Name: Izolacja komórek szpikowych ze skóry myszy i drenaż węzłów chłonnych po szczepieniu śródskórnym żywymi atenuowanymi sporozoitami zarodźca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj izolację komórek szpikowych ze skóry myszy i drenaż węzłów chłonnych po szczepieniu śródskórnym atenuowanymi sporozoitami Plasmodium. Ta metoda umożliwia analizę rekrutacji komórek immunologicznych i odpowiedzi zapalnej na pasożyta malarii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Patricii Baldacci, Vanessie Lagal i Sabine Thiberge za krytyczną lekturę, Irinie Dobrescu i Sabine Thiberge za pomoc w robieniu zdjęć oraz Pauline Formaglio za nauczanie obrazowania in vivo ruchliwości sporozoitów w skórze myszy. Dziękujemy również Markowi Szatanikowi oraz Centrum Produkcji i Zakażenia Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) za hodowlę komarów. Badania te były wspierane przez Fundusz Badawczy AXA oraz środki z Laboratoire d'Excellence "Integrative Biology of Emerging Infectious Diseases" (grant nr 1). ANR-10-LABX-62-IBEID).

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez komitet Instytutu Pasteura oraz przez lokalną Komisję Etyki ds. Doświadczeń na Zwierzętach (Komisja Etyczna IDF-Paryż 1, Paryż, Francja; numer umowy: 2012-0015) i przeprowadzone zgodnie z obowiązującymi wytycznymi i przepisami. 
1. Materiały i odczynniki
<ol>
	<li>Użyj samic komarów Anopheles stephensi (szczep Sda500), które żywią się zakażonymi myszami 3-5 dni po pojawieniu się i wychowują się zgodnie z wcześniejszym opisem21.</li>
	<li>Użyj pasożytów Plasmodium berghei ANKA klon eksprymujący gen zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod kontrolą konstytutywnego promotora białka szoku cieplnego 70 (HSP70). Daje to jasną fluorescencję przez cały cykl życiowy pasożyta22.</li>
	<li>Użyj samic myszy C57BL/6JRj (7 tygodni). 
	UWAGA: Wszystkie odczynniki użyte w opisanym protokole są wymienione wT able materiałów/sprzętu.</li>
</ol>
2. Izolacja sporozoitu z gruczołów ślinowych komarów
<ol>
	<li>Między 18-25 dniem po zakaźnym posiłku z krwi należy zebrać i znieczulić je na zimno do 15 ml probówki na lodzie, jak opisano wcześniej21. Ostrożnie przenieś je na szalkę Petriego, odwracając rurkę. Utrzymuj owady na lodzie i wystaw komary na 12-stopniową dawkę promieniowania γ lub x.</li>
	<li>Wyizolować atenuowane sporozoity z napromieniowanych gruczołów ślinowych komarów, jak opisano wcześniej21. Zbierz zainfekowane gruczoły ślinowe w małej objętości (około 15 μl) 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco na lodzie i delikatnie je zmiażdż, aby uwolnić sporozoity. 
	UWAGA: Wstrzyknięcie wysoce skoncentrowanej zawiesiny pasożyta w małej objętości ma kluczowe znaczenie, dlatego konieczne jest pobranie wystarczającej liczby gruczołów ślinowych od dużej liczby wstępnie wyselekcjonowanych, dobrze zakażonych komarów, o czym świadczy ich silna ekspresja zielonej fluorescencji.</li>
	<li>Przefiltruj zawiesinę sporozoitu przez nasadkę sitową o pojemności 35 μm dostosowaną do probówki mikrowirówkowej o niskiej przyczepności 1,5 ml w celu wyeliminowania grudek i resztek komarów.</li>
	<li>Policz całkowitą liczbę wyizolowanych sporozoitów zgodnie z wcześniejszym opisem21 i dostosuj stężenie zawiesiny pasożyta zimnym 1x DPBS, aby uzyskać 83 000 sporozoitów/μl. Przechowuj pasożyty na lodzie, kontynuując kolejne kroki.</li>
	<li>Pobrać równoważną liczbę gruczołów ślinowych od niezakażonych komarów, które zostaną wykorzystane jako kontrola ujemna, i przetworzyć próbkę zgodnie z opisem w krokach 2.2 i 2.3. Rozcieńczyć próbkę w sposób wskazany powyżej, aby uzyskać podobne stężenie ekstraktów z gruczołów ślinowych w zawiesinie. 
	UWAGA: Sporozoity można przechowywać na lodzie maksymalnie 2 godziny. Jednak najlepiej byłoby je wstrzyknąć w ciągu godziny po zmiażdżeniu gruczołów ślinowych.</li>
</ol>
3. Wstrzykiwanie sporozoitów do warstwy skórnej ucha
<ol>
	<li>Znieczulanie zwierząt przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy (50 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg). Odczekaj 5-8 minut, aż mysz znajdzie się w stanie nieprzytomności i nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Oceń głębokość znieczulenia, wykonując delikatne uszczypnięcie palców u obu tylnych stóp. 
	UWAGA: Dawka znieczulenia trwa krócej niż 20 min, dlatego kolejne kroki należy wykonać szybko.</li>
	<li>Ustabilizuj małżowinę uszną myszy, mocując stronę brzuszną przezroczystą taśmą umieszczoną wcześniej pod mikroskopem stereoskopowym (ryc. 1A). Delikatnie dociśnij ucho, aby uniknąć uszkodzenia układu krwionośnego.</li>
	<li>Załadować strzykawkę o pojemności 10 μl/igłę ze skosem o rozmiarze 35 z 0,6 μl zawieszonych pasożytów10.</li>
	<li>Zawiesinę sporozoitu należy dostarczyć w 4 miejscach wstrzyknięcia (0,15 μl na miejsce), ostrożnie wprowadzając igłę po grzbietowej stronie ucha (ryc. 1A), pod naskórkiem, skosem do góry, uważając, aby uniknąć naczyń krwionośnych. Pozostawić igłę w skórze właściwej przez kilka sekund, aby zapobiec cofaniu się iniekcji przed jej usunięciem. Pod koniec zabiegu należy obserwować charakterystyczny grudek w każdym miejscu wstrzyknięcia (ryc. 1B i 1C).</li>
	<li>Po wstrzyknięciu należy ostrożnie zdjąć ucho z taśmy.</li>
	<li>Wstrzyknąć do ucha przeciwległego taką samą dawkę pasożytów, postępując zgodnie z krokami 3.2-3.4.</li>
	<li>Wstrzyknij 2 dodatkowym myszom 0,6 μl 1x DPBS lub 0,6 μl 1x DPBS + ekstrakt z gruczołów ślinowych od niezakażonych komarów w celu oceny reakcji zapalnej, w której pośredniczy samo wstrzyknięcie i odkładanie się materiału komara w skórze właściwej.</li>
	<li> Monitoruj powrót myszy do zdrowia po znieczuleniu przed umieszczeniem jej z powrotem w klatce. 
	UWAGA: Prawidłowe odkładanie się sporozoitu w skórze można monitorować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (ryc. 2A i 2B), przy czym mysz przygotowuje się zgodnie z wcześniejszym opisem23.</li>
</ol>
4. Rozwarstwienie skóry i drenujących węzłów chłonnych 
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę wzorcową (SM) w następujący sposób: zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM) firmy Dulbecco + 25 mM kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES) uzupełnione 400 j./ml kolagenazy i 50 μg/ml dezoksyrybonukleazy (DNazy).</li>
	<li>Przygotować dwie 6-dołkowe płaskodenne płytki do hodowli tkankowych na lodzie z 4,5 ml sitka do komórek SM + 70 μm na studzienkę dla próbek dLN (płyta A) i 4,5 ml SM na studzienkę dla próbek skóry (płytka B).</li>
	<li>W pożądanym punkcie czasowym po inokulacji sporozoitu głęboko znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy (125 mg / kg) / ksylazyny (12,5 mg / kg) przed zwichnięciem szyjki macicy. Upewnij się, że mysz wykazuje oznaki śmierci klinicznej i natychmiast rozpocznij sekcję. 
	UWAGA: Kinetykę rekrutacji komórek szpikowych można badać w różnym czasie po wstrzyknięciu (tj. 2 godziny, 4 godziny i 24 godziny, jak opisano wcześniej14).</li>
	<li>Zdezynfekuj zaszczepione ucho i odpowiadający mu obszar szyi 70% etanolem, aby zmniejszyć możliwość zanieczyszczenia.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy należy aseptycznie wypreparować proksymalną małżowinę uszną dLN bez zbierania otaczającego tłuszczu. Wykonaj pierwsze nacięcie w bruździe szyjno-szyjnej i usuń włosy z pola operacyjnego. Rozciągnij nacięcie za pomocą 2 kleszczy, aby odsłonić dLN, który wydaje się szarawy w porównaniu z otaczającą tkanką.</li>
	<li>Ostrożnie ściśnij tkanki łączne na górze dLN za pomocą kleszczy, aby ułatwić jego usunięcie. Wyodrębnij dLN, umieszczając kleszcze pod tkanką limfoidalną (ryc. 3A i 3B). Umieścić dLN w studzience zawierającej 4,5 ml sitka do komórek SM + 70 μm (płyta A).</li>
	<li>Zbierz całe zaszczepione ucho za pomocą sterylnych ostrych nożyczek i kleszczy (ryc. 4A). Oddziel grzbietową i brzuszną część ucha, ściskając i rozsuwając odcięte końce dwoma kleszkami (ryc. 4B-4E). Umieścić je w studzience zawierającej 4,5 ml SM (płytka B), upewniając się, że obie tkanki są całkowicie zanurzone w pożywce. 
	UWAGA: W celu poprawy wiarygodności eksperymentu i zwiększenia liczby komórek będących przedmiotem zainteresowania, należy połączyć 2 uszy, którym wstrzyknięto ucho lub 2 dLN od tej samej myszy na próbkę.</li>
	<li>Zbieraj i przetwarzaj równolegle uszy i dLN myszy zaszczepionych 1x DPBS lub ekstraktami z gruczołów ślinowych. Dołącz 2 dodatkowe próbki uszu i węzłów chłonnych pobrane od naiwnej myszy w celu kontroli kompensacji negatywnego i pojedynczego barwienia.</li>
</ol>
5. Izolacja komórek z węzłów chłonnych
<ol>
	<li>Inkubować węzły chłonne (płytka A) w temperaturze 37 °C + 5% CO2 przez 15 minut pod delikatnym mieszaniem. Dodaj 10 mM końcowego kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) na studzienkę, aby zneutralizować aktywność kolagenazy i DNazy. Kolejne kroki wykonaj na lodzie.</li>
	<li>Rozdzielić węzły chłonne za pomocą górnego końca tłoka strzykawki o pojemności 5 ml. Dociskaj okrężnymi ruchami do sitka, aż pozostaną tylko białe tkanki łączne.</li>
	<li>Przepłucz sitko komórkowe dwukrotnie 500 μl 1x DPBS + 2% Płodowa surowica bydlęca (FBS) + 2mM EDTA. Przenieść całą objętość studzienki do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Przepłukać studzienkę dwukrotnie 500 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2mM EDTA i przenieść objętość do probówki o pojemności 15 ml. Trzymaj probówki na lodzie.</li>
</ol>
6. Izolacja komórek od skóry ucha
<ol>
	<li>Inkubować listki uszne (płytka B) w temperaturze 37 °C + 5% CO2 przez 1 godzinę pod delikatnym mieszaniem. 
	UWAGA: Po 20 minutach inkubacji pokrój listki z uszu nożyczkami na małe kawałki, aby ułatwić trawienie tkanek i umieść próbkę z powrotem w inkubatorze na pozostałe 40 minut. Pojedyncze komórki można obserwować w pożywce pod koniec czasu inkubacji.</li>
	<li>Dodaj 10 mM końcowego EDTA na studzienkę, aby zneutralizować aktywność kolagenazy i DNazy. Kolejne kroki wykonaj na lodzie.</li>
	<li>Przenieść fragmenty tkanek ucha i całą objętość podłoża do nowego dołka zawierającego sitko do komórek o wielkości 70 μm za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Wytnij 2 do 3 mm od końca końcówki, aby łatwiej zebrać fragmenty tkanki ucha.</li>
	<li>Oddzielić fragmenty tkanki ucha za pomocą górnego końca tłoka strzykawki o pojemności 5 ml. Dociskaj okrężnymi ruchami do sitka, aż pozostaną tylko białe tkanki łączne.</li>
	<li>Przepłucz sitka komórkowe dwukrotnie 500 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.</li>
	<li>Przenieść całą objętość studzienki do probówki o pojemności 50 ml przez sitko o pojemności 70 μm.</li>
	<li>Przepłukać studzienkę 500 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA i przenieść objętość do probówki o pojemności 50 ml. Trzymaj probówkę na lodzie. 
	UWAGA: Różne etapy izolowania całkowitej liczby komórek ze skóry i tkanek dLN podsumowano na rysunku 5.</li>
</ol>
7. Liczba i żywotność zebranych komórek
<ol>
	<li>Odwirować próbki skóry i dLN przez 5 minut w temperaturze 450 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Delikatnie zawiesić granulat za pomocą 300 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.</li>
	<li>Zbierz niewielką objętość każdej próbki, aby policzyć całkowitą liczbę komórek wyizolowanych ze skóry i dLN za pomocą hemocytometru. Dodaj 0,04% błękitu trypanowego, aby określić żywotność komórki.</li>
</ol>
8. Blokowanie wiązania niespecyficznego dla antygenu
<ol>
	<li>Dodać 10 μg/ml nieznakowanego przeciwciała blokowego Fc CD16/CD32. Inkubować 20 minut w temperaturze 4 °C (może trwać dłużej).</li>
	<li>Dodać 2 ml zimnego 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Odwirować próbkę przez 5 minut przy 450 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Delikatnie zawiesić osad za pomocą 300 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA i utrzymywać próbki na lodzie.</li>
</ol>
9. Barwienie komórek szpikowych skóry i węzłów chłonnych
<ol>
	<li>Inkubuj wcześniej zablokowane komórki wyizolowane przez skórę i dLN za pomocą trackera Live/Dead (tj. 4',6-diamidino-2-fenyloindolu lub DAPI), przeciwciał specyficznych dla anty-CD45 i anty-CD11b. 
	UWAGI: W celu wzbogacenia interesujących subpopulacji komórek szpikowych, zwłaszcza rzadkich, komórki i limfocyty CD45 + mogą być odpowiednio oczyszczone ze skóry lub zubożone z dLN za pomocą kulki magnetycznej ułatwiającej sortowanie komórek. Ponieważ większość komórek wyizolowanych z dLN to CD45+, stosowanie anty-CD45 nie jest obowiązkowe. Inne markery można uwzględnić w celu identyfikacji subpopulacji komórek szpikowych będących przedmiotem zainteresowania za pomocą strategii bramkowania dodatniego lub ujemnego. W tym protokole komórki mieloidalne rekrutowane w dLN zostały wzbogacone poprzez wykluczenie komórek CD8α+ (cały przedział limfocytów T może być celowany za pomocą przeciwciała specyficznego dla anty-CD3).</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Dodać 500 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA, odwirować próbkę 5 minut przy 450 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Powtórz krok prania dwa razy.</li>
	<li>Zawiesić próbki za pomocą 300 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Przenieść całą objętość w probówce FACS przez sitko do komórek 35 μm. Przepłukać filtr 100 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.</li>
	<li>Uruchom wybarwione komórki w cytometrze przepływowym. Bramka żywych pojedynczych komórek (DAPI-, FSC-W) w celu wykluczenia martwych komórek i dubletów. Wykreślić zdarzenia CD45 + CD11b + dla skóry (Figura 6A) i (CD45 +) Zdarzenia CD8α-CD11b + dla dLN (Figura 6B).</li>
</ol>

<ol><li>Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+immunity+produced+by+the+injection+of+x-irradiated+sporozoites+of+plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei.</a> Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).</li>
<li>Hoffman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+humans+against+malaria+by+immunization+with+radiation-attenuated+Plasmodium+falciparum+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites.</a> J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).</li>
<li>Mueller, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+liver+stage+developmental+arrest+by+depletion+of+a+protein+at+the+parasite-host+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).</li>
<li>Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+attenuated+Plasmodium+berghei+liver+stages+persist+and+elicit+sterile+protection+primarily+via+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells.</a> Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).</li>
<li>Tarun, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protracted+sterile+protection+with+Plasmodium+yoelii+pre-erythrocytic+genetically+attenuated+parasite+malaria+vaccines+is+independent+of+significant+liver-stage+persistence+and+is+mediated+by+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells.</a> J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).</li>
<li>van Dijk, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+attenuated%2C+P36p-deficient+malarial+sporozoites+induce+protective+immunity+and+apoptosis+of+infected+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).</li>
<li>Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+antimalarial+immunity+after+vaccination+with+late+liver+stage-arresting+genetically+attenuated+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites.</a> Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+T+cell+immunity+against+malaria+liver+stage+after+vaccination+with+live+sporozoites+under+chloroquine+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment.</a> J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).</li>
<li>Behet, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporozoite+immunization+of+human+volunteers+under+chemoprophylaxis+induces+functional+antibodies+against+pre-erythrocytic+stages+of+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum.</a> Malar J. 13, 136(2014).</li>
<li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+Plasmodium+transmission+from+mosquito+to+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal.</a> Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).</li>
<li>Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+sporozoites+trickle+out+of+the+injection+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site.</a> Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).</li>
<li>Gueirard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+malaria+parasite+in+the+skin+of+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).</li>
<li>Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrahepatic+exo-+erythrocytic+forms+of+rodent+malaria+parasites+at+the+site+of+inoculation%3A+clearance+after+immunization%2C+susceptibility+to+primaquine%2C+and+contribution+to+blood-stage+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection.</a> Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).</li>
<li>CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nat+Med%22">Nat Med</a>. Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. 13 (9), (2007).</li>
<li>Obeid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-draining+lymph+node+priming+is+sufficient+to+induce+sterile+immunity+against+pre-erythrocytic+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria.</a> EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).</li>
<li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+traversal+is+important+for+progression+of+the+malaria+parasite+through+the+dermis+to+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver.</a> Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph-node+resident+CD8%CE%B1%2B+dendritic+cells+capture+antigens+from+migratory+malaria+sporozoites+and+induce+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses.</a> PLoS Pathog. 11 (2), e1004637(2015).</li>
<li>da Silva, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+skin+immunological+disturbance+after+Plasmodium-infected+mosquito+bites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites.</a> Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).</li>
<li>Mac-Daniel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+immune+response+to+injection+of+Plasmodium+sporozoites+into+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin.</a> J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).</li>
<li>Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+capture+of+infected+neutrophils+by+dendritic+cells+in+the+skin+inhibits+the+early+anti-leishmania+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response.</a> PLoS Pathog. 8 (2), e1002536(2012).</li>
<li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo.+imaging+of+malaria+parasites+in+the+murine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).</li>
<li>Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcium-dependent+protein+kinase+regulates+Plasmodium+ookinete+access+to+the+midgut+epithelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell.</a> Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).</li>
<li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+malaria+sporozoites+in+the+dermis+of+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).</li>
<li>Ploemen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+liver+load+following+parenteral+sporozoite+administration+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents.</a> Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).</li>
<li>Epstein, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+attenuated+malaria+vaccine+designed+to+protect+through+hepatic+CD8+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity.</a> Science. 334 (6055), 475-480 (2011).</li>
<li>Roestenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+protection+against+malaria+after+experimental+sporozoite+inoculation%3A+an+open-label+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study.</a> Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).</li>
<li>Seder, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+malaria+by+intravenous+immunization+with+a+nonreplicating+sporozoite+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine.</a> Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).</li>
<li>Douradinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+attenuated+P36p-deficient+Plasmodium+berghei+sporozoites+confer+long-lasting+and+partial+cross-species+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection.</a> Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).</li>
<li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (63), e4040(2012).</li>
<li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Microbiol+Immunol+%28Bp%22%5BJournal%5D)">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W perspektywie zakrojonych na szeroką skalę szczepień ludzi z użyciem całej szczepionki przeciwko malarii sporozoitowej, jednym z głównych wyzwań do pokonania jest opracowanie zoptymalizowanych dróg i metod podawania pasożytów, aby zapewnić skuteczną immunizację i ochronę24,25. U ludzi ocenę skuteczności ochronnej, w której pośredniczą żywe atenuowane pasożyty (LAP), przeprowadzono po naturalnych ukąszeniach komarów2, a także po szczepieniach śródskórnych, podskórnych25,26 i dożylnych<sup...

Malaria jest jedną z najbardziej śmiercionośnych chorób zakaźnych na świecie, zabijającą ponad pół miliona ludzi rocznie. Zakażenie przez Plasmodium, czynnik wywołujący chorobę, rozpoczyna się w fazie przederytrocytarnej (PE). Podczas tej fazy sporozoity wstrzyknięte w skórę żywiciela przez samicę komara Anopheline docierają do wątroby przez krwiobieg i różnicują się wewnątrz hepatocytów w formy pasożytnicze, które infekują czerwone krwinki i powodują objawy choroby.
Etapy PE Plasmodium stanowią uprzywilejowany cel dla szczepień przeciw malarii. Rzeczywiście, żywe atenuowane szczepionki przeciwko tym etapom, takie jak sporozoity atenuowane promieniowaniem (RAS), genetycznie zatrzymane pasożyty (GAP) lub chemoprofilaktyka i sporozoity (CPS) wykazały swoją zdolność do ochrony zarówno gryzoni, jak i ludzkich gospodarzy1-9. W modelu gryzoni większość badań nad szczepieniami przeprowadza się z wykorzystaniem immunizacji dożylnej, która jest złotym standardem pod względem skuteczności ochronnej. Jednak opis etapu skórnego i znaczenie związanego ze skórą drenującego węzła chłonnego (dLN) w wywoływaniu ochrony zmienił nasze postrzeganie fazy PE i podkreślił znaczenie śródskórnej drogi iniekcji. Obrazowanie przyżyciowe sporozoitów P. berghei wstrzykniętych w skórę gryzoni wykazało, że tylko ~25% inokulum dociera do wątroby przez krwioobieg. Pozostałe ~75% rozprowadza się między proksymalnym dLN (~15%) a skórą (~50%)10,11, gdzie niewielka część może przekształcić się i pozostać przy życiu przez tygodnie wewnątrz komórek skóry12,13. Ponadto w kolejnych badaniach opisano, że wytworzenie skutecznej odporności ochronnej po szczepieniu śródskórnym odbywa się głównie w skórze-dLN, gdzie aktywowane są specyficzne dla pasożyta limfocyty T CD8+, a tylko nieznacznie w śledzionie lub wątrobie-dLN14,15.
Podczas gdy większość badań koncentrowała się na charakterystyce komórek efektorowych zaangażowanych w tworzenie ochronnej odpowiedzi immunologicznej, znacznie mniej wiadomo o losie żywych atenuowanych pasożytów wstrzykiwanych w skórę, zwłaszcza o ich interakcjach z wrodzonym układem odpornościowym. W szczególności charakterystyka komórek prezentujących antygen zaangażowanych w wychwyt, przetwarzanie i prezentację antygenu pasożyta limfocytom T CD8 + ma kluczowe znaczenie, wiedząc, że akwizycja antygenu PE może zachodzić zarówno w przedziałach skóry, jak i dLN. Poprzednie badania obrazowania przyżyciowego opisywały wczesny napływ jasno fluorescencyjnych komórek Lys-GFP dodatnich do skóry po zakaźnym ukąszeniu komara16, podczas gdy wczesne interakcje między sporozoitami a komórkami dendrytycznymi zaobserwowano w dLN10,17. Niedawno doniesiono, że sporozoity zaszczepione w skórze przez komary zwiększają ruchliwość zarówno dendrytycznych, jak i regulatorowych limfocytów T w skórze myszy, podczas gdy w dLN18 zaobserwowano zmniejszenie liczby komórek prezentujących antygen.
Naszym celem było dokładniejsze zidentyfikowanie i ilościowe określenie podzbiorów leukocytów rekrutowanych w skórze i odpowiadających im dLN, a także tych oddziałujących z pasożytem po śródskórnym wstrzyknięciu dawek uodparniających RAS19. W tym kontekście wyizolowaliśmy komórki szpikowe (CD45 + CD11b +) z obu tkanek i scharakteryzowaliśmy subpopulacje będące przedmiotem zainteresowania za pomocą wielo=parametrycznej cytometrii przepływowej. Zgodnie z odpowiedzią immunologiczną opisaną we wczesnym stadium dużego zakażenia skóry Leishmania 20, pierwotna odpowiedź gospodarza na wstrzyknięcie sporozoitu polega na sukcesywnej rekrutacji wielojądrzastych neutrofili (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6Cint), po których następują monocyty zapalne (CD45 + CD11b + Ly6G-Ly6C +), które identyfikuje się na podstawie zróżnicowanej ekspresji markerów powierzchniowych Ly6G i Ly6C.
Opisujemy tutaj protokół izolacji komórek szpikowych ze skóry myszy i dLN po śródskórnym wstrzyknięciu immunizujących dawek RAS pobranych z zakażonych gruczołów ślinowych komarów. Powtarzalne wstrzyknięcia śródskórne i przetwarzanie tkanek są kluczowymi etapami ilościowego określania zmian fenotypowych populacji komórek naciekających w zakażonych tkankach. Podejście opisane poniżej zapewnia wiarygodny test do oceny odpowiedzi zapalnej skóry i dLN na pasożyta Plasmodium i może być rozszerzony na różne systemy eksperymentalne.

<table><tbody><tr><td>Ketamina: Imalgen&reg; 1,000</td><td></td> <td>Merial-50</td> <td>mg/kg: wcześniejsze wstrzyknięcie sporozoitu

125 mg/kg: przed uśmierceniem</td></tr><tr><td>Ksylazyna: Rompun&reg; 2%</td><td>Bayer-5</td><td></td> <td>mg/kg: przed wstrzyknięciem sporozoitu

12,5 mg/kg:</td></tr><tr><td>strzykawka NanoFil + igła o rozmiarze 35 World</td><td>Precision Instruments&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Omnican&reg; 50 Strzykawka insulinowa 0,5 ml/50 I.U.</td><td>B. Braun Medycyna&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9151125-MultiwellTM 6-dołkowa płytka do hodowli tkankowych &ndash; Płaskie dno</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td></td><td>353046-70</td></tr> <tr><td>&mikro; Filtr siatkowy M&nbsp;</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td>352350-2</td><td></td></tr> <tr><td>ml Strzykawka</td><td>Terumo</td><td>SS-02S-BLUE</td><td></td></tr> <tr><td>MAXTM 15 ml Polipropylenowa tubka stożkowa</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td></td><td>352097-BLUE</td></tr> <tr><td>MAXTM 50 ml Polipropylenowa tuba stożkowa</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td></td><td>352098-5</td></tr> <tr><td>ml polistyrenowej probówki z okrągłym dnem i 35 &mikro; m Nasadka z sitkiem do komórek</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>352235-DPBS</tr> <tr><td>1x CaCl2- i MgCl2--free</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094-DMEM</td><td></td></tr> <tr><td>1x + GlutaMAXTM</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021-Kolagenaza</td><td></td></tr> <tr><td>z Clostridium histolyticum, typ IV 0,5-5,0 jednostek FALGPA/mg ciała stałego&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C5138</td><td>400 U/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej typu IV&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5025</td><td>50 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>EDTA sól disodowa</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>E-5134</td><td>10 mM lub 2,5 mM</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1810-500-HEPES</td><td></td></tr> <tr><td>roztwór buforowy (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>Trypanowa niebieska plama (0,4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Rozcieńczenie 1:10&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-mysz CD16/CD32 (klon 2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>10 i mikro; g/ml final (1:50)</td></tr><tr><td>DAPI FluoroPureTM klasa</td><td>Life Technologies</td><td>D21490</td><td>1 &micro; g/ml final</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45 (klon 30-F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>559864</td><td>&nbsp; Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Anty-mysz CD11b (klon M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td>&nbsp; Rozcieńczenie 1:400</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD8&alpha; (klon 5H10)</td><td>Technologie życiowe</td><td>MCD0830</td><td>&nbsp; Rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Samica myszy C57BL/6JRj (7-tygodniowa)&nbsp;</td><td>Laboratoria Janvier</td> <td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

izolacja komórek szpikowych ze skóry myszy i drenaż węzłów chłonnych po szczepieniu śródskórnym żywymi atenuowanymi sporozoitami zarodźca

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Zakażenie malarią zaczyna się, gdy sporozoit Plasmodium jest zaszczepiony w skórze ssaka gospodarza poprzez ukąszenie komara. Wysoce ruchliwy pasożyt dociera nie tylko do wątroby, aby zaatakować hepatocyty i przekształcić się w formę zakaźną erytrocytów. Migruje również do skóry i do bliższych węzłów chłonnych drenujących miejsce wstrzyknięcia, gdzie może zostać rozpoznany i zdegradowany przez rezydentne i/lub zrekrutowane komórki szpikowe. Obrazowanie przyżyciowe wykazało wczesną rekrutację jasno fluorescencyjnych leukocytów Lys-GFP dodatnich w skórze oraz interakcje między sporozoitami a komórkami CD11c+ w drenującym węźle chłonnym. Przedstawiamy tutaj skuteczną procedurę odzyskiwania, identyfikacji i zliczania podzbiorów komórek szpikowych, które są rekrutowane do skóry myszy i drenującego węzła chłonnego po śródskórnym wstrzyknięciu immunizujących dawek sporozoitów w modelu mysim. Charakterystyka fenotypowa przy użyciu wieloparametrycznej cytometrii przepływowej zapewnia wiarygodny test do oceny wczesnych dynamicznych zmian komórkowych podczas odpowiedzi zapalnej na zakażenie Plasmodium.

Wykazaliśmy niedawno, że wstrzykiwanie igłą dawek immunizujących sporozoitów P. berghei w skórę myszy indukuje następującą po sobie rekrutację neutrofili polimorfonuclear oraz monocytów zapalnych w skórze i dLN19. Powyższa sekcja protokołu szczegółowo opisuje procedurę wykorzystaną do skutecznej izolacji żywych komórek mieloidalnych z obu tkanek po wielokrotnych iniekcjach dużej liczby sporozoitów w skórę właściwą ucha (Rycina 1 i 2). ...

Opisujemy tutaj protokół izolacji komórek szpikowych ze skóry myszy i drenowania węzłów chłonnych po śródskórnym wstrzyknięciu sporozoitów Plasmodium. Cytometria przepływowa pobranych komórek zapewnia wiarygodny test charakteryzujący reakcję zapalną skóry i węzłów chłonnych drenujących na pasożyta.

Izolacja komórek szpikowych ze skóry myszy i drenaż węzłów chłonnych po szczepieniu śródskórnym żywymi atenuowanymi sporozoitami zarodźca

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Ogólnym celem tego zestawu procedur jest immunizacja myszy promieniowaniem atenuowanymi pasożytami z rodzaju Plasmodium. Ma to na celu ułatwienie analizy rekrutacji komórek mieloidalnych w skórze myszy oraz w drenujących węzłach chłonnych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad malarią, takie jak to, jakie elementy komórkowe biorą udział w wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na żywe, atenuowane pasożyty.W okresie od 18 do 25 dni po posiłku krwi zakażonym, zebrać i znieczulić zimnem zakażone komary w probówce o pojemności 15 ml na lodzie. Następnie ostrożnie odwrócić probówkę do szalki Petriego na lodzie i poddać owady dawce 12 kilorad promieniowania gamma lub rentgenowskiego. Zebrać napromieniowane gruczoły ślinowe komarów do 15 µl DPBS na lodzie.Następnie delikatnie rozgnieć gruczoły, aby uwolnić sporozoity. Wstrzyknięcie wysoce skoncentrowanej zawiesiny pasożytów w małej objętości jest kluczowe, dlatego ważne jest zebranie wystarczającej liczby gruczołów ślinowych z silnie zakażonych komarów, co potwierdza intensywna zielona fluorescencja. Zawiesinę pasożytów należy ponownie zawiesić przed filtracją przez sito o oczkach 35 µm dopasowane do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.Używając komory licznikowej mikroskopu, policz całkowitą liczbę wyizolowanych sporozoitów i dostosuj zawiesinę pasożytów do stężenia 8,3 × 10⁴ sporozoitów na µL w zimnym DPBS na lodzie. Przed wstrzyknięciem sporozoitów potwierdź odpowiedni poziom sedacji zwierzęcia doświadczalnego poprzez ucisk palca u nogi i nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówki. Następnie, pracując szybko, użyj przezroczystej taśmy, aby delikatnie unieruchomić brzuszną stronę małżowiny usznej pod mikroskopem stereoskopowym i nabierz do strzykawki o pojemności 10 µL, wyposażonej w igłę 35 G, 0,6 µL resuspenderowanych pasożytów.Następnie, ostrożnie wprowadź igłę, stroną ściętą do góry, pod naskórek na grzbiecie ucha i wstrzyknij 0,15 µL sporozoitów w to miejsce. W miejscu wstrzyknięcia pojawi się charakterystyczna grudka. Po trzykrotnej iniekcji w skórę właściwą, zgodnie z powyższą demonstracją, ostrożnie usuń taśmę i monitoruj mysz do czasu jej pełnego wyzdrowienia.W wybranym punkcie czasowym po inokulacji sporozoitami uśmierć mysz i natychmiast rozpocznij procedurę. Upewnij się, że u myszy wystąpiły oznaki śmierci klinicznej. Zdezynfekuj ucho oraz odpowiadający mu obszar szyi 70% etanolem.Następnie, używając sterylnych nożyczek i pęsety, wykonaj nacięcie w obszarze żylno-szyjnym. Rozszerz nacięcie za pomocą dwóch pęset, aby odsłonić szary w wyrazie drenujący węzeł chłonny. Ostrożnie odchyl i usuń tkankę łączną znajdującą się bezpośrednio nad węzłem chłonnym, a następnie wyjmij go drugą pęsetą umieszczoną pod nim.Przenieś węzeł chłonny do sitka o oczkach 70 µm umieszczonego w jednym z dołków sześciodołkowej płytki hodowlanej, zawierającego 4,5 ml standardowej pożywki uzupełnionej o kolagenazę i DNazę. Następnie pobierz całe zaszczepione ucho i za pomocą dwóch pincet ściśnij i rozdziel ucho na część grzbietową i brzuszną. Następnie umieść każdą stronę ucha w dołku drugiej sześciodołkowej płytki, zawierającej po 4,5 ml pożywki uzupełnionej enzymami trawiennymi na dołek, dbając o to, aby każda tkanka była całkowicie zanurzona w pożywce.Aby wyizolować komórki odpornościowe z węzłów chłonnych, inkubuj płytkę z tkanką limfatyczną w temperaturze 37°C i 5% CO2 przy łagodnym mieszaniu. Po 15 minutach dodaj 10 mM EDTA do każdej studni i umieść płytkę na lodzie. Następnie, dla każdego węzła chłonnego, użyj końcówki nowego tłoka strzykawki 5 mm i dociskaj węzeł chłonny do sita, wykonując koliste ruchy w celu dysocjacji tkanki.Gdy pozostanie jedynie biała tkanka łączna, wypłucz sitko dwa razy przy użyciu 500 µL DPBS zawierającego FBS i EDTA, a następnie przenieś roztwór płuczący do 15 ml probówki stożkowej. Następnie przemyj studzienkę jeszcze dwa razy 500 µL uzupełnionego DPBS i przenieś roztwór do probówki umieszczonej w lodzie. Aby wyizolować komórki odpornościowe z ucha, inkubuj płatki małżowiny usznej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przy łagodnym mieszaniu.Po 20 minutach pokrój tkanki na mniejsze kawałki, aby ułatwić ich trawienie, a następnie wprowadź próbki z powrotem do inkubatora. Po 40 minutach przerwij proces trawienia za pomocą 10 mM EDTA i umieść płytkę na lodzie. Używając pipety 1 ml z odciętą końcówką, przenieś całą zawartość każdej studzienki do nowych studzienek zawierających sita o rozmiarze 70 µm.Następnie należy użyć tłoka strzykawki o pojemności 5 ml, aby rozdzielić fragmenty tkanki ucha, wykonując ruchy okrężne, tak jak pokazano przed chwilą. Gdy pozostanie tylko biała tkanka łączna i włosy, należy przepłukać sitka i dołki za pomocą DPBS z dodatkiem FBS i EDTA, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, zbierając płukanki do probówki o pojemności 50 ml umieszczonej na lodzie. Na koniec należy dwukrotnie przepłukać dołek uzupełnionym DPBS i przelać płukankę do probówki znajdującej się na lodzie.Na tym filmie można zaobserwować migrację sporozoitów osłabionych promieniowaniem do skóry myszy 15 minut po wstrzyknięciu pasożytów drogą śródskórną. 24 godziny po śródskórnym wstrzyknięciu sporozoitów izoluje się wszystkie komórki ze skóry i drenującego węzła chłonnego. Jak widać na tej rycinie, częstość występowania komórek mieloidalnych w skórze i drenującym węźle chłonnym jest wyraźnie zwiększona w porównaniu z myszami naiwnymi.Po opanowaniu techniki, pierwsze etapy protokołu – od naświetlania komarów do wstrzyknięcia sporozoitów – można zrealizować w ciągu czterech godzin. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że sporozoity wyizolowane z gruczołów ślinowych komarów szybko tracą zdolność do infekcji. Dlatego muszą one zostać wstrzyknięte tak szybko, jak to możliwe.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak izolować komórki mieloidalne ze skóry myszy oraz z drenażowego węzła chłonnego w celu zbadania odpowiedzi immunologicznej na śródskórne wstrzyknięcie żywych atenuowanych pasożytów plasmodium.

myeloid-cell-isolation-from-mouse-skin-draining-lymph-node-following

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niektóre szczepy myszy są odporne na indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mielnowodnego (EAE) za pomocą podstawowego białka mieliny. Opisano tutaj prosty protokół immunizacji, który przełamuje tę brak reakcji i indukuje chorobę porażenną u kilku typowych szczepów myszy odpornych na EAE.

Przełamanie braku reakcji u szczepów myszy odpornych na eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) poprzez transfer adopcyjny i stymulację antygenową

Ten film demonstruje test do monitorowania migracji komórek dendrytycznych po zakażeniu opuszki stopy Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG u myszy. Po zakażeniu bakteryjnym aktywowane komórki DC skóry są znakowane przepuszczalnym dla komórek barwnikiem estru sukcynimidylu dioctanu karboksyfluoresceiny (CFSE). Po odpowiednim odstępie czasu na migrację DC do węzła chłonnego drenującego podniebienie, komórki węzła są izolowane i poddawane barwieniu immunologicznemu w celu uzyskania...

Test oparty na CFSE do monitorowania migracji komórek dendrytycznych skóry do drenujących węzłów chłonnych u zakażonych myszy

Ten film demonstruje test do immunizacji modelu myszy żywymi, atenuowanymi sporozoitami. Osłabione promieniowaniem sporozoity Plasmodium są wstrzykiwane do grzbietowej strony ucha myszy. Po wstrzyknięciach w wielu miejscach na obu uszach mysz może dojść do siebie.

Immunizacja śródskórna żywymi atenuowanymi sporozoitami w modelu mysim

Profilaktyczne i terapeutyczne szczepienia często nie stymulują silnej odpowiedzi immunologicznej z powodu tygodniowego drenażu szczepionki do węzłów chłonnych, a w konsekwencji słabego zaangażowania komórek odpornościowych. Poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie szczepionki do węzłów chłonnych, tzw. wstrzyknięcie dolimfatyczne, można znacznie poprawić skuteczność szczepionki i zmniejszyć dawki szczepionki.

Immunoterapia dolimfatyczna i szczepienie u myszy

Skóra jest domem dla złożonej sieci komórek odpornościowych. Opisujemy skuteczną metodologię trawienia skóry myszy z różnych części ciała zwierzęcia w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej i analizy różnych populacji leukocytów znajdujących się w skórze za pomocą cytometrii przepływowej.

Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych do analizy cytofluorymetrycznej z różnych obszarów skóry myszy

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Ten protokół opisuje enzymatyczne trawienie skóry myszy w pożywce bogatej w składniki odżywcze, a następnie separację gradientową w celu wyizolowania leukocytów.  Uzyskane w ten sposób ogniwa mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań końcowych. Jest to skuteczna, ekonomiczna i ulepszona alternatywa dla maszyn do dysocjacji tkanek i ostrzejszych protokołów trawienia tkanek opartych na trypsynie i dyspazie.

Izolacja naciekających leukocytów ze skóry myszy za pomocą trawienia enzymatycznego i separacji gradientowej

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Opisano test na myszach do śledzenia migracji komórek ze skóry do drenującego węzła chłonnego, który umożliwia scharakteryzowanie komórek dendrytycznych skóry zmobilizowanych do węzła chłonnego po zakażeniu opuszki stopy Bacille Calmette-Guérin.

Test oparty na CFSE do badania migracji komórek dendrytycznych skóry myszy do drenujących węzłów chłonnych podczas zakażenia Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin

Tutaj opisujemy nową metodę, która pomaga wyjaśnić mechanizmy odporności komórkowej na Plasmodium podczas fazy infekcji krwi. Jest to test in vitro, który mierzy zabijanie zakażonych krwinek czerwonych przez limfocyty cytotoksyczne.

In vitro Test zabijania krwinek czerwonych zakażonych zarodźcem przez limfocyty cytotoksyczne

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Poznaj izolację komórek szpikowych ze skóry myszy i drenaż węzłów chłonnych po szczepieniu śródskórnym atenuowanymi sporozoitami Plasmodium. Ta metoda umożliwia analizę rekrutacji komórek immunologicznych i odpowiedzi zapalnej na pasożyta malarii.

Izolacja komórek szpikowych ze skóry myszy i drenaż węzłów chłonnych po szczepieniu śródskórnym żywymi atenuowanymi sporozoitami zarodźca (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja komórek szpikowych ze skóry myszy i drenaż węzłów chłonnych po szczepieniu śródskórnym żywymi atenuowanymi sporozoitami zarodźca

Przeglądaj więcej filmów