Izolacja komórek szpikowych ze skóry myszy i drenaż węzłów chłonnych po szczepieniu śródskórnym żywymi atenuowanymi sporozoitami zarodźca

Ogólnym celem tego zestawu procedur jest uodpornienie myszy na atenuowane promieniowaniem pasożyty plasmodium. Aby ułatwić analizę rekrutacji komórek szpikowych w skórze myszy i drenujących węzły chłonne. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie malarii, takie jak to, jacy aktorzy komórkowi są zaangażowani we wrodzoną odpowiedź immunologiczną na żywe atenuowane pasożyty.

Między 18-25 dni po infekcjach posiłek z krwi, zbierz i zimny znieczulenie zakażone komary w 15-mililitrowej probówce na lodzie. Następnie ostrożnie odwróć probówkę na szalkę Petriego na lodzie i wystaw owady na działanie 12 kiloradów dawki promieniowania gamma lub X. Zebrać napromieniowane gruczoły ślinowe komarów w 15 mikrolitrach DPBS na lodzie.

A następnie delikatnie zmiażdż gruczoły, aby uwolnić sporozoity. Wstrzyknięcie silnie skoncentrowanej zawiesiny pasożyta w małej objętości ma kluczowe znaczenie, dlatego ważne jest, aby zebrać wystarczającą liczbę gruczołów ślinowych od dobrze zakażonych komarów, o czym świadczy silna ekspresja zielonej fluorescencji. Zawiesinę pasożyta należy ponownie zawiesić przed filtracją przez sitko o średnicy 35 mikrometrów dostosowane do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki.

Za pomocą mikroskopowej komory zliczającej policz całkowitą liczbę wyizolowanych sporozoitów i dostosuj zawiesinę pasożyta do 8,3 razy dziesięć do czwartego stężenia sporozoitów na mikrolitr w zimnym DPBS na lodzie. Przed wstrzyknięciem sporozoitów należy potwierdzić prawidłowy poziom uspokojenia zwierzęcia doświadczalnego poprzez uszczypnięcie palca u nogi i nałożenie maści do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Następnie, pracując szybko, użyj przezroczystej taśmy, aby delikatnie przymocować brzuszną stronę małżowiny usznej pod mikroskopem stereoskopowym i załaduj strzykawkę o pojemności dziesięciu mikrolitrów, wyposażoną w igłę o rozmiarze 35, z 0,6 mikrolitra ponownie zawieszonych pasożytów.

Następnie ostrożnie wbij igłę skośną stroną do góry pod naskórek po grzbietowej stronie ucha i wstrzyknij w to miejsce 0,15 mikrolitra sporozoitów. W miejscu wstrzyknięcia będzie obserwowana charakterystyczna grudka. Po trzykrotnym wstrzyknięciu w skórę właściwą, jak właśnie pokazano, ostrożnie usuń taśmę i monitoruj mysz, aż w pełni wyzdrowieje.

W pożądanym punkcie czasowym po zaszczepieniu sporozoitu należy poświęcić mysz i natychmiast rozpocząć procedurę. Upewnij się, że mysz wykazuje oznaki śmierci klinicznej. Zdezynfekuj ucho i odpowiadający mu obszar szyi 70-procentowym etanolem.

Następnie za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy wykonaj nacięcie w okolicy szyjno-szyjnej. Następnie rozciągnij nacięcie dwoma kleszkami, aby odsłonić szary drenujący węzeł chłonny. Ostrożnie ściśnij i usuń tkankę łączną bezpośrednio nad węzłem chłonnym i usuń ją za pomocą drugiej pary kleszczy, umieszczonych pod nią.

Przenieś węzeł chłonny do sitka o średnicy 70 mikronów w jednym dołku sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej, zawierającej 4,5 mililitra standardowej pożywki, uzupełnionej kolagenazą i DNazą. Następnie zbierz całe zaszczepione ucho i użyj dwóch kleszczy, aby uszczypnąć i oddzielić ucho na część grzbietową i brzuszną. Następnie umieść każdą stronę ucha w studzience drugiej sześciodołkowej płytki, zawierającej 4,5 mililitra na studzienkę pożywki uzupełnionej enzymami trawiennymi, uważając, aby każda tkanka była całkowicie zanurzona w pożywce.

Aby wyizolować komórki odpornościowe z węzłów chłonnych, inkubuj płytkę tkanki limfatycznej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2 pod delikatnym mieszaniem. Po 15 minutach dodaj dziesięć milimolowych EDTA do każdej studzienki i umieść płytkę na lodzie. Następnie, dla każdego węzła chłonnego, użyj końca nowego pięciomilimetrowego tłoka strzykawki i dociśnij węzeł chłonny do sitka ruchami okrężnymi, aby oddzielić tkankę.

Gdy pozostanie tylko biała tkanka łączna, przepłucz sitko dwukrotnie 500 mikrolitrami DPBS zawierającego FBS i EDTA i przenieś popłuczynę do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Następnie umyj studzienkę jeszcze dwa razy 500 mikrolitrami uzupełnionego DPBS i przenieś płukanie do rurki umieszczonej na lodzie. Aby wyizolować komórki odpornościowe z ucha, inkubuj ulotki uszne w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2 z delikatnym mieszaniem.

Po 20 minutach pokrój tkanki na mniejsze kawałki, aby ułatwić ich trawienie i włóż próbki z powrotem do inkubatora. Po 40 minutach przerwij trawienie dziesięciomilimolowym EDTA i umieść płytkę na lodzie. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra z odciętą końcówką przenieś całą zawartość każdej studzienki do nowych studzienek zawierających sitka o średnicy 70 mikronów.

I użyj pięciomililitrowego tłoka strzykawki, aby oddzielić fragmenty tkanki ucha za pomocą ruchów okrężnych, jak właśnie pokazano. Gdy pozostanie tylko biała tkanka łączna i włosy, umyj sitka i studzienki za pomocą DPBS plus FBS i EDTA, jak właśnie pokazano, łącząc popłuczyny w 50-mililitrowej tubce na lodzie. Na koniec umyj studzienkę dwukrotnie uzupełnionym DPBS i przenieś popłucz do rurki umieszczonej na lodzie.

Na tym filmie można zobaczyć migrację osłabionych promieniowaniem sporozoitów do skóry myszy 15 minut po śródskórnym wstrzyknięciu pasożytów. 24 godziny po śródskórnym wstrzyknięciu sporozoitu wszystkie komórki są izolowane ze skóry i drenującego węzła chłonnego. Jak zaobserwowano na tym rysunku, częstotliwość komórek mieloidalnych w skórze i drenujących węzłach chłonnych jest znacznie zwiększona w porównaniu z myszami nieleczonymi.

Po opanowaniu, pierwsze kroki protokołu napromieniania komarów do wstrzyknięcia sporozoitu można wykonać w ciągu czterech godzin. Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać, że sporozoit wyizolowany z gruczołów ślinowych komarów szybko traci swoją zakaźność. Dlatego należy je wstrzyknąć tak szybko, jak to możliwe.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować komórki szpiku ze skóry myszy i drenującego węzła chłonnego, aby zbadać odpowiedź immunologiczną na śródskórne wstrzyknięcie żywych atenuowanych pasożytów plasmodium.