Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zastosowanie ilościowego uproszczenia polimerazy rekombinazy w celu ilościowego określenia stężenia DNA w nieznanych próbkach. Osiąga się to poprzez dodanie do reakcji docelowej wewnętrznej kontroli pozytywnej DNA, starterów DNA i sond znakowanych fluorescencyjnie. W drugim etapie reakcje są umieszczane w maszynie do PCR w czasie rzeczywistym, która podgrzewa reakcje w celu aktywacji enzymów i monitoruje fluorescencję sond w celu wykrycia generowania amplikonów docelowych i kontrolnych.

Następnie dane fluorescencyjne są analizowane za pomocą skryptu w celu wygenerowania krzywej wzorcowej i walidacji testu. Wyniki pokazują, że próbki DNA można określić ilościowo z dokładnością do jednego rzędu wielkości od prawidłowego stężenia w oparciu o eksperymenty walidacyjne stosowane do ilościowego określenia jednego docelowego DNA wirusa HIV. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, jest to, że RPA jest izotermiczny, więc nie jest potrzebny kosztowny termocykler.