Dlaczego kwantyfikacja ma znaczenie: charakterystyka fenotypów w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila

Ogólnym celem tej metodologii jest pokazanie, w jaki sposób można przeprowadzać analizy ilościowe cech anatomicznych. Wykazano ilościowe oznaczanie fenotypów wpływających na morfologię, wielkość i położenie jąder z mięśniami prążkowanymi larw drosophila. Zrozumienie mechanizmu molekularnego kontrolującego morfologię, wielkość i rozmieszczenie organelli wewnątrzkomórkowych jest jednym z najważniejszych pytań współczesnej biologii.

W przeszłości różnice morfologiczne między grupami eksperymentalnymi i w ich obrębie były poddawane jedynie analizie jakościowej. Tutaj proponujemy analizę ilościową, która łączy genetykę drosophila z morfometryczną analizą ilościową w celu zidentyfikowania genów kontrolujących wielkość, kształt i rozmieszczenie jąder w mięśniach. W demonstracji procedury pomoże Leire Ledahawski, doktorantka z mojego laboratorium.

Po wypreparowaniu i zabarwieniu larwalnych połączeń nerwowo-mięśniowych zgodnie z protokołem tekstowym, za pomocą kleszczy usuń próbki z 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej i połóż je na szkiełku przetwórczym. Za pomocą nożyczek do mikropreparowania odetnij głowę i ogon od filetów i utrzymuj ich wewnętrzne powierzchnie do góry. Teraz przygotuj szkiełko montażowe, owijając trzy paski taśmy celulozowej wokół czystego szkiełka w odległości jednego centymetra od siebie.

Oprzyj szkiełko nakrywkowe na tej przewidzianej szczelinie, aby nie spłaszczyło próbek. Następnie umieść około 20 mikrolitrów podłoża montażowego między paskami taśmy celulozowej i rozprowadź podłoże za pomocą czystych kleszczyków. Teraz usuń dodatkową tkankę z preparatów.

Przeciągnij wypreparowane larwy ze szkiełka roboczego na szkiełko montażowe i do podłoża montażowego, trzymając wewnętrzną powierzchnię do góry. Następnie delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe, uważając, aby nie zatrzymać powietrza. Następnie uszczelnij szkiełko przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw szkiełko do wyschnięcia na co najmniej 10 minut przed obrazowaniem.

Do tej analizy należy użyć obrazów konfokalnych przedstawiających mięśnie ścian ciała larw barwione przeciwciałami DeVAP, przeciwciałami laminowymi i markerem jądrowym. Następnie przeciągnij i upuść obrazy stosu konfokalnego Z na arenę. Kliknij dwukrotnie obrazy, aby automatycznie otworzyć je w widoku Surpass, dostępnym za pomocą ikony na pasku narzędzi.

Widok Surpass składa się z trzech głównych paneli przestrzeni roboczej. Obszar widoku, obszar Lista obiektów i obszar Właściwości obiektu. Następnie kliknij ikonę Widok 3D, aby utworzyć obraz z trzema kanałami renderowany objętościowo

Następnie wybierz opcję Dodaj nowe punkty pomiarowe z paska narzędzi Obiekty i postępuj zgodnie z instrukcjami Kreatora tworzenia w obszarze Właściwości obiektu. Najpierw wybierz kartę Edycja, a następnie w obszarze Określony kanał wybierz znacznik jądrowy lub kanał laminowy, aby podświetlić jądra. Następnie ustaw wskaźnik w trybie Select poprzez naciśnięcie zakładki Escape, a następnie dostosuj rozmiar pola kursora 3D za pomocą kółka myszy, aby zawierał dane jądro na obrazie.

Dodaj punkt pomiaru, przytrzymując Shift i klikając lewym przyciskiem myszy na tym samym jądrze. Następnie dodaj drugi punkt na pobliskim jądrze tego samego mięśnia, używając tej samej techniki. Między dwoma punktami zostanie automatycznie narysowana linia, a odległość między dwoma jądrami zostanie wyświetlona i zarejestrowana jako zmienna statystyczna.

Powtórz procedurę dla wszystkich jąder otaczających dane jądro. Następnie ze wszystkich zebranych punktów pomiarowych, znajdujących się w sekcji Statystyki Szczegółowe dane odległości, wybierz najkrótszą odległość. W obszarze Właściwości obiektu wybierz opcję Eksportuj statystyki z wyświetlaną zakładką do dostępnego pliku.

Spowoduje to zapisanie danych w arkuszu kalkulacyjnym. Do tej analizy użyj konfokalnych obrazów mięśni ściany ciała zabarwionych laminą i markerem jądrowym, aby uwidocznić jądra. Aby ocenić kształt mięśni, zmierz ich sferyczność, która porównuje powierzchnię jądra z powierzchnią kuli o tej samej objętości.

Alternatywnie zmierz eliptyczność, która rozróżnia prolate, spłaszczone lub elipsoidy i sferoidy. Otwórz obraz zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie kliknij ikonę Dodaj nowe powierzchnie na pasku narzędzi Obiekty.

W Kreatorze tworzenia, który pojawi się w obszarze Właściwości obiektu, wybierz barwienie znacznikiem jądrowym jako kanał źródłowy, aby wyświetlić jądra. Ustaw opcję Intensywność bezwzględna jako próg. Upewnij się, że większość jąder wykazuje płynne, nieprzeciążone renderowanie, zmieniając wartość na krzywej progowej.

Jednocześnie unikaj obecności lub niekompletnych masek jakichkolwiek jąder. Następnie użyj narzędzia Filtr, aby usunąć szum z renderingu powierzchniowego. Na karcie Edycja nowo utworzonej warstwy powierzchniowej podziel powierzchnie jąder, które są nieprawidłowo renderowane.

Inną opcją jest scalenie powierzchni jąder, które są nieprawidłowo renderowane. Wartości eliptyczności i sferyczności renderowanych jąder powierzchniowych są dostępne w zakładce Statystyka. Wyeksportuj te dane do analizy.

W tym protokole należy użyć obrazów konfokalnych przedstawiających mięśnie ścian ciała zabarwione markerem jądrowym i przeciwciałami specyficznymi dla laminy i DeVAP. Otwórz interesujący Cię obraz z pozycji menu głównego, Edytuj, a następnie Przytnij 3D. Postępuj zgodnie z instrukcjami Kreatora tworzenia powierzchni, korzystając z kanału lamin, zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji.

Po utworzeniu powierzchni kliknij Edytuj w obszarze Właściwości obiektów, a następnie wybierz opcję Maskuj wszystko, aby wyizolować sygnał wewnątrz jądra. Następnie wybierz sygnał DeVAP. Z menu rozwijanego Wybierz kanał kliknij opcję Ustaw woksele obok powierzchni i ustaw tę wartość na zero.

Spowoduje to utworzenie nowego zamaskowanego kanału dostępnego w oknie Dopasowanie wyświetlania. Aby zobrazować obecność sygnału wewnątrz jądra, utwórz płaszczyznę konturu, klikając ikonę Dodaj nową płaszczyznę tnącą na pasku narzędzi Obiekty. Następnie interaktywnie dostosuj kąt płaszczyzny przycinania i jej położenie, aby zobrazować rozkład sygnału wewnątrz jądra.

Mutacje typu missense w ludzkim białku B związanym z VAMP są związane z patogenezą ALS. Korzystając z opisanej metody, mięśnie prążkowane wyrażające gen ortologu muchy DeVAP będący siedliskiem ALS powodującego mutację V2601 porównano z kontrolnymi, wyrażającymi porównywalne poziomy DeVAP typu dzikiego lub wyższe poziomy DeVAP typu dzikiego. Analiza najbliższego sąsiedztwa została wykorzystana do oceny rozmieszczenia jąder wzdłuż włókien mięśniowych.

W porównaniu z mięśniami kontrolnymi wykazującymi ekspresję zmutowanego transgenu DeVAP lub nadmiernie eksprymującymi białko typu dzikiego, mutacja będąca przedmiotem zainteresowania spowodowała dramatyczne zmniejszenie średniej najkrótszej odległości między jądrami. Następnie zbadano kulistość jąder. Stwierdzono, że transgeny, które zmniejszały odstępy między jądrami, zwiększały również objętość jąder.

Rekonstrukcje 3D i renderowanie objętości jąder ujawniły, że mięśnie wyrażające mutację będącą przedmiotem zainteresowania tworzą klastry, które są zlokalizowane w jądrach. Metodę tę można również rozszerzyć na ilościową analizę cech morfologicznych związanych z innymi organellami, takimi jak mitochondria. Zmiany w architekturze, położeniu i wielkości jądra są związane ze starzeniem się i wieloma zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Parkinsona i ALS.

Zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw dyspraksji może prowadzić do identyfikacji nowych celów farmakologicznych dla skutecznych interwencji terapeutycznych.