Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Ogólnym celem tego protokołu jest opracowanie wysokowydajnej i wysokowydajnej metody generowania komórek dendrytycznych lub DC, które w fatalny sposób odzwierciedlają ich fenotypową i funkcjonalną rozbieżność in vivo. Komórki dendrytyczne występują jako wielkie populacje w narządach limfatycznych. Dlatego używamy liganda filtrującego, aby zwiększyć częstotliwość tych niezbędnych komórek w tkankach dawcy, aby ułatwić tę izolację.

Główną zaletą tej techniki jest to, że usuwa ona generowanie wszystkich podzbiorów DC w odpowiednich liczbach do analizy przy użyciu tylko dostępnych na rynku czynników. Aby zebrać ligand flt-3 wyrażający komórki czerniaka B16 z 90% zlewającej się hodowli, najpierw umyj komórki PBS i inkubuj kulturę z 05% trypsyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 5 minutach wygasić aktywność proteazy za pomocą 20 mililitrów pożywki o pełnej temperaturze 4 stopni Celsjusza i oderwać przylegającą warstwę modelu komórkowego za pomocą lekkiego stukania i delikatnego pipetowania.

Zbierz komórki przez odwirowanie i policz je. Następnie ponownie zawiesić zawiesinę pojedynczych komórek na 1 razy do stężenia 8 komórek na mililitr w PBS w celu ich podskórnego wstrzyknięcia myszom biorcom C57 black 6. Gdy guz osiągnie średnicę od dwóch do dziesięciu mililitrów, zbierz śledziony od zwierząt z guzem i umieść śledziony na szalce Petriego zawierającej świeżą pożywkę RPMI.

Za pomocą skalpela pokrój tkanki na kawałki o powierzchni 0,2 centymetra kwadratowego, a następnie inkubuj fragmenty w dziesięciu mililitrach kolagenazy i Dnazy w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 30 minutach wlej częściowo strawioną zawiesinę tkankową na sitko o wielkości 70 mikronów i użyj pięciomililitrowego tłoka strzykawki, aby przecisnąć pozostałe fragmenty tkanki przez siatkę sitka. Przepłucz filtr 10 mililitrami świeżego podłoża, łącząc płukanie z resztą zawiesiny jednokomórkowej i osadzając komórki.

Zawiesiliśmy osad komórkowy w 2 mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie umyj komórki w 10 mililitrach świeżego podłoża RPMI i ponownie zawieś je w ilości 1 razy 10 do 8 komórek na mililitr w buforze do sortowania komórek zawierającym blok FC. Aby wyizolować DC cytody osocza, dokładnie wymieszaj 300 mikrolitrów koktajlu przeciwciał znakowanych biotyną z zestawu do izolacji DC cytody osocza z 200 mikrolitrami zawiesiny pojedynczej komórki śledziony.

Umieść komórki w lodowatej kąpieli wodnej na 15 minut, delikatnie stukając co trzy minuty. Następnie umyj komórki 12 mililitrami buforu do sortowania komórek i ponownie zawieś granulat w 500 mikrolitrach świeżego buforu do sortowania. Następnie inkubuj komórki w 300 mikrolitrach antybiotyny, kulek sprzężonych z przeciwciałami przez kolejne 15 minut w lodowatej wodzie z regularnym stukaniem.

Po umyciu komórek w świeżym buforze sortującym, ponownie zawieś paletę w 2 mililitrach bufora do sortowania komórek i załaduj kolumnę magnetyczną o odpowiedniej wielkości na odpowiedni magnes. Zrównoważyć kolumnę pięcioma mililitrami świeżego buforu do sortowania komórek o temperaturze 4 stopni Celsjusza. Gdy cały bufor zostanie opróżniony z górnej części kolumny, ostrożnie dodaj komórki do środka powierzchni głowicy kolumny i zbierz przepływ

Następnie umyj kolumnę 10 mililitrami świeżego buforu sortującego o temperaturze 4 stopni Celsjusza i zbierz przepływ do tej samej probówki. Po przejściu przez drugą kolumnę magnetyczną można spodziewać się populacji komórek dendrytycznych cytody plazmy o czystości większej niż 94%. Aby wyizolować CD8apluca + i CD8alpha-DC, wymieszaj resztę zawiesiny komórek śledziony ze 100 mikrolitrami koktajlu przeciwciał sprzężonych z biocją z zestawu do izolacji komórek dendrytycznych CD8alpha + przez 15 minut na lodzie z delikatnym stukaniem, jak właśnie pokazano.

Pod koniec inkubacji umyj komórki w 12 mililitrach buforu do sortowania komórek o temperaturze 4 stopni Celsjusza i ponownie zawieś osad w 150 mikrolitrach świeżego buforu do sortowania komórek o temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie wymieszaj komórki ze 100 mikrolitrami kulek antybiotynowych CD8alpha + zestaw do izolacji komórek dendrytycznych. Po 15 minutach na lodzie z delikatnym stukaniem, umyj komórki w 10 mililitrach buforu do sortowania komórek o temperaturze 4 stopni Celsjusza i ponownie zawieś granulat w 1 mililitrze świeżego buforu sortującego o temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji posortuj komórki przez magnetyczne oddzielanie kulek, jak właśnie pokazano, zbierając przepływ i pierwsze płukanie. Następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze świeżego bufora do sortowania komórek o temperaturze 4 stopni Celsjusza. Teraz oznacz komórki 200 mikrolitrami sprzężonych kulek magnetycznych anty-CD8aplha z zestawu i przepuść komórki przez nową kolumnę, zbierając przepływ komórek CD8alfa-dendrytycznych.

Aby zebrać CD8alpha + DCs, przenieś kolumnę do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i zanurz 5 mililitrów świeżego bufora do sortowania komórek o temperaturze 4 stopni Celsjusza przez kolumnę. Po przepuszczeniu komórek przez drugą kolumnę można spodziewać się ponad 96% populacji komórek dendrytycznych CD8alfa +. Aby wyizolować komórki CD8alfa, odkręć zawiesinę komórek przepływowych CD8alfa.

Następnie oznacz komórki 100 mikrolitrami kulek c-magnetycznych anty-CD11 i zbierz populację komórek dodatnich z kulkami magnetycznymi, jak właśnie pokazano, aby uzyskać ponad 97% populacji komórek dendrytycznych CD8alfa. Na koniec określ liczbę żywych komórek, wykluczając błękit trypanowy. Gdy guz staje się wyczuwalny, myszy z guzem ligandu B16 flt-3 konsekwentnie wykazują dramatyczny wzrost komórkowości śledziony, który koreluje z ekspansją podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony.

Co ciekawe, podczas gdy 15 do 20-krotny wzrost bezwzględnej liczby komórek obserwuje się dla konwencjonalnych DC u tych zwierząt, tylko około 4-krotny wzrost obserwuje się dla podzbioru DC cytody osocza. Różne podzbiory komórek dendrytycznych są scharakteryzowane zgodnie z ich ekspresją B220, CD11b, CD11c i CD8alpha. Populacje komórek wykazują również inne unikalne markery podzbioru, jednak mPDCA1 ulega ekspresji wyłącznie na cytodach w osoczu, DEC205 ulega silnej ekspresji na CD8alpa+DCs, a CD11b i 33D1 są wykrywane najbardziej widocznie na CD8alpha-DCs.

Korzystając z tej metody, wykazaliśmy, że CD8alpa+DC są najbardziej skuteczne w prezentacji antygenów przez cząsteczki wiążące CD z wyspecjalizowaną populacją komórek T znaną jako niezmienne komórki NKT. Najważniejszą cechą izolacji DC jest utrzymanie ścisłej sterylności i warunków wolnych od antydoksantów. Podczas zabiegów te limfocyty T są wysoce wrażliwe na antydoksant.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z komórkami, ponieważ powtarzająca się stymulacja mechaniczna może zmienić stan dojrzewania komórek dendtrytycznych. Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do wyizolowania dużej liczby wszystkich głównych podzbiorów DC z pojedynczej śledziony. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.