody w teście wewnętrznym i międzytestowym oraz w celu zdefiniowania zakresu dynamicznego testu.
Wydajność testu wewnętrznego została oceniona dla każdej partii na każdym poziomie kontroli jakości. Spodziewaliśmy się, że wszystkie studnie QC i NTC będą miały co najmniej 10 000 kropel. Wymóg ten został spełniony w 216 z 216 badanych studzienek we wszystkich sześciu partiach, przy średniej liczbie kropli wynoszącej 19 748 kropli / studzienkę (Tabela 6). Następnie oczekiwano, że %CV między studzienkami każdego zestawu zduplikowanych studzienek każdej kontroli jakości wyniesie ≤25,0%, z wyjątkiem górnej i dolnej granicy kontroli jakości, gdzie oczekiwano ≤30,0%. Zostało to spełnione w zestawach 90 z 90 dołków testowanych we wszystkich sześciu partiach dla kontroli jakości, ze średnim %CV między studzienkami wynoszącymi 3,9% na wszystkich poziomach kontroli jakości (tabela 7). Wszystkie QC dały średni dodatni stosunek kropli do całkowitej w oczekiwanych zakresach opisanych powyżej (Tabela 6).
W każdej partii, średnia z testu i odchylenie standardowe zostały obliczone dla każdego z niezależnie przygotowanych punktów serii rozcieńczeń, a następnie użyto ich do obliczenia średniej z testu dla każdego stężenia w każdym teście. Wykorzystano to do oceny dokładności i precyzji testu (tabela 8). Precyzja odnosi się do zmienności danych pochodzących z powtórzeń tej samej jednorodnej próbki w normalnych warunkach oznaczania i jest oceniana poprzez obliczenie %CV wielokrotności uwzględnionych podwielokrotności. Spodziewaliśmy się, że trzy podwielokrotności testowane w każdej partii dadzą %CV w teście wewnętrznym ≤25,0%, z wyjątkiem górnej i dolnej granicy kontroli jakości, gdzie oczekiwano ≤30,0%. Zostało to spełnione dla wszystkich pięciu poziomów kontroli jakości w każdej z 60 partii (30 z 30 wszystkich wyników). Ogólnie rzecz biorąc, można było osiągnąć większą precyzję wewnątrz testu niż kryteria docelowe, ze średnią %CV wewnątrz testu wynoszącą 7,7% na wszystkich poziomach kontroli jakości. Dokładność odnosi się do bliskości zgodności między wartością wyznaczoną doświadczalnie a wartością nominalną. Ocenia się to, obliczając procentowy błąd względny (%RE lub %Bias) między obliczonymi stężeniami każdego QC a ich teoretycznie oczekiwanymi stężeniami nominalnymi. Oczekiwano, że średnia z trzech podwielokrotności wyniesie ±25,0% RE stężenia nominalnego, z wyjątkiem górnej i dolnej granicy QC, gdzie oczekiwano ±30,0%. Zostało to spełnione dla wszystkich pięciu poziomów kontroli jakości w każdej z 60 partii (30 z 30 wszystkich wyników). Ogólnie rzecz biorąc, można było osiągnąć większą dokładność testu niż nasz cel, ze średnią bezwzględną %RE wewnątrz testu wynoszącą 4,2% na wszystkich poziomach kontroli jakości. We wszystkich parametrach NTC (łącznie 30) nie wykryto żadnych dodatnich kropel.
Dokładność i precyzja między testami zostały również obliczone przy użyciu średniej z każdego poziomu QC w każdej partii. Oczekiwano, że precyzja między testami wyniesie ≤25,0% CV, z wyjątkiem górnej i dolnej granicy kontroli jakości, gdzie oczekiwano ≤30,0%. Podobnie, w przypadku dokładności między testami, oczekiwano ±25,0% RE, z wyjątkiem górnej i dolnej granicy kontroli jakości, gdzie oczekiwano ±30,0%. Zaobserwowano znacznie większą dokładność i precyzję między testami niż te cele (Tabela 9), z precyzją między testami w zakresie od 4,0% do 8,5% i bezwzględną dokładnością między testami w zakresie od 1,0% do 3,2%. Podsumowując, wyniki te pokazują, że metoda ta może osiągnąć wystarczającą dokładność i precyzję w testach wewnątrz i między nimi, co mieści się w obecnych celach branżowych. Na podstawie tych wyników można określić zakres dynamiczny tego testu wynoszący 2,500-2,5 kopii na μl reakcji PCR, przy ogólnej czułości testu wynoszącej 2,5 kopii na μl reakcji PCR. Jak wspomniano wcześniej, możliwe jest zweryfikowanie szerszych zakresów dynamiki.
Następnie, konieczne było oszacowanie dokładności i precyzji testu w matrycy docelowej - w tym przypadku rozdarcia. Zazwyczaj testy są walidowane przed rozpoczęciem badań klinicznych, co oznacza, że jest mało prawdopodobne, aby łzy pobrane od pacjentów leczonych wektorem były dostępne do celów walidacji. Można to sztucznie stworzyć, wtłaczając docelowy wektor AAV do łez pobranych od ochotniczych dawców w celu wytworzenia QC z kolcami matrycy. Zebrane ludzkie łzy zostały pobrane przez stronę trzecią (BioIVT). Dla udowodnienia zasadności wykorzystano wektor AAV2 z ekspresją eGFP pozyskany ze źródła komercyjnego. Stężenie stada wektorów AAV2 określono empirycznie za pomocą ddPCR, bez użycia etapu izolacji DNA, jak opisano w niniejszym protokole. W każdym przebiegu AAV2 był niezależnie wzbogacany do trzech podwielokrotności łez na wysokim (oczekiwanym 1,41 x 103 kopii/μl reakcji PCR) i niskim (28,2 kopii/μl reakcji PCR) poziomie. Niewzbogacone podwielokrotności włączono jako kontrolę, aby wykazać specyficzność metody.
Wydajność testu wewnętrznego została oceniona dla każdej partii na każdym poziomie spajka. Spodziewano się, że wszystkie próbki łez będą miały co najmniej 10 000 kropel. Zostało to spełnione w 108 ze 108 studzienek testowanych we wszystkich sześciu partiach, przy średniej całkowitej liczbie kropli wynoszącej 20 208 kropli / studzienkę (Tabela 10). Następnie oczekiwano, że %CV między studzienkami każdego zestawu zduplikowanych studzienek każdej kontroli jakości wyniesie ≤25,0% dla wysokich i niskich poziomów skoków. Zostało to spełnione w 36 z 36 zestawów studzienek testowanych we wszystkich sześciu partiach dla kontroli jakości, ze średnim %CV między studzienkami wynoszącymi 3,2% (tabela 11).
W każdej partii, średnia z testu i odchylenie standardowe zostały obliczone dla każdego z niezależnie przygotowanych kolców łez, a następnie użyto ich do obliczenia średniej z testu dla każdego stężenia w każdym teście. Wykorzystano to do oceny dokładności i precyzji testu w matrycy (tabela 12). Spodziewaliśmy się, że %CV w teście wewnętrznym wyniesie ≤25,0%, a poziomy skoków będą wysokie i niskie. Zostało to spełnione w sześciu z sześciu partii dla każdego poziomu. Ogólnie rzecz biorąc, można było osiągnąć większą precyzję wewnątrz testu w matrycy niż wartość docelowa, przy średnim %CV wewnątrz testu wynoszącym 3,7% na wysokim poziomie i 12,2% na niskim poziomie (ogólnie 8,0%). Oczekiwano również, że %RE w teście wewnętrznym wyniesie ±25,0% przy obu poziomach skoków. Zostało to spełnione w sześciu z sześciu partii dla każdego poziomu. Podobnie, ogólnie stwierdzono, że można osiągnąć większą dokładność w matrycy testu niż wartość docelowa, przy średnim bezwzględnym %RE w teście wewnętrznym wynoszącym 8,1% na niskim poziomie i 11,3% na wysokim poziomie (ogólnie 9,7%). W przypadku kontroli bez wzbogacania nie wykryto sygnału eGFP w żadnej z podwielokrotności (Tabela 12), co świadczy o swoistości metody w ludzkiej macierzy łzowej.
Dokładność i precyzja między testami w matrycy łez została również obliczona przy użyciu średniej z testu każdego poziomu skoku w każdej partii. Oczekiwano, że precyzja między testami wyniesie ≤25,0% CV, a dla dokładności między testami spodziewaliśmy się ±25,0% RE. Zaobserwowano znacznie większą dokładność i precyzję między testami niż te cele (tabela 13), z precyzją między testami 5,5% na wysokim poziomie i 7,1% na niskim poziomie oraz z absolutną dokładnością między testami 11,3% na wysokim poziomie i 8,1% na niskim poziomie. Łącznie wyniki te pokazują dokładność, precyzję i specyficzność metody w matrycy łezowej.
Tabela 5: Kontrole jakości używane do określenia zakresu dynamicznego testu. Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre Tabela 5.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 6: Całkowita liczba kropel i dodatnie do całkowitego stosunku kropelek w kontroli jakości syntetycznego dwuniciowego DNA i NTC. Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre Tabela 6.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 7: Statystyki międzydołkowe kontroli jakości (kopiowanie celów/μL reakcji PCR). Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre Tabela 7.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 8: Dokładność i precyzja testów jakości (copy targets/μL PCR reaction). Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre Tabela 8.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 9: Dokładność i precyzja między testami QC (copy targets/μL reakcji PCR). Skróty: ULQC = upper limit quality control; HQC = wysoka kontrola jakości; MQC = średnia kontrola jakości; LQC = niska kontrola jakości; LLQC = dolna granica kontroli jakości; NTC = brak kontroli szablonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre Tabela 9.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 10: Całkowita liczba kropel w próbkach łez. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre Tabela 10.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 11: Statystyki międzydołkowe próbki łez (cele kopiowania/μL reakcji PCR). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre Tabela 11.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 12: Dokładność i precyzja próbek do łez (cele kopiowania/μL reakcji PCR). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre Tabela 12.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 13: Dokładność i precyzja między testami próbek łez (cele kopiowania/μL reakcji PCR). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre Tabela 13.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca S1: Sekwencje starterów, sond i kontroli jakości syntetycznego dwuniciowego DNA wykorzystane w tym badaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre Uzupełnij tabelę 1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i walidacji dobrych praktyk laboratoryjnych w zakresie zgodnego wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w ludzkich łzach za pomocą kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy w celu wsparcia klinicznego rozwoju wektorów terapii genowej.

Walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez

The use of viral vectors to treat genetic diseases has increased substantially in recent years, with over 2,000 studies registered to date. ...

Nasz protokół określa ilościowo wektory wirusowe związane z adenowirusami w złożonych matrycach. Dokładne wykrywanie i oznaczanie ilościowe są niezbędne do oceny ich skuteczności w badaniach klinicznych. Protokół ten ma w szczególności na celu wypełnienie obecnych luk regulacyjnych w projektowaniu badań molekularnych zgodnych z dobrymi praktykami laboratoryjnymi.W ramach opracowywania wektorów wirusowych agencje regulacyjne wymagają oceny biowydzielania wektorów. ddPCR jest obiecującą technologią do tej oceny, ponieważ pozwala na dokładną kwantyfikację bez użycia krzywej standardowej i lepszą czułość w porównaniu z qPCR. Dokładna kwantyfikacja złożonych matryc występujących w warunkach klinicznych, takich jak łzy, może być trudna do walidacji ze względu na interferencję i hamowanie PCR.Ograniczona ilość próbek klinicznych może również ograniczać zdolność do wykrywania rzadkich zdarzeń, jeśli test nie jest wystarczająco czuły. Nasze podejście opracowuje powtarzalne i adaptowalne ramy oparte na ddPCR do walidacji testów do stosowania w badaniach regulowanych. Metoda ta pozwala uniknąć określonego etapu ekstrakcji DNA, co pozwala na bardziej usprawnioną walidację i zapewnia jasne kryteria, na podstawie których można ocenić wydajność testu w celu zapewnienia solidności i powtarzalności.Protokół ten może być potencjalnie zastosowany w każdym badaniu dotyczącym wydalania wektorów wirusowych, a nie tylko w wykrywaniu AAV we łzach, jak przedstawiono tutaj. Tworzy solidne i powtarzalne ramy, na których można opracować wiele programów regulowanych zgodnie z przeznaczeniem. Na początek weź cyfrową mieszankę rozmrażającą lub główną mieszankę ddPCR i dodaj do niej sondy, starter do przodu i starter odwrotny w temperaturze pokojowej.Przygotuj mieszankę wzorcową dla każdego celu amplifikacji zgodnie z sugerowanym składem pokazanym na ekranie i dostosuj stężenia starterów i sond zgodnie z potrzebami. Dokładnie wymieszaj mieszaninę i krótko odwiruj ją w mini wirówce. Dodaj enzym restrykcyjny i odwróć, aby wymieszać.Następnie dodaj 16,5 mikrolitra przygotowanej mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki PCR i uszczelnij płytkę przezroczystą folią samoprzylepną. Używając buforu do rozcieńczania próbki jako rozcieńczalnika, przygotuj rozcieńczenia do kontroli jakości lub kontroli jakości, jak opisano w tej tabeli, która reprezentuje zalecane stężenia dla dokładności walidacji i precyzji przebiegu. Rozcieńczyć próbki łez buforem do rozcieńczania próbki w stosunku 1 do 10 w 0,2 mililitrowych probówkach do PCR.I uszczelnij rurki. Podgrzewać próbki w termocyklerze w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej pięć minut. Usunąć folię klejącą z płytki ddPCR zawierającej mieszankę wzorcową i dodać 5,5 mikrolitra rozcieńczeń QC do odpowiednich dołków płytki 96-dołkowej, jak pokazano na mapie płytki.Następnie dodaj 5,5 mikrolitra próbki do studzienek. Dodać 5,5 mikrolitra buforu do rozcieńczania próbki do studzienek kontrolnych bez matrycy lub studzienek NTC. Rozcieńczyć 2x kontrolę buforu ddPCR w stosunku 1 do 2 przy użyciu wody wolnej od nukleaz.I dodaj 22 mikrolitry buforu do dowolnych pustych studzienek kolumny. Dodaj przebijalną uszczelkę foliową do płytki i umieść płytkę w zgrzewarce do płyt. Zamknij płytkę na pięć sekund w temperaturze 180 stopni Celsjusza.Obracaj płytkę z maksymalną prędkością przez co najmniej 30 sekund. I krótko odwirować w wirówce talerzowej. Na ekranie dotykowym automatycznego generatora kropel wybierz kolumny na mapie płytowej zawierające próbki.Pokład instrumentu zaświeci się, wskazując, które materiały eksploatacyjne są wymagane. Załaduj generator kropel od tyłu do przodu. Żółte światło zmieni kolor z żółtego na zielony, aby wskazać wystarczającą ilość materiałów eksploatacyjnych.Umieść zimny blok w uchwycie płytki kropelkowej. Upewnij się, że blok jest całkowicie niebieski i nie jest widoczny różowy. Umieść nową 96-dołkową płytkę ddPCR w zimnym bloku.Umieścić przygotowaną płytkę do PCR w uchwycie na płytkę do próbki. Zamknij pokrywę urządzenia i naciśnij Start, aby wytworzyć kropelki. W ciągu 30 minut wyjmij płytkę zawierającą kropelki z zimnego bloku.Dodaj przebijalną uszczelkę foliową do płytki i umieść płytkę w zgrzewarce do płyt. Zamknij go na pięć sekund w temperaturze 180 stopni Celsjusza. Następnie umieść płytkę w kompatybilnym termocyklerze i wprowadź warunki jazdy na rowerze pokazane na ekranie.Załaduj płytkę do czytnika kropelkowego, upewniając się, że pozostała wystarczająca ilość oleju w czytniku, a pojemnik na odpady ma wystarczająco dużo miejsca. Na koniec naciśnij przycisk Czytaj w oprogramowaniu, aby rozpocząć odczytywanie kropel. Obliczono średnią z całego testu dla każdego stężenia w każdym teście, która została wykorzystana do oceny precyzji i dokładności testu.Średnia precyzja wewnątrz testu wyniosła 7,7%, a średnia bezwzględna dokładność wewnątrz testu wyniosła 4,2% na wszystkich poziomach kontroli jakości. Dokładność i precyzja między testami zostały również obliczone przy użyciu średniej z całego testu dla każdego poziomu kontroli jakości w każdej partii. Stwierdzono precyzję wewnątrz testu w zakresie od 4 do 8,5% i dokładność bezwzględną w teście w zakresie od 1 do 3,2%.Podobnie w przypadku próbki wielopoziomowej zaobserwowano średnią precyzję wewnątrz testu wynoszącą 3,7% przy wysokim poziomie skoku i 12,2% przy niskim poziomie skoku oraz średnią bezwzględną dokładność wewnątrz testu wynoszącą 11,3% przy wysokim poziomie i 8,1% przy niskim poziomie. W przypadku obliczeń wewnątrz testu stwierdzono precyzję 5,5% na poziomie wysokim i 7,1% na poziomie niskim oraz dokładność bezwzględną 11,3% na poziomie wysokim i 8,1% na poziomie niskim.

a-validatable-droplet-digital-polymerase-chain-reaction-assay-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten protokół pokazuje, jak określić ilościowo skuteczność transdukcji AAV w siatkówce myszy za pomocą cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) wraz z produkcją AAV na małą skalę, iniekcją doszklistkową, obrazowaniem siatkówki i izolacją genomowego DNA siatkówki.

Cyfrowa metoda kropelkowej PCR do ilościowego oznaczania skuteczności transdukcji AAV w siatkówce myszy

Precyzyjna kwantyfikacja kopii genomu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jest kluczowa, ale standardowy protokół nie został jeszcze ustalony. Protokół ten opisuje zwalidowaną metodę przygotowania oczyszczonych próbek AAV i przeprowadzenia cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (dd_PCR) w celu wiarygodnego ilościowego określenia miana genomu wirusa.

Kwantyfikacja genomów wirusów związanych z adenowirusami w oczyszczonych próbkach wektorów za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

PCR stał się powszechną techniką w wielu laboratoriach biologii molekularnej. Niniejszym przedstawiamy krótki przewodnik po kilku konwencjonalnych protokołach PCR. Ponieważ każda reakcja jest unikalnym eksperymentem, optymalne warunki niezbędne do otrzymania produktu są zmienne. Zrozumienie zmiennych w reakcji znacznie zwiększy efektywność rozwiązywania problemów, zwiększając tym samym szansę na uzyskanie pożądanego wyniku.

Reakcja łańcuchowa polimerazy: podstawowy protokół oraz strategie rozwiązywania problemów i optymalizacji

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

Celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić automatyczną ekstrakcję DNA z referencyjnych linii komórkowych z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie (FFPE) oraz cyfrową analizę PCR kropelkowego (ddPCR) w celu wykrycia rzadkich mutacji w warunkach klinicznych. Wykrywanie mutacji w próbkach FFPE pokazuje kliniczną przydatność ddPCR w próbkach FFPE.

Wykorzystanie cyfrowej reakcji kropelkowej PCR do wykrywania mutacji BRAF V600E w standardowych referencyjnych liniach komórkowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje prosty test punktowy do ilościowego oznaczania mian wirusów związanych z adenowirusem (AAV) i jego zastosowanie do badania roli białek aktywujących składanie (AAP), nowej klasy niestrukturalnych białek wirusowych występujących we wszystkich serotypach AAV, w promowaniu składania kapsydów pochodzących z pokrewnych i heterologicznych serotypów AAV.

Ilościowy test igłowy do miareczkowania AAV i jego zastosowanie do oceny funkcjonalnej białek aktywujących składanie wirusa związanego z adenowirusem

Protokół ma na celu wprowadzenie użycia potrójnego kwadrupolowego spektrometru masowego do monitorowania wielu reakcji (MRM) białek z próbek klinicznych. Zapewniliśmy systematyczny przepływ pracy, począwszy od przygotowania próbki po analizę danych dla próbek klinicznych, z zachowaniem wszystkich niezbędnych środków ostrożności, które należy podjąć.

Ilościowy przebieg proteomiki z wykorzystaniem wykrywania białek z ludzkiej tkanki mózgowej w oparciu o monitorowanie wielu reakcji

Ta praca podsumowuje kroki nad opracowaniem różnych testów do wykrywania SARS-CoV-2 przy użyciu dwukolorowego systemu ddPCR. Kroki są skomplikowane i dołączono uwagi dotyczące tego, jak poprawić wyniki testów i eksperymentów. Testy te mogą być stosowane w wielu zastosowaniach SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Dwuetapowe cyfrowe protokoły PCR z kroplami odwrotnej transkrypcji do wykrywania i kwantyfikacji SARS-CoV-2

Obywatelski projekt naukowy miał na celu rekrutację mieszkańców San Diego do pobierania próbek środowiskowych na obecność SARS-CoV-2. Stworzono wielojęzyczną platformę internetową do przesyłania danych za pomocą przyjaznego dla użytkownika interfejsu urządzenia mobilnego. System zarządzania informacjami laboratoryjnymi ułatwił gromadzenie tysięcy próbek zróżnicowanych geograficznie dzięki śledzeniu wyników w czasie rzeczywistym.

Wymazy ze środowiska miejskiego - rurociąg do pobierania próbek i wykrywania SARS-CoV-2 ze zbiorników środowiskowych

Poznaj walidowalny protokół ddPCR do wykrywania wektorów AAV w ludzkich łzach. Ta metoda zapewnia precyzyjną ilościową analizę wektorów wirusowych w złożonych matrycach klinicznych zgodnie z wymogami regulacyjnymi.

Walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez (Wideo) | JoVE Journal

Walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez

Przeglądaj więcej filmów