Opracowanie liofilizowanych odczynników do amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli do wykrywania Coxiella burnetii

Ogólnym celem tego eksperymentu jest opracowanie prostej metody LAMP wykorzystującej liofilizowane odczynniki do wykrywania C. burnetii w próbkach pobranych od pacjentów. Główną zaletą tego protokołu jest to, że do przechowywania odczynników nie jest wymagane coaching. Ta metoda jest idealna do stosowania w warunkach o ograniczonych zasobach, w których gorączka Q jest endemiczna.

Zabieg zademonstruje Tatiana, technik z naszego laboratorium. Zaczynając od DNA dla docelowego genu IS1111a z C.burnetii RSA493, określ stężenie plazmidu za pomocą spektrofotometru o długości 260 nanometrów. Przelicz stężenie DNA plazmidu na liczbę kopii, wykonując następujące obliczenia, gdzie 6330 równa się długości i parom zasad plazmidu, a 34,2 nanogramów na mikrolitr to stężenie plazmidu, jak właśnie określono za pomocą spektrofotometru.

Następnie przygotuj 8-10-krotne seryjne rozcieńczenia plazmidu, aby uzyskać następującą liczbę kopii na mikrolitr. Aby przygotować matrycę DNA do reakcji LAMP, zacznij od 200 mikrolitrów próbek ludzkiego osocza, a za pomocą zestawu do miniprzygotowania DNA wyekstrahuj DNA zgodnie z protokołem producenta. Rozcieńczyć próbkę końcową do objętości 20 mikrolitrów.

Przygotować 1 mililitr 2x buforu reakcyjnego LAMP, łącząc następujące odczynniki. Mieszaj przez wirowanie pulsacyjne przez 10 sekund. Aby przeprowadzić standardową reakcję LAMP, w 0,2 mililitrowej probówce do PCR wymieszaj 12,5 mikrolitra 2x buforu LAMP, 1,2 mikrolitra mieszanki starterów, 1 mikrolitr polimerazy DNA Bst i 5,3 mikrolitra wody.

Następnie dodaj 5 mikrolitrów DNA do 20 mikrolitrowej reakcji i dobrze wymieszaj, a następnie inkubuj w temperaturze 60 stopni Celsjusza w łaźni wodnej lub bloku grzewczym przez 60 minut. Po inkubacji zakończyć reakcję, dodając do probówki 5 mikrolitrów 10x buforu ładującego żel. Następnie załaduj 5 mikrolitrów produktów reakcji na 2% żel agarozowy wybarwiony interkalacyjnym barwnikiem kwasu nukleinowego.

Uruchom żel w 1x TBE przy napięciu 100 woltów przez 35 minut, a następnie użyj światła UV, aby zwizualizować wyniki. Aby przeprowadzić reakcję LAMP z odczynnikami odtworzonymi do rozpuszczenia, należy przygotować 1 mililitr buforu do rozpuszczenia, łącząc następujące odczynniki. Mieszaj przez wirowanie pulsacyjne przez 10 sekund.

Następnie wyjmij probówki zawierające liofilizowane odczynniki z szczelnie zamkniętej torebki z folii aluminiowej. W kroku 4.2 bardzo ważne jest, aby upewnić się, że torebka z folii aluminiowej jest odpowiednio zamknięta przed jej otwarciem. Nie używaj tubek, jeśli aluminiowa torba nie jest szczelna lub jest uszkodzona.

Dodać 20 mikrolitrów buforu do rozpuszczania do każdej probówki z odczynnikami i mieszać, pipetując pięć razy w górę i w dół. Upewnij się, że liofilizowane odczynniki są całkowicie ponownie zawieszone. Następnie dodaj 5 mikrolitrów matrycy DNA do odtworzonych odczynników i dobrze wymieszaj.

Inkubować w temperaturze 60 stopni Celsjusza w łaźni wodnej lub bloku grzewczym przez 60 minut. Aby zakończyć reakcję po inkubacji, dodaj 5 mikrolitrów 10x buforu ładującego żel, a następnie dodaj 5 mikrolitrów produktów reakcji na 2% żel agarozowy wybarwiony interkalacyjnym barwnikiem kwasu nukleinowego. Uruchom żel w 1x buforze TBE przy napięciu 100 woltów przez 35 minut, a następnie wizualizuj wyniki za pomocą światła UV.

Aby przeprowadzić reakcję LAMP z błękitem hydroksynaftolowym lub HNB lub barwnikiem interkalacyjnym, należy przygotować 1 mililitr buforu do rekonstytucji, łącząc następujące odczynniki, które zawierają HNB lub fluorescencyjny barwnik interkalacyjny. Mieszaj przez wirowanie pulsacyjne przez 10 sekund. Przeprowadź reakcję LAMP zgodnie z opisem i użyj światła UV lub gołym okiem, aby zobrazować wyniki.

Aby przeprowadzić reakcję LAMP za pomocą skanera probówkowego, dodaj 5 mikrolitrów DNA do odtworzonych odczynników zawierających fluorescencyjny barwnik interkalacyjny, a następnie włóż zamkniętą probówkę do skanera probówkowego. Ustaw temperaturę inkubacji na 60 stopni Celsjusza i mierz fluorescencję przy 520 nanometrach przez 60 minut. Ten rysunek przedstawia wyniki reakcji LAMP na żelach agarozowych ze świeżo przygotowanymi odczynnikami i odczynnikami liofilizowanymi.

Obserwuj, że liofilizowany odczynnik utrzymuje swoją aktywność. W reakcjach LAMP przygotowanych przez oba odczynniki wykryto 25 kopii matrycy DNA. Na tym rysunku pokazano wykrywanie produktów reakcji z HNB lub fluorescencyjnym barwnikiem interkalacyjnym w reakcji.

Dodanie HNB do reakcji powoduje wizualną zmianę koloru, z fioletowego na niebieski, z 25, 50 i 100 kopiami matrycy DNA obecnymi w reakcjach. Ponadto włączenie fluorescencyjnego barwnika interkalacyjnego do reakcji wykazuje silny sygnał fluorescencyjny ze światłem UV, gdy obecna jest podobna liczba kopii DNA. Poniżej przedstawiono wyniki użycia skanera lampowego do monitorowania sygnałów fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencyjnego barwnika interkalacyjnego.

Sygnały fluorescencyjne są powyżej linii podstawowej po 14, 18, 21 i 23 minutach, z 10^6, 10^4, 10^3 i 100 kopiami matrycy DNA w reakcjach. Po opanowaniu tę procedurę można wykonać w 90 minut. Po opracowaniu test ten utorował drogę do szybkiej diagnozy zakażenia Coxiella burnetii na obszarach o ograniczonych zasobach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozpuszczać liofilizowane odczynniki LAMP. Nie zapominaj, że próbki od pacjentów mogą być zakaźne i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności.