Zoptymalizowana izolacja jąder ze świeżych i mrożonych próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego
13 października 2023
Protokół zapewnia niezawodne i zoptymalizowane podejście do izolacji jąder z próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego przy użyciu platformy 10x Genomics, w tym zalecenia dotyczące warunków dysocjacji tkanek, kriokonserwacji zawiesin pojedynczych komórek i oceny izolowanych jąder.
Wraz ze wzrostem naszej wiedzy na temat biologii nowotworów, zainteresowanie zrozumieniem zawiłości interakcji komórek w guzie może wpływać na wyniki pacjentów. Wzrosło również znaczenie analizy heterogenicznych komórek w mikrośrodowisku guza. Sekwencjonowanie wielozadaniowe, które umożliwia pozyskiwanie RNA pojedynczej komórki i sekwencjonowanie ataku z tej samej komórki w sposób sparowany komórkowy, stanowi znaczny postęp w tym kierunku.
Jakość danych uzyskanych z tych doświadczeń zależy jednak w dużym stopniu od jakości warunków doświadczalnych i wprowadzonego materiału biologicznego. Protokół ten zapewnia niezawodne i zoptymalizowane podejście do izolacji jąder z próbek guzów litych w celu sekwencjonowania wieloomowego przy użyciu platformy genomicznej 10X. Protokół ten jest niezawodny w przypadku świeżych lub mrożonych zawiesin jednokomórkowych.
Przedstawiamy zalecenia dotyczące warunków dysocjacji tkanek, kriokonserwacji zawiesin jednokomórkowych oraz oceny izolowanych jąder. W tym protokole używamy próbek ludzkiego gruczolakoraka przewodowego trzustki, który jest podstawowym typem tkanki w naszym laboratorium. Rak trzustki reprezentuje wysoce desmoplastyczny typ nowotworu, który udaje stosunkowo lepką tkankę, a także komórki.
Co więcej, ponieważ próbki guzów trzustki dostępne do badań są również stosunkowo małe, dokłada się starań, aby zmaksymalizować ilość wychwyconych komórek. Zacznij od przeniesienia wcześniej rozmrożonej zawiesiny komórek nowotworowych trzustki do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej i dodaj PBS, aby osiągnąć końcową objętość dwóch mililitrów. Następnie użyj hemocytometru, aby ocenić ilość i jakość komórek.
Po uzyskaniu osadu komórkowego przez wirowanie, przy użyciu coraz mniejszych końcówek pipet, ostrożnie zdekantować supernatant, aby zminimalizować dystrybucję osadu, jednocześnie maksymalizując dekantację płynu. Przygotuj jeden bufor do lizy komórek X, a następnie dodaj 100 mikrolitrów do 900 mikrolitrów wcześniej przygotowanego buforu do rozcieńczania lizy komórek, aby uzyskać 0,1X bufor do lizy komórek. Przenieś 100 mikrolitrów schłodzonego buforu do lizy komórek 0,1X do osadu komórkowego i delikatnie pipetuj pięć razy, aby zapewnić całkowitą ponowną zawiesinę.
Po inkubacji na lodzie przez trzy minuty, dodać jeden mililitr schłodzonego buforu do płukania do ponownie zawieszonego osadu i delikatnie pipetować pięć razy. Po odwirowaniu odrzucić supernatant w sposób przedstawiony i powtórzyć ten proces mycia jeszcze dwa razy. Załaduj trypanową zawiesinę zabarwioną na niebiesko do hemocytometru, aby policzyć liczbę jąder.
Ponownie zawiesić osad jądrowy w buforze jąder 1X w oparciu o docelowe odzyskiwanie jąder. Ostrożnie przepuść ponownie zawieszone jądra przez sitko do komórek z końcówką pipety o średnicy 40 mikrometrów, a następnie utrzymuj je na lodzie. Teraz ponownie policz jądra.
Jądra otrzymane tą metodą wykazywały odpowiednią wielkość i kształt. Sporadycznie można zaobserwować łagodne nakrapianie się otoczki jądrowej, które powinno być monitorowane podczas końcowej oceny jądrowej za pomocą hemacytometru.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia niezawodną i zoptymalizowaną metodę izolacji jąder komórkowych z próbek guzów litych do sekwencjonowania multiomowego z wykorzystaniem platformy 10x Genomics. Zawiera on zalecenia dotyczące warunków dysocjacji tkanek oraz krio konserwacji zawiesin pojedynczych komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Onkologia
- Genomika
Wprowadzenie
- Zrozumienie biologii nowotworów ma kluczowe znaczenie dla poprawy wyników leczenia pacjentów.
- Analiza heterogenicznych komórek w mikrośrodowisku guza staje się coraz bardziej istotna.
- Sekwencjonowanie multi-omiczne umożliwia sparowane pozyskiwanie danych z sekwencjonowania RNA i ATAC na poziomie pojedynczych komórek.
- Jakość danych w wysokim stopniu zależy od warunków eksperymentalnych oraz materiału biologicznego.
Cel badania
- Aby zapewnić niezawodny protokół izolacji jąder komórkowych z guzów litych.
- Aby poprawić jakość danych z sekwencjonowania multiomicznego.
- Aby ułatwić analizę mikrośrodowisk nowotworowych.
Zastosowane metody
- Izolacja jąder komórkowych z próbek guza litego.
- Wykorzystanie świeżych lub zamrożonych zawiesin pojedynczych komórek.
- Zalecenia dotyczące warunków dysocjacji tkanek.
- Techniki kriokonserwacji zawiesin pojedynczych komórek.
Główne wyniki
- Opracowano zoptymalizowane podejście do izolacji jąder komórkowych.
- Uzyskano wiarygodne wyniki zarówno z próbek świeżych, jak i zamrożonych.
- Poprawiono jakość danych dla sekwencjonowania multiomicznego.
- Przedstawiono wytyczne dotyczące przetwarzania tkanek i kriokonserwacji.
Wnioski
- Protokół zwiększa niezawodność izolacji jąder komórkowych z guzów.
- Wspiera on rozwój technik sekwencjonowania multiomicznego.
- Przyszłe badania mogą odnieść korzyść z poprawionych warunków eksperymentalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zoptymalizowana izolacja jąder komórkowych z próbek guzów litych jest kluczowa dla generowania wysokiej jakości danych z sekwencjonowania multiomowego, co bezpośrednio wpływa na wiarygodność analiz heterogeniczności nowotworów w onkologii translacyjnej. Niniejszy protokół rozwiązuje problem ekstrakcji nienaruszonych jąder z desmoplastycznych tkanek nowotworowych, zarówno świeżych, jak i zamrożonych, wspierając solidne profilowanie multiomowe pojedynczych komórek. Niezawodne przygotowanie jąder na tym etapie zwiększa pewność prognostyczną w późniejszych procesach odkrywania i opracowywania biomarkerów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia wysokiej wierności analizę heterogeniczności komórek nowotworowych na poziomie pojedynczych komórek.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez zachowanie zróżnicowanych populacji komórek podczas izolacji.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki dokładnej reprezentacji mikrośrodowiska guza.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Zapewnia standaryzowane preparaty jąder komórkowych dla powtarzalnych analiz sekwencjonowania multiomu.
- Gwarantuje spójność ilościową i jakościową materiału wejściowego dla dalszych etapów analizy.
- Poprawia gotowość do przeprowadzenia analizy poprzez możliwość wykorzystania zarówno świeżych, jak i krioskładowanych próbek guzów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wspiera odkrywanie biomarkerów translacyjnych, umożliwiając jednoczesne profilowanie RNA oraz dostępności chromatyny z tych samych próbek.
- Zachowuje istotność kliniczną w kontekście choroby dzięki odwzorowaniu złożoności mikrośrodowiska guzów litych.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez standaryzację jakości materiału wejściowego.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół izolacji jąder komórkowych znajduje się na styku przetwarzania tkanek i generowania danych multiomicznych, łącząc wczesne etapy odkryć z procesami badawczymi o charakterze translacyjnym.
- Biologia odkrywcza: Maksymalizuje moc testowania hipotez poprzez zachowanie różnorodności i integralności komórek.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, wysokiej jakości jądra komórkowe do skalowalnych analiz sekwencjonowania multiomu.
- Analityka: Umożliwia uzyskanie wiarygodnych odczytów ilościowych do porównywania stanów komórek nowotworowych i krajobrazów chromatyny.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów poprzez wspieranie sparowanych analiz single-cell RNA i ATAC-seq.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia znormalizowany, adaptowalny protokół dla różnych typów guzów litych i warunków próbek.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad biologią nowotworów i walidacją celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność w przypadku próbek nowotworowych świeżych i mrożonych.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza ryzyko utraty danych lub wprowadzenia artefaktów na etapie przygotowania próbek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowane do ryzyka wdrażanie programów odkrywania leków onkologicznych i badań translacyjnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w dysocjacji tkanek i obróbce jąder komórkowych w celu uzyskania optymalnej wydajności i jakości.
- Wymaga dostępu do specjalistycznych odczynników, sitek do komórek oraz narzędzi do oceny ilościowej.
- Konieczna jest standaryzacja warunków trawienia i lizy pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda musi zostać dostosowana do różnych typów nowotworów i wielkości próbek, zwłaszcza w przypadku tkanek desmoplastycznych.
- Uważne monitorowanie integralności jąder jest niezbędne, aby uniknąć artefaktów w dalszym sekwencjonowaniu.
