Name: Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnego wzbogacania modyfikacji potranslacyjnych przy użyciu przeciwciał i spektrometrii masowej. Technika ta umożliwia identyfikację acetylacji i sukcynilacji z małych próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie ze strony NIH shared instrumentation grant dla systemu TripleTOF w Buck Institute (1S10 OD016281). Prace te były również wspierane przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (R01 AI108255 do B.S.) oraz Narodowy Instytut Cukrzycy i Chorób Trawiennych i Nerek (R24 DK085610 do Erica Verdina; R01 DK090242 do Erica Goetzmana). X.X. był wspierany przez grant z National Institutes of Health (grant NIH T32GM8806, dla Judith Campisi i Lisy Ellerby), N.B. był wspierany przez stypendium podoktorskie z Glenn Foundation for Medical Research.

<ol><li>Christensen, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+Protein+Acetylation%3A+An+Elegant+Mechanism+for+Bacteria+to+Dynamically+Regulate+Metabolic+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1604(2019).</li>
<li>Deribe, Y. L., Pawson, T., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+in+signal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications in signal integration.</a> Nature Structural Molecular Biology. 17 (6), 666-672 (2010).</li>
<li>Sadoul, K., Boyault, C., Pabion, M., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+protein+turnover+by+acetyltransferases+and+deacetylases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases.</a> Biochimie. 90 (2), 306-312 (2008).</li>
<li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+phosphorylation+and+ubiquitylation+cross-talk+in+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation.</a> Nature Methods. 10 (7), 676-682 (2013).</li>
<li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 596-601 (2000).</li>
<li>Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+in+chromatin+structure+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation in chromatin structure and transcription.</a> Nature. 389 (6649), 349-352 (1997).</li>
<li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms.</a> Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li>
<li>Mocciaro, A., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+regulatory+mechanisms+in+ubiquitin-dependent+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control.</a> Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).</li>
<li>Lopez-Otin, C., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulatory+crosstalk+between+kinases+and+proteases+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">The regulatory crosstalk between kinases and proteases in cancer.</a> Nature Reviews in Cancer. 10 (4), 278-292 (2010).</li>
<li>Du, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNMT1+stability+is+regulated+by+proteins+coordinating+deubiquitination+and+acetylation-driven+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signalling%22%5BJournal%5D)">DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination.</a> Science Signalling. 3 (146), (2010).</li>
<li>McManus, F. P., Lamoliatte, F., Thibault, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cross+talk+between+SUMOylation+and+ubiquitylation+using+a+sequential+peptide+immunopurification+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Identification of cross talk between SUMOylation and ubiquitylation using a sequential peptide immunopurification approach.</a> Nature Protocols. 12 (11), 2342-2358 (2017).</li>
<li>Venne, A. S., Kollipara, L., Zahedi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+level+of+complexity%3A+crosstalk+of+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 513-524 (2014).</li>
<li>Mertins, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+proteomic+analysis+of+post-translational+modifications+by+serial+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Integrated proteomic analysis of post-translational modifications by serial enrichment.</a> Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2013).</li>
<li>Basisty, N., Meyer, J. G., Wei, L., Gibson, B. W., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Quantification+of+the+Acetylome+and+Succinylome+by+%27One-Pot%27+Affinity+Enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Quantification of the Acetylome and Succinylome by 'One-Pot' Affinity Enrichment.</a> Proteomics. 18 (17), e1800123(2018).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+UCP1+and+Mitochondrial+Metabolism+in+Brown+Adipose+Tissue+by+Reversible+Succinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of UCP1 and Mitochondrial Metabolism in Brown Adipose Tissue by Reversible Succinylation.</a> Molecular Cell. 74 (4), 844-857 (2019).</li>
<li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((50+years+of+protein+acetylation%3A+from+gene+regulation+to+epigenetics%2C+metabolism+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li>
<li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+proteomics+of+the+lysine+acetylome+in+mitochondria+identifies+substrates+of+SIRT3+in+metabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative proteomics of the lysine acetylome in mitochondria identifies substrates of SIRT3 in metabolic pathways.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110 (16), 6601-6606 (2013).</li>
<li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRT5+regulates+the+mitochondrial+lysine+succinylome+and+metabolic+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks.</a> Cell Metabolism. 18 (6), 920-933 (2013).</li>
<li>Carrico, C., Meyer, J. G., He, W., Gibson, B. W., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+Acylome+Emerges%3A+Proteomics%2C+Regulation+by+Sirtuins%2C+and+Metabolic+and+Disease+Implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications.</a> Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).</li>
<li>Sadhukhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics-assisted+proteomics+identifies+succinylation+and+SIRT5+as+important+regulators+of+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).</li>
<li>Collins, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-laboratory+assessment+of+reproducibility%2C+qualitative+and+quantitative+performance+of+SWATH-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry.</a> Nature Communications. 8 (1), 291(2017).</li>
<li>Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+High-Quality+SWATH%28%28R%29%29+Acquisition+Data+for+Label-free+Quantitative+Proteomics+Studies+Using+TripleTOF%28%28R%29%29+Mass+Spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers.</a> Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).</li>
<li>Meyer, J. G., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+quantitative+proteomics+using+targeted+and+untargeted+data-independent+acquisition+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+in+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of quantitative proteomics using targeted and untargeted data-independent acquisition techniques.</a> Expert Reviews in Proteomics. 14 (5), 419-429 (2017).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Sticker, A., Martens, L., Clement, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometrists+should+search+for+all+peptides%2C+but+assess+only+the+ones+they+care+about%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometrists should search for all peptides, but assess only the ones they care about.</a> Nature Methods. 14 (7), 643-644 (2017).</li>
<li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje nowatorską technikę jednoczesnego wielokrotnego wzbogacania PTM w celu skuteczniejszego zrozumienia przesłuchów PTM. Alternatywne metody osiągnięcia tego celu są zwykle zbyt czasochłonne i kosztowne, a do ich powodzenia potrzebne są duże ilości białka11,13. Protokół ten przedstawia przepływ pracy wzbogacania wielu PTM, który obejmuje inkubację w kulkach sprzężonych z przeciwciałami dla dwóch PTM jednocześnie w celu poprawy ogólnej wydajności eksperymentu. Metoda ta obejmuje również wykorzystanie DDA do generowania biblioteki spektralnej i akwizycji DIA MS w celu wykrycia i ilościowego określenia peptydów obecnych ze zmniejszoną interferencją jonów fragmentacyjnych22,23. Oprogramowanie, takie jak wyszukiwarki baz danych MS, jest wykorzystywane do analizy i ilościowego określania danych pochodzących z akwizycji DDA, podczas gdy oprogramowanie Quantitative ProteomicsSoftware 24 i specjalne oprogramowanie do analizy ilościowej DIA25 są niezbędne do interpretacji złożonych widm wytwarzanych przez akwizycje DIA.
W ramach tego protokołu istnieje kilka krytycznych kroków, których należy uważnie przestrzegać. Ponieważ głównym celem protokołu jest wzbogacenie wielu PTM jednocześnie, etap wzbogacania powinowactwa przeciwciał (sekcja 2) ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Podczas wykonywania prania na koralikach należy upewnić się, że żaden z koralików nie został przypadkowo zassany. Konieczne jest również upewnienie się, że stężenie mocznika zostało rozcieńczone do 1 M przed trawieniem trypsyną (krok 1.8). Chociaż 8 M mocznik jest wymagany wcześniej w protokole do rozpuszczania białek, stężenia mocznika powyżej 1 M będą hamować aktywność enzymatyczną trypsyny. Ponadto ważne jest, aby konsekwentnie sprawdzać pH próbki przez cały czas trwania protokołu. Jest to szczególnie ważne przed trawieniem. Jeśli pH próbki i roztworu trypsyny nie zostaną odpowiednio zneutralizowane przed inkubacją, może to spowodować nieefektywne trawienie, w którym wiele miejsc rozszczepienia może zostać pominiętych, co skutkuje mniejszą liczbą identyfikacji peptydów.
Kilka modyfikacji protokołu może być pomocnych przy przygotowywaniu próbek. W przypadku lizatu białkowego uzyskanego z 1 mg materiału wyjściowego, jedną czwartą kulek przeciwciał znajdujących się w każdej probówce skanującej PTM można zastosować jako opłacalną alternatywę. Aby uzyskać lepsze wyniki, można użyć większej ilości materiału wyjściowego, o ile ilość użytych kulek przeciwciał zostanie proporcjonalnie zwiększona. Inną modyfikacją, która może usprawnić przepływ pracy, jest trawienie próbek z inną proteazą oprócz trypsyny. Ta modyfikacja spowodowałaby większą zmienność rozszczepionych peptydów, zapewniając zwiększone pokrycie reszt białkowych. Chociaż nie jest to konieczne, zaleca się, aby trypsyna była jednym z enzymów stosowanych do analizy PTM ze względu na jej wysoką specyficzność łupliwości26.
Ograniczeniem tego protokołu jest to, że badane PTM muszą mieć podobny skład chemiczny, aby mogły być jednocześnie wzbogacane14. Procedury dla różnych kulek sprzężonych z przeciwciałami muszą być podobne, przy użyciu podobnych rozpuszczalników i roztworów, w tym podobnych warunków elucji, i najlepiej od tego samego dostawcy. Z tego powodu opisana tutaj metoda konsekwentnie wykorzystuje acetylację i sukcynylację jako przykład, z których obie wykorzystują kulki sprzężone z przeciwciałami (Cell Signaling Technology, Inc). Chociaż metoda ta może być teoretycznie zastosowana do dowolnej liczby PTM, potrzebne byłyby dodatkowe badania, aby ocenić dokładne ograniczenie protokołu w tym zakresie. Ponadto, ponieważ jest to metoda wzbogacania oparta na przeciwciałach, metoda ta może zapewnić jedynie względną kwantyfikację miejsc PTM.
W porównaniu z istniejącymi metodami wzbogacania wielu PTM, ten przepływ pracy jest bardziej wykonalną i opłacalną alternatywą. W tym eksperymencie zaobserwowano, że skuteczność tej metody bardzo dobrze wypada w porównaniu z metodami alternatywnymi, takimi jak wzbogacanie indywidualne lub seryjne. Rysunek 2B pokazuje, że mediana CV dla zmodyfikowanych obszarów pików peptydowych była w rzeczywistości zmniejszona w metodzie jednogarnkowej w porównaniu ze wzbogaceniami pojedynczym PTM i szeregowymi wzbogaceniami PTM13. Następnie przeanalizowaliśmy wyniki eksperymentalne, oceniając kwantyfikacje na poziomie miejsca dla acetylacji lub sukcynylacji. Ponadto analiza korelacji Spearmana (rysunek 2C,D) wykazała, że jednoetapowe wzbogacanie PTM działało podobnie do przepływów pracy wzbogacania jednoetapowego. Dotyczyło to również korelacji na poziomie peptydów i fragmentów. Ta sama obserwacja dotyczyła wszystkich trzech korelacji, gdy porównano wzbogacenie jednogarnkowe z szeregowym PTM.
Protokół ten pozwala naukowcom na uzyskanie fascynujących biologicznych spostrzeżeń na temat przesłuchów PTM w szybki i opłacalny sposób. Komponent DIA przepływu pracy pozwala naukowcom lepiej zrozumieć PTM, ponieważ dostarcza informacji o lokalizacji lokalizacji i pokonuje wyzwania, takie jak niskie obłożenie PTM. Jony prekursorowe są zwykle wykluczane za pomocą DDA, co jest szczególnie ważne podczas badania PTM, ponieważ zajętość miejsca jest często niska do punktu, w którym peptydy te nie są wybierane do SM/MS, ale nadal zawierają kluczowe informacje. Można przeprowadzić dalsze eksperymenty w celu oceny górnej granicy liczby PTM, które można jednocześnie wzbogacić przy użyciu tej metody. Przyszłe usprawnienie tego przepływu pracy może obejmować opracowanie bardziej zaawansowanych platform oprogramowania w celu dalszej automatyzacji analizy lokalizacji lokalizacji i zajętości lokalizacji PTM.

Niezliczone modyfikacje potranslacyjne dynamicznie regulują białka i szlaki poprzez wpływ na aktywność1, signaling2, and rotation3,4. Na przykład kinazy białkowe są aktywowane lub dezaktywowane przez dodanie grup fosforanowych5, a acetylacja histonów i inne modyfikacje zapewniają mechanizm zmiany struktury chromatyny i służą jako mechanizmy regulacji transkrypcji6,7. W ostatnich latach pojawiło się wiele dowodów na to, że wiele PTM współpracuje lub konkuruje ze sobą, regulując funkcję lub aktywność białek8,9,10,11. Dlatego zrozumienie przesłuchów PTM jest pojawiającą się potrzebą w badaniach nad PTM. Jednak większość dostępnych proteomicznych procesów pracy mających na celu identyfikację i ilościowe określenie miejsc PTM koncentruje się na pojedynczych modyfikacjach, a nie na wzajemnym oddziaływaniu wielu modyfikacji. Opisany przebieg pracy koreluje specyficzne "gorące punkty" modyfikacji białek i reszty lizyny, które są modyfikowane przez wiele różnych PTM.
W środowisku naukowym rośnie zapotrzebowanie na możliwe metody badania wielu PTM jednocześnie12. Większość metod globalnej identyfikacji i ilościowego określania miejsc wielu typów PTM jest trudna ze względu na wysokie koszty i ilość wymaganej tkanki12,13. Eksperymenty z wzbogacaniem wielu PTM są nie tylko czasochłonne pod względem przygotowania próbek, pozyskiwania danych i analizy danych, ale badania te zazwyczaj wymagają dużych i często zaporowych ilości białka11. Opisano tutaj protokół do jednoczesnego wzbogacania i analizy wielu PTM, który również rozwiązuje kilka z tych barier i umożliwia profilowanie PTM na dużą skalę oraz ocenę przesłuchów między różnymi PTM14. Ten jednoetapowy przepływ pracy przedstawia praktyczny sposób, w jaki badacze biomedyczni mogą globalnie profilować wiele PTM, identyfikować współmodyfikowane peptydy i badać przesłuchy PTM w wydajny i opłacalny sposób14,15.
Tutaj ta metoda jest prezentowana poprzez badanie acylacji białek mitochondrialnych, która została po raz pierwszy zbadana ponad 50 lat temu16. W szczególności koncentruje się na acetylacji lizyny17 i sukcynylacji18, w tym na współwystępowaniu tych modyfikacji na białkach, a nawet na komodyfikacji na poziomie peptydu. Ponieważ w badaniu wykorzystano mysi model nokautujący sirtuinę 5 (SIRT5), wybrano go tak, aby skupić się na wzbogacaniu miejsc acetylacji i sukcynylacji. Decyzja ta została podjęta, ponieważ miejsca sukcynylacji są celami desuccinylazy SIRT5 i dlatego oczekuje się, że będą wykazywać znaczną regulację w górę u myszy KO, co czyni je najbardziej odpowiednimi PTM w tym przypadku. Oba PTM są biologicznie istotne, jak niedawno podsumowali Carrico et al.19. Ogólnie rzecz biorąc, acetylacja wykazuje istotny wpływ na ekspresję genów i metabolizm, a sukcynylacja reguluje metabolizm i funkcję serca20.
Opisany protokół może być wykonany z małą ilością materiału wejściowego białka (np. 1 mg lizatu białkowego) i skraca całkowity czas trwania eksperymentu, skracając czas poświęcony na przetwarzanie próbki, akwizycję MS i analizę danych. Schemat przepływu pracy przedstawiono na rysunku 1. Użyliśmy również jeszcze mniejszych ilości materiału wyjściowego (do 100 μg lizatu białkowego, odpowiednio zmniejszając ilość stosowanych kulek), co zgodnie z oczekiwaniami zmniejsza ogólną wydajność zidentyfikowanych acylowanych peptydów; Jednak nadal zapewnia bardzo cenne wyniki i ilościowe acylowane peptydy.
Podczas gdy tak zwane przepływy pracy z góry na dół lub na środku zazwyczaj nie wykorzystują metod trawienia proteolitycznego (i w ten sposób utrzymują łączność wielu PTM w obrębie jednego białka), ten protokół skupia się na podejściu do wzbogacania powinowactwa opartego na peptydach, aby uzyskać dodatkową głębię i czułość dla identyfikacji i kwantyfikacji PTM (Rysunek 1). Ponadto ten skoncentrowany na peptydach przepływ pracy wykorzystuje nowoczesne metody spektrometrii mas, w tym 1) kombinację akwizycji zależnej od danych (DDA) w celu generowania bibliotek spektralnych oraz 2) akwizycję niezależną od danych (DIA) w celu dokładnej kwantyfikacji PTM w przepływie pracy bez etykiet.
DIA pozwala przezwyciężyć stochastyczność próbkowania typowych schematów skanowania DDA poprzez kompleksową fragmentację wszystkich sygnałów peptydowych w próbkowanym zakresie m/z21. Ta cecha jest również niezwykle korzystna z punktu widzenia lokalizacji miejsca, ponieważ łatwiej jest uzyskać informacje o tym, które konkretne jony fragmentacyjne są modyfikowane w peptydzie. Ponadto przepływy pracy DIA umożliwiają identyfikację i kwantyfikację mniejszych izoform peptydu PTM z identycznymi jonami prekursorowymi. Metody DIA mogą również określić określoną lokalizację miejsca PTM w peptydzie na podstawie określonych odpowiadających im jonów fragmentacyjnych, które są kompleksowo mierzone przez cały czas. Jednak podejścia DDA często wykorzystują funkcje "dynamicznego wykluczania", które wykluczają wielokrotne pobieranie próbek MS/MS dla tego samego jonu prekursorowego, pomijając w ten sposób mniejsze izoformy PTM.
Opisana tutaj strategia jednoczesnego wzbogacania idealnie nadaje się do badań, które skorzystają z globalnego profilowania i kwantyfikacji wielu PTM, badania przesłuchów PTM i zrozumienia dynamicznych interakcji modyfikacji potranslacyjnych. Identyfikacja wielu wzbogaconych PTM w jednym połączonym przepływie pracy została opisana przez: globalne, seryjne lub równoległe wzbogacanie PTM zawierających peptydy proteolityczne lub alternatywnie przez analizę nienaruszonych białek. W bezpośrednim porównaniu z seryjnym wzbogacaniem acetylacji i sukcynylacji, skuteczność metodologii jednogarnkowej została ustalona jako bardzo podobna14. Te alternatywne protokoły wymagają znacznych ilości materiału wyjściowego i czasu oraz mogą być zbyt drogie. W przeciwieństwie do tego, protokół jednogarnkowy zapewnia niedrogą i wydajną metodę wzbogacania więcej niż jednego PTM wraz z późniejszą analizą i identyfikacją.
Tkanki wątroby myszy są pozyskiwane od myszy z nokautem SIRT5 i są tutaj używane jako materiał wyjściowy. Protokół ten można również wykonać dla lizatów białkowych z różnych tkanek lub eksperymentów z kulturami komórkowymi. Protokół ten można zastosować do lizatów białkowych otrzymywanych z tkanek lub granulek kultur komórkowych.

<table><tbody><tr><td>1 M Bufor biowęglanu trietyloamonu (TEAB)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, Burdick i Jackson LC-MS klasy</td><td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td><td>36XL66</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor sonikator</td><td>Diagenode, Denville, NJ, USA</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>Układ przedkolumnowy C18 (200 &mikro; m x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A)</td><td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td><td>5015841</td><td></td></tr><tr><td>C18-CL (75 &micro; m x 15 cm ChromXP, 3 i mikro; m, 300 & Aring ;)</td><td>SCIEX, Framingham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>804-00001</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone</td><td>D9779-5G</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer Compact</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy</td><td>T1317-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Probówka Eppendorf (2.0 ml Safelock)</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone</td><td>F0507-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Indeksowany standard peptydu normalizującego czas retencji (iRT)</td><td>Biognosys AG, Schlieren, Zurych, Szwajcaria</td><td>Ki-3002-2</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAA)</td> <td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>I1149-25G</td><td></td></tr><tr><td>mapDia</td><td></td> web <td>link</td><td>software do usuwania zakłóceń z zestawów danych DIA</td></tr><tr><td>Metanol, Burdick i Jackson LC-MS klasy</td><td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, Stany Zjednoczone</td><td>BJLC230-4</td><td></td></tr><tr><td>Dystrybutor wody ultraczystej PURELAB flex 1</td><td>VWR International, Radnor, PA, USA</td><td>89204-088</td><td></td></tr><tr><td>mProphet w Skyline</td><td></td><td>włączony do Skyline</td><td>zintegrowane algorytmy statystyczne do ocen FDR</td></tr><tr><td>Wkłady Oasis HLB SPE</td><td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td><td>WAT094225</td><td>wkłady do odsalania lizatów białkowych, do 50 mg materiału</td></tr><tr><td>Roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Test Pierce BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>ProteinPilot 5.0 - 'Wyszukiwarka baz danych MS'SCIEX</td><td>, Framingham, MA, USA</td><td>pobieranie oprogramowania SCIEX</td><td>MS Wyszukiwarka baz danych</td></tr><tr><td>PTMScan Motyw sukcynylo-lizynowy [Succ-K] Zestaw #13764</td><td>Sygnalizacja komórkowa Technologia</td><td>13764</td><td>kulki przeciwciał do wzbogacania powinowactwa</td></tr><tr><td>PTMScan Motyw acetylo-lizyny [Ac-K] Zestaw #13416</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>13416</td><td>kulki przeciwciał do wzbogacania powinowactwa</td></tr><tr><td>Liofilizowana trypsyna klasy sekwencjonowania</td><td>Life Technologies</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Skyline - "Ilościowe oprogramowanie proteomiczne"</td><td>Laboratorium MacCoss (akademickie)</td><td>oprogramowanie</td> <td>open sourceOprogramowanie do proteomiki ilościowej (akademickie)</td></tr><tr><td>Spectronaut - 'Oprogramowanie do analizy ilościowej</td> <td>DIA'Biognosys AG, Schlieren, Zurych, Szwajcaria</td> Oprogramowanie do analizy ilościowej <td>DIA SW-3001</td><td>/ lokalizacja na miejscu PTM</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Savant SPD131DDA Koncentrator Speedvac</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>SPD131DDA-115</td><td>przyrząd do koncentracji cieczy próbek</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>85300</td><td>przyrząd do efektywnej lizy tkanek</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>T6508-1L</td><td></td></tr><tr><td>TripleTOF 6600: ortoganol kwadrupolowy spektrometr masowy czasu przelotu (QqTOF)</td><td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td><td>Na wycenę</td><td>spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>System Ultra Plus nano-LC 2D HPLC</td><td>SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA</td><td>Model #845</td><td>chromatograficzny system</td></tr><tr><td>separacji Mocznik</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>PI29700</td><td></td></tr><tr><td>Water, Burdick and Jackson LC-MS</td><td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td><td>600-30-76</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet ZipTip C18, P10</td><td>Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL</td><td>ZTC18S096</td><td>Końcówki C-18 obciążone żywicą do odsalania mieszanin peptydowych</td></tr></tbody></table>

jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Badanie wielu modyfikacji potranslacyjnych (PTM) białek jest kluczowym krokiem do zrozumienia przesłuchów PTM i uzyskania bardziej holistycznego wglądu w funkcję białek. Pomimo znaczenia badań nad wzbogacaniem wielu PTM, niewiele badań bada więcej niż jeden PTM na raz, częściowo ze względu na koszty, czas i duże ilości białka wymagane do przeprowadzenia wielu globalnych analiz proteomicznych PTM. Wzbogacenie powinowactwa "w jednym garnku" wyszczególnione w tym protokole pokonuje te bariery, umożliwiając jednoczesną identyfikację i kwantyfikację peptydów z resztami lizyny zawierającymi PTM acetylacji i sukcynylacji przy niewielkich ilościach wejściowej próbki. Protokół obejmuje przygotowanie lizatu białkowego z wątroby myszy z nokautem SIRT5, przeprowadzenie trawienia trypsyny, wzbogacenie w PTM oraz przeprowadzenie analizy spektrometrii mas przy użyciu przepływu pracy akwizycji niezależnej od danych (DIA). Ponieważ ten przepływ pracy pozwala na jednoczesne wzbogacanie dwóch PTM z tej samej próbki, zapewnia praktyczne narzędzie do badania przesłuchów PTM bez konieczności stosowania dużych ilości próbek i znacznie skraca czas potrzebny na przygotowanie próbki, akwizycję i analizę. Komponent DIA przepływu pracy dostarcza wyczerpujących informacji specyficznych dla PTM. Jest to szczególnie ważne podczas badania lokalizacji miejsc PTM, ponieważ DIA zapewnia kompleksowe zestawy jonów fragmentacyjnych, które można obliczeniowo rozszyfrować w celu rozróżnienia różnych izoform lokalizacji PTM.

Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat procesu roboczego, obejmujący pobieranie tkanki z wątrób myszych, wykorzystanie 1 mg białka do trawienia lizatu białkowego trypsyną, inkubację peptydów z koralikami sprzężonymi z przeciwciałem, analizę próbek za pomocą MS oraz końcową analizę danych w trybach DIA/SWATH przy użyciu różnych pakietów oprogramowania do proteomiki ilościowej (akademickich i komercyjnych).
Rysunek 2A przedstawia harmonogram przepływu pracy oraz ilości wymaganych próbek i białka w porównaniu do alternatywnych metod obecnie stosowanych w badaniach nad wzbogacaniem wielu PTM. Metodę jednopojemnikową (one-pot) można przeprowadzić w połowie czasu i przy użyciu połowy liczby próbek w stosunku do tych alternatywnych metod. W porównaniu do dwóch metod wzbogacania pojedynczych PTM, protokół jednopojemnikowy wymaga również połowy ilości białka.
Wykazano, że niniejszy protokół stanowi wykonalną i kosztowo efektywną alternatywę. Rysunek 2B pokazuje, że mediana współczynnika zmienności (CV) dla obszarów zmodyfikowanych peptydów była niższa w metodzie jednoczłonowej (one-pot) niż w przypadku wzbogaceń pojedynczych PTM oraz seryjnych PTM. Rysunek 2C,D wykazuje, że przy porównaniu metod wzbogacania PTM w systemie one-pot oraz wzbogacania pojedynczych PTM, nie zauważono istotnych różnic w korelacjach ilościowych na poziomie miejsc dla obu modyfikacji. Dotyczyło to również korelacji na poziomie peptydów i fragmentów. Ta sama obserwacja odnosiła się do wszystkich trzech korelacji przy porównaniu wzbogaceń one-pot i seryjnych PTM. Wszystkie podstawowe surowe dane MS oraz przetworzone arkusze wyników w programie Excel powiązane z niedawnym raportem Basisty i wsp.14 są dostępne i mogą zostać pobrane z MassIVE (MSV00081906) oraz ProteomeXchange (PXD008640).
Ogólnie rzecz biorąc, choć strategie wzbogacania przeciwciał mogą wykazywać pewne ograniczenia, takie jak potencjalna okluzja epitopu lub ograniczona swoistość, przeciwciała użyte w niniejszym badaniu są mieszaninami niezależnie generowanych klonów, a tym samym zapewniają szerszy zakres swoistości.
Wyniki eksperymentalne dokumentują możliwość wykrywania i oceny wzajemnego oddziaływania (crosstalk) PTM. Rycina 3 przedstawia dane z udanego wzbogacenia i ilustruje przykład peptydu zawierającego wiele różnych modyfikacji acylowych, wizualizując wzajemne oddziaływanie PTM. Rycina 3A pokazuje peptyd, który jest acetylowany na jednym reszcie lizyny i succynylowany na drugiej, a Rycina 3B pokazuje ten sam peptyd succynylowany na obu resztach lizyny. Dowodzi to, że ta sama reszta lizyny może być modyfikowana obiema grupami acylowymi i istnieje możliwość wystąpienia wzajemnego oddziaływania w tym miejscu. Rycina 4 przedstawia liczbę reszt lizyny, które zidentyfikowano zgodnie z opisem w sekcjach 7.1-7.3 jako posiadające obie modyfikacje, co również wskazuje na możliwy crosstalk PTM.
Jak pokazuje Rysunek 5, przetwarzanie zbiorów danych DIA PTM za pomocą oprogramowania do proteomiki ilościowej pozwala nam precyzyjnie określić, które konkretne reszty lizyny zostały zmodyfikowane. Jest to koncepcja znana jako lokalizacja miejsca modyfikacji, która stanowi niezbędny etap każdej analizy służącej określeniu możliwego przenikania się (crosstalk) różnych PTM. Na Rysunku 5 przedstawiono dwie potencjalne izoformy wraz z jonami potwierdzającymi i wykluczającymi dla każdej z nich, które można zwizualizować i ocenić zgodnie z opisem w sekcjach 8.1-8.3 (konkretnie w krokach 8.3.2 i 8.3.3). Na podstawie tych informacji byliśmy w stanie z pewnością zidentyfikować, która z dwóch izoform była obecna w oryginalnej próbce. Widmo MS/MS potwierdzonej izoformy KQYGEAFEKacR wyraźnie pokazuje, że jony y (y2-y5) zawierające acetylowaną resztę lizyny, przesunięte o 42 m/z (masa przyrostowa grupy acetylowej), potwierdziły konkretną resztę lizyny w peptydzie, która uległa modyfikacji.
<img alt="Schemat procesu analizy białek przedstawiający wątroby SIRT5 KO i typu dzikiego, peptydy AcylK, DDA-MS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Typowy schemat jednopojemnikowego wzbogacania PTM. Tkanki (w tym przypadku wątroby) pobiera się od myszy z knock-outem genu SIRT5 (SIRT5 KO) oraz myszy typu dzikiego (WT), a następnie białka poddaje się lizie, trawieniu trypsyną do peptydów oraz odsoleniu. Peptydy są następnie wzbogacane metodą immunoafinicyjną przy użyciu kombinacji kulek z przeciwciałami przeciwko grupom sukcynylowym i acetylowym. Równoległe procesy MS służą do pomiaru zarówno 1) zmian w ekspresji białek w niewielkich aliquotach całego lizatu (w celu normalizacji białek), jak i 2) wzbogaconych peptydów zawierających grupy acylowe w celu identyfikacji miejsc acylacji (DDA-MS) i lokalizacji tych miejsc, a następnie ich kwantyfikacji (DIA-MS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza modyfikacji białek; wykresy i tabele; acetylacja; succynylacja; porównanie danych; CV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Porównanie przepływu pracy typu one-pot z metodami alternatywnymi. (A) Porównanie czasu, kosztów i materiałów wymaganych dla przepływu pracy typu one-pot, seryjnego wzbogacania PTM oraz dwóch pojedynczych wzbogaceń PTM. (B) Porównanie współczynników zmienności (CV) pomiędzy przepływem pracy typu one-pot, pojedynczym wzbogaceniem PTM acetylolizyny oraz pojedynczym wzbogaceniem PTM succinylolizyny. Analiza korelacji Spearmana porównująca pola powierzchni piku peptydów acylowanych uzyskanych z przepływu pracy typu one-pot oraz pojedynczych wzbogaceń PTM: odpowiadające wykresy wyników log2 pola powierzchni piku dla (C) miejsc acetylacji oraz (D) miejsc succynylacji. Nachylenia regresji i współczynniki korelacji są wskazane na poszczególnych panelach14. Dla każdego z warunków przetworzono dwie niezależne powtórzenia biologiczne. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Basisty i wsp.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig2alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wynik spektrometrii masowej 3-ketoacyl-CoA tiolazy z sekwencją peptydową, intensywność względem m/z." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Interakcja (crosstalk) między modyfikacjami acetylacji a succynylacją reszt lizyny. Widma MS/MS peptydów tryptycznych z mitochondrialnej 3-ketoacyl-CoA tiolazy, wykazujące tę samą sekwencję aminokwasową, ale zmodyfikowane w dwóch resztach lizyny różnymi PTM. (A) MS/MS peptydu AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK oraz (B) MS/MS peptydu AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKsuccK. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Basisty i wsp.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Diagram Venna modyfikacji białek, wykres słupkowy wzbogacenia, schemat domen syntazy ATP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig4a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Nakładanie się i wzajemne oddziaływanie między acetylowanymi i succynylowanymi resztami lizyny – konkretne przykłady w kompleksach białkowych. (A) Diagram Venna przedstawiający nakładanie się 2 235 miejsc acetylacji i 2 173 miejsc succynylacji. Z tych miejsc 943 było jednocześnie acetylowanych i succynylowanych. Analizie poddano wątrobę myszy z nokautem genu SIRT5 (de-succynylazy), w wyniku czego zidentyfikowano wiele miejsc succynylacji. W rzeczywistości były one liczniejsze niż zazwyczaj obserwowane w wątrobie myszy (zmodyfikowane peptydy przefiltrowano przy wartości Q &lt;0,05). (B) Kompleksy białkowe przedstawiające procent ich podjednostek zawierających zarówno miejsca acetylowane, jak i succynylowane (pogrubiona czerwona linia reprezentuje istotność określoną za pomocą dokładnego testu Fishera). (C) Schemat kompleksu syntazy ATP: podjednostki białkowe zaznaczone na czerwono przedstawiają podjednostki zawierające zarówno miejsca acetylowane, jak i succynylowane. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Basisty et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza spektrometrii masowej acetylacji peptydów; obejmuje lokalizację miejsca PTM i dane spektralne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Oprogramowanie do proteomiki ilościowej określa lokalizację miejsca PTM w peptydzie. Na podstawie fragmentacji MS/MS peptydy można dostarczyć informacji o konkretnym reszcie lizyny, którą modyfikuje grupa acetylowa. Ilustruje to zdolność oprogramowania do dostarczania cennych informacji na temat lokalizacji miejsc PTM. (A) Dwie możliwości modyfikacji reszty lizyny i lokalizacji miejsca PTM: KQYGEAFEKacR (lewo) i KacQYGEAFEKR (prawo). Dla każdej z potencjalnych izoform lokalizacji miejsca w peptydzie pokazano jony fragmentacyjne „potwierdzające” i „wykluczające”. Na podstawie tych informacji przypisuje się wyniki potwierdzające i wykluczające, co potwierdza obecność izoformy KQYGEAFEKacR w próbce. (B) Spektrum MS/MS odpowiadające potwierdzonej izoformie KQYGEAFEKacR wskazujące, że wszystkie jony y zawierające acetylowaną resztę lizyny (y2 i wyższe) wykazują przyrost masy o +42 m/z, co odpowiada modyfikacji acetylowej. Obserwowane jony b nie zawierają modyfikacji. (C) Wyekstrahowany chromatogram jonowy (XIC) z obszernymi polami pików wynikającymi z jonów y2 i y3, z których oba tworzą miejsce acetylacji w potwierdzonej izoformie KQYGEAFEKacR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...

Protokół ten opisuje nowatorską technikę jednoczesnego wzbogacania wielu PTM w przeciwciała, a następnie analizy spektrometrii mas niezależnej od danych w celu uzyskania biologicznego wglądu w lokalizację miejsca i przesłuchy. Jest to efektywna czasowo i kosztowo technika, która umożliwia jednoczesną identyfikację i kwantyfikację peptydów z plastrowaniem zawierającym PTM acetylacji i sukcynylacji przy użyciu tylko niewielkich ilości próbki wejściowej. Śledzenie modyfikacji potranslacyjnych jest ważnym krokiem w charakterystyce i zwalczaniu różnych stanów chorobowych.Wiemy już, że niektóre nowotwory i cukrzyca są wysoce regulowane przez te modyfikacje białek. Metoda ta może teoretycznie mieć zastosowanie do dowolnych PTM z przeciwciałami do wzbogacania, takimi jak ubikwitynacja, fosforylacja i inne. Może mieć również zastosowanie do innych typów tkanek lub modeli hodowli komórkowych.Kluczem do uzyskania cennych danych za pomocą tej techniki jest powtarzalność. Można to osiągnąć, upewniając się, że wszystkie kroki są wykonywane bardzo ostrożnie, szczególnie kroki związane z kulkami przeciwciał. Na początek zaopatrz się w wkłady zawierające żywicę C18, które łączyły do 10 miligramów białka.Zamontuj te wkłady w aparacie próżniowym. Dodaj 800 mikrolitrów 80% acetonitrylu i 0,2% kwasu mrówkowego do wkładów z 19,8% wodą i rozpocznij ssanie próżniowe, aby przeciągnąć płyn. Powtórz ten krok jeden raz, unikając całkowitego wyschnięcia wkładów.Zrównoważyć wkłady, dodając 800 mikrolitrów 0,2% kwasu mrówkowego do wody z odsysaniem próżniowym. Powtórz to dwa razy. Załaduj jeden miligram peptydów w roztworze o objętości około 1 000 mikrolitrów na wkłady z odsysaniem próżniowym.Przemyć peptydy dwukrotnie 800 mikrolitrami 0,2% kwasu mrówkowego w wodzie pod odsysaniem próżniowym. Następnie ułóż 1,5 mililitra probówek wirówkowych pod każdym wkładem, aby zebrać peptyd. Pod odsysaniem próżniowym wymyj peptydy z wkładów najpierw 800 mikrolitrami 80% acetonitrylu i 0,2% kwasu mrówkowego w 19,8% wodzie, a następnie 400 mikrolitrami tego samego roztworu.Całkowicie wysuszyć odsolone próbki peptydów w koncentratorze próżniowym przez dwie do trzech godzin. Teraz ponownie zawieś wysuszone peptydy w 1,4 mililitra zimnego buforu oczyszczającego 1X immunoaffinity. Wirować, aby wymieszać i zapewnić pH około 7.Odwirować próbki z ciśnieniem 10 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pojawia się mała kulka. Odłóż peptydy na lód, przygotowując kulki przeciwciał.Dodaj jeden mililitr zimnego 1X PBS do probówki zawierającej 100 mikrolitrów zawiesiny kulek przeciwciała K-acetylu i probówki zawierającej 100 mikrolitrów zawiesiny kulek przeciwciała K-sukcynylu i wymieszaj pipetując. Przenieś cały roztwór do nowych 1,5 mililitrowych probówek i wiruj w miniaturowej wirówce przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Zassać PBS, uważając, aby nie zassać żadnych koralików.Powtórz pranie jeszcze trzy razy. Następnie ponownie zawieś kulki w około 440 mikrolitrach PBS. Odpipetuj koraliki kilka razy, aby dobrze wymieszać.Za pomocą wstępnie naciętych końcówek o pojemności 200 mikrolitrów przenieś 100 mikrolitrów każdego kulki przeciwciała acetylolizyny i kulki przeciwciała sukcynylolizyny do nowej probówki. Wirować przez 30 sekund w miniaturowej wirówce i odessać pożywkę za pomocą końcówki do ładowania żelu. Koraliki zmienią kolor na biały.Odpipetować zawieszony peptyd bezpośrednio na umyte kulki i inkubować peptydy z kulkami w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc z mieszaniem. Rano wiruj próbki peptydów pod ciśnieniem 2000 razy g przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant zawierający niezwiązane peptydy i w razie potrzeby zachować na przyszłe eksperymenty.Dodaj jeden mililitr zimnego buforu oczyszczającego 1X immunoaffinity do kulek, aby umyć i wymieszać, odwracając pięć razy. Wiruj z prędkością 2 000 razy g przez 30 sekund w czterech stopniach Celsjusza. Odessać roztwór oczyszczający z powinowactwa immunologicznego i powtórzyć etap oczyszczania z powinowactwa immunologicznego jeszcze raz.Następnie dodaj jeden mililitr zimnej wody HPLC do kulek i wymieszaj, odwracając pięć razy. Wiruj z prędkością 2 000 razy g przez 30 sekund w czterech stopniach Celsjusza. Odessać wodę i powtórzyć etap płukania wodą jeszcze dwa razy.Wiruj dodatkowo z prędkością 2 000 razy g przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać pozostałą wodę na dnie tuby. Za pomocą końcówek ładujących żel z płaską końcówką odessaj nadmiar wody, która się zebrała. Uważaj, aby nie zasysać koralików.Dodaj 55 mikrolitrów 0,15% kwasu trifluorooctowego w wodzie do kulek. Inkubuj kulki przez 10 minut w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu stukając w dno probówki, aby wymieszać. Wiruj kulki w temperaturze pokojowej przez 30 sekund w miniaturowej wirówce.Użyj płaskiej końcówki do ładowania żelu, aby przenieść eluowane peptydy do nowej probówki. Dodaj 45 mikrolitrów 0,15% kwasu trifluorooctowego w wodzie do kulek. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu stukając w dno probówki, aby wymieszać.Wiruj kulki w temperaturze pokojowej przez 30 sekund w miniaturowej wirówce. Usunąć drugą elucję za pomocą płaskiej końcówki żelowej końcówki ładującej i połączyć ją z pierwszą elucją. Wiruj połączone eluowane peptydy z prędkością 12 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby osadzać wszelkie kulki, które się przenoszą.Przenieś roztwór próbki peptydu do nowej probówki o pojemności 500 mikrolitrów. Zbuduj metodę ładowania, aby załadować wzbogacone mieszaniny peptydów na chip kolumny C18 i ponownie odsalać peptydy, przemłukując ruchomą fazą A w ilości dwóch mikrolitrów na minutę przez 10 minut. Zbuduj metodę chromatograficzną w taki sposób, aby peptydy były przenoszone do kolumny analitycznej i eluowane z szybkością przepływu 300 nanolitrów na minutę z gradientem od dwóch do trzech godzin przy użyciu ruchomych faz A i B. W szczególności użyj gradientu liniowego od 5% fazy ruchomej B do 35% fazy mobilnej B przez 80 minut.Następnie zwiększ ruchomą fazę B do 80% w ciągu pięciu minut, a następnie utrzymuj ją na poziomie 80% B przez osiem minut, a następnie wróć do 5% B na 25-minutową ponowną równowagę. Następnie zbuduj metodę instrumentu MS do akwizycji zależnej od danych. W pierwszym eksperymencie skonfiguruj skanowanie jonów prekursorowych MS1 od M/Z 400 do 1,500.Ustaw czas trwania na 120 minut. Utwórz eksperyment IDA i kliknij przycisk OK. Na karcie kryteriów przełączania ustaw próg intensywności, aby wyzwolić skanowanie MS/MS w poszukiwaniu jonów o stanach naładowanych w zakresie od dwóch do pięciu do 200 zliczeń na sekundę. Ustaw dynamiczne wyłączanie jonów prekursorowych na 60 sekund.W drugim eksperymencie ustaw skanowanie jonów produktu MS/MS z zakresem skanowania MS2 od M/Z 100 do 1,500. Kliknij edytuj parametry i ustaw rozrzut energii zderzenia na pięć i wybierz tryb skanowania jonowego produktu o wysokiej czułości. Na koniec umieść próbkę w automatycznym podajniku próbek.Prześlij kolejkę próbek i uruchom metody akwizycji LC-MS/MS, budując metodę przyrządu MS do akwizycji niezależnej od danych i definiując dwa eksperymenty skanowania instrumentu. Wykonaj skanowanie jonów prekursorowych MS1 od 400 do 1, 250 masy, aby naładować i ustaw czas trwania na 120 minut. Ustaw rozrzut energii zderzenia na 10 i czas akumulacji na 45 milisekund, a następnie wybierz tryb skanowania jonów produktu o wysokiej czułości.Następnie zaimportuj plik tekstowy zawierający schemat akwizycji DIA SWATH z 64 zmiennymi oknem, aby wypełnić okna akwizycji SWATH w metodzie. W tym schemacie akwizycji zmienne okna od 5 do 90 masy do ładunku i szerokości są przekazywane w krokach przyrostowych w pełnym zakresie masy od 400 do 1 250 masy do naładowania, co daje łącznie 64 segmenty SWATH, z których każdy ma czas akumulacji 45 milisekund. Dostosuj czas akumulacji MS1 na 0,25 sekundy.Łączny czas cyklu skanowania MS1 i 64 skanów MS2 powinien teraz wynosić 3,2 sekundy. W tym badaniu wyniki eksperymentalne udokumentowały możliwość wykrywania i oceny przesłuchów PTM. Poniższa tabela pokazuje, w jaki sposób oś czasu przepływu pracy oraz wymagane ilości próbki i białka.Metodę jednodoniczkową można przeprowadzić w o połowę krótszym czasie i przy o połowę mniejszej liczbie próbek niż te alternatywne metody. Mediana współczynnika zmienności dla zmodyfikowanych obszarów peptydowych była niższa w metodzie jednogarnkowej niż w pojedynczym PTM i seryjnym wzbogacaniu PTM. Porównując jednomiskowe i pojedyncze metody wzbogacania PTM, nie stwierdzono istotnych różnic między korelacjami kwantyfikacji na poziomie miejsca dla obu modyfikacji.Ten rysunek przedstawia dane z udanego wzbogacenia i ilustruje przykład peptydu zawierającego wiele różnych modyfikacji acylowych, wizualizujących przesłuchy PTM. Peptyd był acetylowany na jednej reszcie lizyny i sukcylinowany na drugiej, podczas gdy tutaj ten sam peptyd był sukcylinowany na obu lizynach. Pokazuje to, że ta sama reszta lizyny może być modyfikowana za pomocą obu grup acylacyjnych i istnieje możliwość wystąpienia przesłuchów w tym miejscu.Konieczne jest upewnienie się, że każda próbka zawiera taką samą ilość kulek i upewnienie się, że żaden z koralików nie zostanie przypadkowo zasysany podczas mycia kulek o spoiwie peptydowym. Profilowanie oparte na spektrometrii mas i analiza danych w narzędziach programowych, takich jak Spectronaut, są wykonywane zgodnie z tą procedurą w celu identyfikacji, ilościowego określenia i przeprowadzenia lokalizacji PTM. Ten niezależny od danych przepływ pracy akwizycji w połączeniu z jednoczesnym wzbogacaniem PTM otworzy możliwości bardziej efektywnej oceny przesłuchów PTM i zapewni lepszy wgląd w znaczenie sygnalizacji PTM.

simultaneous-affinity-enrichment-two-post-translational-modifications

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Badanie wielu, endogennych modyfikacji potranslacyjnych dla docelowego białka może być niezwykle trudne. Opisane tutaj techniki wykorzystują zoptymalizowany bufor do lizy i system filtrów opracowany ze specyficznymi matrycami powinowactwa do kierowania PTM, do wykrywania modyfikacji acetylacji, ubikwitynacji, SUMOylacji 2/3 i fosforylacji tyrozyny dla białka docelowego przy użyciu jednego, usprawnionego systemu.

Wykorzystanie kompleksowego systemu wzbogacania immunoprecypitacji w celu zidentyfikowania endogennego profilu modyfikacji potranslacyjnej dla białek docelowych

Tutaj prezentujemy bezstronną kwantyfikację specyficznej dla miejsca acetylacji białek i/lub zajętości sukcynylacji (stechiometria) całego proteomu poprzez analizę ratiometryczną endogennych modyfikacji modyfikacji wprowadzonych po ilościowym acylowaniu chemicznym przy użyciu stabilnych bezwodników znakowanych izotopami. W połączeniu ze spektrometrią mas akwizycji niezależnym od wrażliwych danych, uzyskuje się dokładne pomiary zajętości obiektu.

Kwantyfikacja stechiometrii stechiometrii lizyny białek specyficznych dla miejsca przy użyciu spektrometrii mas z akwizycją niezależną od danych

Tutaj prezentujemy narzędzie proteogenomiczne PoGo i protokoły do szybkiej, ilościowej, potranslacyjnej modyfikacji i umożliwionego mapowania wariantów peptydów zidentyfikowanych za pomocą spektrometrii mas na genomy referencyjne. To narzędzie jest przydatne do integracji i wizualizacji proteogenomicznych i osobistych badań proteomicznych w połączeniu z ortogonalnymi danymi genomicznymi.

Szybka i ilościowa metoda modyfikacji potranslacyjnej i wariantów umożliwiła mapowanie peptydów do genomów

Ten protokół opisuje procedurę ekstrakcji i wzbogacania fosfopeptydów z linii komórkowych lub tkanek raka prostaty w celu analizy fosfoproteomu za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Wzbogacanie fosfopeptydem w połączeniu z bezznacznikową ilościową spektrometrią mas w celu zbadania fosfoproteomu w raku prostaty

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) zmieniają struktury i funkcje białek. Metody jednoczesnego wzbogacania wielu typów PTM mogą maksymalizować pokrycie w analizach. Przedstawiamy protokół wykorzystujący dwufunkcyjną chromatografię powinowactwa do metali immobilizowaną Ti(IV), a następnie spektrometrię mas do jednoczesnego wzbogacania i analizy N-glikozylacji i fosforylacji białek w tkankach trzustki.

Strategia wzbogacania spin-tip do jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z ludzkich tkanek trzustki

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Przedstawiamy tutaj protokół automatyzacji analizy posttranslacyjnej modyfikacji histonów pojedynczych komórek, wykorzystując strategię znakowania izotopowego dwu-plexowego oraz trawienie ArgC. Ten workflow umożliwia ilościowe, powtarzalne i wysokoczułe profilowanie heterogeniczności chromatyny oraz odpowiedzi epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczych komórek.

Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2)

Poznaj metodę jednoczesnego wzbogacania modyfikacji potranslacyjnych przy użyciu przeciwciał i spektrometrii masowej. Technika ta umożliwia identyfikację acetylacji i sukcynilacji z małych próbek.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Przeglądaj więcej filmów