In vivo (in vivo) Funkcjonalne obrazowanie mózgu oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin

Ogólnym celem obrazowania bioluminescencyjnego jest zobrazowanie in vivo funkcjonalnego przejściowego wapnia, wskaźnika aktywności przez dłuższy czas i w głębokich strukturach mózgu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii, takie jak to, jak wygląda podstawowa aktywność mózgu muchy podczas snu. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga wzbudzenia za pomocą lasera.

Pozwala to na obrazowanie przejściowego wapnia głębiej w tkance i przez dłuższy czas bez fotowybielania i toksyczności, w porównaniu z klasycznym obrazowaniem wapnia. Metoda ta może zapewnić wgląd w podstawową aktywność mózgu u drosophila, a także może być stosowana w przypadku innych organizmów modelowych, takich jak mysz. Na początek przygotuj interesującą nas linię Drosophila melanogaster oraz roztwory eksperymentalne, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.

Następnie znieczulenie lodem znieczula pojedynczą drosophilę, przenosząc ją do szklanej fiolki na lodzie na dwie minuty. Następnie przenieś muchę na schłodzoną szalkę Petriego i za pomocą kleszczy delikatnie umieść muchę w końcówce pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, przyciętej tak, aby końcówka była pod kątem około 35 stopni. Za pomocą pędzla delikatnie popchnij i wyrównaj każdą muchę tak, aby głowa całkowicie wysunęła się poza krawędź końcówki, a obszar grzbietowy był częściowo odsłonięty.

Następnie nałóż przygotowany klej dentystyczny od głowy do krawędzi końcówki pipety. Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć czubka głowy. Klejenie głowicy ma kluczowe znaczenie, ponieważ zabezpieczenie jej we właściwej pozycji jest niezbędne do udanej sekcji i obrazowania.

Dodatkowo, słabe klejenie doprowadzi do wycieku roztworu dzwonka i śmierci próbki przed obrazowaniem. Następnie umieść końcówkę pipety z dołączoną muchą przez otwór w komorze nagrywającej i delikatnie dociśnij, aby zamocować ją na miejscu. Następnie użyj przygotowanego kleju silikonowego, aby zabezpieczyć płaską stronę komory w miejscu, w którym styka się z końcówką pipety, aby zapobiec wyciekom.

Przymocuj kawałek kranu nad kanałem obfitości, krótszą krawędzią i rozciągający się do tyłu komory. Następnie umieść komorę z muchą pod mikroskopem i włącz świetlówkę. Następnie odpipetować jeden mililitr roztworu Ringera do komory.

Za pomocą cienkiego noża chirurgicznego wykonaj równoległe nacięcia od tyłu głowy muchy do okolicy przedsionkowej po obu stronach. Następnie przetnij wzdłuż krawędzi oka i wykonaj prostopadłe nacięcie nad anteną, która łączy poprzednie nacięcia. Wykonaj ostatnie nacięcie z tyłu głowy, a następnie użyj cienkich, ostrych kleszczy, aby usunąć naskórek.

Delikatnie chwyć i usuń odsłoniętą tkankę oddechową, aż mózg i fluorescencyjne ciało grzyba będą wyraźnie widoczne. Następnie użyj bardzo ostrych kleszczy, aby ostrożnie chwycić i uszczypnąć tkankę nabłonka nerwowego pokrywającą mózg, aby ją usunąć i umożliwić przenikanie celelenterazyny. Za pomocą pipety umyj tkankę dwukrotnie jednym mililitrem roztworu Ringera, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia pozostałe po sekcji, a następnie umieść próbkę w ciemnym pudełku.

Następnie odpipetować jeden mililitr roztworu Ringera, zawierającego pięć mikromolowych benzylo-koelenterazyn do komory. Zamknąć pudełko i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie godziny. Zacznij od włączenia mikroskopu w komputerze.

Schłodzić również aparat do minus 80 stopni Celsjusza. Następnie skonfiguruj system odwadniający i dostosuj elementy otoczenia do 20 stopni Celsjusza. Następnie otwórz imager fotonowy, utwórz nowy folder i nazwij pierwsze nagranie.

Następnie skonfiguruj system profuzji, dodając chlorek potasu, nikotynę i roztwór Ringera do odpowiednich zbiorników. Dostosuj przepływ tak, aby każdy roztwór rozładowywał się z prędkością dwóch mililitrów na minutę. Następnie umieść próbkę na uchwycie pod mikroskopem i ustaw powiększenie na 5X.

Następnie włóż rurkę profuzyjną do kanału przez nakłucie. Ustaw mikroskop w trybie fluorescencyjnym, a następnie wyśrodkuj i ustaw ostrość na ciałach grzybów. Gdy ciała grzybów są już ostre, zmień powiększenie na 20X.

Wyśrodkuj obraz i dostosuj ostrość. Następnie umieść urządzenie drenażowe nad basenem drenażowym i wyreguluj wysokość bocznika drenażowego, tak aby końcówka znajdowała się tuż nad basenem drenażowym. Następnie przepłukać próbkę roztworem dzwonka przez 30 sekund, aby sprawdzić, czy drenaż jest odpowiedni.

Na koniec pociągnij osłonę w dół, aby uszczelnić urządzenie przed światłem zewnętrznym. Korzystając z automatycznego systemu w programie do obrazowania fotonów, dokonaj precyzyjnych korekt ostrości i wykonaj referencyjny obraz fluorescencyjny ciał grzybów. Dostosuj prędkość fotonów do żądanej prędkości nagrywania, która powinna wynosić od jednego obrazu co 50 milisekund do jednego co sekundę lub więcej.

Następnie wybierz tryb fotonowy i otwórz migawkę. Następnie wprowadź genotyp, płeć, wiek i numer próbki we wpisach dziennika. Dostosuj położenie pól obszaru zainteresowania nad kielichem, ciałami komórek i płatami przyśrodkowymi, klikając pola i przeciągając je na miejsce, przytrzymując kontrolę.

Teraz zapisuj wartości bazowe przez około pięć do 10 minut. Następnie włącz przełącznik, aby rozpocząć przepływ nikotyny. W tym samym czasie naciśnij enter i dodaj notatkę oznaczającą, że rozpoczął się przepływ nikotyny.

Po jednej minucie zatrzymaj przepływ i dokonaj kolejnej notatki w dzienniku, co oznacza, że przepływ został zatrzymany. Następnie przemyć próbkę roztworem dzwonka przez pięć minut. Podczas gdy próbka dojśnie, wyłącz pranie, ustaw minutnik na dodatkowe pięć minut i przygotuj się do rozpoczęcia przepływu chlorku potasu.

Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia, rozpocznij przepływ chlorku potasu i wprowadź 100 milimolowy start chlorku potasu do dziennika próbki. Po jednej minucie zatrzymaj przepływ i wprowadź chlorek potasu odcięty do dziennika próbki. Następnie przemyj próbkę roztworem dzwonka przez jedną minutę i przełącz mikroskop w tryb fluorescencyjny.

Wykonaj końcowe zdjęcie fluorescencyjne, a następnie wyłącz roztwór dzwonka i usuń próbkę. W programie do analizy otwórz pierwszy plik, wybierz zakładkę "kontrolka wyświetlania" i kliknij ROI. Następnie przytrzymaj Control i wybierz interesujący Cię region.

Następnie dostosuj rozmiar, orientację i kształt ROI, aby objąć kielich i ciała komórek oświetlone GFP oraz płaty przyśrodkowe. Po dodaniu wszystkich obszarów zainteresowania wybierz film"zakładkę, aby odtworzyć wideo fotonowe. Dostosuj drugą szerokość i drugi krok zgodnie z potrzebami.

Następnie w razie potrzeby dostosuj położenie ROI, tak aby pozostało w aktywnych regionach wideo. Wybierz kilka reprezentatywnych zrzutów ekranu przedstawiających fluorescencję GFP, odpowiedź nikotynową i odpowiedź chlorku potasu. Następnie przytnij zrzuty ekranu i wklej reprezentatywne obrazy do slajdu prezentacji w celu późnej analizy i porównania.

Dostosuj zarówno drugą szerokość, jak i drugi krok do prędkości nagrywania w kilka sekund. Wybierz również długość analizy, przesuwając szare znaczniki w górnym panelu do obszaru w nawiasach, przed inicjacją bodźca i tuż po zakończeniu odpowiedzi. Następnie wybierz zawieś widoki"podczas odtwarzania, a następnie naciśnij przycisk przewijania do tyłu, aby zresetować odtwarzanie wideo do początku, a następnie przycisk odtwarzania.

Następnie wybierz zakładkę wykres stawki zliczania"w celu dostosowania jednostek, a także dostosowania koloru obszarów zainteresowania, a także kolorów linii zgodnie z potrzebami. Po zakończeniu analizy wybierz opcję eksportuj dane dotyczące stawki inwentaryzacji. Następnie wybierz połączone nagrania kielicha i ciał komórek, a także te z obszarów płata przyśrodkowego po każdej stronie i wklej te obrazy do slajdu z obrazami odpowiedzi.

Jednym z najprostszych sposobów stymulacji ciał grzybów jest aktywacja jonotropowych nikotynowych receptorów acetylocholiny. Typowa reakcja na 25-mikromolową nikotynę, pokazana tutaj, rozpoczyna się od szybkiej aktywacji zarówno kielicha, jak i ciał komórkowych oraz płatów przyśrodkowych i wykorzystuje połączony konstrukt GFP-aequorin, który wiąże się z wapniem i emituje światło. Ogólnie rzecz biorąc, odpowiedź w kielichu i ciałach komórkowych trwa dłużej i wykazuje większą odpowiedź bioluminescencyjną niż płaty, jak pokazano w sekwencyjnych panelach odpowiedzi.

Przykładowy zapis odpowiedzi bioluminescencyjnej na aktywację nikotynową w czasie jest opisany na tym wykresie, gdzie liczba fotonów w obszarze zainteresowania zawierającym kielich i ciała komórkowe jest przedstawiona na czarnym wykresie, a liczba fotonów w obszarze płata przyśrodkowego jest pokazana na czerwono. Na podstawie tego wykresu można określić długość odpowiedzi, szczytową wartość fotonu podczas odpowiedzi oraz całkowity obszar pod każdą krzywą. Po opanowaniu faza przygotowania powinna trwać tylko dwie godziny przed inkubacją, w zależności od liczby much.

Ponadto każde nagranie można ukończyć w ciągu zaledwie dwudziestu minut, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o odpowiednim starzeniu i przechowywaniu stada much, aby zapewnić powtarzalność między próbkami. Po tej procedurze można przeprowadzić dalsze testy behawioralne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. jaki wpływ ma aktywność struktury na określone zachowanie.

Rozwój tej techniki utorował drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do zbadania długoterminowej aktywności neuronalnej w mózgu drosophila. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki do obrazowania bioluminescencyjnego w mózgu muchy. Nie zapominaj, że nikotyna może być niebezpieczna dla zdrowia.

Podczas przygotowywania roztworów lub sprzątania po tej procedurze należy zachować środki ostrożności, takie jak rękawiczki.