Name: Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj ilościową metodę amplifikacji polimerazy rekombinazy do oznaczania stężenia DNA z wewnętrzną kontrolą pozytywną. Technika izotermiczna nie wymaga drogiego termocyklera i umożliwia szybką analizę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane z grantu Fundacji Billa i Melindy Gatesów w ramach Grand Challenges in Global Health Initiative.

<ol><li>Yoon, J. -Y., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-a-Chip+Pathogen+Sensors+for+Food+Safety%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety.</a> Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).</li>
<li>Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptosporidium+parvum+and+Cyclospora+cayetanensis%3A+A+review+of+laboratory+methods+for+detection+of+these+waterborne+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (3), 209-224 (2002).</li>
<li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li>
<li>Asiello, P. J., Baeumner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+isothermal+nucleic+acid+amplification%2C+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review.</a> Lab on a Chip. 11 (8), 1420-1430 (2011).</li>
<li>Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+detection+using+recombination+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA detection using recombination proteins.</a> PLoS Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).</li>
<li>Krõlov, K., Frolova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+Rapid+Detection+of+Chlamydia+trachomatis+by+Recombinase+Polymerase+Amplification+Directly+from+Urine+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics+JMD%22%5BJournal%5D)">Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples.</a> The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16 (1), 127-135 (2014).</li>
<li>Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a, Puchades, R., Maquieira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase+polymerase+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay+as+a+DNA+amplification-detection+strategy+for+food+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis.</a> Analytica Chimica Acta. 811 (1), 81-87 (2014).</li>
<li>Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Plasmodium+falciparum+with+isothermal+recombinase+polymerase+amplification+and+lateral+flow+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis.</a> Malaria Journal. 13 (1), 99(2014).</li>
<li>Crannell, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+test+to+diagnose+cryptosporidiosis%3A+lab+assessment+in+animal+and+patient+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2565-2571 (2014).</li>
<li>Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paper+and+plastic+device+for+performing+recombinase+polymerase+amplification+of+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA.</a> Lab on a Chip. 12 (17), 3082(2012).</li>
<li>Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+aptamer-based+bio-barcode+assay+with+isothermal+recombinase+polymerase+amplification+for+cytochrome-c+detection+and+anti-cancer+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening.</a> Talanta. 115 (1), 159-165 (2013).</li>
<li>Euler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+panel+of+recombinase+polymerase+amplification+assays+for+detection+of+biothreat+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1110-1117 (2013).</li>
<li>Abd El Wahed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portable+reverse+transcription+recombinase+polymerase+amplification+assay+for+rapid+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus.</a> PloS One. 8 (8), e71642(2013).</li>
<li>Escadafal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Molecular+Assays+for+the+Detection+of+Yellow+Fever+Virus+in+Low-Resource+Settings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (3), e2730(2014).</li>
<li>Hutson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T.+gondii+RP+Promoters+%26+Knockdown+Reveal+Molecular+Pathways+Associated+with+Proliferation+and+Cell-Cycle+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest.</a> PLoS ONE. 5 (11), 15(2010).</li>
<li>Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+detection+of+artificial+replication-competent+lentivirus+of+altered+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 118-129 (2003).</li>
<li>DNA Extraction from Serum. Life Technologies. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html</a> (2014).</li>
<li>Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+HIV-1+DNA+using+Real-Time+Recombinase+Polymerase+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).</li>
<li>Sollis, K. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+of+the+performance+of+HIV+viral+load+technologies+on+plasma+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples.</a> PloS one. 9 (2), e85869(2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+use+of+antiretroviral+agents+in+HIV-1-infected+adults+and+adolescents%22">Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents</a>. , Department of Health and Human Services. Washington D.C. 1-166 (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Aby uzyskać miarodajne dane kwantyfikacyjne za pomocą algorytmu MATLAB, użytkownik musi wybrać odpowiednie wartości wejściowe, gdy zostanie o to poproszony. Po zainicjowaniu każdego skryptu w sekcjach 5 i 6, wszystkie zmienne wejściowe są automatycznie pobierane w oknie poleceń, a dane wyjściowe są generowane automatycznie. W sekcji 5.7 użytkownik jest proszony o wybranie progu nachylenia. Wartość progu nachylenia wpływa na kwadrat współczynnika korelacji (r2) pasowania. W przypadku korzystania z surowych dany...

Ilościowa amplifikacja kwasów nukleinowych jest ważną techniką wykrywania patogenów przenoszonych przez środowisko, żywność i wodę, a także do diagnostyki klinicznej. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) jest złotym standardem w czułym, specyficznym i ilościowym wykrywaniu kwasów nukleinowych, np. do badania wiremii HIV-1, wykrywania patogenów bakteryjnych i badań przesiewowych w kierunku wielu innych organizmów1–3. Podczas qPCR w czasie rzeczywistym startery amplifikują DNA patogenu w cyklach i generowany jest sygnał fluorescencyjny, który jest proporcjonalny do ilości amplifikowanego DNA w próbce w każdym cyklu. Próbka zawierająca nieznane stężenie DNA patogenu może być oznaczona ilościowo za pomocą krzywej wzorcowej, która wiąże początkowe stężenie DNA w próbkach wzorcowych z czasem, w którym sygnał fluorescencyjny osiąga określony próg (tj. próg cyklu lubCT).
Ponieważ qPCR w czasie rzeczywistym wymaga drogiego sprzętu do cykli termicznych i kilku godzin na otrzymanie wyników, opracowano alternatywne techniki amplifikacji izotermicznej, takie jak amplifikacja polimerazy rekombinazy (RPA)4. Platformy te na ogół zapewniają szybsze wyniki i amplifikują kwasy nukleinowe w niższej, pojedynczej temperaturze, co można osiągnąć za pomocą tańszego i prostszego sprzętu. RPA, który jest szczególnie atrakcyjny do zastosowań przyłóżkowych, amplifikuje DNA w ciągu kilku minut, wymaga niskiej temperatury amplifikacji (37 °C) i pozostaje aktywny w obecności zanieczyszczeń5,6. Testy RPA zostały opracowane do szerokiego zakresu zastosowań, w tym do analizy żywności, wykrywania patogenów, badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych i wykrywania czynników zagrożenia biologicznego7–12. Jednak zastosowanie RPA do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych było ograniczone13,14.
W poprzedniej pracy wykazano, że ilościowe RPA (qRPA) w czasie rzeczywistym jest wykonalne15. W tym miejscu przedstawiono bardziej szczegółowy protokół wykorzystania ilościowego RPA w czasie rzeczywistym do ilościowego oznaczania nieznanych próbek przy użyciu krzywej standardowej, metody analogicznej do kwantyfikacji za pomocą qPCR. Protokół ten opisuje, jak przeprowadzić reakcję RPA na termocyklerze w celu wykrycia DNA HIV-1 jako dowodu słuszności koncepcji, a także jak opracować wewnętrzną kontrolę pozytywną (IPC), aby zapewnić prawidłowe działanie systemu. Szczegółowe jest również gromadzenie danych za pomocą termocyklera lub mikroskopu oraz analiza danych w celu skonstruowania krzywej standardowej na podstawie danych treningowych. Na koniec zademonstrowano metodę ilościowego oznaczania nieznanych próbek przy użyciu krzywej standardowej z niestandardowym skryptem. Ta technika qRPA umożliwia kwantyfikację próbek o nieznanych stężeniach i ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnym qPCR w czasie rzeczywistym.

<table><tbody><tr><td>qRPA Test</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 do przodu</td><td>starter Zintegrowane technologie DNA</td><td>niestandardowe oligonukleotydy DNA</td><td>5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>Odwrócony starter HIV-1</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>niestandardowe oligonukleotydy DNA</td><td>5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT TTT TTT G-3 ' &nbsp;</td></tr><tr><td>Sonda HIV-1</td><td>BioSearch Technologies&nbsp;</td><td>niestandardowe oligonukleotydy DNA</td><td>5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3' &nbsp;</td></tr><tr><td>Sonda IPC</td><td>BioSearch Technologies&nbsp;</td><td>niestandardowe oligonukleotydy DNA</td><td>5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3'</td></tr><tr><td>Odczynniki do egzoterapii RPA (granulki, bufor hydratacyjny, octan magnezu</td><td>TwistDx</td><td>TwistAmp exo</td><td></td></tr><tr><td>PCR paski do probówek</td><td>BioRad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>PCR z płaską nakrętką</td><td>BioRad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>Klej do mikrouszczelek</td><td>BioRad</td><td>558/MJ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cel HIV-1 (pHIV-IRES- eYFP&Delta; Env&Delta; Vif&Delta; Vpr)</td><td></td><td></td><td>niestandardowy plazmid, patrz: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, RE Charakterystyka i wykrywanie lentiwirusa kompetentnego do sztucznej replikacji o zmienionym zakresie gospodarza. Terapia molekularna 8, 118&ndash; 129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).</td></tr><tr><td>Ludzki męski genomiczny DNA</td><td>Applied Biosystems</td><td>360486</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy zimny blok</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-36700-48</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>MiniFuge</td><td>VWR</td><td>93000-196</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Tris 1,0 M, pH 8,0</td><td>EMD Milipore</td><td>648314</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8,0</td><td>Promega</td><td>V4321</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Rozwój</td><td></td><td></td><td></td>IPC</tr><tr><td>Cryptosporidium parvum Szablon IPC</td><td>Waterborne Inc</td><td>P102C</td><td>Możliwe jest również zamówienie dwuniciowego celu syntetycznego w IDT, jeśli użytkownik nie jest wyposażony do pracy z C. parvum (czynnikiem zakaźnym BSL-2). Startery PCR i RPA dla C. parvum zostały zaprojektowane przy użyciu startera o numerze dostępu GenBank AF115377.1</td></tr><tr><td>PCR long forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom DNA oligos</td><td>5'-TGG CAG TAT TCA, TTC, ACA, ATT TTA, AAA, GAA, G/ ATC, TAA, GGA, AGG, CAG, CAG, CAG, GC-3'</td></tr><tr><td>PCR długi odwrócony starter</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>niestandardowe oligonukleotydy DNA</td><td>5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT TTT TTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3</td></tr>'<tr><td>Phusion High-Fidelty DNA Polymeraza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S Zestaw do ekstrakcji</td><td></td></tr><tr><td>żelu</td><td>Qiaquick Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X bufor</td><td>EMD Millipore</td><td>574797</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A9539</td><td></td></tr><tr><td>Eksperymenty mikroskopowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pionowy mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Imager.J1</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz sceniczny</td><td>Narzędzia biologiczne</td><td>TC-GSH</td><td></td></tr><tr><td>1-kanałowy precyzyjny regulator temperatury o wysokiej stabilności Narzędzia</td><td>biologiczne</td><td>TC-1100S</td><td></td></tr><tr><td>FAM/GFP kostka</td><td>filtracyjna Zeiss</td><td>zestaw filtrów 38 (000000-1031-346)</td><td>wzbudzenie BP 470/40 nm, emisja BP 520/50 nm</td></tr><tr><td>Kostka filtra HEX</td><td>Chroma</td><td>49014</td><td>wzbudzenie BP 530/30 nm, emisja BP 575/40 nm</td></tr><tr><td>Wycinarka</td><td>laserowa Grawer Network</td><td>VLS3.60</td><td></td></tr><tr><td>1/8" akryl</td><td>McMaster Carr</td><td>8505K113</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mm przezroczysty akryl</td><td>McMaster Carr</td><td>PD-72268940&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Super klej</td><td>Office Depot</td><td>Duro super klej&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny klasy PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8662-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Analiza</td><td></td><td></td><td></td>danych</tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATLAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skrypt MATLAB: "JoVE_qRPA_standard_curve.m"</td><td>Zawarte w</td> skrypcie SI <td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"</td><td>Zawarte w</td> skrypcie SI <td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"</td><td>Zawarte w SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_well.ai</td><td>Zawarte w SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_base.ai</td><td>Zawarte w oprogramowaniu SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioVision</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_AxioVision_Script.ziscript</td><td>Zawarte w SI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Niedawno wykazano, że amplifikacja polimerazy rekombinazy (RPA), platforma amplifikacji izotermicznej do wykrywania patogenów, może być użyta do ilościowego określenia stężenia próbki DNA za pomocą krzywej standardowej. W niniejszym manuskrypcie przedstawiono szczegółowy protokół opracowywania i wdrażania ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym (test qRPA). Na przykładzie kwantyfikacji DNA HIV-1 opisano montaż reakcji RPA w czasie rzeczywistym, projektowanie sekwencji wewnętrznej kontroli pozytywnej (IPC) oraz koamplifikację IPC i celu zainteresowania. Dostarczane są instrukcje i skrypty przetwarzania danych do budowy krzywej wzorcowej na podstawie danych z wielu eksperymentów, które mogą być wykorzystane do przewidywania stężenia nieznanych próbek lub oceny wydajności testu. Na koniec opisano alternatywną metodę zbierania danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopu i podgrzewacza stopniowego jako krok w kierunku opracowania testu qRPA w miejscu opieki. Dostarczony protokół i skrypty mogą być wykorzystane do opracowania testu qRPA dla dowolnego celu DNA, który jest przedmiotem zainteresowania.

Przed wybraniem sekwencji, która będzie służyć jako IPC w eksperymentach qRPA z docelowym DNA (HIV-1), generowane są kandydaci na wewnętrzną kontrolę pozytywną (IPC), a następnie sprawdzana jest ich zdolność do amplifikacji w reakcjach qRPA w obecności DNA HIV-1. Kandydaci na IPC są dłuższe niż docelowe DNA (HIV-1), aby zapobiec sytuacji, w której tworzenie IPC konkurowałoby z tworzeniem amplikonów HIV-1. Jak pokazano na Rysunku 2A, generowanie dwóch kandydatów na IPC z C. parvum zostało potwier...

Dostarczony jest protokół do opracowania testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia początkowego stężenia próbek DNA za pomocą termocyklera lub mikroskopu i podgrzewacza scenicznego. Opisano również rozwój wewnętrznej kontroli pozytywnej. Dostępne są skrypty do przetwarzania surowych danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym.

Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykorzystanie ilościowego uproszczonego procesu polimerazy i rekombinazy do oznaczenia stężenia DNA w nieznanych próbkach. Osiąga się to poprzez uprzednie dodanie do reakcji wewnętrznej dodatniej kontroli DNA, starterów DNA oraz znakowanych fluorescencyjnie sond. W drugim kroku reakcje są umieszczane w urządzeniu do real-time PCR, które podgrzewa próbki w celu aktywacji enzymów i monitoruje fluorescencję sond, aby wykryć powstawanie amplikonów docelowych i kontrolnych.Następnie dane fluorescencyjne są analizowane za pomocą skryptu w celu wygenerowania krzywej standardowej oraz walidacji testu. Wyniki pokazują, że próbki DNA mogą być ilościowo określone z dokładnością w obrębie jednego rzędu wielkości właściwego stężenia, w oparciu o eksperymenty walidacyjne zastosowane do kwantyfikacji DNA celu HIV 1. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ilościowa PCR w czasie rzeczywistym, jest fakt, że RPA jest procesem izotermicznym, dzięki czemu nie jest wymagany kosztowny termocykler.Metoda RPA wymaga również niższej temperatury amplifikacji, jest odporna na zanieczyszczenia w próbkach, amplifikuje cel do poziomów wykrywalnych w ciągu kilku minut i wykorzystuje liofilizowane enzymy, co umożliwia łatwy transport i przechowywanie w temperaturze pokojowej. Aby rozpocząć, należy przemyć wszystkie powierzchnie blatów i sprzętu roztworem 50% wybielacza, aby stworzyć czysty obszar roboczy przed amplifikacją, a następnie wyjąć z zamrażarki o temperaturze -20 °C roztwór octanu magnezu o stężeniu 280 mM, bufor rehydracyjny oraz pellety reakcyjne i rozmrozić roztwory w temperaturze pokojowej. Następnie należy przygotować master mix, przenosząc 383,5 µL buforu rehydracyjnego do nowej probówki do wirówki, dodając do buforu 41,6 µL wody wolnej od nukleaz i mieszając w wirówce typu vortex, a następnie przenosząc 35 µL octanu magnezu do oddzielnej probówki.Przenieś roztwory zapasowe octanu magnezu w buforze rehydratacyjnym z powrotem do zamrażarki. Następnie wyjmij primery i sondy z lodówki o temperaturze 4°C. Umieść je w obszarze roboczym przeznaczonym do preamplifikacji i wyłącz światło, aby zminimalizować ekspozycję na światło, a następnie dodaj po 27,3 µL każdego z 10 µM primerów prawego i lewego do master mixu.Następnie do master miksu dodaje się 7,8 µL sondy HIV 1D NA znakowanej hex o stężeniu 10 µM i miesza próbkę w wirówce typu vortex. Następnie roztwory zapasowe startera i sondy należy odłożyć do przechowywania. W tym miejscu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, można dodać odczynniki dla wewnętrznej kontroli pozytywnej w celu przygotowania reakcji QRPA. Najpierw liofilizowane pellety enzymu umieszcza się w pojedynczych probówkach dwóch niskoprofilowych paskach PCR z ośmioma dołkami, a następnie do probówki zawierającej pellet pipetuje się 37,5 µL master miksu.Delikatnie wymieszaj zawartość probówki końcówką pipety, aby rozpuścić osad, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Ostrożnie wyjmij końcówkę z mieszaniny reakcyjnej, aby zapobiec utracie objętości, i pamiętaj o zmianie końcówek pipety pomiędzy każdą probówką. Przenieś probówki do schłodzonego bloku 96-dołkowego na co najmniej pięć minut, aby schłodzić master mix.W międzyczasie wczytaj protokół do oprogramowania termocyklera; układ płytki jest wskazany w protokole tekstowym. Następnie odetnij dwa paski przezroczystych klejowych uszczelnień z tworzywa sztucznego do mikroprobówek, tak aby były nieco szersze niż probówki PCR. Przygotuj również dwie płaskie pokrywki do pasków probówek PCR i odmierz odpowiednią ilość matrycy plazmidowej HIV 1, zgodnie ze wskazówkami w protokole tekstowym.Następnie dodaj 10 µL matrycy do odpowiedniej probówki PCR. Ponownie delikatnie wymieszaj zawartość końcówką pipety. Dalej, nanieś 2,5 µL octanu magnezu na każdą zakrętkę, a następnie delikatnie nałóż zakrętki na probówki z reakcją tak, aby nie były one szczelnie zamknięte.Octan magnezu powinien być wyraźnie widoczny przez zakrętkę. Umieść paski probówek PCR w mikrocentryfużorce i wiruj probówki przez 10 sekund, aby zgromadzić cały płyn na dnie probówki i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Połączenie roztworu octanu magnezu z master mixem inicjuje reakcję QRPA.Szybko przenieś probówki PCR do bloku chłodzącego, aby zatrzymać reakcję. Następnie powoli zdejmij nakrętki, aby zapobiec zanieczyszczeniu reakcji, i uszczelnij probówki przezroczystą folią uszczelniającą do mikroprobówek. Przenieś probówki do termocyklera zgodnie z ich położeniem w schemacie płyty.Zamknij pokrywę termocyklera i kliknij start run. Pamiętaj, aby nadać nazwę plikowi z eksperymentem po zakończeniu cyklu. Przejrzyj surowe dane fluorescencji i wyeksportuj je do arkusza kalkulacyjnego, co utworzy plik o nazwie quantification amplification results.Aby zbudować krzywą wzorcową, najpierw pobierz skrypt do krzywej wzorcowej, a następnie otwórz MATLAB lub podobny program do analizy danych. Otwórz skrypt i naciśnij przycisk uruchom, aby go wykonać.Po wyświetleniu monitu wpisz liczbę plików danych do analizy. Następnie, w oknie poleceń, wpisz liczbę próbek oraz liczbę powtórzeń w każdym pliku treningowym.Wpisz najniższe stężenie DNA w logarytmicznej skali 10 kopii, które zostało użyte do zbudowania krzywej standardowej, i naciśnij enter. W poniższym przykładzie najniższe stężenie wynosi jedna kopia w skali logarytmicznej 10.Następnie wpisz w wierszu poleceń różnicę w stężeniu między poszczególnymi standardami DNA i naciśnij enter. Przedział stężeń wynosi jedną logarytmiczną jednostkę w podstawie 10 kopii. W kolejnym kroku wprowadź do okna poleceń wartość progu nachylenia i naciśnij enter.Wartość ta mieści się zazwyczaj w przedziale od trzech do pięciu. Wpisz liczbę odchyleń standardowych powyżej tła dla progu pozytywnego, znaną również jako Z, a następnie naciśnij enter; typowe wartości Z mieszczą się w zakresie od jednego do pięciu. Następnie określ sprzęt, który został użyty do zebrania danych w tym przypadku.Wpisz jeden dla termocyklera, a następnie naciśnij enter. Jeśli zastosowano wewnętrzną kontrolę pozytywną, wybierz domyślną lub nową wartość progu, wpisując Y lub N w zależności od tego, czy konieczne jest ustalenie nowego progu. Na koniec wybierz wszystkie pliki arkusza kalkulacyjnego, które zostaną wykorzystane do zbudowania krzywej wzorcowej.Następnie skrypt automatycznie zaimportuje i przeanalizuje wszystkie dane. Badanie Realtime QRPA przeprowadzono na próbkach powtórzonych zawierających różne liczby kopii HIV 1D NA. Początek wykrywalnej amplifikacji, sygnalizowany wzrostem fluorescencji, następuje wcześniej w próbkach o wyższej liczbie kopii DNA niż w próbkach o niższej liczbie kopii. Surowe dane fluorescencyjne wykorzystano do wygenerowania krzywej wzorcowej z amplifikacji znanych stężeń HIV 1D NA. Dane te dopasowano do krzywej wykładniczej, a wartość R kwadrat wskazuje na wysoką jakość dopasowania.Krzywą wzorcową wykorzystano do wyznaczenia stężeń dodatkowych próbek DNA o znanym stężeniu. Ustawienie wartości Z na jeden pozwala na dokładne wyznaczenie niskich stężeń DNA. Z kolei wysokie stężenia DNA są dokładniej wyznaczane przy wartości Z równej pięć.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że metoda RPA nie posiada rzeczywistych cykli ograniczających tempo amplifikacji DNA. W związku z tym tempo amplifikacji musi być precyzyjnie kontrolowane. Kluczowa jest spójność między doświadczeniami, dlatego należy używać tych samych aliquot starterów we wszystkich eksperymentach.Chronić składniki reakcji przed ciepłem i światłem. Octan magnezu należy dodać bezpośrednio przed rozpoczęciem zbierania danych, a próbki reakcyjne przechowywać w bloku chłodzącym do momentu startu. Eksperyment.

development-quantitative-recombinase-polymerase-amplification-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrznym dodatnim kontrolnym

Opisano niedrogą, wysokoprzepustową metodę jednoczesnego wykrywania do 43 celów molekularnych. Zastosowania mPCR/RLB obejmują typowanie mikrobiologiczne oraz wykrywanie wielu patogenów w próbkach klinicznych.

Wielokrotna reakcja łańcuchowa polimerazy i analiza hybrydyzacji w układzie reverse line blot (mPCR/RLB)

Badanie opisuje kosztowo efektywną metodę identyfikacji źródła zanieczyszczenia kałowego/moczowego lub zanieczyszczenia azotanami w wodzie z wykorzystaniem qPCR do specyficznej kwantyfikacji ludzkich/świńskich/bydlęcych wirusów DNA, adenowirusów i poliomawirusów, proponowanych jako narzędzia MST.

Kosztowo efektywna metoda śledzenia źródeł mikrobów z wykorzystaniem specyficznych wirusów ludzkich i zwierzęcych

W tym filmie demonstrujemy technikę duplex digital PCR (ddPCR) — modyfikację tradycyjnej techniki PCR, która jest przydatna do jednoczesnego wykrywania dwóch różnych markerów genetycznych. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na zemulgowane kropelki o wielkości nanolitrów, które są niezależnie amplifikowane, a wykrywanie różnokolorowych sygnałów amplifikacji fluorescencji z frakcji kropel służy do obliczenia początkowego stężenia sekwencji docelowych.

Duplex Digital PCR do jednoczesnej kwantyfikacji podwójnych markerów genetycznych

Tutaj opisujemy metodę jednoczesnej kwantyfikacji okręgów wycinania receptora limfocytów T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji deklacyjnej K (KRECs). Test TREC/KREC może być stosowany jako marker wydalania grasicy i szpiku kostnego.

Jednoczesna kwantyfikacja kręgów wycinania receptora komórek T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji z delecją K (KREC) za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i walidacji ilościowej metody PCR używanej do wykrywania i kwantyfikacji DNA EHV-2 w płynach oddechowych koni. Protokół walidacji EHV-2 qRT-PCR obejmuje trzyczęściową procedurę: opracowanie, scharakteryzowanie samego testu qRT-PCR oraz scharakteryzowanie całej metody analitycznej.

Opracowanie i walidacja ilościowej metody PCR do diagnostyki herpeswirusa koniowatego-2 w płynach oddechowych

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Ten manuskrypt opisuje procedurę eksperymentalną i analizę oprogramowania dla dwukierunkowego testu miejsca integracji, który może jednocześnie analizować DNA połączenia wektor-gospodarz w górę i w dół. Dwukierunkowe produkty PCR mogą być używane na dowolnej platformie sekwencjonowania niższego szczebla. Uzyskane dane są przydatne do wysokoprzepustowego, ilościowego porównania zintegrowanych celów DNA.

Dwukierunkowa metodologia PCR w miejscu integracji retrowirusowej i przepływ pracy analizy danych ilościowych

Środowiskowe testy DNA wymagają rygorystycznego projektowania, testowania, optymalizacji i walidacji przed rozpoczęciem zbierania danych terenowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który przeprowadza użytkowników przez każdy etap projektowania specyficznego dla gatunku, opartego na sondzie testu qPCR do wykrywania i kwantyfikacji DNA gatunku docelowego z próbek środowiskowych.

Opracowywanie i testowanie specyficznych dla gatunku ilościowych testów PCR do zastosowań środowiskowych DNA

Szczegółowe instrukcje są dostarczone do budowy otwartego, modułowego fluorymetru, który jest kompatybilny z wieloma tanimi grzejnikami, aby przeprowadzać w czasie rzeczywistym, ilościowe izotermiczne amplifikacje kwasów nukleinowych.

Miniaturowy fluorymetr typu open source do monitorowania reakcji amplifikacji izotermicznych kwasów nukleinowych w czasie rzeczywistym w warunkach ograniczonych zasobów

Testy wychwytywania pętli D (DLC) i przedłużania pętli D (DLE) wykorzystują zasadę ligacji zbliżeniowej wraz z ilościowym PCR do ilościowego określenia powstawania pętli D, wydłużania pętli D i tworzenia produktu w miejscu indukowalnego dwuniciowego pęknięcia u Saccharomyces cerevisiae.

Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae

Aby ułatwić szybkie i precyzyjne wykrywanie Acinetobacter baumannii, przedstawiamy protokół, który wykorzystuje amplifikację polimerazy rekombinazy (RPA) w połączeniu z endonukleazą LbaCas12a do identyfikacji infekcji A. baumannii.

Szybkie i swoiste wykrywanie zakażeń Acinetobacter baumannii za pomocą systemu opartego na amplifikacji polimerazy rekombinazy/Cas12a

Poznaj ilościową metodę amplifikacji polimerazy rekombinazy do oznaczania stężenia DNA z wewnętrzną kontrolą pozytywną. Technika izotermiczna nie wymaga drogiego termocyklera i umożliwia szybką analizę.

Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną

Przeglądaj więcej filmów