Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF

Ogólnym celem testu HS-MRM jest zmniejszenie zjawiska interferencji MRM, które wpływa na kwantyfikację peptydów lub białek poprzez połączenie separacji ruchliwości jonów prekursorów peptydów z detekcją jonów fragmentacyjnych metodą spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w obszarze charakterystyki bioterapeutycznej, a także kwantyfikacji biomarkerów białkowych lub peptydowych oraz proteomiki ilościowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wykrywanie białek komórek gospodarza o niskiej liczebności, które mogą być obecne w białkach biofarmaceutycznych.

Najpierw kliknij utwórz metodę analizy w oprogramowaniu do akwizycji danych i wybierz metodę generowania i pozyskiwania oraz przetwarzania. Wpisz nazwę i opis metody, przejdź do folderu metody i kliknij przycisk Dalej. Jako typ analizy wybierz mapę peptydową IMS i kliknij przycisk Dalej.

Następnie wybierz bieżącą konfigurację systemu i kliknij Dalej i Zakończ. W nowo utworzonej metodzie kliknij zakładkę instrumentów, wybierz binarny menedżer rozpuszczalników i edytuj ustawienia gradientu, aby uzyskać separację peptydów przy natężeniu przepływu 0,2 mililitra na minutę. Stosować rozcieńczenie gradientowe od jednego do 40% rozpuszczalnika B w ciągu 30 minut, a następnie dwuminutowe mycie kolumny i 10-minutową równowagę o łącznym czasie pracy wynoszącym 45 minut.

Następnie wybierz menedżera próbek i ustaw temperaturę próbki na 10 stopni Celsjusza, a temperaturę kolumny na 60 stopni Celsjusza. Na karcie instrumentów wybierz instrument Vion IMS QTof. W sekcji ustawień wybierz czułość dla trybu analizatora i wprowadź trzy kilowolty dla napięcia kapilary, 100 stopni Celsjusza dla temperatury źródła, 250 stopni Celsjusza dla temperatury desolwatacji, 50 litrów na godzinę dla przepływu gazu stożkowego i 500 litrów na godzinę dla przepływu gazu do desolwatacji.

Kliknij kartę eksperymentu i wybierz MSE w wysokiej rozdzielczości dla trybu. Następnie wprowadź 100 dla małej masy, 2000 dla dużej masy i 0,4 sekundy dla czasu skanowania. W sekcji energii zderzenia wpisz sześć elektronowoltów dla ustawienia niskiej energii i wybierz rampę o wysokiej energii od 15 do 40 elektronowoltów.

W przypadku czasu pobierania użyj niestandardowego środowiska uruchomieniowego z zakresu od pięciu do 30 minut. Następnie kliknij zakładkę opcji i wybierz tryb automatycznej korekcji blokady z interwałem automatycznej korekcji blokady wynoszącym pięć minut. Następnie wybierz opcję kontynuuj z korekcją blokady i upewnij się, że automatyczne sprawdzanie detektora jest wyłączone.

W menu bieżącej konfiguracji systemu wybierz instrument Vion IMS QTof i kliknij narzędzia. Wprowadź trzy kilowolty dla napięcia kapilarnego, 40 woltów dla stożka próbkowania, 100 woltów dla przesunięcia źródła, 100 stopni Celsjusza dla temperatury źródła, 250 stopni Celsjusza dla temperatury desolwatacji, 50 litrów na godzinę dla przepływu gazu stożkowego, 500 litrów na godzinę dla przepływu gazu do desolwatacji i trzy kilowolty dla referencyjnego napięcia kapilarnego. Przeanalizuj wcześniej przygotowaną 10-nanomolową próbkę z fałszywymi kolcami za pomocą opisanego właśnie testu LC-HDMSE, wstrzykując 10 mikrolitrów próbki do urządzenia.

Przedstawiono tutaj poszczególne sekwencje sześciu wzorców peptydu fosforylazy B zawartych w mieszaninie fałszywych peptydów wraz z ich czasami retencji i najliczniejszymi prekursorami zaobserwowanymi w eksperymencie HDMSE. Widma HDMSE uzyskane dla jednego ze sztucznych peptydów wzbogaconych w trawieniu Infliksymabu są wyświetlane tutaj. W oprogramowaniu do akwizycji danych kliknij utwórz metodę analizy i wybierz metodę generowania i pozyskiwania oraz przetwarzania.

Wpisz nazwę i opis metody, przejdź do folderu metody i kliknij przycisk Dalej. Jako typ analizy wybierz opcję kwantyfikuj, wybierz opcję Ilościowo oznacz test Tof chromatograficzny 2D i kliknij przycisk Dalej. Następnie wybierz bieżącą konfigurację systemu i kliknij Dalej i Zakończ.

Kliknij na zakładkę instrumentów w nowo utworzonej metodzie. Wybierz binarny menedżer rozpuszczalników i edytuj ustawienia gradientu, aby uzyskać separację peptydów przy natężeniu przepływu 0,2 mililitra na minutę. Stosować rozcieńczenie gradientowe od jednego do 40% rozpuszczalnika B w ciągu 30 minut, a następnie dwuminutowe płukanie kolumny i 10-minutową równowagę o łącznym czasie pracy wynoszącym 45 minut.

W zakładce przyrządy wybierz menedżer próbek i ustaw temperaturę próbki na 10 stopni Celsjusza, a temperaturę kolumny na 60 stopni Celsjusza. Teraz wybierz instrument Vion IMS QTof i w sekcji ustawień wybierz czułość dla trybu analizatora. Następnie wprowadź trzy kilowolty dla napięcia kapilarnego, 100 stopni Celsjusza dla temperatury źródła, 250 stopni Celsjusza dla temperatury desolwatacji, 50 litrów na godzinę dla przepływu gazu stożkowego i 500 litrów na godzinę dla przepływu gazu do desolwatacji.

Kliknij kartę eksperymentu i jako typ eksperymentu wybierz tabelę funkcji co najmniej jedną funkcję MS, MSMS lub MRM. Usuń domyślną funkcję akwizycji, kliknij dodaj plus MRM i edytuj parametry okna przechowywania w sekcji środowiska uruchomieniowego. W edytorze funkcji Tof MRM wprowadź stosunek głównego ładunku prekursora peptydu, wybierz niski dla rozdzielczości prekursora i wprowadź stan ładunku prekursora.

Następnie wprowadź współczynnik ładunku głównego produktu 16 elektronowoltów dla początkowej energii zderzenia, 0,1 sekundy dla ustalonego czasu skanowania i szeroki dla kolumny widma. Za pomocą przycisku duplikowania dodaj 10 dodatkowych przejść MRM i użyj różnych wartości energii zderzenia w zakresie od 18 do 36 elektronowoltów. Po ustaleniu trzech najlepszych przejść dla każdego peptydu, przeprowadzono eksperyment Tof MRM w celu znalezienia optymalnej energii zderzenia, aby zmaksymalizować sygnały generowane dla każdego peptydu.

Następnie skonfiguruj metodę HS-MRM zawierającą tylko jeden jon fragmentacyjny na peptyd. Zmodyfikuj poprzednio utworzoną metodę Tof MRM, wybierając funkcję HS-MRM zamiast funkcji Tof MRM. W edytorze funkcji HS-MRM wprowadź współczynnik naładowania głównego, wybierz niski dla rozdzielczości prekursora i wprowadź stan ładowania prekursora.

Następnie wprowadź wartość prekursora CCS i wybierz niską rozdzielczość prekursora CCS. Dla jonu produktu wprowadź jego współczynnik ładunku głównego, wybierz optymalną energię zderzenia, wybierz czas skanowania 0,4 sekundy i wybierz ustawienie szerokiego spektrum, aby uwzględnić wszystkie jego izotopy. Końcowy test HS-MRM zachowuje tylko najlepsze przejście dla każdego peptydu i służy do analizy wszystkich próbek wzbogaconych.

W metodzie analizy utworzonej dla metody akwizycji danych HS-MRM należy kliknąć w zakładkę cel i wybrać opcję zarządzania komponentami. Z menu rozwijanego w obszarze Typ eksperymentu wybierz opcję HS MSMS/HS MRM. Kliknij utwórz i wprowadź nazwę komponentu, oczekiwany czas przechowywania, okno czasowe ekstrakcji i współczynnik ładunku głównego prekursora.

Wybierz tryb wyodrębniania XIC i wpisz oczekiwaną wartość CCS. Dla jonu fragmentacyjnego wprowadź jego stan naładowania i współczynnik ładunku głównego. Następnie wprowadź wszystkie składniki peptydowe monitorowane za pomocą testu HS-MRM.

W zakładce celu tej samej metody pozyskiwania HS-MRM kliknij domyślne ilości i wprowadź 0,1, jeden, 10 i 100 nanomolów dla wszystkich fałszywych składników peptydowych. Po wprowadzeniu pierwszej wartości kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję wypełnienia w dół, aby wprowadzić to samo stężenie dla wszystkich składników. Powtórzyć tę samą procedurę dla wszystkich czterech stężeń krzywej kalibracyjnej.

Teraz przejdź do zakładki przetwarzania i kliknij ustawienia ekstrakcji. Wprowadź 10 PPM dla tolerancji masy. Następnie kliknij tolerancję czasu dryfu CCS i wprowadź 5% dla tolerancji CCS.

Na karcie przetwarzania wybierz ustawienia przetwarzania szczytowego. W sekcji wygładzania wybierz średnią jako algorytm wygładzania, jedną jako połowę szerokości i jedną jako iteracje. W sekcji integracji upewnij się, że zaznaczone są opcje automatycznego pikowania szerokości i automatycznego wykrywania.

Następnie wybierz ustawienia ekranu docelowego w zakładce przetwarzania i wybierz opcję najbliżej RT w oknie RT. Następnie wprowadź 0,2 minuty dla tolerancji czasu przechowywania. Wybierz ustawienia ilościowe i w menu kalibracji wybierz liniową dla typu dopasowania krzywej kalibracyjnej, jeden ponad x kwadrat dla typu masy, stężenie jako typ wartości składnika, milimole na litr dla jednostek wartości składników i brak dla obliczania punktów kalibracji przez uśrednianie.

W menu kwantyfikacji wybierz obszar jako wartość odpowiedzi. Przykłady chromatogramów HS-MRM wygenerowanych dla fałszywych peptydów we wszystkich stężeniach przedstawiono tutaj. W tym miejscu przedstawiono krzywe kalibracyjne uzyskane dla każdego peptydu po całkowaniu pików HS-MRM.

W tym miejscu podsumowano względne odchylenie standardowe powierzchni piku obliczone na podstawie czterech powtórzonych wstrzyknięć. Ponieważ test MRM o wysokiej selektywności obejmuje zarówno separację prekursorów ruchliwości jonów, jak i ukierunkowaną detekcję spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości, ma ogromny potencjał, aby stać się szybkim, wysokowydajnym testem monitorowania wielu białek komórek gospodarza w partiach biofarmaceutyków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować test MRM o wysokiej selektywności na instrumencie Vion IMS QTof.