Wizualizacja migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodku danio pręgowanego za pomocą wielofotonowego obrazowania poklatkowego

Zacznij od żywego, zdechorionowanego transgenicznego zarodka danio pręgowanego osadzonego w agarozie o niskiej temperaturze topnienia i umieszczonego w komorze wypełnionej pożywką zarodkową.

Zarodek wykazuje ekspresję komórek grzebienia nerwowego znakowanych białkiem zielonej fluorescencji (EGFP).

Ustaw komorę na stoliku mikroskopu. Korzystając z oświetlenia jasnego pola, wyreguluj obiektyw, aby ustawić ostrość i wyśrodkować zarodek w polu view.

Przełącz się na obiektyw zanurzenia w wodzie i ponownie skup się na zarodku.

Dostosuj parametry obrazowania, aby uzyskać obrazy stosu Z od krawędzi bocznej do przyśrodkowej, rejestrując szerokość oka.

Wyłącz oświetlenie w jasnym polu, zakryj scenę i rozpocznij obrazowanie poklatkowe.

W razie potrzeby napełnij komorę mediami podczas obrazowania.

Pod wpływem oświetlenia laserowego komórki grzebienia nerwowego fluoryzują.

Wizualizuj migrację tych komórek z cewy nerwowej do obszarów twarzoczaszki, wokół rozwijającego się oka, aby wypełnić mezenchymę okołogałkową i wyrostek czołowo-nosowy oraz brzusznie, aby utworzyć łuki gardłowe.

Po umieszczeniu całego zestawu na stoliku mikroskopu, zgodnie z protokołem tekstowym, użyj pięciokrotnego obiektywu, aby zlokalizować zarodek. Następnie ręcznie podnieś stolik do najwyższej pozycji i użyj precyzyjnej ostrości, aby ustawić zarodek w środku zakresu mikroskopu.

Ręcznie opuść stolik i zmień obiektyw pięciokrotny na obiektyw 25-krotnego zanurzenia w wodzie. Ostrożnie podnieś scenę, aby zarodek ponownie był ostry. W oprogramowaniu kliknij tryb xyzt, aby uzyskać wiele obrazów w czasie lub w odstępach t w płaszczyźnie xy na głębokości z.

Użyj widoku epifluorescencji lub jasnego pola, aby znaleźć głębię ostrości w obszarze zainteresowania, który wyznaczy stos z. W tych eksperymentach boczna krawędź oka jest początkiem stosu z. Po ustawieniu ostrości w tym miejscu w oprogramowaniu kliknij przycisk Rozpocząć. Po ustawieniu ostrości w dół do linii środkowej zarodka, która jest końcem stosu z, kliknij przycisk Koniec.

Krytycznym krokiem jest upewnienie się, że krok z obejmuje obszar zainteresowania. W naszym przypadku chcemy uchwycić szerokość oka od krawędzi bocznych do przyśrodkowych.

Kliknij menu, aby dostosować czas akwizycji i częstotliwość obrazowania. Aby zapewnić odpowiednie odzyskanie fluoroforu i przeżycie zarodka, należy przewidzieć stosunek co najmniej 1 do 3 między akwizycją z-stack, gdy moc lasera jest włączona, a czasem regeneracji, gdy moc lasera jest wyłączona. Mając odpowiedni czas na powrót do zdrowia zarodków, ustaw czas między stosami z a wyznaczonym oknem. Następnie ustaw łączny czas trwania eksperymentu w odpowiednim oknie.

Teraz włącz ustawienie obrazu na żywo, aby dokonać ostatecznych korekt ustawień lasera. Dostosuj suwaki transmisji laserowej, wzmocnienia i przesunięcia w oprogramowaniu, aby zoptymalizować obraz fluorescencyjny. Dostosuj również orientację zarodka w razie potrzeby w zależności od długości eksperymentu, przewidywanego wzrostu zarodka i tak dalej. Upewnij się, że obszar zainteresowania pozostaje w kadrze przez cały czas trwania eksperymentu.

Podczas akwizycji poklatkowej wyłącz źródło światła epifluorescencji. Przykryj scenę laserowym bezpiecznikiem, który jest odpowiedni do ochrony przed światłem tła. Następnie naciśnij Start.

Uzyskaj dostęp do otwartej komory kąpieli przez przesuwne drzwi w laserowej skrzynce bezpieczeństwa, aby napełnić ją pożywką poklatkową dla zarodków co 8 do 12 godzin. Po pobraniu obrazu otwórz pliki w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu. Wyróżnij właściwą serię obrazów.

W oprogramowaniu wybierz menu Proces. Kliknij Dekonwolucja 3D i zastosuj, aby zdekonwolucjonizować każdy stos z. Importuj pojedyncze pliki TIFF do oprogramowania do przetwarzania wideo. Następnie zaznacz wszystkie pliki TIFF i przeciągnij je do edytora wideo. Dostosuj długość każdego obrazu w filmie do 0,1 sekundy. Na koniec wyeksportuj wideo jako plik MOV lub MP4.