Funkcjonalne obrazowanie wapnia w rozwoju sieci korowych

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, w jaki sposób mierzyć aktywność sieci na podstawie rozwijających się wycinków kory mózgowej za pomocą wrażliwego na wapń wskaźnika fluorescencyjnego. Wycinki mózgu DY są wykonane z rozwijającej się kory brzusznej młodej myszy. Zarówno neurony, jak i astrocyty są obciążone markerami zależnymi od wapnia.

Zmiany we fluorescencji barwników zależnych od wapnia odzwierciedlają zmiany w aktywności komórkowej. Komórki nieneuronalne, w tym astrocyty, mikroglej i komórki śródbłonka, można barwić przy użyciu określonych barwników markerowych. Aktywność sieci korowej jest rejestrowana za pomocą poklatkowego obrazowania wielofotonowego Komórki są wykrywane w sieci poprzez tworzenie stosu obrazów 3D przez obszar zainteresowania.

Zmiany we fluorescencji komórkowej w wielu komórkach mogą być następnie analizowane w celu odczytania aktywności rozwijającej się sieci korowej. Charakterystycznym wzorcem aktywności w rozwijającym się układzie nerwowym jest spontaniczna, zsynchronizowana aktywność sieciowa. Zsynchronizowaną aktywność zaobserwowano w wielu różnych rozwijających się regionach neuronalnych, w tym w nienaruszonej korze rdzenia kręgowego i zdysocjowanych preparatach kultur neuronalnych w okresach spontanicznej aktywności neuronów, zdepolaryzowanych do ognia, pojedynczych skoków lub wybuchów potencjałów czynnościowych aktywujących wiele kanałów żelaza, w tym kanały wapniowe bramkowane napięciem prowadzące do napływu wapnia.

Wysoce zsynchronizowana aktywność została zmierzona z sieci lokalnych przy użyciu elektrod polowych lub układów wieloelektrodowych. Umożliwiają one wysokie czasowe częstotliwości próbkowania, ale dają niższą rozdzielczość przestrzenną ze względu na zintegrowany odczyt aktywności komórek. Rozdzielczość aktywności neuronalnej pojedynczej komórki jest możliwa przy użyciu elektrofizjologii pojedynczych neuronów w celu pomiaru szybkości wypalania.

Jednak możliwość pomiaru z sieci jest ograniczona do liczby neuronów załatanych jednocześnie i zazwyczaj jest to tylko jeden lub dwa neurony. Zastosowanie fluorescencyjnych barwników wskaźnikowych zależnych od wapnia umożliwiło pomiar zsynchronizowanej aktywności w sieci komórek. Technika ta zapewnia zarówno wysoką rozdzielczość przestrzenną, jak i wystarczające próbkowanie czasowe do zarejestrowania spontanicznej aktywności rozwijającej się sieci.

Fluorescencyjne wskaźniki wrażliwe na wapń, takie jak ester URA 2:00 AM, zawierają grupy kwasów karboksylowych, które są zdolne do wiązania kopalni wapnia. Te barwniki fluorescencyjne są aktywowane przez określone długości fal świetlnych za pomocą mikroskopii jedno- lub dwufotonowej. Liczba fotonów emitowanych przez barwnik ulega przejściowej zmianie po związaniu wapnia.

Ta zmiana liczby fotonów lub fluorescencji jest zgłaszana jako sygnał delta FF i odpowiada zmianie poziomu wapnia w neuronach. Pomiar zmian wskaźników wrażliwych na wapń jest użyteczną miarą wzorców aktywności sieci w rozwijających się komórkach. Cześć, nazywam się Rianna Morty i nazywam się Julie Abbots.

Jesteśmy z Zakładu Neurofizjologii Interpretacyjnej i Uniwersytetu w Amsterdamie. Używaliśmy obrazowania wapnia do badania aktywności funkcjonalnej w rozwoju tkanki w korze myszy przy użyciu wskaźników wrażliwych na wapń w obrazowaniu wieloogniskowym. Celem tego krótkiego filmu jest pokazanie, w jaki sposób metody te mogą być wykorzystane do pomiaru zarówno spontanicznych, jak i wywołanych wzorców aktywności w rozwijających się sieciach w układzie nerwowym.

Usuń mózg Szybko z czaszki młodej myszy, aby zmniejszyć uszkodzenie obwodów nerwowych. Wypreparuj mózg w lodowatym roztworze plastrów. Roztwór plastrów zawiera chlorek koliny zamiast sodu powszechnie stosowanego w A TSF do zapisów neuronalnych.

W tych eksperymentach robimy wycinki mózgu z kory brzusznej rozwijającego się mózgu myszy. Umieść kawałek bibuły filtracyjnej na naczyniu petro i zwilż kilkoma mililitrami A TSF. Przenieś mózg na kawałek bibuły filtracyjnej.

Przetnij półkule na pół za pomocą żyletki o pojedynczej krawędzi. Oddziel dwie półkule. Umieść jeden z powrotem w roztworze lodowatego plastra z pozostałą półkulą.

Usuń móżdżek za pomocą żyletki. Odwróć jedną półkulę na linię środkową i wykonaj cięcie o długości około jednego milimetra od powierzchni grzbietowej z niewielkim kątem ostrza w kierunku końca rostralnego. Odwróć mózg do.

Jego niedawno przyciętą powierzchnię za pomocą bawełnianego ptaka i metalowej szpatułki. Przenieś mózg do metalowego bloku tnącego. Delikatnie zepchnij mózg ze szpatułki za pomocą bawełnianego ptaszka na sklejoną powierzchnię.

Wycinki mózgu o grubości 300 mikrometrów są wycinane dla młodych tkanek, prędkości cięcia, a częstotliwość ostrzy jest zwykle mniejsza niż w przypadku bardziej dojrzałych tkanek. Po pokrojeniu przenieś każdą plasterkę za pomocą szklanej pipety, plastry przenosi się do komory trzymania, która zawiera natleniony A TSF w temperaturze pokojowej. Płyn mózgowo-rdzeniowy A zawiera wyższy stosunek magnezu do wapnia niż roztwór płynu mózgowo-rdzeniowego A.

Używane do nagrywania plasterki pozostawia się na godzinę do odzyskania. Aby załadować komórki wskaźnikiem zależnym od wapnia lub specyficznymi dla komórek plastrami markera, należy przenieść je do komory w celu przeprowadzenia procedury barwienia. Chociaż dostępne są komory komercyjne, można je łatwo zmontować ze standardowego sprzętu laboratoryjnego za bardzo niewielką cenę.

Aby wykonać komorę do barwienia, potrzebujesz następującego podstawowego sprzętu laboratoryjnego, dwóch plastikowych szalek Petriego, jednej 10-mililitrowej strzykawki, odcinka rurki krzemionkowej, wkładki do hodowli komórkowej z półprzepuszczalnym super klejem membranowym, trzech małych łączników rurek i cienkiej igły. Weź dużą szalkę Petriego i zrób mały otwór za pomocą podgrzewanego pręta przez ścianę boczną. Weź małą szalkę Petriego i zrób otwór o podobnej średnicy, wystarczająco duży, aby mogła przejść przez niego silikonowa rurka.

Przełóż odcinek silikonowej rurki przez otwór i uformuj pętlę wewnątrz małego naczynia. Użyj super kleju, aby uszczelnić otwarty koniec rurki. Następnie przyklej pozostałą część rurki do wewnętrznej ścianki małej szalki Petriego.

Umieść małą szalkę Petriego na środku dużej i przyklej na miejscu. Weź pozostały koniec silikonowej rurki i przełóż go przez mały otwór w ścianie bocznej szalki Petriego. Weź cienką igłę i zrób małe otwory w silikonowej rurce wewnątrz szalki Petriego.

Wykonaj otwory w równych odstępach, aby uzyskać równomierne wtopienie gazu. Weź dobrze kulturę komórkową z półprzepuszczalną membraną za pomocą podgrzanego skalpela. Odetnij górny centymetr dołka, aby pozostawić płytkie naczynie do przechowywania plastrów podczas inkubacji.

Umieść płytkie naczynie na środku małego naczynia otoczonego porowatymi silikonowymi rurkami. Zrób otwór o średnicy około pół do jednego centymetra w pokrywie dużego naczynia. Weź 10-mililitrową plastikową strzykawkę za pomocą podgrzanego skalpela.

Wykonaj cięcie pod kątem, aby usunąć koniec strzykawki. Nałóż super klej na przeciętą powierzchnię rurki strzykawki. Przyklej go bezpośrednio do otworu w dużej pokrywie szalki Petriego.

Przymocować łącznik rurki do końca końcówki strzykawki. Umieść płytkie naczynie na środku małej szalki Petriego, upewniając się, że porowate rurki gazowe leżą wokół naczynia. Rurka ta jest następnie podłączana do źródła gazu karbogenicznego w celu natlenienia plastrów.

Podczas inkubacji należy założyć pokrywę dużego naczynia, które jest również bezpośrednio podłączone do źródła gazu za pomocą końcówki strzykawki. Spowoduje to dopływ samochodu i gazu do plastrów podczas inkubacji, aby uniknąć bielenia barwnika. Wszystkie zabiegi przeprowadza się przy jak najmniejszej ilości światła, a zarówno barwnik, jak i plastry są trzymane w ciemności.

Napełnij komorę barwienia około półtora mililitra A TSF z uchwytu na plastry. Umieść komorę interfejsu w środku i napełnij kolejnym mililitrem A TSF. Ważne jest, aby utrzymać dobry dopływ tlenu, aby utrzymać tkankę w zdrowiu i dobrze obciążyć plasterek.

Barwienie zachodzi w temperaturze około 35 stopni C, aby ułatwić wchłanianie barwnika do neuronów, podczas gdy komora barwienia się nagrzewa. Przygotuj barwnik wskaźnikowy dla firy 2:00 AM Ester. Dodaj dziewięć mikrolitrów DMSO z jednym mikrolitrem kwasu onowego do fiolki o wielkości 50 mikrogramów.

DMSO i kwas oninowy. Działają jako środki przepuszczalności, które umożliwiają wchłanianie barwnika przez błonę lipidową. Wirować fiolkę przez 15 minut, aby upewnić się, że barwnik całkowicie się rozpuścił.

W celu barwienia przenieś każdy plasterek do interfejsu. Włóż do komory barwienia. Pogłaszcz barwnik bezpośrednio w obszarze zainteresowania nad plastrami, zamknij pokrywę komory barwienia.

Pozostaw plastry inkubowane w ciemności na 20 do 40 minut, w zależności od wieku użytego maus. Po inkubacji przenieś plastry z powrotem do uchwytu na plastry, aby zmyć pozostały nadmiar barwnika. Protokoły barwienia do obrazowania wapnia można również dostosować do starszych tkanek.

Wymaga to dodatkowego etapu wstępnej inkubacji. Przenieś stare plastry do płytkiego naczynia do inkubacji wypełnionej trzema mililitrami płynu mózgowo-rdzeniowego i ośmioma mikrolitrami roztworu pianki czteroskładnikowej o temperaturze 0,5% Podgrzej do 35 stopni C przez trzy minuty. Następnie przenieś plastry do interfejsu, włóż do komory barwienia i postępuj zgodnie z normalnymi procedurami barwienia.

Możliwe jest również barwienie tych plasterków na komórki nieneuronalne, a mianowicie astrocyty, mikroglej i komórki śródbłonka. Żwir siarkowy 1 0 1 może być używany do barwienia astrocytów na dominę siarki. Przygotuj roztwór 10 mikromolów, odpipetuj fioletowy barwnik na obszar zainteresowania w plastrach.

Pozostaw do inkubacji na okres 15 minut. Przenieś plastry z powrotem do komory trzymania, aby usunąć nadmiar barwnika. Koniugat FSE z lektyną pomidorową może barwić komórki mikrogleju i śródbłonka.

W przypadku lektyny pomidorowej przygotuj roztwór 20 mikrogramów na mililitr. Pogłaszcz barwnik nad obszarem zainteresowania w plasterkach. Pozostaw plastry do inkubacji na okres 45 minut.

Następnie przenieś plastry z powrotem do komory trzymania. Podczas obrazowania plastry muszą być stabilne pod mikroskopem. Zwykle metalowa harfa jest umieszczana w celu przytrzymania tkanki, jednak może ona nierównomiernie zniekształcić powierzchnię plasterka, dając tylko ograniczone pole widzenia w ostrości, aby obrazowanie mogło uniknąć.

Plastry te przykleja się do komory nagraniowej za pomocą roztworu POLIETYLENU lub PEI. PEI to polimer stosowany w celu zwiększenia przyczepności komórek do powierzchni przez co najmniej jedną godzinę. Przed umieszczeniem plastrów w komorach nagrywających, napełnij te komory kilkoma mililitrami roztworu PEI, aby pokryć podłogę komory.

Najpierw spłucz PEI z komory wodą destylowaną, a następnie przelej roztwór płynu mózgowo-rdzeniowego. Przenieś plasterek do komory zapisu i usuń nadmiar roztworu płynu mózgowo-rdzeniowego. Umieść plaster na środku komory za pomocą cienkiego pędzla.

Usuń cały dalszy płyn mózgowo-rdzeniowy za pomocą małych kawałków chłonnej bibuły filtracyjnej. Uważaj, aby plasterek nie miał więcej A CSF wokół krawędzi. Na koniec delikatnie pogłaszcz pół mililitra płynu mózgowo-rdzeniowego na plasterku, nie wyjmując go z komory.

Umieść komory w dużym pojemniku z natlenionym interfejsem i pozostaw na jeszcze godzinę w ciemności. Zmiany w wrażliwych na wapń barwnikach wskaźnikowych można rejestrować za pomocą jednej lub dwóch mikroskopii fotonowych. Używamy lasera tytanowo-szafirowego sprzężonego z mikroskopem Olympus, aby umożliwić obrazowanie dwóch fotonów w naszych sieciach neuronowych.

Ponadto korzystamy z biotechnologicznego systemu lunety L Vision z kamerą EM CCD hammer MATSU w celu zwiększenia szybkości skanowania klatek. Umieść komorę plastrów pod mikroskopem ze stabilnym przepływem natlenionego A-T-S-F-A-T-S-F zawierającego 1.6 milimola wapnia i 1.5 milimola. Magnez jest podgrzewany do około 30 stopni C w konfiguracji za pomocą białego światła.

Zlokalizuj obszar zainteresowania w przekroju i skoncentruj się na powierzchni. Wyłącz światła i zamknij drzwi szafki nagrywającej. Aby zmniejszyć poziom światła w tle.

Dostępnych jest wiele różnych komercyjnych lub otwartych pakietów oprogramowania do nagrywania i analizowania obrazów W naszym laboratorium korzystamy z oprogramowania inspektorskiego do akwizycji od Lavis Biotech. Aby rozpocząć obrazowanie, wybierz tryb kamery CCD do wykrywania. Ustaw długość fali odpowiednią dla Twojego wskaźnika.

W przypadku fira 2:00 AM Ester ustawiamy wzbudzenie na 820 nanometrów w oprogramowaniu do trymowania. Wybierz tryb skanowania 64 B. Wybierz optymalny rozmiar, pole widzenia i rozdzielczość w pikselach dla swojego regionu zainteresowania.

Wybierz odpowiednią liczbę klatek na sekundę i obracanie pikseli, jeśli jest to wymagane do próbkowania obrazu. Otwórz migawkę lasera, aby przygotować się do ciągłego obrazowania. Korzystanie z trybu obrazowania ciągłego.

Dostosuj wzmocnienie i intensywność lasera i skup się na sieci neuronalnej, którą chcesz zobrazować. Zatrzymaj skanowanie. Wybierz ustawienia poklatkowe dla liczby klatek na sekundę i czasu trwania sekwencji.

Po obrazowaniu poklatkowym utwórz stos obrazów Z, zaznaczając 20 mikronów powyżej i 20 mikronów poniżej w krokach co jeden mikron. Ten stos Z jest używany do wykrywania komórek podczas analizy. Nagrane pliki można wyeksportować jako stos obrazów w formacie TIFF.

Podsumowując, pokazaliśmy wykorzystanie wskaźników wapnia do pomiaru synchronicznej spontanicznej aktywności sieci w rozwijającej się korze mózgowej. Więcej szczegółów na temat metodologii i odczynników można znaleźć w kartach katalogowych dołączonych do tego filmu, aby umożliwić Ci skonfigurowanie techniki we własnym laboratorium.