Zoptymalizowana izolacja jąder ze świeżych i mrożonych próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego

Wraz ze wzrostem naszej wiedzy na temat biologii nowotworów, zainteresowanie zrozumieniem zawiłości interakcji komórek w guzie może wpływać na wyniki pacjentów. Wzrosło również znaczenie analizy heterogenicznych komórek w mikrośrodowisku guza. Sekwencjonowanie wielozadaniowe, które umożliwia pozyskiwanie RNA pojedynczej komórki i sekwencjonowanie ataku z tej samej komórki w sposób sparowany komórkowy, stanowi znaczny postęp w tym kierunku.

Jakość danych uzyskanych z tych doświadczeń zależy jednak w dużym stopniu od jakości warunków doświadczalnych i wprowadzonego materiału biologicznego. Protokół ten zapewnia niezawodne i zoptymalizowane podejście do izolacji jąder z próbek guzów litych w celu sekwencjonowania wieloomowego przy użyciu platformy genomicznej 10X. Protokół ten jest niezawodny w przypadku świeżych lub mrożonych zawiesin jednokomórkowych.

Przedstawiamy zalecenia dotyczące warunków dysocjacji tkanek, kriokonserwacji zawiesin jednokomórkowych oraz oceny izolowanych jąder. W tym protokole używamy próbek ludzkiego gruczolakoraka przewodowego trzustki, który jest podstawowym typem tkanki w naszym laboratorium. Rak trzustki reprezentuje wysoce desmoplastyczny typ nowotworu, który udaje stosunkowo lepką tkankę, a także komórki.

Co więcej, ponieważ próbki guzów trzustki dostępne do badań są również stosunkowo małe, dokłada się starań, aby zmaksymalizować ilość wychwyconych komórek. Zacznij od przeniesienia wcześniej rozmrożonej zawiesiny komórek nowotworowych trzustki do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej i dodaj PBS, aby osiągnąć końcową objętość dwóch mililitrów. Następnie użyj hemocytometru, aby ocenić ilość i jakość komórek.

Po uzyskaniu osadu komórkowego przez wirowanie, przy użyciu coraz mniejszych końcówek pipet, ostrożnie zdekantować supernatant, aby zminimalizować dystrybucję osadu, jednocześnie maksymalizując dekantację płynu. Przygotuj jeden bufor do lizy komórek X, a następnie dodaj 100 mikrolitrów do 900 mikrolitrów wcześniej przygotowanego buforu do rozcieńczania lizy komórek, aby uzyskać 0,1X bufor do lizy komórek. Przenieś 100 mikrolitrów schłodzonego buforu do lizy komórek 0,1X do osadu komórkowego i delikatnie pipetuj pięć razy, aby zapewnić całkowitą ponowną zawiesinę.

Po inkubacji na lodzie przez trzy minuty, dodać jeden mililitr schłodzonego buforu do płukania do ponownie zawieszonego osadu i delikatnie pipetować pięć razy. Po odwirowaniu odrzucić supernatant w sposób przedstawiony i powtórzyć ten proces mycia jeszcze dwa razy. Załaduj trypanową zawiesinę zabarwioną na niebiesko do hemocytometru, aby policzyć liczbę jąder.

Ponownie zawiesić osad jądrowy w buforze jąder 1X w oparciu o docelowe odzyskiwanie jąder. Ostrożnie przepuść ponownie zawieszone jądra przez sitko do komórek z końcówką pipety o średnicy 40 mikrometrów, a następnie utrzymuj je na lodzie. Teraz ponownie policz jądra.

Jądra otrzymane tą metodą wykazywały odpowiednią wielkość i kształt. Sporadycznie można zaobserwować łagodne nakrapianie się otoczki jądrowej, które powinno być monitorowane podczas końcowej oceny jądrowej za pomocą hemacytometru.