Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Protokół ten opisuje nowatorską technikę jednoczesnego wzbogacania wielu PTM w przeciwciała, a następnie analizy spektrometrii mas niezależnej od danych w celu uzyskania biologicznego wglądu w lokalizację miejsca i przesłuchy. Jest to efektywna czasowo i kosztowo technika, która umożliwia jednoczesną identyfikację i kwantyfikację peptydów z plastrowaniem zawierającym PTM acetylacji i sukcynylacji przy użyciu tylko niewielkich ilości próbki wejściowej. Śledzenie modyfikacji potranslacyjnych jest ważnym krokiem w charakterystyce i zwalczaniu różnych stanów chorobowych.

Wiemy już, że niektóre nowotwory i cukrzyca są wysoce regulowane przez te modyfikacje białek. Metoda ta może teoretycznie mieć zastosowanie do dowolnych PTM z przeciwciałami do wzbogacania, takimi jak ubikwitynacja, fosforylacja i inne. Może mieć również zastosowanie do innych typów tkanek lub modeli hodowli komórkowych.

Kluczem do uzyskania cennych danych za pomocą tej techniki jest powtarzalność. Można to osiągnąć, upewniając się, że wszystkie kroki są wykonywane bardzo ostrożnie, szczególnie kroki związane z kulkami przeciwciał. Na początek zaopatrz się w wkłady zawierające żywicę C18, które łączyły do 10 miligramów białka.

Zamontuj te wkłady w aparacie próżniowym. Dodaj 800 mikrolitrów 80% acetonitrylu i 0,2% kwasu mrówkowego do wkładów z 19,8% wodą i rozpocznij ssanie próżniowe, aby przeciągnąć płyn. Powtórz ten krok jeden raz, unikając całkowitego wyschnięcia wkładów.

Zrównoważyć wkłady, dodając 800 mikrolitrów 0,2% kwasu mrówkowego do wody z odsysaniem próżniowym. Powtórz to dwa razy. Załaduj jeden miligram peptydów w roztworze o objętości około 1 000 mikrolitrów na wkłady z odsysaniem próżniowym.

Przemyć peptydy dwukrotnie 800 mikrolitrami 0,2% kwasu mrówkowego w wodzie pod odsysaniem próżniowym. Następnie ułóż 1,5 mililitra probówek wirówkowych pod każdym wkładem, aby zebrać peptyd. Pod odsysaniem próżniowym wymyj peptydy z wkładów najpierw 800 mikrolitrami 80% acetonitrylu i 0,2% kwasu mrówkowego w 19,8% wodzie, a następnie 400 mikrolitrami tego samego roztworu.

Całkowicie wysuszyć odsolone próbki peptydów w koncentratorze próżniowym przez dwie do trzech godzin. Teraz ponownie zawieś wysuszone peptydy w 1,4 mililitra zimnego buforu oczyszczającego 1X immunoaffinity. Wirować, aby wymieszać i zapewnić pH około 7.

Odwirować próbki z ciśnieniem 10 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pojawia się mała kulka. Odłóż peptydy na lód, przygotowując kulki przeciwciał.

Dodaj jeden mililitr zimnego 1X PBS do probówki zawierającej 100 mikrolitrów zawiesiny kulek przeciwciała K-acetylu i probówki zawierającej 100 mikrolitrów zawiesiny kulek przeciwciała K-sukcynylu i wymieszaj pipetując. Przenieś cały roztwór do nowych 1,5 mililitrowych probówek i wiruj w miniaturowej wirówce przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Zassać PBS, uważając, aby nie zassać żadnych koralików.

Powtórz pranie jeszcze trzy razy. Następnie ponownie zawieś kulki w około 440 mikrolitrach PBS. Odpipetuj koraliki kilka razy, aby dobrze wymieszać.

Za pomocą wstępnie naciętych końcówek o pojemności 200 mikrolitrów przenieś 100 mikrolitrów każdego kulki przeciwciała acetylolizyny i kulki przeciwciała sukcynylolizyny do nowej probówki. Wirować przez 30 sekund w miniaturowej wirówce i odessać pożywkę za pomocą końcówki do ładowania żelu. Koraliki zmienią kolor na biały.

Odpipetować zawieszony peptyd bezpośrednio na umyte kulki i inkubować peptydy z kulkami w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc z mieszaniem. Rano wiruj próbki peptydów pod ciśnieniem 2000 razy g przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant zawierający niezwiązane peptydy i w razie potrzeby zachować na przyszłe eksperymenty.

Dodaj jeden mililitr zimnego buforu oczyszczającego 1X immunoaffinity do kulek, aby umyć i wymieszać, odwracając pięć razy. Wiruj z prędkością 2 000 razy g przez 30 sekund w czterech stopniach Celsjusza. Odessać roztwór oczyszczający z powinowactwa immunologicznego i powtórzyć etap oczyszczania z powinowactwa immunologicznego jeszcze raz.

Następnie dodaj jeden mililitr zimnej wody HPLC do kulek i wymieszaj, odwracając pięć razy. Wiruj z prędkością 2 000 razy g przez 30 sekund w czterech stopniach Celsjusza. Odessać wodę i powtórzyć etap płukania wodą jeszcze dwa razy.

Wiruj dodatkowo z prędkością 2 000 razy g przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać pozostałą wodę na dnie tuby. Za pomocą końcówek ładujących żel z płaską końcówką odessaj nadmiar wody, która się zebrała. Uważaj, aby nie zasysać koralików.

Dodaj 55 mikrolitrów 0,15% kwasu trifluorooctowego w wodzie do kulek. Inkubuj kulki przez 10 minut w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu stukając w dno probówki, aby wymieszać. Wiruj kulki w temperaturze pokojowej przez 30 sekund w miniaturowej wirówce.

Użyj płaskiej końcówki do ładowania żelu, aby przenieść eluowane peptydy do nowej probówki. Dodaj 45 mikrolitrów 0,15% kwasu trifluorooctowego w wodzie do kulek. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu stukając w dno probówki, aby wymieszać.

Wiruj kulki w temperaturze pokojowej przez 30 sekund w miniaturowej wirówce. Usunąć drugą elucję za pomocą płaskiej końcówki żelowej końcówki ładującej i połączyć ją z pierwszą elucją. Wiruj połączone eluowane peptydy z prędkością 12 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby osadzać wszelkie kulki, które się przenoszą.

Przenieś roztwór próbki peptydu do nowej probówki o pojemności 500 mikrolitrów. Zbuduj metodę ładowania, aby załadować wzbogacone mieszaniny peptydów na chip kolumny C18 i ponownie odsalać peptydy, przemłukując ruchomą fazą A w ilości dwóch mikrolitrów na minutę przez 10 minut. Zbuduj metodę chromatograficzną w taki sposób, aby peptydy były przenoszone do kolumny analitycznej i eluowane z szybkością przepływu 300 nanolitrów na minutę z gradientem od dwóch do trzech godzin przy użyciu ruchomych faz A i B. W szczególności użyj gradientu liniowego od 5% fazy ruchomej B do 35% fazy mobilnej B przez 80 minut.

Następnie zwiększ ruchomą fazę B do 80% w ciągu pięciu minut, a następnie utrzymuj ją na poziomie 80% B przez osiem minut, a następnie wróć do 5% B na 25-minutową ponowną równowagę. Następnie zbuduj metodę instrumentu MS do akwizycji zależnej od danych. W pierwszym eksperymencie skonfiguruj skanowanie jonów prekursorowych MS1 od M/Z 400 do 1,500.

Ustaw czas trwania na 120 minut. Utwórz eksperyment IDA i kliknij przycisk OK. Na karcie kryteriów przełączania ustaw próg intensywności, aby wyzwolić skanowanie MS/MS w poszukiwaniu jonów o stanach naładowanych w zakresie od dwóch do pięciu do 200 zliczeń na sekundę. Ustaw dynamiczne wyłączanie jonów prekursorowych na 60 sekund.

W drugim eksperymencie ustaw skanowanie jonów produktu MS/MS z zakresem skanowania MS2 od M/Z 100 do 1,500. Kliknij edytuj parametry i ustaw rozrzut energii zderzenia na pięć i wybierz tryb skanowania jonowego produktu o wysokiej czułości. Na koniec umieść próbkę w automatycznym podajniku próbek.

Prześlij kolejkę próbek i uruchom metody akwizycji LC-MS/MS, budując metodę przyrządu MS do akwizycji niezależnej od danych i definiując dwa eksperymenty skanowania instrumentu. Wykonaj skanowanie jonów prekursorowych MS1 od 400 do 1, 250 masy, aby naładować i ustaw czas trwania na 120 minut. Ustaw rozrzut energii zderzenia na 10 i czas akumulacji na 45 milisekund, a następnie wybierz tryb skanowania jonów produktu o wysokiej czułości.

Następnie zaimportuj plik tekstowy zawierający schemat akwizycji DIA SWATH z 64 zmiennymi oknem, aby wypełnić okna akwizycji SWATH w metodzie. W tym schemacie akwizycji zmienne okna od 5 do 90 masy do ładunku i szerokości są przekazywane w krokach przyrostowych w pełnym zakresie masy od 400 do 1 250 masy do naładowania, co daje łącznie 64 segmenty SWATH, z których każdy ma czas akumulacji 45 milisekund. Dostosuj czas akumulacji MS1 na 0,25 sekundy.

Łączny czas cyklu skanowania MS1 i 64 skanów MS2 powinien teraz wynosić 3,2 sekundy. W tym badaniu wyniki eksperymentalne udokumentowały możliwość wykrywania i oceny przesłuchów PTM. Poniższa tabela pokazuje, w jaki sposób oś czasu przepływu pracy oraz wymagane ilości próbki i białka.

Metodę jednodoniczkową można przeprowadzić w o połowę krótszym czasie i przy o połowę mniejszej liczbie próbek niż te alternatywne metody. Mediana współczynnika zmienności dla zmodyfikowanych obszarów peptydowych była niższa w metodzie jednogarnkowej niż w pojedynczym PTM i seryjnym wzbogacaniu PTM. Porównując jednomiskowe i pojedyncze metody wzbogacania PTM, nie stwierdzono istotnych różnic między korelacjami kwantyfikacji na poziomie miejsca dla obu modyfikacji.

Ten rysunek przedstawia dane z udanego wzbogacenia i ilustruje przykład peptydu zawierającego wiele różnych modyfikacji acylowych, wizualizujących przesłuchy PTM. Peptyd był acetylowany na jednej reszcie lizyny i sukcylinowany na drugiej, podczas gdy tutaj ten sam peptyd był sukcylinowany na obu lizynach. Pokazuje to, że ta sama reszta lizyny może być modyfikowana za pomocą obu grup acylacyjnych i istnieje możliwość wystąpienia przesłuchów w tym miejscu.

Konieczne jest upewnienie się, że każda próbka zawiera taką samą ilość kulek i upewnienie się, że żaden z koralików nie zostanie przypadkowo zasysany podczas mycia kulek o spoiwie peptydowym. Profilowanie oparte na spektrometrii mas i analiza danych w narzędziach programowych, takich jak Spectronaut, są wykonywane zgodnie z tą procedurą w celu identyfikacji, ilościowego określenia i przeprowadzenia lokalizacji PTM. Ten niezależny od danych przepływ pracy akwizycji w połączeniu z jednoczesnym wzbogacaniem PTM otworzy możliwości bardziej efektywnej oceny przesłuchów PTM i zapewni lepszy wgląd w znaczenie sygnalizacji PTM.