Opracowanie liofilizowanych odczynników do amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli do wykrywania Coxiella burnetii

Ogólnym celem tego eksperymentu jest opracowanie prostej metody LAMP z wykorzystaniem liofilizowanych odczynników do wykrywania C.burnetii w próbkach pacjentów. Główną zaletą tego protokołu jest brak konieczności chłodzenia podczas przechowywania odczynników. Metoda ta jest idealna do zastosowania w warunkach z ograniczonymi zasobami, w których gorączka Q jest endemiczna.

Procedurę zaprezentuje Tatiana, technik z naszego laboratorium. Rozpoczynając od DNA dla genu docelowego IS1111a z C.burnetii RSA493, należy określić stężenie plazmidu za pomocą spektrofotometru przy 260 nanometrach. Przelicz stężenie plazmidowego DNA na liczbę kopii, korzystając z poniższych obliczeń, gdzie 6330 odpowiada długości plazmidu w parach zasad, a 34,2 nanogramów na mikrolitr to stężenie plazmidu, właśnie wyznaczone za pomocą spektrofotometru.

Następnie przygotuj rozcieńczenia seryjne plazmidu w stosunku od 8- do 10-krotnego, aby uzyskać następującą liczbę kopii na mikrolitr. Aby przygotować matrycę DNA do reakcji LAMP, zacznij od 200 mikrolitrów próbek osocza ludzkiego, a następnie za pomocą zestawu do miniprepu DNA wyizoluj DNA zgodnie z protokołem producenta. Rozcieńcz końcową próbkę do objętości 20 mikrolitrów.

Przygotuj 1 mililitr buforu do reakcji LAMP 2x, łącząc następujące odczynniki. Wymieszaj za pomocą pulsacyjnego wstrząsania w wirówce przez 10 sekund. Aby przeprowadzić standardową reakcję LAMP, w probówce PCR o objętości 0,2 mililitra wymieszaj 12,5 mikrolitrów buforu LAMP 2x, 1,2 mikrolitra mieszaniny starterów, 1 mikrolitr polimerazy Bst DNA oraz 5,3 mikrolitra wody.

Następnie dodaj 5 µL DNA do 20 µL mieszaniny reakcyjnej i dokładnie wymieszaj, po czym inkubuj w temperaturze 60 °C w kąpieli wodnej lub bloku grzewczym przez 60 minut. Po inkubacji przerwij reakcję, dodając do probówki 5 µL 10x buforu do ładowania żelu. Następnie nanieś 5 µL produktów reakcji na żel agarozowy o stężeniu 2% zabarwiony barwnikiem do kwasów nukleinowych.

Przeprowadź elektroforezę żelu w 1x TBE przy napięciu 100 V przez 35 minut, a następnie użyj światła UV, aby zwizualizować wyniki. Aby przeprowadzić reakcję LAMP z zrekonstytuowanymi odczynnikami, przygotuj 1 mililitr buforu do rekonstytucji, łącząc poniższe odczynniki. Wymieszaj za pomocą pulsacyjnego wstrząsania w wirówce przez 10 sekund.

Następnie wyjmij probówki zawierające liofilizowane odczynniki z zamkniętej aluminiowej torebki. W kroku 4.2 bardzo ważne jest upewnienie się, że aluminiowa torebka jest szczelnie zamknięta przed jej otwarciem. Nie używaj probówek, jeśli aluminiowa torebka nie jest zamknięta lub jest uszkodzona.

Do każdej probówki z odczynnikami dodać 20 µL buforu do konstytuowania i wymieszać, pipetując w górę i w dół pięć razy. Należy upewnić się, że liofilizowane odczynniki zostały całkowicie resuspendowane. Następnie do zrekonstytuowanych odczynników dodać 5 µL matrycy DNA i dokładnie wymieszać.

Inkubować w temperaturze 60 °C w kąpieli wodnej lub bloku grzewczym przez 60 minut. Aby przerwać reakcję po inkubacji, dodać 5 µL 10x buforu do ładowania żelu, a następnie nanieść 5 µL produktów reakcji na 2% żel agarozowy barwiony interkalującym barwnikiem kwasów nukleinowych. Prowadzić elektroforezę w 1x buforze TBE przy napięciu 100 V przez 35 minut, a następnie wizualizować wyniki w świetle UV.

Aby przeprowadzić reakcję LAMP z wykorzystaniem błękitu hydroksynaftolowego (HNB) lub barwnika interkalującego, należy przygotować 1 mililitr buforu do rekonstytucji, łącząc następujące odczynniki zawierające HNB lub fluorescencyjny barwnik interkalujący. Wymieszać próbkę za pomocą pulsacyjnego wstrząsania w wirówce przez 10 sekund. Reakcję LAMP przeprowadzić zgodnie z powyższym opisem, a wyniki zwizualizować przy użyciu światła UV lub gołym okiem.

Aby przeprowadzić reakcję LAMP za pomocą skanera do probówek, należy dodać 5 µL DNA do zrekonstytuowanych odczynników zawierających fluorescencyjny barwnik interkalujący, a następnie włożyć zamkniętą probówkę do skanera. Temperaturę inkubacji należy ustawić na 60 °C i mierzyć fluorescencję przy 520 nm przez 60 minut. Na tej rycinie przedstawiono wyniki reakcji LAMP na żelach agarozowych z zastosowaniem świeżo przygotowanych odczynników oraz odczynników liofilizowanych.

Zaobserwowano, że liofilizowany odczyn zachowuje swoją aktywność. Reakcje LAMP przygotowane przy użyciu obu odczynników wykryły 25 kopii matrycy DNA. Na tej rycinie przedstawiono detekcję produktów reakcji za pomocą HNB lub fluorescencyjnego barwnika interkalującego w reakcji.

Dodatek HNB do reakcji wywołuje wizualną zmianę koloru z fioletowego na niebieski w obecności 25, 50 i 100 kopii matrycy DNA w reakcjach. Ponadto zastosowanie fluorescencyjnego barwnika interkalującego w reakcji daje silny sygnał fluorescencyjny pod wpływem światła UV przy podobnej liczbie kopii DNA. Przedstawiono tutaj wyniki monitorowania sygnałów fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym za pomocą skanera probówek z wykorzystaniem fluorescencyjnego barwnika interkalującego.

Sygnały fluorescencyjne przekraczają poziom linii bazowej po 14, 18, 21 i 23 minutach, przy zastosowaniu odpowiednio 10^6, 10^4, 10^3 i 100 kopii matrycy DNA w reakcjach. Po opanowaniu techniki procedura ta może zostać wykonana w 90 minut. Po opracowaniu test ten utorował drogę do szybkiej diagnostyki zakażeń Coxiella burnetii w obszarach o ograniczonych zasobach.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak rekonstytuować liofilizowane odczynniki LAMP. Należy pamiętać, że próbki pacjentów mogą być zakaźne, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności.