Name: Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj wydajną metodę izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy przy użyciu ligandu Flt-3. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej czystości pDC, CD8α+ i CD8α− DC z śledziony do badań immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez AI45889 grantów NIH/NIAID dla S.A.P. Badania cytometrii przepływowej zostały przeprowadzone przy użyciu głównych urządzeń FACS wspieranych przez Einstein Cancer Center (NIH/NCI CA013330) i Center for AIDS Research (NIH/NIAID AI51519).

Eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania (IACUC). Wszystkie zabiegi wymagające sterylności wykonywane są w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
1. Implantacja czerniaka B16.Flt3L u myszy
<ol>
	<li>Hodowla linii komórkowej czerniaka B16 z ekspresją Flt-3 w kolbach hodowli tkankowej T25 o gęstości 0,5 x 106 komórek/ml w kompletnym pożywce DMEM z 10% CO2 w temperaturze 37 °C. Rosnąć, aż komórki osiągną ~90% konfluencji (~20 godzin).</li>
	<li>Zbierz komórki przez trawienie trypsyny. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć przylegające komórki PBS. Dodać 5 ml 0,05% trypsyny i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Dodać zimne 20 ml kompletnej pożywki DMEM (4 °C) zawierającej płodową surowicę cielęcą (FCS) w celu wygaszenia trawienia proteazy. Wyjmij komórki, lekko stukając, a następnie delikatnie pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika żywotności komórek. Zawiesić do gęstości 10-8 komórek/ml w PBS.</li>
	<li>Implanty myszy (C57BL / 6 lub inny szczep zgodny tkankowo) z komórkami nowotworowymi przez wstrzyknięcie podskórne, jak opisano przez Machholza i wsp.19 u podstawy szyjki ze 100 μl zawiesiny komórek (10,7 komórek).</li>
	<li>Pozwól guzowi rosnąć, aż stanie się wyczuwalny lub widoczny (średnica 2 - 10 mm, zwykle 7 - 12 dni) przed złożeniem zwierząt w ofierze do pobrania narządów.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej śledziony od myszy z nowotworem
<ol>
	<li>Znieczulij myszy przedawkowaniem izofluranu (dostosuj szybkość przepływu izofluranu do >5% i kontynuuj ekspozycję co najmniej 2 minuty po ustaniu oddychania). Złożyć w ofierze mysz z guzem czerniaka Flt-3 przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi eutanazji.</li>
	<li>Zdezynfekuj skórę 70% etanolem i zbierz śledzionę w sposób aseptyczny za pomocą sterylnych nożyczek 20.</li>
	<li>Umieścić śledzionę na sterylnej szalce Petriego w celu przetransportowania do komory bezpieczeństwa biologicznego. Od tego momentu wykonuj wszystkie kroki w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Przenieś śledzionę na świeżą szalkę Petriego i umyj pożywką RPMI. Śledzionę pokroić na małe (~0,2cm2) kawałki za pomocą skalpela. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C z 10 ml roztworu kolagenazy/DNazy.</li>
	<li>Wlać częściowo strawioną zawiesinę tkanki śledziony na sitko do komórek o wielkości 70 μm. Pozostałe fragmenty tkanek należy wycisnąć przez siatkę sitka za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Umyj filtr siatkowy 10 ml świeżego podłoża i wyrzuć filtr. Odwirować zawiesinę o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml buforu do lizy RBC. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Ugasić bufor do lizy RBC, dodając 10 ml kompletnej pożywki RPMI.</li>
	<li>Osadzać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić w odpowiedniej objętości do uzyskania gęstości komórek 10-8 komórek/ml w buforze do sortowania komórek (np. MACS) zawierającym 20 μg/ml przeciwciała blokowego Fc (2,4G2).</li>
</ol>
3. Oczyszczanie plazmocytoidów DC, CD8αPos DC i CD8αNeg DC z zawiesiny pojedynczej komórki śledziony
Uwaga: Izolacja podzbiorów DC śledziony od zawiesiny pojedynczej komórki jest procedurą wieloetapową, jak pokazano na rysunku 1. Wykonać wszystkie czynności, używając wstępnie schłodzonego buforu i lodowatej łaźni wodnej w celu utrzymania temperatury na poziomie 4-8 °C. Wszystkie objętości odczynników w następnej sekcji protokołu oblicza się dla początkowego wprowadzenia 200 μl zawiesiny komórek śledziony przy 10-8 komórkach/ml). Można to skalować w górę lub w dół w zależności od potrzeb, zmieniając objętość zawiesiny komórek (zawsze o gęstości 1 X 108 komórek/ml) i innych odczynników proporcjonalnie w początkowym etapie (3.1.1 i 3.2.1). Dostosuj odpowiednio objętości odczynnika we wszystkich późniejszych krokach. Na przykład, jeśli zaczynasz od 100 μl zawiesiny komórek śledziony o sile 1 x 108/ml, użyj połowy podanych objętości odczynnika we wszystkich krokach.
<ol>
	<li>Izolacja plazmocytoidalnych DC (pDC)
	<ol>
		<li>Dodać 300 μl koktajlu przeciwciał znakowanych biotyną dostarczonego w zestawie do izolacji plazmocytoidu DC do 200 μl zawiesiny komórek śledziony.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj i inkubuj w lodowatej kąpieli wodnej przez 15 minut. Stukaj w probówkę co 3 minuty, aby utrzymać komórki w zawieszeniu i zmaksymalizować wiązanie przeciwciał.</li>
		<li>Dodać 12 ml buforu do sortowania komórek i osadzać komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał biotynylowanych.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu do sortowania komórek. Dodać 300 μl kulek sprzężonych z przeciwciałami antybiotyny. Powtórz kroki 3.1.2 i 3.1.3.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 2 ml buforu do sortowania komórek. Wykonaj wszystkie czynności od tego momentu w temperaturze pokojowej, korzystając z wstępnie schłodzonych.</li>
		<li>Umieść świeżą kolumnę LS do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie w stojaku magnetycznym. Przemyć i wyrównać kolumnę 5 ml buforu do sortowania komórek.</li>
		<li>Odpipetować zawiesinę komórek na kolumnę, delikatnie nakładając ją na środek powierzchni łoża kolumny. Zbierz przepływ.</li>
		<li>Przemyć kolumnę 10 ml buforu do sortowania komórek. Zebrać ten przepływ i połączyć go z przepływem z kroku 3.1.7. PDC są wzbogacone w tym przepływie kolumnowym (FT1).</li>
		<li>Osadzać komórki z FT1 przez odwirowywanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić w 2 ml buforu do sortowania komórek i przepuścić komórki przez świeżą kolumnę LS, powtarzając czynności 3.1.6-3.1.8. To zastosowanie dwóch sekwencyjnych kolumn zapewnia zwiększoną czystość izolowanych komórek.</li>
		<li>Komórki osadu należy rozdmuchiwać przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić przy użyciu 2 ml pełnej prędkości obrotowej. Ułóż na lodzie, aż będzie potrzebny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja CD8αPos i CD8αNeg DCs 
	Uwaga: Pierwszym krokiem w tej procedurze jest wyczerpanie komórek B, pDC, T i NK.
	<ol>
		<li>Zaczynając od całej zawiesiny komórek śledziony (1 ml z 108 komórek/ml uzyskanych w kroku 2.8), dodaj 100 μl koktajlu przeciwciał sprzężonych z biotyną dostarczonego w zestawie do izolacji CD8αPos DC.</li>
		<li>Dobrze wymieszaj i inkubuj w lodowatej kąpieli wodnej przez 15 minut. Delikatnie postukaj w probówkę co 3 minuty, aby zmaksymalizować wiązanie przeciwciał znakowanych biotyną z ich komórkami docelowymi.</li>
		<li>Dodać 12 ml buforu do sortowania komórek i osadzać komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał biotynylowanych.</li>
		<li>Dodać 150 μl buforu do sortowania komórek i 100 μl kulek antybiotyny znajdujących się w zestawie izolacyjnym CD8αPos DC. Dobrze wymieszaj i inkubuj w lodowatej kąpieli wodnej przez 15 minut.</li>
		<li>Dodać 10 ml buforu do sortowania komórek i granulować komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 1 ml buforze do sortowania komórek i przepuścić przez nową kolumnę LS zgodnie z procedurą opisaną w krokach 3.1.6–3.1.8.</li>
		<li>Zbierz nieoznaczony przepływ przez 2 (FT2) i odrzuć retentat kolumny. Ta nieznakowana frakcja jest wzbogacona o CD8αPos i CD8αNeg DCs.</li>
		<li>Osadzać komórki w FT2 przez odwirowywanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ponownie zawieś komórki w 1 ml buforze do sortowania komórek i dodaj 200 μl sprzężonych kulek magnetycznych anty-CD8α dostarczonych w zestawie izolacyjnym CD8αPos DC.</li>
		<li>Powtórz kroki od 3.2.2 do 3.2.6. Przepływ przez kolumnę jest wzbogacony o CD8αNeg DC i zubożony o CD8αPos DC. Jest to oznaczone jako przepływ przez 3 (FT3).</li>
		<li>Aby wymyć CD8αPos DC zatrzymane w kolumnie, wyjmij kolumnę z magnesu, dodaj 5 ml buforu do sortowania komórek i przedmuchnij matrycę kolumny za pomocą tłoka dostarczonego z kolumną LS.</li>
		<li>Granulować komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml buforu do sortowania komórek. Aby zwiększyć czystość, wymywane komórki należy ponownie przepuścić przez nową kolumnę LS, powtarzając kroki 3.1.6 do 3.1.8, z wyjątkiem odrzucenia przepływu i zebrania zatrzymanych komórek, jak w ppkt 3.2.11.</li>
		<li>Aby oczyścić CD8αNeg DC z zawiesiny FT3, należy zagnieździć FT3 przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 300 μl buforu do sortowania komórek.</li>
		<li>Dodaj 100 μl kulek magnetycznych anty-CD11c. Dobrze wymieszaj i inkubuj w lodowatej kąpieli wodnej przez 15 minut.</li>
		<li>Dodać 10 ml buforu do sortowania komórek i komórek osadu przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Powtórz kroki od 3.1.5 do 3.1.8. Prądy stałe CD8αNeg są pozytywnie wybierane za pomocą koralików CD11c i są związane z kolumną. Przepływ można odrzucić.</li>
		<li>Eluować komórki zatrzymane w kolumnie, jak opisano w kroku 3.2.11, aby zebrać oczyszczone CD8αNeg DCs.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pulsujące APC z antygenami i transferem komórek
<ol>
	<li>Policz żywe komórki po oczyszczeniu, używając wykluczenia błękitu trypanowego 21 w celu odróżnienia żywych i martwych komórek.</li>
	<li>Inkubuj komórki z wybranym antygenem. Stosować analogi antygenu glikolipidowego zwanego ceramidem alfa-galaktozylu (αGalCer) w stężeniu 100 nM13. Zazwyczaj płytka 106 żywotnych komórek / studzienki w kompletnym podłożu RPMI przy użyciu 96-dołkowych płytek o bardzo niskim przyleganiu U-bottom, aby zminimalizować przyłączenie komórek. Inkubować komórki w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 1–4 godziny.</li>
	<li>Pobrać komórki, kilkakrotnie delikatnie pipetując. Używaj końcówek do pipet o szerokim otworze, aby zminimalizować uszkodzenia komórek spowodowane siłami ścinającymi. Umyj studzienki PBS i połącz te płuczki, aby zmaksymalizować zbieranie komórek.</li>
	<li>Granulować komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić do żądanej gęstości w PBS. Zazwyczaj wstrzykuje się 1 milion komórek w 200 μl na zwierzę biorcy. Utrzymuj komórki na lodzie, aby zmaksymalizować żywotność przed podaniem zwierzętom gospodarzom.</li>
	<li>Wstrzyknij komórki dożylnie myszom przez boczny ogon lub splot żylny zadoczodołowy 19. Użyć igły 27 G na strzykawce o pojemności 1 ml i wstrzyknąć maksymalną objętość 0,1 ml na mysz.</li>
</ol>

<ol><li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li>
<li>Dudziak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+antigen+processing+by+dendritic+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo.</a> Science. 315 (5808), 107-111 (2007).</li>
<li>Belz, G. T., Nutt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+programming+of+the+dendritic+cell+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional programming of the dendritic cell network.</a> Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).</li>
<li>den Haan, J. M., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+versus+activation-dependent+cross-presentation+of+immune+complexes+by+CD8%28%2B%29+and+CD8%28-%29+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).</li>
<li>Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation%3A+a+general+mechanism+for+CTL+immunity+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance.</a> Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).</li>
<li>Yamazaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+CD205%2B+splenic+dendritic+cells+are+specialized+to+induce+Foxp3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells.</a> J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).</li>
<li>Mukherjee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+steady-state+dendritic+cells+induces+deletion+of+diabetogenic+CD8%28%2B%29+T+cells+independently+of+PD-1+and+PD-L1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1.</a> Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).</li>
<li>Melief, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+Regulation+of+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+by+dendritic+cells%3A+peaceful+coexistence+of+cross-priming+and+direct+priming%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming.</a> Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).</li>
<li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biology of NKT cells.</a> Annu Rev Immunol. 25, 297-336 (2007).</li>
<li>Benlagha, K., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1d-restricted+mouse+V+alpha+14+and+human+V+alpha+24+T+cells%3A+lymphocytes+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity.</a> Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
<li>Arora, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+subset+of+dendritic+cells+controls+the+cytokine+bias+of+natural+killer+T+cell+responses+to+diverse+glycolipid+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens.</a> Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).</li>
<li>Semmling, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+cross-priming+through+CCL17-CCR4-mediated+attraction+of+CTLs+toward+NKT+cell-licensed+DCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs.</a> Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).</li>
<li>Duriancik, D. M., Hoag, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+and+enumeration+of+dendritic+cell+populations+from+individual+mouse+spleen+and+Peyer%27s+patches+using+flow+cytometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis.</a> Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).</li>
<li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3+ligand+regulates+dendritic+cell+development+from+Flt3%2B+lymphoid+and+myeloid-committed+progenitors+to+Flt3%2B+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).</li>
<li>Mach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+dendritic+cells+stimulated+in+vivo+by+tumors+engineered+to+secrete+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+or+Flt3-ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand.</a> Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).</li>
<li>Vremec, D., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+purification+of+large+numbers+of+antigen+presenting+dendritic+cells+from+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen.</a> Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReeves%2C+JP+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. , (2001).</li>
<li>Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrober%2C+W+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. , (2001).</li>
<li>Vremec, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+dendritic+cell+viability+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Maintaining dendritic cell viability in culture.</a> Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przyjmuje się, że komórki dendrytyczne są głównymi profesjonalnymi komórkami prezentującymi antygen zaangażowanymi w pobudzanie odpowiedzi limfocytów T. Ich główną funkcją jest badanie mikrośrodowiska tkanek poprzez pobieranie i przetwarzanie antygenów w celu prezentacji limfocytom T. Aby zbadać funkcję określonych podzbiorów DC, należy je wyizolować w wystarczającej liczbie przy użyciu podejścia, które zachowuje ich normalny fenotyp i funkcje. Większość protokołów opiera się na izolacji określonego podzbioru DC od naiwn...

Komórki dendrytyczne (DC) zostały odkryte prawie czterdzieści lat temu jako "duża komórka gwiaździsta (grecki dendron)" znajdująca się w narządach limfoidalnych1. Wiele badań wykazało, że DC są jedynymi komórkami prezentującymi antygen, które mogą skutecznie stymulować naiwne limfocyty T2. Główną funkcją tych komórek jest wychwyt i prezentacja antygenów oraz ich efektywne przetwarzanie i ładowanie ich na cząsteczki prezentujące antygen. W śledzionie myszy DC można podzielić na podzbiory plazmocytoidalne i konwencjonalne. Plazmocytoidy DC charakteryzują się niską ekspresją CD11c i wysokimi poziomami B220 i Gr-1. Są one również dodatnie dla markera powierzchniowego mPDCA1 i wydzielają interferon typu I w odpowiedzi na ligandy receptora toll like 9 (TLR9). Konwencjonalne prądy stałe są wysokie dla ekspresji CD11c i MHC klasy II. Można je podzielić na trzy odrębne podzbiory w oparciu o powierzchniową ekspresję markerów fenotypowych, takich jak CD4, CD8α, DEC205, CD11b i białka receptora hamującego komórki dendrytyczne 2 (DCIR2, rozpoznawane przez przeciwciało 33D1) 3,4. CD8αPos DC są również znane jako cDC1, są dodatnie dla DEC205, ale ujemne dla markerów szpikowych, takich jak CD11b i 33D1. CD8αNeg DC, zwane również cDC2, są dodatnie dla 33D1, CD11b i CD4, ale nie mają DEC205. Podzbiór podwójnie ujemny (tj. ujemny zarówno dla CD4, jak i CD8α) jest stosunkowo rzadki i jest ujemny dla DEC205 i 33D1. Jest to najmniej scharakteryzowany podzbiór i może być mniej zróżnicowaną formą CD8αNeg DC.
Różnice fenotypowe w różnych podzbiorach DC rozciągają się również na ich funkcje in vivo. CD8αNeg DC są silnie fagocytarne i uważa się, że prezentują antygen egzogenny głównie za pośrednictwem komórek T MHC klasy II do CD4 3. W przeciwieństwie do tego, CD8αPos DC są wyspecjalizowane w prezentacji rozpuszczalnego antygenu białkowego na MHC klasy I w mechanizmie zwanym prezentacją krzyżową. Wynik prezentacji krzyżowej zależy od statusu aktywacji tych DC5 i może prowadzić do ekspansji cytotoksycznych limfocytów T (CTL) lub rozwoju limfocytów T regulatorowych 62,7. Kierowanie antygenu do CD8αPos DC za pomocą dostarczania za pośrednictwem przeciwciał anty-DEC205 powoduje w dużej mierze delecję limfocytów T8, podczas gdy prezentacja antygenów pochodzących z zakażonych komórek apoptotycznych indukuje silną odpowiedź CTL 9.
Oprócz rozpoznawania antygenów peptydowych, układ odpornościowy ssaków ewoluował w kierunku rozpoznawania antygenów lipidowych i glikolipidowych. Antygeny te są prezentowane przez cząsteczki CD1, które są białkami powierzchniowymi komórek podobnymi do MHC klasy I, które występują w wielu pokrewnych formach u różnych ssaków. U myszy pojedynczy typ wysoce konserwatywnej cząsteczki CD1 o nazwie CD1d jest odpowiedzialny za prezentację antygenów glikolipidowych 10. Główna populacja limfocytów T, które rozpoznają kompleksy CD1d / glikolipidowe, nazywana jest niezmiennymi komórkami NKT (komórki iNKT). Komórki te wyrażają półniezmienny receptor limfocytów T (TCR) składający się z niezmiennego łańcucha TCRα, który jest sparowany z łańcuchami TCRβ, które mają ograniczoną różnorodność 11. W przeciwieństwie do konwencjonalnych limfocytów T, które muszą się namnażać i różnicować, aby stać się aktywowanymi efektorowymi limfocytami T, komórki iNKT istnieją jako populacja efektorowa i zaczynają szybko reagować po podaniu glikolipidów 12. Identyfikacja fizjologicznie istotnych komórek prezentujących antygen lipidowy jest aktywnym obszarem badań i zasugerowano, że kilka różnych typów komórek, takich jak limfocyty B, makrofagi i DC, pełni tę funkcję. Wykazano jednak, że podzbiór CD8αPos DC jest główną komórką pośredniczącą w wychwytywaniu i prezentacji antygenów lipidowych mysim komórkom iNKT 13 oraz mieszanemu primingowi glikolipidów limfocytów T CD8 14.
Aby porównać skuteczność prezentacji antygenu przez różne komórki prezentujące antygen, prostym podejściem jest przeniesienie różnych typów oczyszczonych APC pulsujących równoważnymi ilościami antygenu do naiwnych gospodarzy. Eksperymenty z transferem komórek tego typu są często wykonywane w badaniach immunologicznych. Jednak przeprowadzenie badań transferu z DC traktowanymi antygenem ex vivo jest trudne, ponieważ komórki te występują jako rzadkie populacje w narządach limfatycznych, gdzie stanowią mniej niż 2% wszystkich komórek15. W związku z tym konieczne jest przyspieszenie rozwoju tych komórek u zwierząt dawców w celu zwiększenia skuteczności protokołów izolacji.
Wiadomo, że wspólne komórki progenitorowe limfoidalne i szpikowe, które są niezbędne do generowania podzbiorów pDC, CD8Pos i CD8Neg DC, wykazują ekspresję receptorowej kinazy tyrozynowej 3 (Flt-3) związanej z fms. Po podaniu in vivo ligandu Flt-3 (Flt-3L) emigracja komórek progenitorowych wykazujących ekspresję Flt-3 ze szpiku kostnego jest zwiększona, co skutkuje zwiększonym wysiewem obwodowych narządów limfatycznych i ekspansją ich dojrzałego potomstwa DC16. Ekspresja Flt-3 jest tracona podczas angażowania się w szlaki różnicowania komórek B, T lub NK. Dlatego po podaniu Flt-3L obserwuje się tylko minimalne zmiany w tych komórkach. Podobną ekspansję w populacjach DC obserwuje się u myszy z guzami powstałymi w wyniku implantacji linii komórkowej B16-czerniaka wydzielającej mysi Flt-3L, co zapewnia prostą i ekonomiczną metodę zapewnienia trwałego ogólnoustrojowego poziomu Flt-3L17,18. Stosując to podejście, opracowaliśmy protokół oparty na implantacji komórek czerniaka B16 wydzielających Flt-3L w celu stymulowania ekspansji wszystkich normalnych podzbiorów DC w śledzionie myszy, zwiększając w ten sposób wydajność tych komórek, które można wyizolować do kolejnych eksperymentów. Konsekwentnie stwierdzamy, że w ciągu 10 - 14 dni po podskórnym wszczepieniu guza wydzielającego Flt-3 u myszy rozwija się splenomegalia z wyraźnym wzbogaceniem DC do 40-60% wszystkich komórek śledziony. Z tych śledzion, różne podzbiory DC można wyizolować z wysoką czystością przy użyciu standardowych dostępnych na rynku zestawów do oczyszczania komórek, które wykorzystują markery fenotypowe specyficzne dla podzbioru.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS019936-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I (suchy proszek)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>200 proof etanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9-6705-004-220</td><td>Służy do przygotowania 70% etanolowego</td></tr><tr><td>buforu do lizy RBC</td><td>Pożywka Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 z L-glutaminą&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka DMEM z L-glutaminą&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-glutamina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminokwasy endogenne&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy egzogenne MEM&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>11130-051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS Ca2+ i Mg2+ pH 7.2)</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (DPBS z Ca2+ i Mg2+)</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>14040-182</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M roztwór etylenodiaminotetraoctanu (EDTA)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna&nbsp;</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy (suchy proszek)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146-5G&nbsp;</td><td>Przygotuj 0,08% z PBS</td></tr><tr><td>Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mysz</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-786</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne sprzężone z anty-mysim CD11c&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-152-001</td><td></td></tr><tr><td>CD8&alfa; Pos zestaw izolacyjny DC myszy&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-169</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało blokujące receptor Fc-gamma (klon 2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysie CD11c-FITC&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553801</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz CD8&alpha;-PerCP&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553036</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz B220-PE&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553090</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 1 ml&nbsp;</td><td>Igła BD</td><td>26048</td><td></td></tr><tr><td>23 G1&nbsp;</td><td>Szalki</td> Petriego BD <td>305145</td><td></td></tr><tr><td>100 mm&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia chirurgiczne&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek (70 &mikro; m)</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Duże płytki Petriego&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>System filtracji próżniowej (500 ml (0,22 &mikro; m))</td><td>Kolumny Corning</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>LS&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny Separator MACS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Szeroki otwór 200 &mu; l Końcówki do pipet&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>111623</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-dołkowe płytki z ultra niskim nasadką&nbsp;</td><td>Corning</td><td>CLS3474-24EA</td><td></td></tr><tr><td>6-8 tygodniowa samica myszy C57BL/6&nbsp;</td><td>Jackson Research Laboratories, Jax</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Murine B16.Flt3L linia komórkowa czerniaka</td><td>opisana przez Mach et al., 2000</td></tr><tr><td>Serum free DMEM i RPMI media 500 ml DMEM z L-glutaminą lub 500 ml RPMI-1640 z L-glutaminą 5 ml MEM aminokwasy endogenne (100x, 10&nbsp; mM) 5 ml buforu HEPES (1 M) 5 ml L-glutaminy (200&nbsp; mM) 0,5 ml 2-merkaptoetanolu (5,5 x 10-2 M)</td><td></td><td></td><td>Wymieszaj wszystkie składniki w komorze bezpieczeństwa biologicznego z pożywką DMEM lub RPMI, w zależności od potrzeb. Filtr sterylizuje media, przechodząc przez 0,22 i mikro; m system filtracji próżniowej.</td></tr><tr><td>Complete RPMI i DMEM pożywki</td><td></td><td></td>Dodaj <td>50 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej do surowicy wolnej od RPMI lub DMEM, aby uzyskać kompletną pożywkę.</td></tr><tr><td>MACS buffer</td><td></td><td></td><td>Dodać 2 ml 0,5 M EDTA i 10 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej do 500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, Ca2+ i Mg2+ Free, pH 7,2) i 2&nbsp; &mikro; g/ml 2,4G2 (przeciwciało Fc-Block).</td></tr><tr><td>FACS bufor do barwienia</td><td></td><td></td><td>Rozpuścić azydek sodu do 0,05% (0,25 g na 500 ml) w buforze MACS, aby otrzymać bufor barwiący FACS</td></tr><tr><td>10x roztwór podstawowy kolagenazy D i DNazy 1 
Rozpuścić 1 g kolagenazy D i 0,2 ml preparatu DNazy 1 (1 mg/ml, 100x) w 20 ml PBS zawierającego Ca2+ i Mg2+ do uzyskania roztworu o stężeniu około 1,000-2,000 jednostek aktywności kolagenazy na ml.</td><td></td><td></td><td>Ten 10-krotny roztwór podstawowy można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -20 &deg; C przez kilka tygodni. Rozcieńczyć 1 ml tego roztworu w 9 ml wolnego RPMI w surowicy bezpośrednio przed użyciem.</td></tr></tbody></table>

wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Komórki dendrytyczne (DC) to profesjonalne komórki prezentujące antygen, głównie odpowiedzialne za pozyskiwanie, przetwarzanie i prezentowanie antygenów na cząsteczkach prezentujących antygen w celu zainicjowania odporności za pośrednictwem limfocytów T. Komórki dendrytyczne można podzielić na kilka fenotypowo i funkcjonalnie heterogenicznych podzbiorów. Trzy ważne podzbiory komórek dendrytycznych śledziony to plazmocytoidy, komórki CD8αPos i CD8αNeg. Plazmocytoidy DC są naturalnymi producentami interferonu typu I i są ważne dla odporności przeciwwirusowych komórek T. Podzbiór CD8αNeg DC specjalizuje się w prezentacji antygenu MHC klasy II i jest centralnie zaangażowany w pobudzanie limfocytów T CD4. CD8αPos DC są przede wszystkim odpowiedzialne za krzyżową prezentację egzogennych antygenów i pobudzanie limfocytów T CD8. Wykazano, że CD8αPos DC są najbardziej skuteczne w prezentacji antygenów glikolipidowych przez cząsteczki CD1d wyspecjalizowanej populacji komórek T znanej jako niezmienne komórki T NK (iNKT). Podanie liganda Flt-3 zwiększa częstość migracji komórek progenitorowych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego, co ostatecznie prowadzi do ekspansji komórek dendrytycznych w obwodowych narządach limfatycznych w modelach mysich. Dostosowaliśmy ten model do oczyszczania dużej liczby funkcjonalnych komórek dendrytycznych do wykorzystania w eksperymentach z transferem komórek w celu porównania biegłości in vivo różnych podzbiorów DC.

Wynik tej procedury opiera się na ekspansji subpopulacji komórek DC poprzez mysie Flt-3L ekspresjonowane przez zaimplantowane komórki czerniaka. Guz B16.Flt3L został wyizolowany z myszy C57BL/6 i powinien być implantowany zwierzętom o tym samym tle genetycznym, aby uniknąć niepowodzenia w rozwoju guza z powodu odrzutu. W niektórych przypadkach pożądane może być użycie myszy modyfikowanych genetycznie w celu uzyskania komórek DC z określonymi defektami w szlakach sygnalizacyjnych lub recep...

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Ogólnym celem tego protokołu jest opracowanie wysokowydajnej i wysokowydajnej metody generowania komórek dendrytycznych lub DC, które w fatalny sposób odzwierciedlają ich fenotypową i funkcjonalną rozbieżność in vivo. Komórki dendrytyczne występują jako wielkie populacje w narządach limfatycznych. Dlatego używamy liganda filtrującego, aby zwiększyć częstotliwość tych niezbędnych komórek w tkankach dawcy, aby ułatwić tę izolację.Główną zaletą tej techniki jest to, że usuwa ona generowanie wszystkich podzbiorów DC w odpowiednich liczbach do analizy przy użyciu tylko dostępnych na rynku czynników. Aby zebrać ligand flt-3 wyrażający komórki czerniaka B16 z 90% zlewającej się hodowli, najpierw umyj komórki PBS i inkubuj kulturę z 05% trypsyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 5 minutach wygasić aktywność proteazy za pomocą 20 mililitrów pożywki o pełnej temperaturze 4 stopni Celsjusza i oderwać przylegającą warstwę modelu komórkowego za pomocą lekkiego stukania i delikatnego pipetowania.Zbierz komórki przez odwirowanie i policz je. Następnie ponownie zawiesić zawiesinę pojedynczych komórek na 1 razy do stężenia 8 komórek na mililitr w PBS w celu ich podskórnego wstrzyknięcia myszom biorcom C57 black 6. Gdy guz osiągnie średnicę od dwóch do dziesięciu mililitrów, zbierz śledziony od zwierząt z guzem i umieść śledziony na szalce Petriego zawierającej świeżą pożywkę RPMI.Za pomocą skalpela pokrój tkanki na kawałki o powierzchni 0,2 centymetra kwadratowego, a następnie inkubuj fragmenty w dziesięciu mililitrach kolagenazy i Dnazy w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 30 minutach wlej częściowo strawioną zawiesinę tkankową na sitko o wielkości 70 mikronów i użyj pięciomililitrowego tłoka strzykawki, aby przecisnąć pozostałe fragmenty tkanki przez siatkę sitka. Przepłucz filtr 10 mililitrami świeżego podłoża, łącząc płukanie z resztą zawiesiny jednokomórkowej i osadzając komórki.Zawiesiliśmy osad komórkowy w 2 mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie umyj komórki w 10 mililitrach świeżego podłoża RPMI i ponownie zawieś je w ilości 1 razy 10 do 8 komórek na mililitr w buforze do sortowania komórek zawierającym blok FC. Aby wyizolować DC cytody osocza, dokładnie wymieszaj 300 mikrolitrów koktajlu przeciwciał znakowanych biotyną z zestawu do izolacji DC cytody osocza z 200 mikrolitrami zawiesiny pojedynczej komórki śledziony.Umieść komórki w lodowatej kąpieli wodnej na 15 minut, delikatnie stukając co trzy minuty. Następnie umyj komórki 12 mililitrami buforu do sortowania komórek i ponownie zawieś granulat w 500 mikrolitrach świeżego buforu do sortowania. Następnie inkubuj komórki w 300 mikrolitrach antybiotyny, kulek sprzężonych z przeciwciałami przez kolejne 15 minut w lodowatej wodzie z regularnym stukaniem.Po umyciu komórek w świeżym buforze sortującym, ponownie zawieś paletę w 2 mililitrach bufora do sortowania komórek i załaduj kolumnę magnetyczną o odpowiedniej wielkości na odpowiedni magnes. Zrównoważyć kolumnę pięcioma mililitrami świeżego buforu do sortowania komórek o temperaturze 4 stopni Celsjusza. Gdy cały bufor zostanie opróżniony z górnej części kolumny, ostrożnie dodaj komórki do środka powierzchni głowicy kolumny i zbierz przepływ.Następnie umyj kolumnę 10 mililitrami świeżego buforu sortującego o temperaturze 4 stopni Celsjusza i zbierz przepływ do tej samej probówki. Po przejściu przez drugą kolumnę magnetyczną można spodziewać się populacji komórek dendrytycznych cytody plazmy o czystości większej niż 94%. Aby wyizolować CD8apluca + i CD8alpha-DC, wymieszaj resztę zawiesiny komórek śledziony ze 100 mikrolitrami koktajlu przeciwciał sprzężonych z biocją z zestawu do izolacji komórek dendrytycznych CD8alpha + przez 15 minut na lodzie z delikatnym stukaniem, jak właśnie pokazano.Pod koniec inkubacji umyj komórki w 12 mililitrach buforu do sortowania komórek o temperaturze 4 stopni Celsjusza i ponownie zawieś osad w 150 mikrolitrach świeżego buforu do sortowania komórek o temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie wymieszaj komórki ze 100 mikrolitrami kulek antybiotynowych CD8alpha + zestaw do izolacji komórek dendrytycznych. Po 15 minutach na lodzie z delikatnym stukaniem, umyj komórki w 10 mililitrach buforu do sortowania komórek o temperaturze 4 stopni Celsjusza i ponownie zawieś granulat w 1 mililitrze świeżego buforu sortującego o temperaturze 4 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji posortuj komórki przez magnetyczne oddzielanie kulek, jak właśnie pokazano, zbierając przepływ i pierwsze płukanie. Następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze świeżego bufora do sortowania komórek o temperaturze 4 stopni Celsjusza. Teraz oznacz komórki 200 mikrolitrami sprzężonych kulek magnetycznych anty-CD8aplha z zestawu i przepuść komórki przez nową kolumnę, zbierając przepływ komórek CD8alfa-dendrytycznych.Aby zebrać CD8alpha + DCs, przenieś kolumnę do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i zanurz 5 mililitrów świeżego bufora do sortowania komórek o temperaturze 4 stopni Celsjusza przez kolumnę. Po przepuszczeniu komórek przez drugą kolumnę można spodziewać się ponad 96% populacji komórek dendrytycznych CD8alfa +. Aby wyizolować komórki CD8alfa, odkręć zawiesinę komórek przepływowych CD8alfa.Następnie oznacz komórki 100 mikrolitrami kulek c-magnetycznych anty-CD11 i zbierz populację komórek dodatnich z kulkami magnetycznymi, jak właśnie pokazano, aby uzyskać ponad 97% populacji komórek dendrytycznych CD8alfa. Na koniec określ liczbę żywych komórek, wykluczając błękit trypanowy. Gdy guz staje się wyczuwalny, myszy z guzem ligandu B16 flt-3 konsekwentnie wykazują dramatyczny wzrost komórkowości śledziony, który koreluje z ekspansją podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony.Co ciekawe, podczas gdy 15 do 20-krotny wzrost bezwzględnej liczby komórek obserwuje się dla konwencjonalnych DC u tych zwierząt, tylko około 4-krotny wzrost obserwuje się dla podzbioru DC cytody osocza. Różne podzbiory komórek dendrytycznych są scharakteryzowane zgodnie z ich ekspresją B220, CD11b, CD11c i CD8alpha. Populacje komórek wykazują również inne unikalne markery podzbioru, jednak mPDCA1 ulega ekspresji wyłącznie na cytodach w osoczu, DEC205 ulega silnej ekspresji na CD8alpa+DCs, a CD11b i 33D1 są wykrywane najbardziej widocznie na CD8alpha-DCs.Korzystając z tej metody, wykazaliśmy, że CD8alpa+DC są najbardziej skuteczne w prezentacji antygenów przez cząsteczki wiążące CD z wyspecjalizowaną populacją komórek T znaną jako niezmienne komórki NKT. Najważniejszą cechą izolacji DC jest utrzymanie ścisłej sterylności i warunków wolnych od antydoksantów. Podczas zabiegów te limfocyty T są wysoce wrażliwe na antydoksant.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z komórkami, ponieważ powtarzająca się stymulacja mechaniczna może zmienić stan dojrzewania komórek dendtrytycznych. Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do wyizolowania dużej liczby wszystkich głównych podzbiorów DC z pojedynczej śledziony. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

an-efficient-high-yield-method-for-isolation-mouse-dendritic-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja limfocytów przy użyciu zestawu Miltenyi MACs jest niezawodną metodą oczyszczania komórek z homogenatów całych tkanek limfatycznych. Komórki oczyszczone za pomocą systemu Miltenyi charakteryzują się zazwyczaj czystością ≥ 96%. W niniejszym materiale przedstawiamy kroki niezbędne do izolacji komórek T CD4+, wykorzystując jeden z wielu zestawów oferowanych przez firmę Miltenyi.

Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisano metodologię szybkiej izolacji komórek dendrytycznych (DCs) oraz makrofagów z jelit myszy. Charakterystyka fenotypowa jelitowych komórek dendrytycznych i makrofagów jest przeprowadzana za pomocą wielokolorowej analizy cytometrycznej, natomiast wzbogacanie za pomocą kulek magnetycznych z następującym po nim sortowaniem komórek jest stosowane w celu uzyskania populacji o wysokiej czystości do badań funkcjonalnych.

Izolacja i charakterystyka komórek dendrytycznych oraz makrofagów z jelit myszy

Ten film opisuje protokół generowania komórek dendrytycznych - kluczowych komórek prezentujących antygen, które aktywują limfocyty T - ze szpiku kostnego dorosłej myszy.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego: metoda generowania komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Ten film demonstruje procedurę adoptywnego transferu komórek dendrytycznych (DC) o wysokiej zawartości soli do myszy. Mysie komórki dendrytyczne CD11c+ (DC) są wystawione na działanie pożywki zawierającej duże ilości sodu, tworząc w komórkach addukty białka izolewuglandyny (IsoLG). Te addukty służą jako neoantygeny i są prezentowane na powierzchni DC. Komórki potraktowane wysoką solą są wstrzykiwane myszom poprzez adoptywny transfer komórek.

Metoda leczenia komórek dendrytycznych o wysokiej zawartości soli i ich adoptywnego transferu do myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Opisujemy tutaj metodę izolowania i oczyszczania komórek dendrytycznych z różnych anatomicznych przedziałów w ludzkim żeńskim układzie rozrodczym w celu oceny ich cech fenotypowych i funkcjonalnych. Metodę tę można dostosować do izolowania innych komórek odpornościowych lub komórek dendrytycznych z innych tkanek błony śluzowej.

Izolacja komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego do badań fenotypowych i funkcjonalnych

DC (MoDC) pochodzące z monocytów może wykrywać niewielkie ilości cząsteczek związanych z niebezpieczeństwem i dlatego jest łatwo zapoczątkowane. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji MoDC z krwi i nowotworów oraz ich aktywacji za pomocą kompleksów immunologicznych, podkreślając jednocześnie kluczowe środki ostrożności, które należy wziąć pod uwagę, aby uniknąć ich przedwczesnej aktywacji.

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych (TolDCs) oraz oceny ich immunoterapeutycznej użyteczności.

Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek dendrytycznych z mysich śledzion, poprzez magnetyczne sortowanie komórek, a następnie transfer adoptywny do naiwnych myszy. Model komórek dendrytycznych aktywowanych solą został wybrany, aby wyjaśnić krok po kroku procedury adoptywnej cytometrii transferowej i przepływowej.

Izolacja i transfer adoptywny komórek dendrytycznych prezentujących antygen traktowany wysoką solą

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Poznaj wydajną metodę izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy przy użyciu ligandu Flt-3. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej czystości pDC, CD8α+ i CD8α− DC z śledziony do badań immunologicznych.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Przeglądaj więcej filmów