Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną
March 30th, 2015
Dostarczony jest protokół do opracowania testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia początkowego stężenia próbek DNA za pomocą termocyklera lub mikroskopu i podgrzewacza scenicznego. Opisano również rozwój wewnętrznej kontroli pozytywnej. Dostępne są skrypty do przetwarzania surowych danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zastosowanie ilościowego uproszczenia polimerazy rekombinazy w celu ilościowego określenia stężenia DNA w nieznanych próbkach. Osiąga się to poprzez dodanie do reakcji docelowej wewnętrznej kontroli pozytywnej DNA, starterów DNA i sond znakowanych fluorescencyjnie. W drugim etapie reakcje są umieszczane w maszynie do PCR w czasie rzeczywistym, która podgrzewa reakcje w celu aktywacji enzymów i monitoruje fluorescencję sond w celu wykrycia generowania amplikonów docelowych i kontrolnych.
Następnie dane fluorescencyjne są analizowane za pomocą skryptu w celu wygenerowania krzywej wzorcowej i walidacji testu. Wyniki pokazują, że próbki DNA można określić ilościowo z dokładnością do jednego rzędu wielkości od prawidłowego stężenia w oparciu o eksperymenty walidacyjne stosowane do ilościowego określenia jednego docelowego DNA wirusa HIV. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, jest to, że RPA jest izotermiczny, więc nie jest potrzebny kosztowny termocykler.
RPA wymaga również niższego wzmocnienia temperatury, jest tolerancyjny na brudne próbki, wzmacnia cel do wykrywalnych poziomów w ciągu kilku minut i wykorzystuje enzymy lly, aby umożliwić łatwy transport i przechowywanie w temperaturze pokojowej. Aby rozpocząć czyszczenie wszystkich powierzchni stołu i sprzętu roztworem 50% wybielacza, aby stworzyć czystą przestrzeń roboczą przed amplifikacją, usuń 280-milimolowy roztwór octanu magnezu, bufor rehydratacyjny i granulki reakcyjne z zamrażarki o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i rozmroź roztwory w temperaturze pokojowej. Następnie złóż mieszankę główną, przenosząc 383,5 mikrolitrów buforu do rehydratacji do nowej probówki mikro fuge z 41,6 mikrolitrami wody wolnej od nukleaz do buforu i wiruj, aby wymieszać 35 mikrolitrów octanu magnezu do oddzielnej probówki.
Zwrócić octan magnezu z roztworów podstawowych buforu do rehydratacji do zamrażarki. Następnie zaopatrz się w starter i prob quas z lodówki o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieść je w przestrzeni roboczej przed amplifikacją i wyłącz światła, aby zminimalizować ekspozycję na światło przy 27,3 mikrolitrach każdego z 10 mikromolowych starterów do przodu i do tyłu do mieszanki głównej.
Następnie w 7,8 mikrolitra 10 mikromolowego sześciokąta oznaczonego HIV 1D NA. Sondę do mieszanki głównej i przekręć rurkę wirowo. Następnie zwróć starter i roztwory podstawowe sondy do przechowywania, odczynniki do wewnętrznej kontroli dodatniej można dodać tutaj, jak wskazano w protokole tekstowym, aby zmontować reakcje QRPA. Najpierw umieść liofilizowane granulki enzymów w pojedynczych probówkach z dwoma, nisko osadzonymi, ośmiodołkowymi paskami probówki do PCR, pipetują 37,5 mikrolitra mieszanki wzorcowej do probówki zawierającej osad.
Delikatnie wymieszaj zawartość probówki końcówką pipety, aby rozpuścić osad bez tworzenia pęcherzyków. Ostrożnie wyjmij końcówkę z miejsca reakcji, aby zapobiec utracie objętości i upewnić się, że końcówki pipet są wymieniane między każdą probówką. Przenieść probówki do schłodzonego 96-dołkowego zimnego bloku na co najmniej pięć minut w celu schłodzenia mieszanki wzorcowej.
W międzyczasie załaduj do oprogramowania termocyklera protokół, a układ płytki zostanie wskazany w protokole tekstowym. Następnie wytnij dwa paski przezroczystych plastikowych klejów do mikrouszczelnień tak, aby były nieco szersze niż probówki do PCR. A także uzyskać dwie płaskie wieczka z paskami probówki do PCR, poddzielić jedną matrycę plazmidu HIV, jak wskazano w protokole tekstowym.
A następnie dodaj 10 mikrolitrów matrycy do odpowiedniej probówki do PCR. Ponownie delikatnie wymieszaj mieszankę końcówką pipety. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra octanu magnezu do każdej nakrętki probówki, a następnie delikatnie umieść nakrętki na probówkach reakcyjnych, aby nie były całkowicie zamknięte.
Octan magnezu powinien być wyraźnie widoczny przez nasadkę. Umieść paski probówki do PCR w mikrowirówce i wiruj probówki przez 10 sekund, aby zebrać cały płyn na dnie probówki i usunąć wszelkie pęcherzyki. Połączenie roztworu octanu magnezu z mieszanką wzorcową inicjuje reakcję QRPA.
Szybko wyjmij probówki PCR do zimnego bloku, aby zatrzymać reakcję. Następnie powoli zdejmij pokrywki, aby zapobiec zanieczyszczeniu reakcji i uszczelnij probówki przezroczystą folią z mikros. Przenieś rurki do termocyklera zgodnie z miejscami w układzie płyt.
Zamknij pokrywę termocyklera i kliknij przycisk start run. Pamiętaj, aby wyznaczyć nazwę pliku dla eksperymentu po zakończeniu przebiegu. Wyświetl surowe dane dotyczące fluorescencji i wyeksportuj je do arkusza kalkulacyjnego, który utworzy plik o nazwie wyniki amplifikacji ilościowej.
Aby utworzyć krzywą standardową. Najpierw pobierz skrypt krzywej standardowej, a następnie otwórz MATLAB lub podobny program do analizy danych. Otwórz skrypt i naciśnij uruchom, aby uruchomić skrypt.
Wpisz liczbę plików danych, które mają być analizowane po wyświetleniu monitu. Następnie wpisz liczbę próbek i liczbę powtórzeń w każdym pliku treningowym. W oknie poleceń.
Wpisz najniższe stężenie DNA w 10 kopiach opartych na logarytmie, które zostało użyte do zbudowania krzywej standardowej i naciśnij enter. W poniższym przykładzie. Najniższe stężenie to 10 kopii na podstawie jednego logarytmu.
Następnie wpisz różnicę w stężeniu między każdym wzorcem DNA w wierszu polecenia i naciśnij tutaj enter. Przedział stężeń to jeden log oparty na 10 kopiach. Następnie wprowadź wartość progu nachylenia w oknie poleceń i naciśnij enter.
Ta wartość wynosi zwykle od trzech do pięciu. Wpisz liczbę odchyleń standardowych powyżej tła dla progu dodatniego, znanego również jako Z, a następnie naciśnij Wprowadź typowe wartości Z z zakresu od jednego do pięciu. Następnie określ sprzęt, który został użyty do zebrania danych w tym przypadku.
Wpisz jeden dla termocyklera, a następnie naciśnij Enter. Jeżeli istnieje wewnętrzna kontrola dodatnia, należy wybrać wartość domyślną lub nową wartość progu, wpisując Y lub N w zależności od tego, czy konieczny jest nowy próg. Na koniec wybierz wszystkie pliki arkuszy kalkulacyjnych, które zostaną użyte do zbudowania krzywej standardowej.
Skrypt następnie automatycznie zaimportuje i przeanalizuje wszystkie dane. QRPA w czasie rzeczywistym przeprowadzono na zduplikowanych próbkach zawierających różne numery kopii HIV 1D NA. Początek wykrywalnej amplifikacji, na który wskazuje wzrost fluorescencji, występuje wcześniej w przypadku próbek o wyższej liczbie kopii DNA niż w przypadku próbek o niższej liczbie kopii. Surowe dane dotyczące fluorescencji wykorzystano do wygenerowania krzywej wzorcowej z amplifikacji znanych stężeń HIV 1D NA. Dane te zostały dopasowane do krzywej wykładniczej, a wartość R kwadrat wskazuje na wysoką wartość dopasowania.
Krzywa standardowa została wykorzystana do przewidywania stężeń dodatkowych próbek DNA o znanym stężeniu. Dostosowanie wartości Z do jednego pozwala na dokładne przewidywanie niskich stężeń DNA. Natomiast wysokie stężenia DNA są lepiej przewidywane przy wartości Z wynoszącej pięć.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że RPA nie ma prawdziwych cykli, które ograniczałyby szybkość amplifikacji DNA. Dlatego szybkość amplifikacji musi być precyzyjnie kontrolowana. Spójność między eksperymentami ma kluczowe znaczenie, więc upewnij się, że używasz tych samych podwielokrotności startera we wszystkich eksperymentach.
Chronić składniki reakcji przed ciepłem i światłem. Dodaj octan magnezu bezpośrednio przed rozpoczęciem zbierania danych i utrzymuj reakcje w zimnym bloku do rozpoczęcia. Eksperyment.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
W tym artykule przedstawiono protokół dla testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym, zaprojektowanego do kwantyfikacji stężeń DNA w próbkach. Metoda wykorzystuje albo cykler termiczny, albo mikroskop z podgrzewaną płytą, i obejmuje opracowanie wewnętrznej pozytywnej kontroli.
Kluczowe Elementy Badania
Dział Obszaru Nauki
- Biotechnologia
- Biologia Molekularna
- Genomika
Wprowadzenie
- Kwantytywna analiza DNA jest kluczowa w różnych dziedzinach badań biologicznych.
- Tradycyjne metody, takie jak kwantytatywna PCR w czasie rzeczywistym, wymagają drogich cyklerów termicznych.
- Amplifikacja polimerazy rekombinazy (RPA) oferuje izotermiczną alternatywę.
- Wewnętrzne pozytywne kontrole zwiększają wiarygodność testów kwantytatywnych.
Cel Badania
- Opracowanie protokołu do kwantyfikacji stężeń DNA z wykorzystaniem RPA.
- Stworzenie wewnętrznej pozytywnej kontroli w celu poprawy walidacji testu.
- Dostarczenie skryptów do analizy danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym.
Wykorzystane Metody
- Przygotowanie mieszanin reakcyjnych z DNA docelowym, primerami i sondami fluorescencyjnymi.
- Wykorzystanie maszyny PCR w czasie rzeczywistym do monitorowania fluorescencji podczas amplifikacji.
- Analiza danych fluorescencyjnych w celu wygenerowania krzywej wzorcowej.
- Walidacja testu poprzez eksperymenty kwantyfikujące DNA docelowe HIV.
Główne Wyniki
- Test dokładnie kwantyfikuje stężenia DNA w granicach jednego rzędu wielkości.
- Eksperymenty walidacyjne potwierdziły skuteczność wewnętrznej pozytywnej kontroli.
- RPA wykazała zalety nad tradycyjnymi metodami PCR.
- Protokół jest dostępny dla badaczy bez drogiego sprzętu.
Wnioski
- Opracowany test RPA jest wiarygodną metodą do kwantyfikacji DNA.
- Wewnętrzne pozytywne kontrole są niezbędne do walidacji testu.
- Ta metoda może ułatwić szerszy dostęp do technik kwantyfikacji DNA.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative DNA measurement is a foundational capability in target validation and assay development, where accurate concentration data supports lead identification and predictive confidence. The described qRPA method provides an isothermal alternative to qPCR, reducing equipment dependency and enabling deployment in resource-variable settings. This positions the assay as a scalable tool for early discovery workflows requiring reliable nucleic acid quantification without thermal cycling infrastructure.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise DNA target quantification in complex samples.
- Operational Value: Supports functional target validation by delivering concentration data within one order of magnitude accuracy using internal positive controls.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by generating standard curves that allow cross-experiment comparison and assay performance assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative dependent variable measurements essential for dose-response modeling and compound screening readiness.
- Operational Value: Enables assay standardization through internal positive controls that monitor amplification efficiency and inhibition.
- Scalability: Compatible with microscope-based detection, supporting adaptation to point-of-care or decentralized testing formats.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage quantification to preclinical validation through reproducible standard curve generation.
- Biomarker Alignment: Supports monitoring of DNA-based biomarkers where concentration changes indicate target engagement or pathway modulation.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative outputs that inform go/no-go decisions by defining detectable limits and dynamic range.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where quantitative nucleic acid data informs compound prioritization and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing by quantifying DNA targets to assess pathway modulation or genetic perturbation effects.
- Screening: Delivers reproducible fluorescence-based readouts suitable for high-throughput adaptation when paired with automated liquid handling.
- Analytics: Generates standard curves and Z-score thresholds that allow teams to compare conditions and validate assay sensitivity.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by providing quantifiable DNA measurements that correlate with biological activity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable quantification platform applicable across DNA targets, reducing redevelopment effort for new assays.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing variability through internal positive control normalization.
- Operational Value: Enhances reproducibility via isothermal amplification and cold-block reaction setup, minimizing temperature-dependent artifacts.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by eliminating need for thermal cyclers, lowering barrier to entry for quantitative DNA analysis.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through concentration data that supports accurate dosing and target exposure modeling.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise in primer/probe design and fluorescence data interpretation.
- Needs access to fluorescence detection equipment such as a real-time PCR machine or microscope with stage heater.
- Demands standardization of reagent handling, including magnesium acetate addition timing and cold-block storage.
- Involves adaptation considerations for sample types, particularly regarding inhibitor tolerance and DNA purity.
- Includes practical limitations such as the one-order-of-magnitude quantification accuracy and absence of true amplification cycles requiring precise reaction timing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:30
Assembling the Quantitative Recombinase Polymerase Amplification (qRPA) Reactions for a Standards Curve
5:16
Constructing a Standard Curve from Multiple Experiments with Custom Scripts
6:55
Results: Construction of an HIV-1 DNA Standard Curve by qRPA
7:53
Conclusion
