Name: Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Poznaj metodę HS-MRM do ilościowego oznaczania białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach z wykorzystaniem chromatografii cieczowej i spektrometrii mas QTOF. Technika ta umożliwia wykrywanie niskostężonych peptydów z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Lesley Malouin i Tony'emu Catlinowi z Waters Corporation za przygotowanie rysunku 6 manuskryptu.

1. Przygotowanie trawienia infliksymabu (procedura ~24 h)
<ol>
	<li>Przygotować świeże roztwory 50 mM wodorowęglanu amonu, 1% anionowego środka powierzchniowo czynnego w 50 mM NH4HCO3, 500 mM ditiotreitolu (DTT) w 50 mM NH4HCO3 i 500 mM jodoacetamidu (IAM) w 50 mM NH4HCO3.</li>
	<li>Do 750 μl 50 mM NH4HCO3 dodać 200 μl mAb infliksymabu (10 mg/ml) i 50 μl 1% anionowego roztworu środka powierzchniowo czynnego i denaturować białko przez 15 minut w temperaturze 60 °C w obecności 0,05% anionowego środka powierzchniowo czynnego.</li>
	<li>Dodać 40 μl 500 mM DTT i redukować próbkę przez 60 minut w temperaturze 60 °C w obecności 20 mM DTT.</li>
	<li>Dodać 20 μl 500 mM IAM i alkilować próbkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności w obecności ~10 mM IAM.</li>
	<li>Dodać zawartość probówki do mikrowirówki do szklanej fiolki zawierającej 20 μg MS Lys C/trypsyna do sekwencjonowania i trawić próbkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać drugą porcję enzymu (20 μg), przenosząc strawioną próbkę do innej szklanej fiolki zawierającej 20 μg Lys C/Trypsyny MS klasy sekwencjonowania i wytrawić próbkę przez noc (12-15 godzin) w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po całonocnej proteolizie dodać 5 μl 100% kwasu mrówkowego (FA) i inkubować trawienie przez 30 minut w temperaturze 37 °C w celu rozkładu kwasowego, labilnego, anionowego środka powierzchniowo czynnego.</li>
	<li>Wirować trawienie przez 15 minut przy 4 000 x g w wirówce, aby wytrącić nierozpuszczalny składnik anionowego środka powierzchniowo czynnego.</li>
	<li>Odzyskać ~1 000 μl roztworu mineralizowanego infliksymabu i umieścić go w fiolce z automatycznym samplerem LC; stężenie w roztworze powinno wynosić ~2 mg/ml. Przechowywać digest w zamrażarce w temperaturze -20 °C do czasu, gdy system LC/MS będzie gotowy do analizy.</li>
</ol>
2. Skok standardów peptydowych (~30 min)
<ol>
	<li>Rozmrozić trawienie infliksymabu, umieszczając zamrożoną próbkę w szklanej fiolce na stole w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 1 ml 0,1% FA w H2O do jednej fiolki do trawienia fosforylazy królika b (PHO), aby przygotować roztwory podstawowe 1 μM dla wszystkich sześciu wzorców peptydów z PHO zawartego w fiolce (fiolka zawiera 1 nmol każdego peptydu).</li>
	<li>Przygotować 4 x 1-mililitrowe rozcieńczenia roztworu podstawowego PHO w celu otrzymania roztworów zawierających peptydy 0,1, 1, 10 i 100 nM, używając 0,1% FA jako rozpuszczalnika rozcieńczającego. Przygotować wszystkie rozcieńczenia w szklanych fiolkach (fiolki LC z automatycznym samplerem) i dodać 100 μl roztworu do trawienia infliksymabu jako matrycę tła do wszystkich fiolek. Załadować 2 μg tła trawiącego do kolumny przy każdym wstrzyknięciu 10 μl. Przygotować ślepą próbkę, która zawiera rozcieńczony roztwór infliksymabu (w tym samym rozcieńczeniu 1:10), bez peptydów wzbogaconych.</li>
</ol>
3. Konfiguracja metody akwizycji danych LC/HDMS E
UWAGA: Przepływ pracy podsumowujący kroki wymagane do skonfigurowania akwizycji HS-MRM jest przedstawiony na rysunku 1 i jest szczegółowo opisany w sekcjach 3-6. Akwizycja niezależnego od danych zbioru danych HDMSE jest wymagana w celu ustalenia czasu retencji każdego monitorowanego peptydu, macierzystego m/z najobficiej występującego jonu peptydowego po jonizacji elektronrozpylacyjnej, oraz odpowiadającego mu CCS (kolizyjnego przekroju czynnego) uzyskanego z separacji ruchliwości jonów. Ponadto niezależny od danych zestaw danych dostarcza informacji dotyczących m/z trzech najliczniejszych jonów fragmentacyjnych dla każdego prekursora peptydu. W drugim etapie przepływu pracy (optymalizacja CE) czułość testu jest zwiększana poprzez dostrojenie energii komórki zderzeniowej w celu uzyskania najwyższej intensywności jonów dla każdego jonu fragmentu. Wreszcie, w ostatnim kroku, wszystkie opisane powyżej parametry są wprowadzane do edytora metody HS-MRM dla każdego monitorowanego peptydu.
<ol>
	<li>Wykonaj eksperymenty LC/MS na kwadrupolowym spektrometrze mas czasu przelotu (QTOF) sprzężonym z ultra-sprawnym systemem chromatografii cieczowej przy użyciu metody akwizycji niezależnej od danych (HDMSE). 
	UWAGA: Więcej szczegółów dotyczących konfiguracji przyrządu znajduje się w sekcji Materiał. Ten instrument wykorzystuje urządzenie do przemieszczania jonów na fali biegnącej do separacji prekursorów peptydów10.</li>
	<li>Przygotować dwie fazy ruchome zawierające 0,1% FA w wodzie (rozpuszczalnik A) i 0,1% FA w acetonitrylu (rozpuszczalnik B). 
	UWAGA: Użyj kolumny C18 z hybrydą o naładowanej powierzchni (CSH) (2,1 x 150 mm, wypełnionej cząstkami 1,7 μm) do oddzielenia wzbogaconych trawień mAb.</li>
	<li>W oprogramowaniu do akwizycji danych kliknij "Create/Analysis Method" i wybierz "Generuj metodę akwizycji i przetwarzania". Wpisz nazwę metody, przejdź do folderu (katalogu) metody i kliknij "Dalej".</li>
	<li>W polu "Typ analizy" wybierz "Mapa peptydów (IMS)", a następnie w zakładce "System instrumentów" wybierz instrument "Czwartorzędowy menedżer rozpuszczalników". Edytuj ustawienia gradientu, aby uzyskać separację peptydów przy natężeniu przepływu 200 μl/min. Zastosować elucję gradientową od 1 do 40% rozpuszczalnika B w ciągu 30 minut, a następnie 2-minutowe płukanie kolumny i 9-minutową równowagę, z łącznym czasem pracy wynoszącym 50 minut. Wprowadź te parametry eksperymentalne w edytorze metody LC.</li>
	<li>W zakładce "Instrument System" wybierz instrument "Sample Manager". Ustawić temperaturę próbki na 10 °C, a temperaturę kolumny na 60 °C.</li>
	<li>Spektrometr masowy QTOF pracuje w trybie czułości ESI jonów dodatnich, z typową zdolnością rozdzielczą 30 000 FWHM. 
	UWAGA: LC/HDMSE to tryb akwizycji niezależnej od danych (DIA), który działa poprzez szybkie zbieranie skanów o zmiennych energiach zderzeń (w komórce zderzeniowej) między niską energią (6 V dla skanów MS kanał 1) a podwyższoną energią (rampa od 15 do 40 V w celu wytworzenia widm fragmentacji bez wyboru prekursora w kanale MS 2).
	<ol>
		<li>Wprowadź domyślne parametry MS związane ze źródłem w oprogramowaniu do akwizycji danych: z "Moja praca/System instrumentów" wybierz zakładkę "Vion IMS Qtof", a w menu "Narzędzia" wprowadź następujące parametry: napięcie kapilarne 3,0 kV, temperatura źródła 100 °C, przesunięcie źródła 100 V, przepływ gazu w stożku 50 l/h oraz napięcie stożka 40 V. Ustawić temperaturę desolwatacji na 250 °C, natężenie przepływu gazu do desolwatacji na 500 l/h, a napięcie odniesienia kapilary na 3,0 kV.</li>
		<li>W oprogramowaniu do akwizycji danych kliknij "Create/Analysis Method" i wybierz "Generate an acquisition and processing method". Wpisz nazwę metody i przejdź do folderu (katalogu) metody, a następnie kliknij "Next".</li>
		<li>W polu "Typ analizy" wybierz "Mapa peptydów (IMS)", a w zakładce "System instrumentów" wybierz instrument "Vion IMS QTof". Kliknij "Zakończ"." 
		UWAGA: Nowo utworzona metoda LC/HDMSE otwiera się automatycznie na ekranie "Konfiguracja metody instrumentu".</li>
		<li>W zakładce "Ustawienia" wprowadź następujące parametry: napięcie kapilarne 3,0 kV, temperatura źródła 100 °C, temperatura desolwatacji 250 °C, przepływ gazu stożkowego 50 l/h oraz przepływ gazu do desolwatacji 500 l/h.</li>
		<li>W ustawieniach zakładki "Eksperyment" wybierz "High Definition MSE" i wybierz "Czas wykonywania metody analizy". W zakładce "Ustawienia skanowania" wprowadź następujące parametry: niska masa – 100; wysoka masa – 2 000 oraz czas skanowania – 400 ms. W zakładce "CE" wpisz "6 V" dla ustawienia niskiego zużycia energii i wybierz rampę wysokoenergetyczną od 15 do 40 V. Upewnij się, że zaznaczona jest opcja "Wyłącz redukcję danych".</li>
		<li>Podać roztwór 50 ng/ml enkefaliny leucyny (LE) przygotowany w 50% acetonitrylu z 0,1% FA przy natężeniu przepływu 10 μl/min w celu kalibracji masy zamkniętej podczas pozyskiwania danych. 
		UWAGA: Dane dotyczące masy blokady są pozyskiwane co 5 minut przy użyciu tej samej szybkości akwizycji w tym samym zakresie masy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizować próbkę 10 nM z dodatkiem fosforanu za pomocą opisanego powyżej testu LC/HDMSE, wstrzykując 10 μl próbki (ilość załadowana na kolumnie wynosi 100 fmol dla każdego wzorca peptydu).</li>
</ol>
4. Ustawienie metody Tof-MRM do optymalizacji energii zderzeń (CE)
<ol>
	<li>Ze zbioru danych LC/HDMSE uzyskaj czas retencji, prekursor i jon fragmentacyjny m/z dla każdego peptydu PHO. Zachowaj m/z i stan naładowania dla najliczniejszego jonu prekursorowego i odpowiadających mu trzech najobficiej występujących jonów fragmentacyjnych. 
	UWAGA: Przykład widm niskoenergetycznych i wysokoenergetycznych zwykle rejestrowanych przez test LC/HDMSE przedstawiono na rysunku 2.</li>
	<li>Użyj optymalizacji energii zderzenia (CE) w eksperymencie SRM/MRM, aby uzyskać najlepszy sygnał dla każdego peptydu23.
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu do akwizycji danych kliknij "Create/Analysis Method" i wybierz "Generuj metodę akwizycji i przetwarzania". Wpisz nazwę metody, przejdź do folderu (katalogu) metody i kliknij "Dalej".</li>
		<li>W polu "Typ analizy" wybierz "Kwantyfikuj". Wybierz "Ilościowo oznacz test chromatograficzny 2D" i kliknij "Dalej". W zakładce "System instrumentów" wybierz "Vion IMS QTof" i kliknij "Zakończ". 
		UWAGA: Nowo utworzona metoda Tof-MRM otwiera się automatycznie na ekranie "Konfiguracja metody instrumentu".</li>
		<li>W zakładce "Ustawienia" wprowadź następujące parametry: napięcie kapilarne 3,0 kV, temperatura źródła 100 °C, temperatura desolwatacji 250 °C, przepływ gazu stożkowego 50 l/h oraz przepływ gazu do desolwatacji 500 l/h.</li>
		<li>W ustawieniach zakładki "Eksperyment" wybierz "Tabela funkcji" i wybierz "Jedna lub więcej funkcji MS, MSMS lub MRM". Za pomocą strzałek w dół ustaw funkcję "Tof-MRM" dla każdego peptydu, wprowadzając trzy "przejścia" (kombinacje najliczniejszego prekursora i trzech jego najliczniejszych jonów fragmentacyjnych). 
		UWAGA: W trybie Tof-MRM najwyższą czułość uzyskuje się przy użyciu zaplanowanego podejścia MRM.</li>
		<li>W edytorze funkcji "Tof-MRM" wybierz jedno okno czasu retencji dla każdego peptydu (o długości co najmniej 1 minuty), ułożone zgodnie z kolejnością elucji peptydów. W edytorze funkcji "Tof-MRM" wstawić prekursor peptydu m/z i produkt m/z; wybrać okno izolacji poczwórnej jako »Niskie« (okno 4-Da) dla prekursora peptydów; wybierz stały czas skanowania 100 ms; i wybrać dwanaście różnych wartości energii zderzenia w zakresie 14-36 V, w następujący sposób: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 i 36, jak pokazano na przykładzie z rysunku 3. 
		UWAGA: W przypadku metody Tof-MRM opisanej powyżej, dla każdego piku chromatograficznego zbiera się co najmniej 10 punktów danych dla każdego przejścia przy każdym określonym CE. Aby zmniejszyć rozmiar pliku danych, wybierz opcję "Szeroki" (okno 6-Da) dla sygnału jonu fragmentu. Przykłady wartości zoptymalizowanych pod kątem CE przedstawiono w tabeli 2.</li>
		<li>Przeanalizować próbkę o długości 10 nM z dodatkiem PHO za pomocą opisanego powyżej testu Tof-MRM, wstrzykując 10 μl próbki (ilość załadowana na kolumnie wynosi 100 fmol dla każdego wzorca peptydu).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ustawienie końcowej metody akwizycji HS-MRM do kwantyfikacji peptydów za pomocą separacji ruchliwości jonów prekursorów peptydów
<ol>
	<li>W menu "Zbadaj" oprogramowania do akwizycji danych wyświetl wszystkie 11 śladów chromatograficznych wygenerowanych dla każdego CE dla każdego peptydu i zintegruj piki za pomocą przycisku "Integruj" z paska narzędzi "Opcje przetwarzania/Operacje"; najwyższy obszar piku wskaże najlepszą CE dla każdego przejścia.</li>
	<li>Porównaj wizualnie najlepsze obszary pików dla 3 fragmentów każdego peptydu i zachowaj tylko najlepsze "przejście" (jon fragmentu, który wytwarza najbardziej intensywny sygnał); Tabela 2 przedstawia najlepsze "przejścia" uzyskane z czterech peptydów PHO.</li>
	<li>Ustaw metodę HS-MRM zawierającą tylko jeden jon fragmentacyjny na peptyd. Należy użyć wartości CCS każdego prekursora peptydu ze zbioru danych LC/HDMSE.
	<ol>
		<li>Zmodyfikuj metodę Tof-MRM utworzoną w poprzedniej sekcji (sekcja 4), wybierając funkcję "HS-MRM" zamiast funkcji "Tof-MRM".</li>
		<li>W edytorze funkcji "HS-MRM" wprowadź następujące parametry związane z prekursorem: m/z, rozdzielczość kwadrupolowa: niska (4 Da), stan naładowania, wartość prekursora CCS i rozdzielczość prekursora CCS: niska. Dla jonu produktu wprowadź jego m/z, optymalną energię zderzenia, wybierz czas skanowania 0,4 s i wybierz ustawienie widma "Szerokie" (6 Da), aby uwzględnić wszystkie jego izotopy. Przykład końcowej metody akwizycji HS-MRM dla wszystkich czterech peptydów przedstawiono na rysunku 4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizować wszystkie próbki metodą HS-MRM, zaczynając od ślepej próby trawienia mAb (próbka bez wzbogaceń), a następnie 4 powtórzone wstrzyknięcia (po 10 μl każde) o następujących stężeniach: peptydy PHO 0,1, 1, 10 i 100 nM.</li>
</ol>
6. Tworzenie metody przetwarzania do analizy zbioru danych HS-MRM
<ol>
	<li>Utwórz metodę przetwarzania na potrzeby analizy zestawu danych HS-MRM.
	<ol>
		<li>W metodzie analizy utworzonej dla metody akwizycji danych "HS-MRM" należy kliknąć na zakładkę "Przeznaczenie" i wybrać "Zarządzaj komponentami".</li>
		<li>Z menu rozwijanego w sekcji "Typ eksperymentu" wybierz opcję "HS MS/MS / HS-MRM".</li>
		<li>Kliknij "Utwórz/Nowy wpis" i wprowadź następujące parametry w edytorze metod przetwarzania: czas retencji peptydu (RT), stan ładunku prekursora, prekursor m/z i czas dryfu prekursora (DT). Dla jonu fragmentacyjnego wprowadź jego stan m/z i naładowania, a następnie określ ślad "XIC" jako tryb ekstrakcji.</li>
		<li>W zakładce "Przeznaczenie" tej samej metody pozyskiwania "HS-MRM" kliknij na "Kwoty domyślne" i wprowadź następujące stężenia: peptydy PHO 0,1, 1, 10 i 100 nM.</li>
		<li>W polu "Ustawienia przetwarzania/ekstrakcji" należy wprowadzić następujące parametry: domyślna tolerancja masy, 10 ppm (dla m/z wszystkich jonów fragmentacyjnych) i domyślny czas dryftu, 5%; przykład metody przetwarzania peptydów PHO pokazano na rysunku 5.</li>
		<li>Jako typ kalibracji wybierz łącznik krzywej liniowej z ważeniem 1/X2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzać dane HS-MRM w celu zintegrowania wszystkich chromatogramów i skonstruowania krzywych kalibracyjnych każdego peptydu PHO.</li>
</ol>

<ol><li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+host-cell+proteins+in+biotherapeutic+proteins+by+comprehensive+online+two-dimensional+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry.</a> MAbs. 4, 24-44 (2012).</li>
<li>Schenauer, M. R., Flynn, G. C., Goetze, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+host-cell+protein+impurities+in+biotherapeutics+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification of host-cell protein impurities in biotherapeutics using mass spectrometry.</a> Anal Biochem. 428, 150-157 (2012).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+tracking+of+host-cell+proteins+during+monoclonal+antibody+purifications+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Comprehensive tracking of host-cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry.</a> MAbs. 6, 659-670 (2014).</li>
<li>Farrell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+host-cell+protein+analysis+using+two-dimensional+data+independent+LC-MS%28E%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative host-cell protein analysis using two-dimensional data independent LC-MS(E).</a> Anal Chem. 87, 9186-9193 (2015).</li>
<li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+low-abundance+host+cell+protein+impurities+in+high-purity+monoclonal+antibodies+down+to+1+ppm+using+ion+mobility+mass+spectrometry+coupled+with+multidimensional+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography.</a> Anal Chem. 87, 10283-10291 (2015).</li>
<li>Doneanu, C. E., et al. Improved identification and quantification of host cell proteins (HCPs) in biotherapeutics using liquid chromatography mass spectrometry. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bk-2015-1202.ch013?src=recsys">Technologies for therapeutic monoclonal antibody characterization, vol. 3: Defining the next generation of analytical and biophysical techniques</a>. , Washington DC. ACS Symposium series 1202 357-393 (2015).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+co-elution+of+host-cell+proteins+with+monoclonal+antibodies+during+protein+A+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Characterization of the co-elution of host-cell proteins with monoclonal antibodies during protein A purification.</a> Biotechnol Prog. 32, 708-717 (2016).</li>
<li>Reisinger, V., Toll, H., Mayer, R. E., Visser, J., Wolschin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometry+based+approach+to+host+cell+protein+identification+and+its+application+in+a+comparatibility+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometry based approach to host cell protein identification and its application in a comparatibility exercise.</a> Anal Biochem. , 1-6 (2014).</li>
<li>Madsen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+complete+characterization+of+host-cell+proteins+in+biotherapeutics+via+affinity+depletions%2C+LC%2FMS%2FMS+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Toward the complete characterization of host-cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC/MS/MS and multivariate analysis.</a> MAbs. 7, 1128-1137 (2015).</li>
<li>Giles, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+trevelling+wave-based+radio-frequency-only+stacked+ring+ion+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Applications of a trevelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18, 2401-2414 (2004).</li>
<li>Anderson, V., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometric+multiple+reaction+monitoring+assays+for+major+plasma+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 573-588 (2006).</li>
<li>Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18854821">Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 4, 1-14 (2008).</li>
<li>Picotti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+generation+of+selected+reaction-monitoring+assays+for+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes.</a> Nat Methods. 7, 43-46 (2010).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+proteins+using+peptide+immunoaffinity+enrichment+coupled+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li>
<li>Liebler, D. C., Zimmerman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+quantitation+of+proteins+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Targeted quantitation of proteins by mass spectrometry.</a> Biochemistry. 52, 3797-3806 (2013).</li>
<li>Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+for+absolute+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification.</a> J Vis Exp. (102), (2015).</li>
<li>Ebhardt, H. A., Sabido, E., Huttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22577020">Range of protein detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry in an unfractioned human cell culture lysate.</a> Proteomics. 12, 1185-1193 (2012).</li>
<li>Picotti, P., Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+dynamic+range+proteome+analysis+of+S.+cerevisiae+by+targetted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Full dynamic range proteome analysis of S. cerevisiae by targetted proteomics.</a> Cell. 138, 795-806 (2009).</li>
<li>Sherman, J., McKay, M. J., Ashman, K., Molloy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+specific+is+my+SRM%3A+the+issue+of+precursor+and+product+ion+reductancy%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">How specific is my SRM: the issue of precursor and product ion reductancy.</a> Proteomics. 9, 1120-1123 (2009).</li>
<li>Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+innacurate+and+imprecise+transitions+in+peptide+quantification+by+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated detection of innacurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry.</a> Clin Chem. 56, 291-305 (2010).</li>
<li>Rost, H., Malmstrom, L., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+tool+to+detect+and+avoid+redundancy+in+selected+reaction+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A computational tool to detect and avoid redundancy in selected reaction monitoring.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 540-549 (2012).</li>
<li>Bao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+correction+of+interference+in+SRM+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and correction of interference in SRM analysis.</a> Methods. 61, 299-303 (2013).</li>
<li>Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+collision+energy+optimization+on+the+measurement+of+peptides+by+selected+reaction+monitoring+%28SRM%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).</li>
<li>Mbasu, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quadrupole+and+time-of-flight+mass+spectrometry+for+peptide+MRM+based+translational+reserch+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advances in quadrupole and time-of-flight mass spectrometry for peptide MRM based translational reserch analysis.</a> Proteomics. 16, 2206-2220 (2016).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są pracownikami firmy Waters Corporation, która jest producentem kilku odczynników i przyrządów wykorzystanych w tym artykule.

>Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości (20 000 Rs) jest rutynowo stosowana do strukturalnej charakterystyki białek terapeutycznych na różnych platformach instrumentów. W przeciwieństwie do tego, kwantyfikacja białek na podstawie MS jest zwykle przeprowadzana przez SRM / MRM na tandemowych kwadrupolowych spektrometrach masowych o niskiej rozdzielczości (Rs ~ 1,000) przy użyciu peptydów sygnaturowych generowanych przez enzymatyczne rozszczepienie białek 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,Rozdział 22,23. Ponieważ jednowymiarowe rozdzielania chromatograficzne nie mogą w pełni rozpuścić złożonych mieszanin peptydów wytwarzanych w procesie trawienia enzymatycznego, koelucja peptydów jest częstym zjawiskiem, nawet w przypadku trawienia pojedynczych białek. W przypadku bardzo złożonych procesów trawienia białek (np. w celu ilościowego oznaczania 1-100 ppm HCP w obecności bogatego w peptydy tła wytwarzanego przez białko terapeutyczne) zakłócenia mogą mieć wpływ na czułość, dokładność lub liniowość testu SRM/MRM.
Testy SRM/MRM mają jednowymiarową selektywność, opierając się wyłącznie na "unikalnej" kombinacji mas prekursora/fragmentu. Z tego powodu testy te zawodzą w sytuacjach, gdy tło peptydów zmienia się nieoczekiwanie (np . w przypadku próbek biofarmaceutycznych uzyskanych z różnych procedur oczyszczania). Aby przezwyciężyć te ograniczenia, proponujemy tutaj test MRM o wysokiej selektywności (HS) zaimplementowany na hybrydowym spektrometrze mas o wysokiej rozdzielczości z kwadrupolem czasu przelotu (QTOF) z obsługą ruchliwości jonów (schemat instrumentu, patrz rysunek 6).
Przyrząd oddziela prekursory peptydu będącego przedmiotem zainteresowania od innych prekursorów peptydów spruwających (interferujących) w komórce ruchliwości jonów, izoluje pełną otoczkę izotopową prekursora w kwadrupolu i fragmentuje ją z ustalonym CE w komórce zderzeniowej. Sygnał wytwarzany przez najliczniejszy fragment peptydu jest dodatkowo wzmacniany przez regulację częstotliwości popychacza (Target Enhancement), która selektywnie wpycha do rurki przelotowej obszary masy będące przedmiotem zainteresowania, a nie wszystkie jony, jak w przypadku pełnego skanowania. Kwantyfikacja peptydów odbywa się przy użyciu sygnałów o wysokiej rozdzielczości MS (Rs ~ 30 000) wytwarzanych przez ten jon fragmentacyjny. W porównaniu z testami SRM/MRM, test HS-MRM oferuje dwa dodatkowe poziomy selektywności: jeden jest zapewniony przez separację ruchliwości jonów na poziomie prekursora, podczas gdy drugi jest oferowany przez zwiększoną rozdzielczość masową analizatora DOF. Wyniki uzyskane dzięki poprawie selektywności są widoczne na chromatogramach HS-MRM przedstawionych na rysunku 7, które są wolne od zakłóceń w trzech rzędach wielkości.
W przeciwieństwie do testów SRM/MRM, istnieje kilka parametrów, które można dostosować w celu optymalizacji testów HS-MRM: okno RT wokół prekursora peptydu (zwykle ustawiane na 0,2 min), okno izolacji kwadrupolowej (4 Da), okno czasu dryfu otaczające prekursor (± FWHM piku prekursora z odpowiedniego mobilogramu jonowego) oraz rozdzielczość MS jonu fragmentacyjnego (20 000-40 000). Testy HS-MRM są bardzo czułe: najniższa wykryta ilość dla każdego peptydu PHO to 1 femtomol na kolumnie (lub 0,1 nM pod względem stężenia peptydu). Biorąc pod uwagę peptyd MW (patrz Tabela 1 dla dokładnych MW), ilość wykryta na kolumnie jest rzędu 1-2 pg, podczas gdy kolumna jest obciążona znacznie większą ilością (2 μg) peptydów tła z trawienia mAb.
Biorąc pod uwagę masę cząsteczkową pełnowymiarowego białka PHO (97,2 kDa), z którego uzyskano peptydy wzbogacone, test jest w stanie wykryć 50 ppm zanieczyszczenia białkowego w obecności jonów tła o wysokiej obfitości. Dolne granice wykrywalności (5-10 ppm) są osiągalne dla HCP o niższej masie cząsteczkowej (10-20 kDa). Test obejmuje trzy rzędy wielkości (jak pokazano na krzywych kalibracyjnych z rysunku 8), co oznacza, że może mierzyć HCP w zakresie 1-1,000 ppm. Również odtwarzalność testów HS-MRM, zilustrowana w tabeli 3, bardzo dobrze pasuje do odtwarzalności małocząsteczkowych testów SRM/MRM, w których RSD o powierzchni pików są lepsze niż 15%.
Zbadaliśmy możliwości nowego testu do ilościowego oznaczania wzorców peptydów wzbogaconych w trawieniu przeciwciał monoklonalnych (mAb) i wykazaliśmy jego czułość i użyteczność w celu pokrycia szerokiego zakresu dynamiki (co najmniej trzy rzędy wielkości) zwykle spotykanego w analizie HCP. Wszystkie sześć wzorców peptydowych wykryto w stężeniach tak niskich, jak 0,1 nM (1 femtomol załadowany na kolumnę chromatograficzną o średnicy wewnętrznej 2,1 mm) w obecności tła peptydowego o wysokiej obfitości (2 μg trawienia mAb załadowanego na kolumnie). Dzięki zastosowaniu zarówno ukierunkowanego HRMS, jak i separacji prekursorów ruchliwości jonów, test HS-MRM ma ogromny potencjał, aby stać się szybkim, wysokowydajnym testem monitorowania wielu HCP w wielu partiach biofarmaceutyków.

Kwantyfikacja dużych biomolekuł (białek) w warunkach przemysłowych opiera się obecnie na testach immunologicznych (np. ELISA), głównie ze względu na kilka zalet: czułość, wysoką przepustowość, łatwość użycia i niski koszt na próbkę. W przypadku zastosowania do analizy zanieczyszczeń białkowych o niskiej liczebności (1-100 ppm białek komórek gospodarza (HCP)) obecnych w terapiach białkowych, te testy biologiczne zazwyczaj dostarczają całkowitego stężenia HCP (zwykle wyrażonego w ppm lub ng HCP / mg mAb), ale nie mogą zidentyfikować i zmierzyć poszczególnych zanieczyszczeń HCP. Ostatnio opracowano kilka testów opartych na MS w celu uzupełnienia testów ELISA lub dostarczenia informacji, których testy ELISA nie są w stanie zaoferować1,2,3,4,5,6,7,8,9. Ze względu na złożoność próbki i wymóg wykrywania peptydów HCP w szerokim zakresie dynamicznym stężenia (co najmniej 3 rzędy wielkości), wielowymiarowe metody chromatograficzne umożliwiające ekstensywne frakcjonowanie próbek są tradycyjnie stosowane w celu identyfikacji HCP o niskiej liczebności1,2,3,4,5,6,7.
Naturalnym krokiem po identyfikacji i walidacji HCP jest śledzenie (monitorowanie) HCP w wielu partiach biofarmaceutyków. W tej sytuacji zaproponowano jednowymiarowe metody LC/MS w celu poprawy przepustowości próbki8,9. Jednak na dokładność i zakres dynamiczny pomiarów HCP w teście 1D LC/MS może mieć wpływ przytłaczająca obecność peptydów biofarmaceutycznych. W porównaniu z separacją wielowymiarową, potencjał zakłóceń sygnału 19,20,21,22 jest zwiększony w jednowymiarowej separacji chromatograficznej, ponieważ zwiększa się prawdopodobieństwo koelucji większej liczby prekursorów peptydów. Włączenie ortogonalnych środków do rozdzielania prekursorów peptydów bez wydłużania czasu rozdzielania chromatograficznego byłoby wyraźnie korzystne. Ruchliwość jonów fali przemieszczającej się (TWIM)10 ma zdolność rozpoznawania zatłoczonych widm MS w ciągu milisekund. Podczas elucji pojedynczego peptydu można przeprowadzić około 500 separacji ruchliwości, zakładając pełną szerokość piku chromatograficznego wynoszącą 10 s i biorąc pod uwagę, że czas trwania separacji IM w przyrządzie do pomiaru ruchliwości jonów wynosi 20 ms.
Testy spektrometryczne mas do kwantyfikacji białek zostały pomyślnie opracowane w ciągu ostatniej dekady przy użyciu dobrze przyjętego podejścia do monitorowania wybranych (wielokrotnych) reakcji (metoda SRM/MRM) wdrożonego na tandemowych spektrometrach masowych11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Jednym z ograniczeń tego testu spektrometrii mas o niskiej rozdzielczości jest zjawisko interferencji19,20,21,22 obserwowane, gdy peptyd będący przedmiotem zainteresowania ma "taką samą" masę prekursora i fragmentu, jak inne peptydy koeluujące obecne w próbce (w oknie 1-Da). Istnieją dwa sposoby poprawy dokładności metod SRM/MRM: jedna opcja obejmuje dodatkowy etap separacji na poziomie prekursora w celu usunięcia zakłócających jonów prekursorowych, podczas gdy druga opcja polega na zwiększeniu rozdzielczości MS wykrywania prekursora/fragmentu, aby uniknąć nakładania się sygnałów MS. Opisany tutaj tryb akwizycji MRM o wysokiej selektywności (HS) wykorzystuje oba te podejścia poprzez sprzężenie separacji ruchliwości jonów prekursorów peptydów z detekcją MS o wysokiej rozdzielczości (Rs ~ 30 000) MS fragmentów peptydów. Opisany tutaj test obejmuje co najmniej trzy rzędy wielkości, co jest zakresem dynamiki zwykle obserwowanym w eksperymentach proteomicznych SRM/MRM17,18,24.
Użyteczność testu HS-MRM do kwantyfikacji HCP została wykazana poprzez monitorowanie liniowości sygnału wytwarzanego przez sześć wzorców peptydów wzbogaconych o różne stężenia (zakres od 0,1 do 100 nM) w trawieniu przeciwciał monoklonalnych.

<table><tbody><tr><td>Spektrometr masowy Vion IMS Qtof</td><td>Wody</td><td>186009214</td><td></td></tr><tr><td>Acquity Klasa H Menedżer rozpuszczalników czwartorzędowych (QSM)</td><td>Wody</td><td>186015041</td><td></td></tr><tr><td>Acquity Menedżer próbek FTN klasy H (SM)</td><td>Wody</td><td>186015040</td><td></td></tr><tr><td>Acquity Menedżer kolumn klasy H (CM)</td><td>Wody</td><td>186015043</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl (ACN)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40867-50G-F</td><td></td></tr><tr><td>2,1 x 150 mm CSH C18 Kolumna UPLC, 1,8 i mikro; m cząstki</td><td>Wody</td><td>186005298</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy, dodatek eluentowy do LC/MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56302-10X1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Hi3 fosforylaza królicza (PHO) MassPREP standard</td><td>Wody</td><td>186006011</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I-1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki LC (fiolki szklane 12x32 mm, zakręcana szyjka)</td><td>Wody</td><td>186000327c</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli octanu enkefaliny Leucyna</td><td>Probówka Sigma Aldrich</td><td>L9133-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Białko LoBind 2,0 ml (2x50)</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka enzymów trypsyny/Lys-C, klasa masowa (5 x 20 i mikro; g)</td> <td>Promega</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Woda, klasa LC / MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39253-1L-R</td><td></td></tr></tbody></table>

test hs-mrm do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej mobilność jonów spektrometria mas qtof

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

Analiza niskopoziomowych (1-100 ppm) zanieczyszczeń białkowych (np. białek komórek gospodarza (HCP)) w bioterapeutykach białkowych jest trudnym testem wymagającym wysokiej czułości i szerokiego zakresu dynamiki. Testy ilościowe białek oparte na spektrometrii mas zazwyczaj obejmują trawienie białek, po którym następuje monitorowanie reakcji selektywnej/monitorowanie wielu reakcji (SRM/MRM) kwantyfikacja peptydów przy użyciu tandemowego kwadrupolowego spektrometru masowego o niskiej rozdzielczości (Rs ~ 1,000). Jednym z ograniczeń tego podejścia jest zjawisko interferencji obserwowane, gdy badany peptyd ma "taką samą" masę prekursora i fragmentu (pod względem wartości m/z) jak inne peptydy koeluujące obecne w próbce (w oknie 1-Da). Aby uniknąć tego zjawiska, proponujemy alternatywne podejście spektrometryczne mas, test MRM o wysokiej selektywności (HS), który łączy separację ruchliwości jonów prekursorów peptydów z wykrywaniem fragmentów peptydów w wysokiej rozdzielczości (Rs ~ 30 000) MS. Zbadaliśmy możliwości tego podejścia w zakresie ilościowego określania standardów peptydów o niskiej liczebności wzbogaconych w trawienie przeciwciał monoklonalnych (mAb) i wykazaliśmy, że ma ono czułość i zakres dynamiki (co najmniej 3 rzędy wielkości) zwykle osiągane w analizie HCP. Wszystkie sześć wzorców peptydowych wykryto w stężeniach tak niskich, jak 0,1 nM (1 femtomol załadowany na kolumnę chromatograficzną o średnicy wewnętrznej 2,1 mm) w obecności tła peptydowego o wysokiej obfitości (2 μg trawienia mAb załadowanego na kolumnie). Biorąc pod uwagę MW fosforylazy królika (97,2 kDa), z której poprowadzono peptydy wzbogacone, LOQ tego testu jest niższy niż 50 ppm. Względne odchylenia standardowe (RSD) powierzchni pików (n = 4 kontrpróby) były mniejsze niż 15% w całym badanym zakresie stężeń (0,1-100 nM lub 1-1000 ppm) w tym badaniu.

Indywidualne sekwencje sześciu standardów peptydowych fosforylazy b zawartych w mieszaninie peptydów PHO przedstawiono w Tabeli 1 wraz z ich czasami retencji oraz najliczniejszymi prekursorami zaobserwowanymi w eksperymencie HDMSE. Pierwszym krokiem w opracowaniu analizy MRM o wysokiej selektywności (HS) jest pozyskanie zbioru danych HDMSE w celu ustalenia czasów elucji każdego peptydu PHO wraz z odpowiadającym mu najliczniejszym prekursorem oraz trzema najliczniejszymi fragmentami. Rycina 2 przedstawia widma HDMSE uzyskane dla jednego z peptydów PHO (Pep 6) dodanego do trawienia infliksymabu. Po ustaleniu 3 najlepszych „ przejść” (kombinacji mas prekursora i fragmentu) dla każdego peptydu przeprowadzany jest eksperyment Tof-MRM w celu znalezienia optymalnej energii kolizyjnej, która zmaksymalizuje sygnały generowane dla każdego peptydu. Wyniki eksperymentu optymalizacji CE podsumowano w Tabeli 2. Końcowa analiza HS-MRM (patrz Rycina 4) zachowuje jedynie najlepsze „przejście” dla każdego peptydu i jest wykorzystywana do analizy wszystkich wzbogaconych próbek. Przykłady chromatogramów HS-MRM wygenerowanych dla 4 peptydów PHO dla wszystkich badanych stężeń przedstawiono na Rycinie 7. Na Rycinie 8 przedstawiono cztery krzywe kalibracyjne uzyskane dla każdego peptydu po całkowaniu pików HS-MRM wyróżnionych na Rycinie 7. Dodatkowo względne odchylenie standardowe pola powierzchni piku, obliczone na podstawie 4 powtórnych wstrzyknięć, podsumowano w 4 tabelach przedstawionych w Tabeli 3.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Peptyd</td>
			<td colspan="2">Peptyd</td>
			<td >Retencja</td>
			<td colspan="4">Stany ładunkowe</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >ID</td>
			<td colspan="2">Sekwencja</td>
			<td >czas (min)</td>
			<td >+ 1</td>
			<td >+ 2</td>
			<td >+ 3</td>
			<td >+ 4</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Pep 1</td>
			<td colspan="2">VLYPNDNFFEGK</td>
			<td >19.4</td>
			<td >142.6951</td>
			<td >721.8512</td>
			<td >481.569</td>
			<td >361.4292</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Pep 2</td>
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td>
			<td >16.0</td>
			<td >1874.9065</td>
			<td >937.9569</td>
			<td >625.6404</td>
			<td >469.4821</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Pep 3</td>
			<td colspan="2">IGEEYISDLDQLRK</td>
			<td >18.9</td>
			<td >1678.8646</td>
			<td >839.9360</td>
			<td >560.2931</td>
			<td >420.4716</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Pep 4</td>
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td>
			<td >21.1</td>
			<td >140.7369</td>
			<td >720.8721</td>
			<td >480.9172</td>
			<td >360.9397</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Pep 5</td>
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td>
			<td >19.7</td>
			<td >1890.080</td>
			<td >945.5076</td>
			<td >630.6742</td>
			<td >473.2574</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Pep 6</td>
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td>
			<td >17.7</td>
			<td >1262.5939</td>
			<td >631.806</td>
			<td >421.5362</td>
			<td >316.4039</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1. Standardy peptydów PHO zawarte w mieszaninie Mass PREP dodanej do trawienia infliksymabu.Czasy retencji peptydów oraz ich najliczniejsze prekursory (wyróżnione pogrubieniem) przedstawiono w formie tabelarycznej.
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Peptyd</td >
			<td colspan="2">Peptyd</td >
			<td >Retencja</td >
			<td colspan="2">Prekursor peptydu</td >
			<td colspan="3">Najliczniejsze jony fragmentowe/ładunek</td >
			<td >Optimum</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >ID</td >
			<td colspan="2">Sekwencja</td >
			<td >czas (min)</td >
			<td >m/z i ładunek</td >
			<td >Czas dryftu (ms)</td >
			<td >I</td >
			<td >II</td >
			<td >III</td >
			<td >CE (V)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Pep 2</td >
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td >
			<td >16.0</td >
			<td >625.6404 (+3)</td >
			<td >6.2</td >
			<td >714.3781 (+1)</td >
			<td >807.417 (+2)</td >
			<td >827.4621 (+1)</td >
			<td >24</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Pep 4</td >
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td >
			<td >21.1</td >
			<td >720.8721 (+2)</td >
			<td >7.5</td >
			<td >865.4050 (+1)</td >
			<td >964.4734 (+1)</td >
			<td >1214.568 (+1)</td >
			<td >2</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Pep 5</td >
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td >
			<td >19.7</td >
			<td >630.6742 (+3)</td >
			<td >6.3</td >
			<td >642.3570 (+1)</td >
			<td >689.8391 (+2)</td >
			<td >832.4236 (+2)</td >
			<td >20</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Pep 6</td >
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td >
			<td >17.7</td >
			<td >631.806 (+2)</td >
			<td >7.0</td >
			<td >830.3931 (+1)</td >
			<td >945.420 (+2)</td >
			<td >1016.4571 (+1)</td >
			<td >24</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2. Wyniki eksperymentu optymalizacji Tof-MRM: wskazano trzy najliczniejsze fragmenty każdego peptydu PHO ilościowo określonego w niniejszym badaniu, wraz z odpowiadającą im zoptymalizowaną energią kolizyjną.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stężenie</td>
			<td>Ilość</td>
			<td colspan="6">Powierzchnie pików Pep 2 (Tabela 3A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(nM)</td>
			<td>na kolumnie (fmoli)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Średnia</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>439</td>
			<td>462</td>
			<td>431</td>
			<td>456</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>5121</td>
			<td>4842</td>
			<td>5198</td>
			<td>4842</td>
			<td>5001</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>63853</td>
			<td>64279</td>
			<td>66111</td>
			<td>62509</td>
			<td>64188</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>612392</td>
			<td>605553</td>
			<td>613229</td>
			<td>611004</td>
			<td>610545</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stężenie</td>
			<td>Ilość</td>
			<td colspan="6">Powierzchnie pików Pep 4 (Tabela 3B)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(nM)</td>
			<td>na kolumnie (fmoli)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Średnia</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>275</td>
			<td>359</td>
			<td>325</td>
			<td>288</td>
			<td>312</td>
			<td>12.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>3559</td>
			<td>3694</td>
			<td>3287</td>
			<td>3754</td>
			<td>3574</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>45259</td>
			<td>45775</td>
			<td>42976</td>
			<td>45548</td>
			<td>44890</td>
			<td>2.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>459374</td>
			<td>467927</td>
			<td>436272</td>
			<td>458994</td>
			<td>455642</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stężenie</td>
			<td>Ilość</td>
			<td colspan="6">Powierzchnie pików Pep 5 (Tabela 3C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(nM)</td>
			<td>na kolumnie (fmoli)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Średnia</td>
			<td>Względne odchylenie standardowe (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>3194</td>
			<td>3243</td>
			<td>3202</td>
			<td>3257</td>
			<td>3224</td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>31464</td>
			<td>31150</td>
			<td>31464</td>
			<td>31433</td>
			<td>31378</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>313638</td>
			<td>320712</td>
			<td>311943</td>
			<td>311943</td>
			<td>314559</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>2845736</td>
			<td>2840031</td>
			<td>2882006</td>
			<td>2864052</td>
			<td>2857956</td>
			<td>0.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stężenie</td>
			<td>Ilość</td>
			<td colspan="6">Powierzchnie piku Pep 6 (Tabela 3D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(nM)</td>
			<td>na kolumnie (fmoli)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Średnia</td>
			<td>Względne odchylenie standardowe (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>583</td>
			<td>440</td>
			<td>440</td>
			<td>488</td>
			<td>13.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>6429</td>
			<td>6429</td>
			<td>6848</td>
			<td>6623</td>
			<td>6582</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>71295</td>
			<td>70400</td>
			<td>71563</td>
			<td>70400</td>
			<td>70915</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>707640</td>
			<td>707640</td>
			<td>694461</td>
			<td>729490</td>
			<td>709808</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3. Tabela zawierająca pola pików chromatogramów HS-MRM zarejestrowanych dla 4 peptydów PHO (Pep 2, 4, 5 i 6) dla każdego wtrysku LC/MS (16 analiz LC/MS i 4 badane stężenia). 
Względne odchylenie standardowe dla wszystkich peptydów w całym badanym zakresie stężeń było mniejsze niż 15%.
<img alt="Schemat procedury akwizycji niezależnej od danych; diagram z optymalizacją energii kolizyjnej, konfiguracją HS-MRM." src="/files/ftp_upload/55325/55325fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat procesu podsumowujący trzy kroki niezbędne do skonfigurowania metody akwizycji HS-MRM. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykres spektrometrii mas analizujący jony próbek, dane spektralne, porównanie kanałów niskiej i wysokiej energii." src="/files/ftp_upload/55325/55325fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 2. Przykład danych HDMSE: 
(A) Spektrum niskiej energii wykazujące jon prekursorowy Pep 6. (B) Spektrum fragmentacji wysokiej energii tego samego peptydy, prezentujące 3 najbardziej obfite jony fragmentacyjne (zakreślone okręgiem), wybrane do optymalizacji energii kolizyjnej w trybie Tof-MRM. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Tabela przejść MRM, opisująca układ eksperymentalny i dane dla analizy spektrometrią mas." src="/files/ftp_upload/55325/55325fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 3. Parametry wykorzystane do konfiguracji eksperymentu optymalizacji Tof-MRM. 
Dla każdego przejścia przetestowano jedenaście energii kolizyjnych (w zakresie od 16 do 36 V). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres analizy danych spektrometrii mas; funkcja MRM o wysokiej selektywności; szczegóły czasu trwania eksperymentu." src="/files/ftp_upload/55325/55325fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 4. Przykład końcowej metody HS-MRM. 
Dla każdego „przejścia” wymaganych jest kilka parametrów, w tym m/z prekursora peptydowego, jego stan ładunku i czas dryfu mobilności jonowej, m/z najbardziej obfitego jonu fragmentacyjnego, optymalna energia kolizyjna oraz czas akwizycji MS. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Tabela danych spektrometrii mas, konfiguracja analizy MS/MS, specyfikacja chromatogramu, tryb ekstrakcji XIC." src="/files/ftp_upload/55325/55325fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 5. Ustawienia zastosowane w metodzie przetwarzania danych dla analizy zbioru danych HS-MRM. 
Każdy peptyd jest monitorowany za pomocą pojedynczego „przejścia” (transition), definiowanego przez m/z prekursora peptydowego, stan ładunku i oczekiwany czas retencji, wraz z m/z najliczniejszego fragmentu oraz jego stanem ładunku. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat spektrometrii mas z rozdziałem w oparciu o mobilność jonów, kwadrupolem oraz system detekcji jonów." src="/files/ftp_upload/55325/55325fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 6. Schemat spektrometru mas z mobilnością jonów. 
W trybie akwizycji HS-MRM prekursory peptydów poddawanych ilościowemu oznaczeniu są oddzielane od innych współeluujących (interferujących) prekursorów peptydowych w komórce mobilności jonowej, izolowane przez kwadrupol, a następnie fragmentowane przy stałej energii kolizyjnej w komórce kolizyjnej. Sygnał generowany przez fragmenty jonowe peptydów jest wzmacniany poprzez regulację częstotliwości wypychacza, a ilościowe oznaczenie peptydów jest przeprowadzane przy użyciu wysokiej rozdzielczości spektrometrii mas (&gt;30 0) sygnały generowane przez najbardziej intensywny jon fragmentacyjny każdego peptydu. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig6large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Chromatogramy spektrometrii mas czterech próbek, porównujące intensywności jonów dla ilościowego oznaczenia w zakresie 1–100 fmoli." src="/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 7. Chromatogramy HS-MRM zarejestrowane dla 4 peptydów PHO w 4 różnych stężeniach obejmujących 3 rzędy wielkości (0,1, 1, 10 i 10 nM). 
(A) chromatogramy Pep 2, (B) chromatogramy Pep 4, (C) chromatogramy Pep 5 oraz (D) chromatogramy Pep 6. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres analizy ilościowej, wartości R² dla kalibracji, tabela danych regresji liniowej." src="/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 8. Krzywe kalibracyjne dla 4 peptydów PHO w 4 różnych stężeniach (0,1, 1, 10 i 10 nM). 
Tabele znajdujące się pod każdą krzywą przedstawiają poszczególne pola powierzchni pików (wartości Y) zarejestrowane dla każdego wstrzyknięcia, natomiast druga kolumna w każdej tabeli pokazuje procentowe odchylenie od oczekiwanej odpowiedzi liniowej. (A) kalibracja Pep 2, (B) kalibracja Pep 4, (C) kalibracja Pep 5 oraz (D) kalibracja Pep 6. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj opisujemy test chromatograficzny połączony z separacją ruchliwości jonów prekursorów peptydów, po której następuje detekcja MS w wysokiej rozdzielczości (~30 000) MS dla kwantyfikacji wzorców peptydów wzbogaconych w trawieniu przeciwciał monoklonalnych.

Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Ogólnym celem analizy HS-MRM jest zmniejszenie zjawiska interferencji w trybie MRM, które wpływa na kwantyfikację peptydów lub białek, poprzez połączenie rozdziału prekursorów peptydowych za pomocą mobilności jonowej z detekcją jonów fragmentacyjnych przy użyciu spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości. Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w obszarze charakterystyki biofarmaceutyków, a także w kwantyfikacji biomarkerów białkowych i peptydowych oraz w proteomice ilościowej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykrycia niskostężnych białek komórek gospodarza, które mogą występować w białkach biofarmaceutycznych.Najpierw kliknij opcję utworzenia metody analizy w oprogramowaniu do akwizycji danych i wybierz generowanie oraz akwizycję i przetwarzanie metody. Wpisz nazwę i opis metody, przejdź do folderu metod i kliknij dalej. Jako typ analizy wybierz peptide map IMS i kliknij dalej.Następnie należy wybrać aktualną konfigurację systemu, a następnie kliknąć „dalej” i „zakończ”. W nowo utworzonej metodzie należy przejść do karty instrumentów, wybrać binarny menedżer rozpuszczalników i edytować ustawienia gradientu, aby uzyskać rozdzielenie peptydów przy szybkości przepływu 0,2 ml/min. Należy zastosować gradient rozcieńczenia od 1 do 40% rozpuszczalnika B w czasie 30 minut, po czym następuje dwuminutowe płukanie kolumny oraz 10-minutowa równowaga, przy całkowitym czasie analizy wynoszącym 45 minut.Następnie wybierz menedżera próbek i ustaw temperaturę próbek na 10 °C oraz temperaturę kolumny na 60 °C. W zakładce instrumentów wybierz instrument Vion IMS QTof. W sekcji ustawień wybierz czułość (sensitivity) jako tryb analizatora i wprowadź wartości: 3 kV dla napięcia kapilary, 100 °C dla temperatury źródła, 250 °C dla temperatury desolwatacji, 50 L/h dla przepływu gazu stożkowego oraz 500 L/h dla przepływu gazu desolwatacyjnego.Kliknij kartę eksperymentu i wybierz wysoką rozdzielczość MSE jako tryb. Następnie wprowadź 100 dla niskiej masy, 2000 dla wysokiej masy oraz 0,4 seconds dla czasu skanowania. W sekcji energii kolizyjnej wpisz sześć electron volts dla ustawienia niskiej energii i wybierz rampę wysokiej energii od 15 do 40 electron volts.W przypadku czasu akwizycji należy ustawić niestandardowy czas trwania od 5 do 30 minut. Następnie należy kliknąć kartę opcji i wybrać tryb automatycznej korekcji blokady (automatic lock correction mode) z interwałem automatycznej korekcji blokady wynoszącym pięć minut. Następnie należy wybrać opcję kontynuowania z korekcją blokady (continue with lock correction) i upewnić się, że automatyczna kontrola detektora (automatic detector check) jest wyłączona.W aktualnym menu konfiguracji systemu wybierz instrument Vion IMS QTof i kliknij narzędzia (tools). Wprowadź 3 kV dla napięcia kapilary, 40 V dla stożka próbkowania (sampling cone), 100 V dla przesunięcia źródła (source offset), 100 °C dla temperatury źródła, 250 °C dla temperatury desolwatacji, 50 L/h dla przepływu gazu w stożku, 500 L/h dla przepływu gazu desolwatacyjnego oraz 3 kV dla napięcia kapilary referencyjnej. Przeanalizuj wcześniej przygotowaną próbkę z dodanym standardem o stężeniu 10 nM, wykorzystując opisany wcześniej test LC-HDMSE poprzez wstrzyknięcie 10 µL próbki do instrumentu.Poniżej przedstawiono poszczególne sekwencje sześciu standardów peptydowych fosforylazy B zawartych w sztucznej mieszaninie peptydowej, wraz z ich czasami retencji oraz najliczniejszymi prekursorami zaobserwowanymi w eksperymencie HDMSE. Tutaj wyświetlone są widma HDMSE uzyskane dla jednego z peptydów dodanych do trawienia Infliximabu. W oprogramowaniu do akwizycji danych kliknij „create analysis method”, a następnie wybierz „generate and acquire and process method”.Wpisz nazwę i opis metody, przejdź do folderu metody i kliknij „dalej”. W polu typu analizy wybierz „ilościowa”, zaznacz „Quantify Assay Tof 2D Chromatographic” i kliknij „dalej”. Następnie wybierz aktualną konfigurację systemu, kliknij „dalej”, a potem „zakończ”.Kliknij kartę instrumentów w nowo utworzonej metodzie. Wybierz binarny menedżer rozpuszczalników i zmień ustawienia gradientu, aby uzyskać separację peptydów przy przepływie 0,2 milliliters per minute. Zastosuj rozcieńczenie gradientowe od 1 do 40% solvent B w ciągu 30 minut, następnie dwuminutowe płukanie kolumny i 10-minutową ekwilibrację, przy całkowitym czasie analizy wynoszącym 45 minut.W zakładce instrumentów wybierz menedżera próbek i ustaw temperaturę próbki na 10 °C oraz temperaturę kolumny na 60 °C. Następnie wybierz instrument Vion IMS QTof i w sekcji ustawień wybierz czułość (sensitivity) dla trybu analizatora. Następnie wprowadź 3 kV dla napięcia kapilary, 100 °C dla temperatury źródła, 250 °C dla temperatury desolwatacji, 50 L/h dla przepływu gazu stożkowego oraz 500 L/h dla przepływu gazu desolwatacyjnego.Kliknij kartę eksperymentu i w polu typu eksperymentu wybierz tablicę funkcji obejmującą jedną lub więcej funkcji MS, MSMS lub MRM. Usuń domyślną funkcję akwizycji, kliknij dodaj plus MRM i edytuj parametry okna retencji w sekcji czasu uruchomienia. W edytorze funkcji Tof MRM wprowadź główny stosunek ładunku prekursora peptydowego, wybierz niską rozdzielczość dla prekursora i wprowadź stan ładunku prekursora.Następnie wprowadź wartość 16 eV dla ładunku głównego produktu w odniesieniu do początkowej energii kolizyjnej, 0,1 s dla stałego czasu skanowania oraz opcję wide dla kolumny widma. Używając przycisku duplikowania, dodaj 10 kolejnych przejść MRM, stosując różne wartości energii kolizyjnej w zakresie od 18 do 36 eV. Po ustaleniu trzech najlepszych przejść dla każdego peptydu przeprowadzono eksperyment Tof MRM, aby znaleźć optymalną energię kolizyjną pozwalającą na maksymalizację sygnałów generowanych dla każdego peptydu.Następnie skonfiguruj metodę HS-MRM zawierającą tylko jeden jon fragmentacyjny na peptyd. Zmodyfikuj wcześniej utworzoną metodę Tof MRM, wybierając funkcję HS-MRM zamiast funkcji Tof MRM. W edytorze funkcji HS-MRM wprowadź główny stosunek ładunku, wybierz niską rozdzielczość dla prekursora oraz wprowadź stan naładowania prekursora.Następnie wprowadź wartość CCS prekursora i wybierz niską rozdzielczość CCS prekursora. Dla jonu produktu wprowadź jego główny stosunek masy do ładunku, wybierz optymalną energię kolizyjną, ustaw czas skanowania na 0,4 sekundy oraz wybierz szerokie ustawienie widma, aby uwzględnić wszystkie jego izotopy. Końcowa analiza HS-MRM zachowuje tylko najlepsze przejście dla każdego peptydy i jest wykorzystywana do analizy wszystkich wzbogaconych próbek.W metodzie analizy utworzonej dla metody akwizycji danych HS-MRM kliknij kartę celu i wybierz zarządzanie komponentami. Z menu rozwijanego pod typem eksperymentu wybierz opcję HS MSMS/HS MRM. Kliknij utwórz i wprowadź nazwę komponentu, oczekiwany czas retencji, okno czasu ekstrakcji oraz główny stosunek masy do ładunku prekursora.Wybierz tryb ekstrakcji XIC i wpisz oczekiwaną wartość CCS. Dla jonu fragmentowego wprowadź jego stan ładunku oraz główny stosunek masy do ładunku. Następnie wprowadź wszystkie komponenty peptydowe monitorowane przez analizę HS-MRM.W zakładce celu tej samej metody akwizycji HS-MRM kliknij w wartości domyślne i wprowadź 0,1, 1, 10 i 100 nanomolar dla wszystkich komponentów faux peptide. Po wprowadzeniu pierwszej wartości kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję wypełnij w dół, aby wprowadzić tę samą koncentrację dla wszystkich komponentów. Powtórz tę samą procedurę dla wszystkich czterech stężeń krzywej kalibracyjnej.Przejdź teraz do karty przetwarzania i kliknij ustawienia ekstrakcji. W polu tolerancji masy wpisz 10 PPM. Następnie kliknij tolerancję czasu dryftu CCS i wprowadź 5% jako tolerancję CCS.W zakładce przetwarzania wybierz ustawienia przetwarzania piku. W sekcji wygładzania (smooth) wybierz średnią (mean) jako algorytm wygładzania, wartość jeden jako połowę szerokości (half width) oraz wartość jeden jako liczbę iteracji. W sekcji całkowania (integrate) upewnij się, że zaznaczone są obie opcje: automatyczna szerokość piku (automatic peak width) oraz automatyczne wykrywanie (automatic detection).Następnie w karcie przetwarzania (processing) wybierz ustawienia przesiewania celowanego (targeted screen) i zaznacz opcję najbliższą RT (closest to RT) w oknie czasu retencji (RT window). Następnie wprowadź 0,2 minutes jako tolerancję czasu retencji. Wybierz ustawienia ilościowe (quantitation settings), a w menu kalibracji (calibrate) wybierz linear dla typu dopasowania krzywej kalibracyjnej, one over x squared dla typu ważenia, concentration dla typu wartości komponentu, millimoles per liter dla jednostek wartości komponentu oraz none dla opcji obliczania punktów kalibracyjnych poprzez uśrednianie.W menu kwantyfikacji wybierz obszar (area) jako wartość odpowiedzi. Tutaj przedstawiono przykłady chromatogramów HS-MRM wygenerowanych dla sztucznych peptydów przy wszystkich stężeniach. Tutaj wyświetlone są krzywe kalibracyjne uzyskane dla każdego peptydu po całkowaniu pików HS-MRM.Względne odchylenie standardowe pola powierzchni piku obliczone na podstawie czterech powtórzeń wstrzykiwań zostało tutaj podsumowane. Ponieważ wysokoselektywny test MRM łączy w sobie separację prekursorów za pomocą mobilności jonów oraz ukierunkowaną detekcję spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, posiada on ogromny potencjał, aby stać się szybkim, wysokoprzepływowym testem monitorującym wiele białek komórek gospodarza w różnych partiach produktów biofarmaceutycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak skonfigurować wysokoselektywny test MRM na instrumencie Vion IMS QTof.

an-hs-mrm-assay-for-quantification-host-cell-proteins-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Metoda SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies) łączy wzbogacanie peptydów metodą powinowactwa z masową spektrometrią z rozcieńczeniem izotopem stabilnym (MRM-MS), aby zapewnić ilościowe pomiary peptydów jako substytutów odpowiadających im białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół z wykorzystaniem cząstek magnetycznych w formacie częściowo zautomatyzowanym.

Ilościowe oznaczanie białek z wykorzystaniem immunoafinityjnego wzbogacania peptydów sprzężonego ze spektrometrią mas

Testy biochemiczne z rekombinowanymi ludzkimi cząsteczkami MHC II mogą dostarczyć szybkich, ilościowych wglądów w identyfikację, delecję lub projektowanie epitopów immunogennych. Tutaj opisany jest test wiązania peptyd-MHC II skalowany do płytek 384-dołkowych. Ten opłacalny format powinien okazać się przydatny w dziedzinie deimmunizacji białek oraz projektowania i opracowywania szczepionek.

Wysokoprzepustowy test wiązania MHC II do analizy ilościowej epitopów peptydowych

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać bezwzględne testy kwantyfikacyjne docelowych białek w złożonych próbkach biologicznych przy użyciu monitorowania wybranych reakcji. Wykorzystano go do dokładnego ilościowego określenia białek szlaku sygnałowego chemotaksji makrofagów myszy. Szczegółowo opisano wybór peptydów docelowych, opracowywanie testów oraz testy jakościowe i ilościowe.

Spektrometria mas do monitorowania wybranych reakcji do bezwzględnej kwantyfikacji białek

Opisujemy wysokoprzepustowy, multipleksowy i celowany test proteomicznego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), opracowany z potencjałem do klinicznego tłumaczenia. Test może określić ilościowo potencjalne markery i czynniki ryzyka neurodegeneracji, takie jak warianty apolipoproteiny E (E2, E3 i E4), oraz zmierzyć ich ekspresję alleli.

Wysokoprzepustowy, multipleksowany i ukierunkowany test proteomiczny, płyn mózgowo-rdzeniowy do ilościowego określania biomarkerów neurodegeneracyjnych i statusu izoform apolipoproteiny E

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Ten protokół opisuje użycie chromatografii jonowymiennej o wysokiej specyficzności z wielokątowym rozpraszaniem światła do dokładnego wyznaczania masy molowej białek, kompleksów białkowych i peptydów w heterogenicznej próbce. Metoda ta jest cenna dla oceny jakości, a także dla scharakteryzowania natywnych oligomerów, wariantów ładunku i próbek białek mieszanych.

Chromatografia jonowymienna (IEX) sprzężona z wielokątowym rozpraszaniem światła (MALS) w celu separacji i charakterystyki białek

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Przedstawiono protokół wzbogacania białek komórek gospodarza (HCP) z produktów leczniczych (DP) i wykrywania peptydów za pomocą kulek wzbogacających proteom. Metodę demonstruje się przy użyciu wyprodukowanej we własnym zakresie substancji leczniczej (DS) opartej na przeciwciałach monoklonalnych (mAb), która jest dobrze scharakteryzowanym materiałem referencyjnym do oceny i porównywania różnych metod pod względem wydajności.

Analiza białek komórek gospodarza przy użyciu kulek wzbogacających w połączeniu z ograniczonym trawieniem

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Poznaj metodę HS-MRM do ilościowego oznaczania białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach z wykorzystaniem chromatografii cieczowej i spektrometrii mas QTOF. Technika ta umożliwia wykrywanie niskostężonych peptydów z wysoką czułością.

Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF (Wideo) | JoVE Journal

Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF

Przeglądaj więcej filmów