Name: Zoptymalizowana izolacja jąder ze świeżych i mrożonych próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T12:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 49 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę izolacji jąder z próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego. Protokół obejmuje warunki dysocjacji tkanek oraz krioprezerwację zawiesin komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Stanford Functional Genomics Facility (SFGF), w szczególności Dhananjay Wagh i Johnowi Collerowi, oraz 10x Genomics za pomoc w optymalizacji naszych eksperymentów. Chcielibyśmy również podziękować doktorom George'owi Poultsidesowi, Monice Dua, Brendanowi Visserowi i Byrne'owi Lee za pomoc w pozyskiwaniu próbek od pacjentów. Chcielibyśmy podziękować Artowi i Elaine Taylor, Fundacji Rantz oraz Warrenowi i Judy Kaplanom za ich hojne wsparcie naszych wysiłków badawczych. Źródła finansowania obejmują granty NIH 1F32CA23931201A1 (D.S.F.), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L.), Goldman Sachs Foundation (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), Damon Runyon Cancer Research Foundation (D.D., M.T.L.), Gunn/Olivier Fund, California Institute for Regenerative Medicine, Stinehart/Reed Foundation oraz Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine. Sekwencjonowanie uzyskano przy użyciu maszyn zakupionych ze środków NIH (S10OD025212, S10OD018220 i 1S10OD01058001A1).

Próbki ludzkiego raka trzustki (gruczolakorak przewodowy trzustki) zostały pobrane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IRB w naszym laboratorium. Uzyskano świadomą zgodę pacjentów na pobranie tkanek. Tkanka została przetransportowana z sali operacyjnej do laboratorium, a następnie przetworzona w następujący sposób.
1. Dysocjacja tkanek (trawienie)
<ol>
	<li>Przygotuj bufor trawienny (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Uzyskaj interesującą tkankę tak szybko, jak to możliwe po wycięciu guza i przetransportuj próbkę w buforze hartowniczym (DMEM F-12 z ~5% płodowej surowicy bydlęcej) lub 1x PBS na lodzie.</li>
	<li>Zmiel tkankę za pomocą czystych kleszczyków i nożyczek w 3-5 ml buforu do trawienia na szalce Petriego o średnicy 90 mm (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Przenieść zmieloną tkankę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dysocjować w ~10 ml buforu trawiennego przez 30 minut w temperaturze 37 °C, używając łaźni wodnej z funkcją wstrząsania lub suchego mieszadła.</li>
	<li>Wyjąć z mieszadła i zalać ~20 ml pożywki hartującej. Przefiltrować roztwór przez sitko o wielkości 100 μm do czystej stożkowej probówki.</li>
	<li>Zebrać pozostałą tkankę stałą z sitka (w razie potrzeby ponownie zmielić pozostałe kawałki tkanki) i umieścić w ~10 ml świeżego buforu do trawienia na kolejne 30 minut w temperaturze 37 °C z mieszaniem. Powtarzaj, aż cała tkanka nowotworowa zostanie zdysocjowana.</li>
	<li>Zebrać podwielokrotności zawiesiny komórek i przefiltrować przez 70 μm, a następnie sitko o wielkości 40 μm do czystej stożkowej rurki na lodzie.</li>
	<li>Odwirować do osadzania komórek w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie zdekantować supernatant.</li>
</ol>
2. Kriokonserwacja
<ol>
	<li>Przepłukać komórki, ponownie zawieszając osad w 1 ml 1x PBS.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę komórek (~1-10 milionów komórek/probówkę dla optymalnego zamrażania) do 1,5 ml kriowialu na lodzie.</li>
	<li>Odwirować do osadzania komórek w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie zdekantować supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml roztworu Bambankera, przenieść do 1,5 lub 2 ml kriowialnego (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2B) i zamrozić za pomocą pojemnika do zamrażania o szybkości chłodzenia -1 °C/min (zawierającego 100% alkoholu izopropylowego) w temperaturze -80 °C lub przenieść do ciekłego azotu, jeśli przewiduje się dłuższe przechowywanie próbki.</li>
</ol>
3. Izolacja jąder
<ol>
	<li>Szybko rozmrozić kriowialną zawiesinę komórkową i umieścić ją na mokrym lodzie.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę rozmrożonych komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i uzupełnić fiolkę do roztworu o objętości 2 ml 1x PBS w celu przepłukania komórek.</li>
	<li>Uzyskaj ręczne zliczanie komórek za pomocą hemocytometru, aby ocenić zarówno ilość, jak i jakość komórek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Odwirować do granulek o masie 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie delikatnie zdekantować supernatant za pomocą coraz mniejszych końcówek pipet, aby pozostawić suchy osad i utrzymać go na lodzie.
	<ol>
		<li>Do wszystkich etapów wirowania należy używać wirnika z odchylanym kubełkiem. Aby uzyskać maksymalną wydajność komórek, umieść probówki w wirówce z zawiasem skierowanym na zewnątrz, a następnie zdekantuj z końcówką pipety skierowaną na przeciwną stronę probówki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). 
		UWAGA: Do dekantacji supernatantu należy używać stopniowo mniejszych końcówek pipet do usuwania płynu, aby ograniczyć rozerwanie osadu, jednocześnie maksymalizując objętość dekantowanego płynu. Strategia ta jest szczególnie pomocna w dalszej części protokołu po ekstrakcji jąder, ponieważ osad jądrowy na ogół nie jest widoczny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 1x bufor do lizy komórek, bufor do rozcieńczania lizy komórek i bufor do płukania (<silna klasa = "xfig" > rysunek 3A) zgodnie z opublikowanym protokołem z następującymi modyfikacjami (patrz Tabela 1, Tabela materiałów): 
	UWAGA: Przed użyciem umieścić digitoninę na bloku grzewczym w temperaturze 65 °C, aby rozpuścić osad (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3B). Zwykle trwa to około 10 minut.</li>
	<li>Przygotuj 0,1x bufor do lizy komórek, łącząc 100 μl 1x buforu do lizy komórek i 900 μl buforu do rozcieńczania lizy komórek, delikatnie odpipetuj do wymieszania i umieść na lodzie.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl schłodzonego 0,1x buforu do lizy komórek i delikatnie pipetować, aby wymieszać 5x.</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 3 minuty (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</li>
	<li>Dodaj 1 ml schłodzonego buforu do płukania i pipetuj w górę iw dół, aby delikatnie wymieszać 5x.</li>
	<li>Odwirować do granulowania jąder o masie 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie zdekantować supernatant do postaci suchego osadu i utrzymywać na lodzie. 
	UWAGA: Jeśli początkowa liczba komórek jest niska (100 000-200 000 komórek), wykonaj etapy lizy i płukania komórek w probówce PCR o pojemności 200 μl zamiast w probówce mikrowirówki o pojemności 2 ml, aby zmniejszyć powierzchnię probówki i zminimalizować straty. W takim przypadku zmniejsz objętość bufora myjącego, aby dostosować się do mniejszej objętości rurki.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.9-3.10 2x, w sumie trzy prania.</li>
	<li>Ręcznie policz jądra za pomocą szkiełka hemocytometrycznego pod mikroskopem. W razie potrzeby użyj barwnika z błękitem trypanowym, aby zapewnić kontrast do oglądania jąder i pomóc w odróżnieniu jąder od niezlizowanych komórek.</li>
	<li>Przygotuj 1x Bufor Jąder zgodnie z opublikowanym protokołem: 20x Nuclei Buffer Stock, 1 mM DTT, 1 U/μL RNazy Inhibitor w wodzie wolnej od nukleaz i trzymaj na lodzie (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad jądrowy w 1x buforze jąder w oparciu o celowe odzyskiwanie jąder. 
	UWAGA: Jeśli stężenie jest wystarczająco wysokie, należy dążyć do docelowego odzysku 10 000 lub nieco wyższego na tym etapie (3 230-8 060 jąder/μl) podczas określania początkowej objętości refuzji, biorąc pod uwagę przewidywaną utratę objętości o 25 μl i 20% spadek stężenia przy filtrowaniu (krok 3.15).</li>
	<li>Delikatnie przepuść objętość zawieszonych jąder przez sitko do komórek z końcówką pipety o średnicy 40 μm i umieść jądra na lodzie (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3D).</li>
	<li>Przelicz jądra (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A-C). W razie potrzeby rozcieńczyć końcowy roztwór buforem jądrowym.</li>
	<li>Transportuj jądra na lodzie i natychmiast przystąp do wychwytywania jąder zgodnie z opublikowanymi protokołami.</li>
</ol>

Isolation of Nuclei for Multiome Sequencing in Solid Tumor Specimen

<ol><li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+and+spatial+transcriptomics+reveal+cancer-associated+fibroblasts+in+glioblastoma+with+protumoral+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects.</a> J Clin Invest. 133 (5), e147087(2023).</li>
<li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+advancing+our+understanding+of+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts.</a> Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).</li>
<li>Foster, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiomic+analysis+reveals+conservation+of+cancer-associated+fibroblast+phenotypes+across+species+and+tissue+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiomic analysis reveals conservation of cancer-associated fibroblast phenotypes across species and tissue of origin.</a> Cancer Cell. 40 (11), 1392-1406 (2022).</li>
<li>Hasan, S., Buechler, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+in+a+name%3F+An+emerging+framework+for+cancer-associated+fibroblasts%2C+myofibroblasts%2C+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">What's in a name? An emerging framework for cancer-associated fibroblasts, myofibroblasts, and fibroblasts.</a> Cancer Cell. 40 (11), 1273-1275 (2022).</li>
<li>Nuclei isolation from complex tissues for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).</li>
<li>Nuclei isolation from embryonic mouse brain tissue for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).</li>
<li>Januszyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+diabetic+and+non-diabetic+foot+ulcers+using+single-cell+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Characterization of diabetic and non-diabetic foot ulcers using single-cell RNA-sequencing.</a> Micromachines (Basel). 11 (9), 815(2020).</li>
<li>Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+relationship+of+wound+healing+and+tumor+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">The evolving relationship of wound healing and tumor stroma.</a> JCI Insight. 3 (18), e99911(2018).</li>
<li>Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+of+multiple+brain+cell+types+for+omics+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).</li>
<li>Foster, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+spatial+multiomics+reveals+fibroblast+fate+during+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118(2021).</li>
<li>Leiz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+adult+mouse+kidney+for+single-nucleus+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing.</a> J Vis Exp. (175), (2021).</li>
<li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+fresh+frozen+brain+tumors+for+single-nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> J Vis Exp. (162), e61542(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Rozplątywanie heterogenicznych populacji komórek obecnych w mikrośrodowisku guza jest aktywnym obszarem zainteresowania w biologii nowotworów. Podobnie złożone tkanki występują w łagodnych patologiach, takich jak gojenie się ran i zwłóknienie. Sekwencjonowanie wieloomowe okazało się potężnym narzędziem umożliwiającym pozyskiwanie danych sekwencyjnych scRNA i ATAC dla tych samych par komórek. Protokół ten opisuje izolację jąder, która wymaga optymalizacji w warunkach przetwarzania świeżych, delikatnych, małych próbek guza...

Wraz ze wzrostem naszej wiedzy na temat biologii nowotworów, wzrosło również znaczenie analizy heterogenicznych komórek w mikrośrodowisku guza1,2. Możliwość pozyskiwania RNA pojedynczej komórki i testu chromatyny dostępnej dla transpozazy z danymi sekwencjonowania (sekwencjonowanie ATAC) z tej samej komórki w sposób sparowany (sekwencjonowanie wieloomowe) zapewnia znaczny postęp w tym kierunku3,4. Eksperymenty te są jednak kosztowne i czasochłonne, a jakość i wpływ uzyskanych danych w dużym stopniu zależą od jakości warunków i materiałów doświadczalnych. Opublikowano ustandaryzowane protokoły izolacji jąder5,6. Świeże i niejednorodne tkanki wymagają optymalizacji protokołu, ponieważ świeżo wyizolowane komórki z próbek guzów litych są bardziej kruche niż te wyizolowane z linii komórkowych.
Inną kwestią jest to, że w przypadku guzów litych, próbki chirurgiczne często nie są dostępne na sali operacyjnej aż do późnych godzin porannych. W związku z tym na ogół nie jest możliwe bezpośrednie przejście od pobrania próbki do wychwytu jąder bez etapu kriokonserwacji. Z naszego doświadczenia wynika, że zamrożenie zawiesiny pojedynczej komórki daje jądra najwyższej jakości (a nie zamrożoną całą tkankę lub inne metody konserwacji). Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku typów tkanek enzymatycznych o wysokiej zawartości RNazy, takich jak trzustka.
Warunki trawienia tkanek również muszą być zaprojektowane tak, aby maksymalizować wydajność komórek bez poświęcania jakości7. W kontekście typów guzów litych z gęstymi matrycami desmoplastycznymi8, macierz zewnątrzkomórkowa musi zostać delikatnie rozbita w celu uwolnienia komórek. Dodatkowo, ponieważ izolowane typy komórek są niejednorodne, warunki powinny być dostosowane do obsługi całej populacji komórek. W opisanym protokole wykorzystuje się próbki ludzkiego raka trzustki (gruczolakorak przewodowy trzustki). Rak trzustki reprezentuje wysoce desmoplastyczny typ nowotworu, który zwiastuje stosunkowo lepką tkankę i komórki. Co więcej, ponieważ próbki guzów trzustki dostępne do badań są również stosunkowo małe, dokłada się starań, aby zmaksymalizować ilość wychwyconych komórek.
Izolacja jąder wymaga największej optymalizacji pod względem warunków i czasu lizy komórek, a także typów i proporcji odczynników. Obchodzenie się z jądrami w trakcie izolacji również wymaga dużej ostrożności. W tym artykule opisujemy nasze doświadczenia w optymalizacji izolacji jądrowej dla platformy sekwencjonowania multiomu 10x Genomics z tkanki guza litego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Przedstawiamy zalecenia dotyczące trawienia tkanek, kriokonserwacji zawiesin jednokomórkowych (w razie potrzeby) i izolacji jądrowej.

<table><tbody><tr><td>100, 70 i 40 &mu; m Sitka do komórek Falcon&nbsp;</td><td>&nbsp; ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor jąder Genomics (20x)</td><td>10x Genomics</td><td>2000153/2000207</td><td></td></tr><tr><td>Bambanker&nbsp;</td><td>Wako, Fisher Naukowy</td><td>NC9582225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>499609</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza (Kolagenaza typu IV)</td><td>ThermoFisher</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Thermo Fisher</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington</td><td>LS006330</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowana Eagle Medium F-12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>Flowmi 40 &mu; m&nbsp; Sitko do końcówek pipet&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BAH136800040</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1119 Gradientowy roztwór do separacji komórek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2520</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi GentleMACSTM digest kit&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik do zamrażania Nalgene Cryo "Mr. Frosty"</td><td>&nbsp; ThermoFisher</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Nonident P40 Substytut</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 188</td><td>Sigma</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor Rnazy&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher</td><td>85113</td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowana izolacja jąder ze świeżych i mrożonych próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego

Optimized Nuclei Isolation from Fresh and Frozen Solid Tumor Specimens for Multiome Sequencing

Sekwencjonowanie Multiome, które dostarcza RNA dla tej samej komórki/sparowanej pojedynczej komórki- oraz test na chromatynę dostępną dla transpozazy z danymi sekwencjonowania (sekwencjonowania ATAC), stanowi przełom w naszej zdolności do rozpoznawania heterogeniczności komórek nowotworowych - głównego celu badań translacyjnych nad rakiem w tym czasie. Jednak jakość danych sekwencjonowania uzyskanych przy użyciu tej zaawansowanej modalności w dużym stopniu zależy od jakości materiału wejściowego. 
Warunki trawienia muszą być zoptymalizowane, aby zmaksymalizować wydajność komórek bez utraty jakości. Jest to szczególnie trudne w kontekście guzów litych z gęstymi matrycami desmoplastycznymi, które muszą być delikatnie rozbite w celu uwolnienia komórek. Świeżo wyizolowane komórki z litej tkanki nowotworowej są bardziej kruche niż te wyizolowane z linii komórkowych. Dodatkowo, ponieważ izolowane typy komórek są niejednorodne, należy wybrać warunki sprzyjające utrzymaniu całej populacji komórek. 
Na koniec, warunki izolacji jądrowej muszą być zoptymalizowane w oparciu o te cechy pod względem czasu lizy i typów/proporcji odczynników. W tym artykule opisujemy nasze doświadczenia z izolacją jądrową dla platformy sekwencjonowania multiomu 10x Genomics z próbek guzów litych. Przedstawiamy zalecenia dotyczące trawienia tkanek, przechowywania zawiesin jednokomórkowych (w razie potrzeby) oraz izolacji i oceny jądra komórkowego.

Aby wyizolować wysokiej jakości jądra komórkowe z próbek guzów litych pacjentów do sekwencjonowania multiomowego (Rysunek 1), tkankę nowotworową zdysocjowano, a zawiesinę pojedynczych komórek kriokonserwowano (Rysunek 2A-D). Zawiesinę komórek rozmrożono w czasie planowanego przechwytywania danych multiomowych. Przechwytywanie jąder przeprowadzono z zastosowaniem zoptymalizowanych odczynników buforu lizującego oraz odpowiedniego ...

Protokół zapewnia niezawodne i zoptymalizowane podejście do izolacji jąder z próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego przy użyciu platformy 10x Genomics, w tym zalecenia dotyczące warunków dysocjacji tkanek, kriokonserwacji zawiesin pojedynczych komórek i oceny izolowanych jąder.

Zoptymalizowana izolacja jąder ze świeżych i mrożonych próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) ...

Wraz ze wzrostem naszej wiedzy na temat biologii nowotworów, zainteresowanie zrozumieniem zawiłości interakcji komórek w guzie może wpływać na wyniki pacjentów. Wzrosło również znaczenie analizy heterogenicznych komórek w mikrośrodowisku guza. Sekwencjonowanie wielozadaniowe, które umożliwia pozyskiwanie RNA pojedynczej komórki i sekwencjonowanie ataku z tej samej komórki w sposób sparowany komórkowy, stanowi znaczny postęp w tym kierunku.Jakość danych uzyskanych z tych doświadczeń zależy jednak w dużym stopniu od jakości warunków doświadczalnych i wprowadzonego materiału biologicznego. Protokół ten zapewnia niezawodne i zoptymalizowane podejście do izolacji jąder z próbek guzów litych w celu sekwencjonowania wieloomowego przy użyciu platformy genomicznej 10X. Protokół ten jest niezawodny w przypadku świeżych lub mrożonych zawiesin jednokomórkowych.Przedstawiamy zalecenia dotyczące warunków dysocjacji tkanek, kriokonserwacji zawiesin jednokomórkowych oraz oceny izolowanych jąder. W tym protokole używamy próbek ludzkiego gruczolakoraka przewodowego trzustki, który jest podstawowym typem tkanki w naszym laboratorium. Rak trzustki reprezentuje wysoce desmoplastyczny typ nowotworu, który udaje stosunkowo lepką tkankę, a także komórki.Co więcej, ponieważ próbki guzów trzustki dostępne do badań są również stosunkowo małe, dokłada się starań, aby zmaksymalizować ilość wychwyconych komórek. Zacznij od przeniesienia wcześniej rozmrożonej zawiesiny komórek nowotworowych trzustki do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej i dodaj PBS, aby osiągnąć końcową objętość dwóch mililitrów. Następnie użyj hemocytometru, aby ocenić ilość i jakość komórek.Po uzyskaniu osadu komórkowego przez wirowanie, przy użyciu coraz mniejszych końcówek pipet, ostrożnie zdekantować supernatant, aby zminimalizować dystrybucję osadu, jednocześnie maksymalizując dekantację płynu. Przygotuj jeden bufor do lizy komórek X, a następnie dodaj 100 mikrolitrów do 900 mikrolitrów wcześniej przygotowanego buforu do rozcieńczania lizy komórek, aby uzyskać 0,1X bufor do lizy komórek. Przenieś 100 mikrolitrów schłodzonego buforu do lizy komórek 0,1X do osadu komórkowego i delikatnie pipetuj pięć razy, aby zapewnić całkowitą ponowną zawiesinę.Po inkubacji na lodzie przez trzy minuty, dodać jeden mililitr schłodzonego buforu do płukania do ponownie zawieszonego osadu i delikatnie pipetować pięć razy. Po odwirowaniu odrzucić supernatant w sposób przedstawiony i powtórzyć ten proces mycia jeszcze dwa razy. Załaduj trypanową zawiesinę zabarwioną na niebiesko do hemocytometru, aby policzyć liczbę jąder.Ponownie zawiesić osad jądrowy w buforze jąder 1X w oparciu o docelowe odzyskiwanie jąder. Ostrożnie przepuść ponownie zawieszone jądra przez sitko do komórek z końcówką pipety o średnicy 40 mikrometrów, a następnie utrzymuj je na lodzie. Teraz ponownie policz jądra.Jądra otrzymane tą metodą wykazywały odpowiednią wielkość i kształt. Sporadycznie można zaobserwować łagodne nakrapianie się otoczki jądrowej, które powinno być monitorowane podczas końcowej oceny jądrowej za pomocą hemacytometru.

optimized-nuclei-isolation-from-fresh-frozen-solid-tumor-specimens

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje protokół izolacji pojedynczych jąder ze świeżo zamrożonej tkanki glejaka. Wyizolowane pojedyncze jądra mogą być wykorzystane jako próbki do technik sekwencjonowania, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA) i test pojedynczych jąder do sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozazy (snATAC) w celu uzyskania głębszego wglądu w niejednorodność między- i wewnątrznowotworową obserwowaną w glejaku ośrodkowych tkanek nerwowych.

Izolacja jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka: metoda uzyskiwania nienaruszonych jąder z próbek guza glejaka

Niejednorodność wewnątrznowotworowa jest nieodłączną cechą nowotworów, w tym glejaków. Opracowaliśmy prosty i wydajny protokół, który wykorzystuje kombinację i wirowania gradientowego do izolowania pojedynczych jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka do badań sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i ATAC.

Izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji RNA pojedynczego jądra i sekwencji ATAC

Tutaj prezentujemy protokół izolacji jąder z błyskawicznie zamrożonych, zarchiwizowanych tkanek wątroby dla jednojądrowego sekwencjonowania RNA, sekwencji ATAC i multiomiki stawów (sekwencja RNA i sekwencja ATAC).

Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

Badanie opisuje prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych tkanek ssaków do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Sukces transkryptomiki i multiomiki pojedynczej komórki/pojedynczego jądra w dużej mierze zależy od jakości komórek/jąder. Dlatego izolowanie komórek/jąder od tkanek i ich oczyszczanie musi być wysoce ustandaryzowane. Protokół ten opisuje przygotowanie jąder z mózgu i szpiku kostnego do dalszego testu multiomu pojedynczego jądra.

Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

Ten manuskrypt opisuje protokoły kliniczne dla dwóch paneli sekwencjonowania nowej generacji. Jeden panel bada nowotwory hematologiczne, podczas gdy drugi panel koncentruje się na genach powszechnie zmutowanych w guzach litych. Klasyfikacja molekularna mutacji powodujących nowotwory złośliwe u ludzi dostarcza cennych informacji prognostykujących i predykcyjnych.

Sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych

Uzyskanie wysokiej jakości genomowego DNA z tkanek nowotworowych jest niezbędnym pierwszym krokiem do analizy zmian genetycznych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. W tym artykule przedstawiamy prostą i szybką metodę wzbogacania komórek nowotworowych i uzyskiwania nienaruszonego DNA z próbek cytologicznych odcisku dotykowego.

Prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego

Opisujemy szczegółowy protokół izolacji komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z ludzkim mięsakiem poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, przy użyciu ludzkiego antygenu leukocytów-1 (HLA-1) jako markera ujemnego, oraz dla dalszej walidacji i charakterystyki tych komórek inicjujących HLA-1-ujemny nowotwór.

Izolacja i charakterystyka komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z mięsakiem

Rękopis opisuje cyfrowy test PCR oparty na chipie, który wykrywa rzadki wariant transkryptu CDH1 (CDH1a) w świeżo zamrożonych tkankach normalnych i nowotworowych pobranych od pacjentów z rakiem żołądka.

Wykrywanie rzadkiego wariantu transkryptu CDH1 w świeżo mrożonych tkankach raka żołądka za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie

W tym badaniu prezentujemy nowatorski i skuteczny protokół izolacji limfocytów z plastrów Peyera (PPs), który może być następnie wykorzystany do testów funkcjonalnych in vivo i in vitro, a także do badań cytometrycznych komórek T pomocniczych pęcherzyków i komórek B centrum rozrodczego.

Odkrywanie kluczowych graczy odporności humoralnej: zaawansowany i zoptymalizowany protokół izolacji limfocytów z plastrów mysich Peyera

Poznaj zoptymalizowaną metodę izolacji jąder z próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego. Protokół obejmuje warunki dysocjacji tkanek oraz krioprezerwację zawiesin komórkowych.

Zoptymalizowana izolacja jąder ze świeżych i mrożonych próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego

Przeglądaj więcej filmów