Walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez

Nasz protokół określa ilościowo wektory wirusowe związane z adenowirusami w złożonych matrycach. Dokładne wykrywanie i oznaczanie ilościowe są niezbędne do oceny ich skuteczności w badaniach klinicznych. Protokół ten ma w szczególności na celu wypełnienie obecnych luk regulacyjnych w projektowaniu badań molekularnych zgodnych z dobrymi praktykami laboratoryjnymi.

W ramach opracowywania wektorów wirusowych agencje regulacyjne wymagają oceny biowydzielania wektorów. ddPCR jest obiecującą technologią do tej oceny, ponieważ pozwala na dokładną kwantyfikację bez użycia krzywej standardowej i lepszą czułość w porównaniu z qPCR. Dokładna kwantyfikacja złożonych matryc występujących w warunkach klinicznych, takich jak łzy, może być trudna do walidacji ze względu na interferencję i hamowanie PCR.

Ograniczona ilość próbek klinicznych może również ograniczać zdolność do wykrywania rzadkich zdarzeń, jeśli test nie jest wystarczająco czuły. Nasze podejście opracowuje powtarzalne i adaptowalne ramy oparte na ddPCR do walidacji testów do stosowania w badaniach regulowanych. Metoda ta pozwala uniknąć określonego etapu ekstrakcji DNA, co pozwala na bardziej usprawnioną walidację i zapewnia jasne kryteria, na podstawie których można ocenić wydajność testu w celu zapewnienia solidności i powtarzalności.

Protokół ten może być potencjalnie zastosowany w każdym badaniu dotyczącym wydalania wektorów wirusowych, a nie tylko w wykrywaniu AAV we łzach, jak przedstawiono tutaj. Tworzy solidne i powtarzalne ramy, na których można opracować wiele programów regulowanych zgodnie z przeznaczeniem. Na początek weź cyfrową mieszankę rozmrażającą lub główną mieszankę ddPCR i dodaj do niej sondy, starter do przodu i starter odwrotny w temperaturze pokojowej.

Przygotuj mieszankę wzorcową dla każdego celu amplifikacji zgodnie z sugerowanym składem pokazanym na ekranie i dostosuj stężenia starterów i sond zgodnie z potrzebami. Dokładnie wymieszaj mieszaninę i krótko odwiruj ją w mini wirówce. Dodaj enzym restrykcyjny i odwróć, aby wymieszać.

Następnie dodaj 16,5 mikrolitra przygotowanej mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki PCR i uszczelnij płytkę przezroczystą folią samoprzylepną. Używając buforu do rozcieńczania próbki jako rozcieńczalnika, przygotuj rozcieńczenia do kontroli jakości lub kontroli jakości, jak opisano w tej tabeli, która reprezentuje zalecane stężenia dla dokładności walidacji i precyzji przebiegu. Rozcieńczyć próbki łez buforem do rozcieńczania próbki w stosunku 1 do 10 w 0,2 mililitrowych probówkach do PCR.

I uszczelnij rurki. Podgrzewać próbki w termocyklerze w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej pięć minut. Usunąć folię klejącą z płytki ddPCR zawierającej mieszankę wzorcową i dodać 5,5 mikrolitra rozcieńczeń QC do odpowiednich dołków płytki 96-dołkowej, jak pokazano na mapie płytki.

Następnie dodaj 5,5 mikrolitra próbki do studzienek. Dodać 5,5 mikrolitra buforu do rozcieńczania próbki do studzienek kontrolnych bez matrycy lub studzienek NTC. Rozcieńczyć 2x kontrolę buforu ddPCR w stosunku 1 do 2 przy użyciu wody wolnej od nukleaz.

I dodaj 22 mikrolitry buforu do dowolnych pustych studzienek kolumny. Dodaj przebijalną uszczelkę foliową do płytki i umieść płytkę w zgrzewarce do płyt. Zamknij płytkę na pięć sekund w temperaturze 180 stopni Celsjusza.

Obracaj płytkę z maksymalną prędkością przez co najmniej 30 sekund. I krótko odwirować w wirówce talerzowej. Na ekranie dotykowym automatycznego generatora kropel wybierz kolumny na mapie płytowej zawierające próbki.

Pokład instrumentu zaświeci się, wskazując, które materiały eksploatacyjne są wymagane. Załaduj generator kropel od tyłu do przodu. Żółte światło zmieni kolor z żółtego na zielony, aby wskazać wystarczającą ilość materiałów eksploatacyjnych.

Umieść zimny blok w uchwycie płytki kropelkowej. Upewnij się, że blok jest całkowicie niebieski i nie jest widoczny różowy. Umieść nową 96-dołkową płytkę ddPCR w zimnym bloku.

Umieścić przygotowaną płytkę do PCR w uchwycie na płytkę do próbki. Zamknij pokrywę urządzenia i naciśnij Start, aby wytworzyć kropelki. W ciągu 30 minut wyjmij płytkę zawierającą kropelki z zimnego bloku.

Dodaj przebijalną uszczelkę foliową do płytki i umieść płytkę w zgrzewarce do płyt. Zamknij go na pięć sekund w temperaturze 180 stopni Celsjusza. Następnie umieść płytkę w kompatybilnym termocyklerze i wprowadź warunki jazdy na rowerze pokazane na ekranie.

Załaduj płytkę do czytnika kropelkowego, upewniając się, że pozostała wystarczająca ilość oleju w czytniku, a pojemnik na odpady ma wystarczająco dużo miejsca. Na koniec naciśnij przycisk Czytaj w oprogramowaniu, aby rozpocząć odczytywanie kropel. Obliczono średnią z całego testu dla każdego stężenia w każdym teście, która została wykorzystana do oceny precyzji i dokładności testu.

Średnia precyzja wewnątrz testu wyniosła 7,7%, a średnia bezwzględna dokładność wewnątrz testu wyniosła 4,2% na wszystkich poziomach kontroli jakości. Dokładność i precyzja między testami zostały również obliczone przy użyciu średniej z całego testu dla każdego poziomu kontroli jakości w każdej partii. Stwierdzono precyzję wewnątrz testu w zakresie od 4 do 8,5% i dokładność bezwzględną w teście w zakresie od 1 do 3,2%.

Podobnie w przypadku próbki wielopoziomowej zaobserwowano średnią precyzję wewnątrz testu wynoszącą 3,7% przy wysokim poziomie skoku i 12,2% przy niskim poziomie skoku oraz średnią bezwzględną dokładność wewnątrz testu wynoszącą 11,3% przy wysokim poziomie i 8,1% przy niskim poziomie. W przypadku obliczeń wewnątrz testu stwierdzono precyzję 5,5% na poziomie wysokim i 7,1% na poziomie niskim oraz dokładność bezwzględną 11,3% na poziomie wysokim i 8,1% na poziomie niskim.